Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn 23 2.2.7.. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng khuẩn
Trang 1LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi lời cảm ơn chân
thành tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật học, trường
ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội Người đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận văn
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội.Trong quá trình làm luận văn, tôi đã luôn nhận được sự chỉ bảo trực tiếp và được tạo điều kiện thuận lợi nhất
Đồng thời, tôi chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo tại khoa Sinh học nói chung và bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự nhiên- ĐH Quốc gia
Hà Nội nói riêng đã tận tình dạy dỗ tôi trong quá trình học tập
Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và toàn thể các bạn trong nhóm.Những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập
Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2015
Học viên
Dương Thị Phương
Trang 2MỤC LỤC
Trang 32.1.2 Hóa chất và thiết bị 20
2.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học - OD 23 2.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn
23
2.2.7 Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và giấm táo mèo 24 2.2.8 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng khuẩn
26
3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN
QUẢ TÁO MÈO
30
3.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis 32
3.3 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƯỞNG VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
37
Trang 43.3.5 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 41
3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO
VÀ DỊCH LÊN MEN VI KHUẨN
43
3.4.1.Tách chiết chất khoáng sinh từ dịch lên men vi khuẩn TM5.2 43 3.4.2.Xác định một số đặc tính của chất kháng sinh từ chủng vi khuẩn TM5.2 46
3.5 TÁCH CHIẾT CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT QUẢ TÁO MÈO
51
3.5.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 51 3.5.3 Sắc ký bản mỏng các phân đoạn kháng khuẩn của dịch lên men chủng TM5.2 và dịch chiết táo mèo
52
3.5.4 Sơ bộ thành phần hóa học của cao dịch chiết táo mèo và các phân đoạn 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 5BẢNG MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
LB Môi trường Luria Bertani
Trang 6DANH SÁCH BẢNG BIỂU, BIỂU ĐỒ
Hình 3.1: Vòng vô khuẩn của dịch chiết táo mèo nguyên chất với
M.catarrhalis
30
Bảng 3.1: Hoạt tính kháng M.catarrhalis của dịch lên men quả táo mèo 31
Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn của chủng TM5.2 lên các chủng vi khuẩn
kiểm định
33
Hình 3.2: Vị trí phân loại của chủng TM5.2 với các loài quan hệ họ hàng gần 35
Hình 3.3: Quan sát bào tử chủng TM5.2 dưới kính hiển vi quang học (A) và
kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (B)
37
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và hoạt
tính kháng khuẩn của chủng TM5.2
38
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính
kháng khuẩn của chủng TM5.2
39
Trang 7Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, hoạt tính kháng khuẩn
của chủng TM5.2
40
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng và HTKK của TM5.2 40 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính
kháng khuẩn của chủng TM5.2
41
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và
hoạt tính kháng khuẩn của chủng TM5.2
42
Hình 3.6: Hoạt tính kháng sinh của dịch chiết từ sinh khối với 8 loại dung
môi
44
Hình 3.10: Hoạt tính kháng sinh khi xử lý ở các mức nhiệt độ và thời gian
khác nhau
47
Hình 3.11: Kết quả phân tích hợp chất thu được bằng sắc ký lỏng cao áp 48
Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của cao dịch
chiết táo mèo tại các nồng độ khác nhau
51
Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của các phân
đoạn từ dịch chiết táo mèo
52
Bảng 3.15: Kết quả thử định tính các nhóm hợp chất của dịch chiết quả táo
mèo và các phân đoạn
53
Trang 8Bảng 3.16: Kích thước vòng vô khuẩn của 14 mẫu giấm táo mèo sau 1 tháng 54 Hình 3.15: Kích thước vòng vô khuẩn của 14 mẫu giấm táo mèo sau 1 tháng 55
Bảng 3.17: Kích thước vòng kháng M.catarrhaliscủa 14 mẫu giấm táo mèo
sau từng tháng(mm)
55
Hình 3.16: Vòng vô khuẩn với M.catarrhaliscủa các mẫu giấm táo mèo lên
men tự nhiên sau 5 tháng
57
Trang 9MỞ ĐẦU
Nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số
10 bệnh lý nhiễm khuẩn ở các nước có thu nhập thấp Chương trình toàn cầu về phòng chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đã được WHO phát động, tại Việt Nam chương trình này đã được triển khai từ năm 1984 Kiểm soát và phòng chống bệnh được ưu tiên hàng đầu tại các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, nhưng đã
và đang chịu tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh
Bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đường hô hấp trên
và nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới Tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp trên chiếm phần lớn so với các bệnh về hô hấp khác, là bệnh thường gặp, mắc hàng năm, theo mùa nhưng có thể gây nhiều biến chứng nặng như viêm tai giữa, viêm màng não, áp xe não, áp xe sau thành họng Khi mắc viêm đường hô hấp trên có thể lây nhiễm xuống đường hô hấp dưới gây viêm khí, phế quản và viêm phổi nặng.Có thể thấy bệnh gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, người già và gây thiệt hại kinh tế
Moraxella catarrhalis là căn nguyên gây ra phần lớn các trường hợp mắc
bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, đặc biệt hiện nay được coi như tác nhân gây bệnh viêm
tai giữa phổ biến thứ ba sau Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae Trong khi đó M catarrhalis hiện đã kháng lại hầu hết các chất kháng sinh thuộc
nhóm beta-lactam, chỉ còn nhạy cảm với cephalosporin thế hệ 2, 3 và ciprofloxacin
thuộc họ quinolon Thực trạng kháng kháng sinh của M catarrhalis nói riêng, các
vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung đã và đang đem đến gánh nặng kinh tế,
xã hội trong việc thay thế kháng sinh thế hệ cũ bằng kháng sinh thế hệ mới đắt tiền Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học hiện đại đem lại một triển vọng lớn cho nền Y học khi tìm kiếm thêm những hợp chất tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng và điều trị bệnh trên Các hợp chất này góp phần giảm tác dụng phụ không mong muốn
Trang 10của các hợp chất tổng hợp, giảm gánh nặng về mặt kinh tế cho người bệnh và xã hội
Từ ngàn xưa, ông cha ta đã lưu truyền rất nhiều bài thuốc dân gian từ cây, cỏ chữa các bệnh đường hô hấp và rất nhiều bệnh khác Hiện nay táo mèo và các sản phẩm chế biến từ táo mèo đặc biệt là giấm táo mèo được lan truyền rộng rãi trong cộng đồng như một bài thuốc chống béo phì, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn, giảm chứng suy hô hấp Trên thế giới cây táo mèo phân bố tại Trung Quốc, Ấn
Độ, Myanma, tại Việt Nam tập trung ở các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu
và Lâm Đồng Năm 2010, nhóm tác giả đã có những nghiên cứu sơ bộ với kết quả
khả quan về tác dụng kháng khuẩn của dịch lên men quả táo mèo đối với M
Catarrhalis- gây bệnh đường hô hấp ở người Các nghiên cứu này, đã mở ra một
hướng nghiên cứu mới cũng như định hướng ứng dụng của dịch lên men quả táo mèo trong việc hỗ trợ và nâng cao thể trạng cho con người Với mục tiêu góp phần chứng minh và làm sáng tỏ vai trò chủ đạo của các tác nhân có trong dịch lên men quả táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt là công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp trên đã kháng kháng sinh thông dụng, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng phòng chống vi khuẩn Moraxella catarrhalis
gây viêm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo Docynia”
Trang 11TÀI LIỆU THAM KHẢO
I TÀI LIỆU VIỆT NAM
1 Nguyễn Văn Bản (1996), Phân tích sàng lọc hóa thực vật, Tập II, tr
132-169
2 Nguyễn Đình Bảng (1992), “Vấn đề kháng sinh trong Tai Mũi Họng”
,Chuyên đề Tai Mũi Họng, tr 20-24
3 Nguyễn Thị Ngọc Bích (2007), Nghiên cứu giá trị của phương pháp cấy
đờm tìm vi khuẩn trong chẩn đoán nguyên nhân nhiễm khuẩn hô hấp,
Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa II, Học viên Quân y
4 Phạm Văn Ca (2005), “Tần suất bắt gặp Moraxella catarrhalis trong các
vi khuẩn gây bệnh và mức độ kháng thuốc tại Việt Nam”, Tạp chí Y học
dự phòng, 15(1), tr 55 – 59
5 Đinh Thị Kim Chung (2007), “Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá
trình lên men vang tóa mèo (Docynia indica)”, Tạp chí KH&CN, 45(2),
tr 87 – 92
6 Danh lục các loài Thực vật(2006), Tập II
7 Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nxb
Khoa học kỹ thuật, Hà Nội
8 Đào Đình Đức, Lê Đăng Hà, Phạm Văn Ca (1996), Tình hình nhiễm
khuẩn và kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh tại bệnh viện Bạch Mai trong 5 năm (1990-1994), Một số công trình nghiên cứu về độ
nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc khánh sinh (1994-1995), tr 30-32
9 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh
chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sỹ sinh học
10 Nguyễn Minh Hải, Nguyễn Tiền (2007), “ Nghiên cứu căn nguyên vi
khuẩn trong đờm và tính nhạy cảm kháng sinh của chúng trong đợt bùng
Trang 1211 Trần Thị Thu Hằng (2009), Thuốc sử dụng trong hóa trị liệu, Dược lực
học, Nxb Phương Đông, tr 681 – 685
12 Phạm Thị Hóa, Lê Kim Phụng, Lương Lệ Nhi (2010), Hợp chất thiên
nhiên của thuốc y học cổ truyền, Dược học cổ truyền, Bộ môn dược học
cổ truyền, tr 11 – 24
13 Nguyễn Hồng Lâm, (2009), Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của
vi khuẩn Moraxella catarrhalis và khả măng gây bệnh của chúng tại bệnh viện Tai Mũi Họng Trung Ương từ tháng 1 năm 2007 đến tháng 1 năm 2008, Khóa luận tốt nghiệp, trường Đại hoc Khoa Học Tự nhiên
14 Phạm Thùy Linh (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng
chất diệt khuẩn sinh học (nicin và enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
15 Nguyễn Thị Thanh Loan (2011), “ Tác dụng chống béo phì và giảm
trọng lượng của dịch chiết quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm”, Tạp chí Khoa học Đại học
Quốc gia Hà Nội, 27, tr 125 – 133
16 Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học
17 Vũ Văn Ngũ (1987), Các tác nhân gây ra viêm cấp tính đường hô hấp
dưới ở trẻ em dưới 5 tuổi, Nxb Y học, tr 3-7
18 Nguyễn Phi Kim Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ,
Nxb ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh
19 Đỗ Quyết (2010), “Nguyên nhân vi khuẩn giai đoạn đầu và sau đợt bùng
Trang 13II TÀI LIỆU TIẾNG ANH
23 Akinjogunla, O.J and Eghafona, N.O (2011), “Prevalence, Haemolytic
activities and flouroquinolones susceptibility profiles of Moraxella
catarrhalis, Streptococcus pneumoniae associated with acut otitis media”, Nature and Science, 9(6), pp 85 – 92
24 Austria R (1981), “Pneumococcus: The first one hundred years”, Rev
Infect, 3, pp 9 – 183
25 Borris, R.P (1996), “ Natural products research: perspective from a major
pharmaceutical company”, J Ethnopharmacol, 51, pp 29 – 38
26 Catlin BW (1990), “Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 3, pp 293 – 320
27 Cees M Verduin, Cees Hol, Andre Fleer, Hans van Dijk, and Alexvan
Belkum (2002), “ Moraxella catarrhalis: from Emerging to Established pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 15(1), pp 125 – 144
28 Chen H., Hoover D.G (2003), “Bacteriocins and their food application”,
Compre Rev in Foood Scien Food Safety,2(3), pp 82-100
29 Cleveland J., Montville T J., Nes I F., Chikindas M L (2001),
“Bacteriocins: Safe, natural antimicrobials for food preservation”, Int J
Food Microbiol, 71, pp 1-20
30 Critchley et al (2002), “Antimicrobial resistance among respiratory
pathogens collected in Thailand during 1999- 2000”, J Chemother, 14,
21 Hoàng Thị Minh Tân (2009), Nghiên cứu tách chiết một số hợp chất tự
nhiên từ cây táo mèo có tác dụng chống rối loạn trao đổi gluxit, lipid,
Luận văn thạc sỹ sinh học
22 WHO (2015), Gánh nặng bệnh tật toàn cầu: cập nhật 2015
Trang 14pp 147- 154
31 Dask, R.K.S Tiwari and D.K.Shrivastava (2010), “ Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: Curent
methods and future trends”, Journal of Medicinal Plants Research, 4 (2),
pp 104-111
32 Ejlertsen T, Thisted E, Ebbesen F, Olesen B, Renneberg J (1994), “
Branhamella catarrhalis in children and adults A study of prevalence,
time of coloisation, and association with upper and lower respiratory tract
infections”, J Infect, 29, pp 23- 31
33 Fang G., Fine M., Orloff J., et al (1990), “New and emerging etilogies for community – acquired pneumonia with implications for therapy”,
Medicine, 69, pp 307 – 316
34 FAO yearbook (2008), pp 35 – 37
35 Frances M.Boyle, Paul R Georghiou, martyn H Tilse & Joseph G
McCormack (1991), " Branhamella (Moraxella) catarrhalis: pathogenic significance in respiratory infection", The Medical Journal of Australia,
154, pp.592-596
36 Hongli Qiu, Wakako Kumita, Kenya Sato, Shinichi Nakajima, Hiroyuki Nishiyama, Ryoichi Saito, Etsuko Sawabe, Emi Ono, Toshio Chidaand
Noboru Okamura (2009), “uspA1 of Moraxella catarrhalis Clinical
Isolates in Japan and its Relationship with Adherence to HEp-2 Cells”,
Med Dent Sci, 56, pp 61-67
37 Jacobs MR (1996), “ Increaing importance f antibiotic – resistant
Trang 15acid bacteria”, FEMS Microbiol Rev, 12, pp 39-85
40 Krystal, Reval, LauraA.Dobbs, Sungeeta Narr, Janak A.Patel, Jame J.Grady, Tasnee Chonmaitree (2007), “Incidence of Acute Otiris Media and Sinusitis complicating Upper Respiratory Tract Infection: The effect
of age”, Pediatric, 119(6), pp 1408- 1412
41 M.C.Enright, H.Mc Kenzie (1997), “Moraxella (Branhamella)
catarrhalis – clinical and molecular aspects of a redicovered pathogen”, J.Med Microbiol, 46, pp 360- 371
42 Marjorie Murphy Cowan (1999), “ Plant products as antimicrobial
agents”, Clinical Microbiology Reviews, 12(4), pp 564- 582
43 Meyer GA, Shope TR, Waecker NJ, Lanningham FH (1995), “ Moraxella
(Branhamella) catarrhalis bacteremia in children A report of two
patients and review of literature”, Clin Pediatr, 34, pp 146- 150
44 Moerman, D.E (1996), “ An analysis of the food plants and drug plants
of native North America”, I.Ethopharmacol, 58, pp 85- 88
45 Riley M.A., Wertz J.E (2002), “Bacteriocins: evolution, ecology, and
application”, Annual Review of Microbiology, 56, pp 117-137
46 Rohani (1999), “Antimicrobial resistance among respiratory pathogens
collected in Malaysia”, Int Med Res J, 3, pp 57
47 Timothy F Murphy, G Iyer Parameswaran, (2009), “Moraxella
catarrhalis, a Human Respiratory Tract Pathogen”,Clinical Infectious Diseases, 49, pp 124–31
48 Vaneechoutte M, Verschraegen G, Clayeys G, Weise B, Van den Abeele
(1990), “Respiratory tract carrier rates of Moraxella (Branhamella)
catarrhalis in adults and children and interpretation of the isolation of M.catarrhalis from sputum”, J Clin Microbiol, 28, pp 2674 – 2680
49 Vu Thi Hue, Bui Thi Viet Ha (2010), “ Study on antibacterial activity
toward bacteria causing upper respiratory (Moraxella catarrhalis) of