Sàng lọc và nghiên cứu thu nhận lectin từ bọt biển

Một số hoạt tính sinh học của lectin như đặc tính liên kết carbohydrate và hoạt tính kháng khuẩn của lectin cũng sẽ được khảo sát trong nghiên cứu này.. Một số phương pháp sử dụng trong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng công nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Khánh Hòa, ngày 19 tháng 08 năm 2017

Chữ ký học viên

Đinh Thành Trung

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng, Trưởng phòng Công nghệ sinh học biển – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang), và PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học & môi trường – Đại học Nha Trang, đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học biển và Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại Viện công nghệ sinh học và môi trường – Đại học Nha Trang đã truyền đạt, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Luận văn này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam: “Nghiên cứu và định hướng sử dụng hemagglutinin từ sinh vật biển” với mã số: VAST06.04/16-17, thực hiện trong 2 năm 2016-2017

Xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 19 tháng 08 năm 2017

Chữ ký học viên

Đinh Thành Trung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH ẢNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bọt biển 3

1.1.1 Sự phân bố của bọt biển 3

1.1.2 Phân loại bọt biển 3

1.2 Tổng quan về lectin 4

1.2.1 Định nghĩa 4

1.2.2 Sự phân bố lectin trong sinh giới 5

1.2.3 Vai trò sinh học của lectin 6

1.2.4 Một số ứng dụng của lectin 7

1.3 Tổng quan lectin từ bọt biển 7

1.3.1 Các dạng lectin ở bọt biển 7

1.3.2 Một số đặc điểm của lectin từ bọt biển 9

1.3.2.1 Trọng lượng phân tử 9

1.3.2.2 Trình tự và cấu trúc 10

1.3.2.3 Tương tác giữa lectin với các loại đường 12

1.3.2.4 Khả năng gây ngưng kết tế bào 12

1.3.2.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt độ của lectin 12

1.3.3 Một số hoạt tính sinh học của lectin từ bọt biển 13

1.3.3.1 Tác động đến sự phân chia tế bào 13

1.3.3.2 Gắn kết với tế bào 14

1.3.3.3 Gây độc tế bào 14

1.3.3.4 Sản sinh cytokine 14

1.3.3.5 Kháng vi sinh vật 15

1.3.4 Ứng dụng sinh học của lectin từ bọt biển 15

1.3.5 Tình hình nghiên cứu lectin từ bọt biển 16

1.4 Phương pháp thu nhận lectin 17

1.4.1 Các kỹ thuật chiết lectin 17

1.4.2 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính 17

1.4.3 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ 18

1.4.4 Thẩm tách 18

1.4.5 Các kỹ thuật tinh sạch bằng sắc ký 18

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.2 Vât liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu 22

2.3.2 Phương pháp định danh mẫu bọt biển 22

2.3.3 Quy trình nghiên cứu tổng quát lectin từ bọt biển 23

2.3.4 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp Ngưng kết hồng cầu 24

2.3.5 Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Lowry 25

2.3.6 Phương pháp khảo sát các yếu tố cho quá trình chiết lectin từ bọt biển 27

2.3.6.1 Khảo sát dung môi chiết 27

2.3.6.2 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 27

2.3.6.3 Khảo sát thời gian chiết 27

2.3.6.4 Khảo sát nhiệt độ chiết 28

2.3.7 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa lectin 28

2.3.8 Tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 28

2.3.9 Tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 29

2.3.10 Kiểm tra mức độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 29

2.3.11 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, EDTA và ion Ca2+ lên hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin 32

2.3.12 Phương pháp khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate của lectin 33

2.3.13 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lectin từ bọt biển 34

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Kết quả đánh giá sự hiện diện của lectin trên một số mẫu bọt biển 37

3.2 Kết quả định danh mẫu bọt biển BB-NT01.1 43

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 43

3.3.1 Ảnh hưởng của dung môi 44

3.3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) 45

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 46

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 47

3.4 Tinh sạch lectin 48

3.4.1 Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4 để kết tủa lectin 48

3.4.2 Kết quả tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion trên nhựa DEAE-Sepharose 50

3.4.3 Kết quả tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký lọc gel trên nhựa Sephacryl S-200 51 3.4.4 Kiểm tra mức độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 52

3.4.5 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ bọt biển Axinyssa sp 54

3.5 Kết quả khảo sát một số đặc tính hóa lý và sinh học của lectin từ bọt biển

Axinyssa sp 58

3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin 58

3.5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoat độ ngưng kết hồng cầu của lectin 59

3.5.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin 61

3.5.4 Đặc tính liên kết carbohydrate 62

3.5.5 Hoạt tính kháng khuẩn của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

Tris buffer saline

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Các loại đường và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết đường

của lectin 33 Bảng 2.3 Các vi khuẩn kiểm định dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn 35 Bảng 3.1 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu động vật của dịch chiết lectin từ 16 mẫu bọt

biển 38 Bảng 3.2 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu người của dịch chiết lectin từ 16 mẫu bọt biển

62

Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của lectin từ bọt biển Axinyssa

sp 65

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu tạo gai xương các lớp bọt biển 4

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của lectin CchG từ bọt biển Cinachyrella sp 10

Hình 2.1 Quy trình tổng quát nghiên cứu lectin từ bọt biển 23

Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 26

Hình 2.3 Đồ thị tương quan giữa LgM và Rf của protein trong thang chuẩn 32

Hình 3.1: Thành phần glycolipid ở các tế bào hồng cầu ABO 42

Hình 3.2 Ảnh hưởng của dung môi đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 44

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của lectin từ bọt biển Axynissa sp 45

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 46

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 47

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối ammonium sunfate (NH4)2SO4 đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 48

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (λ = 280nm) và nồng độ muối của quá trình sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 50

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (λ = 280nm) và hoạt độ ngưng kết hồng cầu của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 51

Hình 3.9 Kết quả chạy điện di SDS-PAGE 52

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ bọt biển Axinyssa sp 56

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 58

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 60

Hình 3.13 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng một spố vi sinh vật kiểm định của lectin từ bọt biển Axinyssa sp 66

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Bọt biển - sinh vật biển được quan tâm hàng đầu trong việc tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính sinh học để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y dược Trong

số các hợp chất mang hoạt tính có lợi từ bọt biển, lectin là một trong nhóm các hợp chất mới đang được quan tâm để phát triển thành các loại thuốc kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng u và điều biến miễn dịch Đề tài được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự hiện diện của lectin trên 16 mẫu bọt biển được thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Vĩnh

Hy (Ninh Thuận) Trong đó, lựa chọn một mẫu chứa lectin có hoạt tính ngưng kết hồng cao, tiến hành nghiên cứu thu nhận lectin (khảo sát các yếu tố thích hợp cho quá trình chiết lectin như dung môi chiết, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi, thời gian chiết và nhiệt độ chiết Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa lectin trong dịch chiết thu được, tinh sạch lectin bằng kĩ thuật sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose và sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 Lectin thu nhận được sau sắc ký được kiểm tra độ tinh sạch bằng kĩ thuật điện di SDS_PAGE Sau đó, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của một

số yếu tố như nhiệt độ, pH, EDTA và ion Ca2+ lên hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin nghiên cứu Một số hoạt tính sinh học của lectin như đặc tính liên kết carbohydrate và hoạt tính kháng khuẩn của lectin cũng sẽ được khảo sát trong nghiên cứu này Kết quả đạt được là cơ sở để định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng lectin

từ mẫu bọt biển được lựa chọn và làm nền tảng cho các nghiên cứu khác về lectin từ bọt biển tại Việt Nam

Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu: bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố thích hợp cho quá trình chiết lectin theo phương pháp cổ điển; xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu của Hori; xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry; xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp của Bauer; tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel; xác định trọng lượng phân

tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE

Kết quả nghiên cứu đã thu thập và đánh giá sự hiện diện lectin trên 16 mẫu bọt biển Từ đó, chọn mẫu BB-NT01.1 – một trong những mẫu bọt biển có chứa lectin có hoạt tính ngưng kết hồng cầu tốt nhất để thu nhận, tinh sạch, đồng thời đánh giá một

số đặc điểm hóa lý và sinh học của lectin Mẫu bọt biển BB-NT01.1 đã được định

danh bởi Ths Thái Minh Quang - Viện Hải Dương Học với kết quả là Axinyssa sp

Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình thu nhận lectin từ loài bọt biển

Axinyssa sp với các yếu tố: dung môi chiết TBS; tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) là

1:4; thời gian chiết 4 giờ và nhiệt độ chiết là 4 °C Lectin đã được tinh sạch qua 3 bước, bao gồm: kết tủa bằng muối ammonium sunfate (NH4)2SO4 ở nồng độ bão hòa 50%; sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose và sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 Kết quả tinh sạch được đánh giá bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và cũng bằng phương

pháp này trọng lượng phân tử của lectin từ bọt biển Axinyssa sp đã được xác định là

khoảng 61 kDa và tồn tại ở dạng monomer Một số đặc tính hóa lý và sinh học của

lectin từ bọt biển Axinyssa sp cũng đã được đánh giá như: nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của lectin từ bọt biển Axinyssa sp là dưới 60 °C; pH thích hợp từ 4 đến 10; hoạt

tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ bọt biển Axinyssa sp không bị ảnh hưởng khi có

mặt ion Ca2+ và EDTA; lectin có khả năng liên kết với 4 loại đường

N-acetylneuraminic acid) và 2 loại glycoprotein (Mucin và Asialo mucin) khảo sát; lectin

từ bọt biển Axinyssa sp chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với một chủng vi khuẩn kiểm định là Vibrio parahaemolyticus

Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu nâng cao hiệu quả tách chiết và thu nhận lectin, nghiên cứu cấu trúc phân tử, hiểu rõ cơ chế của các tính chất cũng như hoạt tính

của lectin từ bọt biển Axinyssa sp Trên cơ sở đó phát triển các nghiên cứu ứng dụng

lectin này trong các lĩnh vực phục vụ đời sống

Từ khóa: Axinyssa sp., bọt biển, đặc tính liên kết carbohydrate, lectin.

MỞ ĐẦU

Đại dương là một nguồn tài nguyên vô cùng quý giá của con người và là nơi sinh sống của hơn 80% các loài sinh vật trên Trái Đất (Fenton et al 2013) Sinh vật biển không chỉ đa dạng về số loài, dồi dào về số lượng, mà chính trong những điều kiện sống khắc nghiệt về nồng độ muối, ánh sáng, áp lực dòng chảy, nhiệt độ… chúng còn sản sinh ra nhiều hợp chất để tồn tại và phát triển, mà phần lớn trong số đó không được tìm thấy ở các sinh vật trên cạn (Carté 1996; Sipkema et al 2005) Các hợp chất hữu cơ ở sinh vật biển như acid béo, polysaccharide, polyether, peptide, protein và enzyme đã được chứng minh có các hoạt tính sinh học đa dạng như hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng viêm, kháng virus, kháng u…(Munro et al 1999; Donia and Hamann 2003; Mayer et al 2009) Do đó, các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đặc biệt là trong lĩnh vực y dược nhằm nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới tiềm năng kháng các vi sinh vật gây bệnh, kháng virus HIV, kháng ung thư và thuốc chữa bệnh Alzhemer…(Sang and Kim 2010; Smith et al 2010)

Trong số các sinh vật biển, thuộc vào nhóm động vật nguyên thủy nhất và có cấu tạo khá đơn giản, nhưng bọt biển lại là đối tượng biển được đặc biệt quan tâm trong các nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Bọt biển được coi là một “mỏ vàng” các hợp chất thiên nhiên, với hơn 4851 hợp chất, chiếm gần 30% tổng

số các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ biển đã được xác định, trong đó có khoảng 1455 hợp chất mới đã được phân lập từ đối tượng này trong giai đoạn 2008 đến 2012 (Mehbub et al 2014) Các kết quả nghiên cứu trên thế giới đã tìm thấy rất nhiều hoạt tính sinh học quý báu như hoạt tính kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng viêm và nhiều hoạt tính sinh học khác của các hợp chất tách chiết từ bọt biển (Mebs et al 1985; Blunt et al 2005; Molinski et al 2009) Trong số các hợp chất từ sinh vật biển nói chung bao gồm cả bọt biển, lectin là một nhóm hợp chất đang được quan tâm để phát triển thành các loại thuốc mới kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng u và điều biến miễn dịch… Các cấu trúc proteoglycan, glycoprotein và glycolipid liên quan đến một số loại tế bào nhất định, cũng như các chức năng sinh lý

và bệnh lý của chúng bao gồm khả năng tương tác với tế bào chủ, mối liên hệ giữa tế bào – tế bào, là điều kiện ban đầu để gây nên nhiều bệnh lý Lectin có thể nhận biết

các dạng carbohydrate khác nhau trong cấu trúc proteoglycan, glycoprotein và glycolipid, kết quả là chúng có thể điều chỉnh các tế bào thông qua sự hình thành glyco liên hợp, do đó ngăn chặn sự tương tác giữa các tác nhân gây bệnh với vật chủ qua liên kết với các oligosaccharide trên bề mặt của tác nhân gây bệnh (Ogawa et al 2011) Lectin từ bọt biển đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu về lectin từ sinh vật biển chủ yếu chỉ mới tập trung ở một số loài rong biển, và chưa có công bố chính thức nào về lectin từ bọt biển Thêm vào đó, theo kết quả nghiên cứu của tác giả Thái Minh Quang cho thấy vùng biển Việt Nam có trên

176 loài bọt biển, trong đó tại vùng biển Nha Trang có khoảng 89 loài thuộc 11 họ (Quang 2013), đây là điều kiện thuận lợi để bước đầu tiến hành các nghiên cứu cơ bản

về lectin từ đối tượng này, làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc, hoạt tính

và từ đó định hướng cho việc ứng dụng lectin từ bọt biển tại Việt Nam

Dựa trên những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Sàng lọc và

nghiên cứu thu nhận lectin từ bọt biển”, nhằm:

 Đánh giá sự hiện diện của lectin trên một số mẫu bọt biển

 Xây dựng quy trình tách chiết thu nhận một lectin có hoạt tính NKHC cao

 Đánh giá một số tính chất hóa lý và sinh học của lectin từ bọt biển thu nhận được

Ý nghĩa của đề tài:

 Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu về lectin

từ động vật biển, bổ sung vào nguồn tư liệu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ bọt biển tại Việt Nam

 Đề tài đã xác định được quy trình thu nhận lectin từ mẫu bọt biển có hoạt tính NKHC cao, làm cơ sở để tiến hành các nghiên cứu về lectin trên các loài bọt biển khác

 Kết quả nghiên cứu đã làm sáng tỏ các tính chất của lectin thu nhận được từ loài

bọt biển Axinyssa sp., góp phần định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng lectin này

vào cuộc sống

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về bọt biển

Bọt biển còn gọi là hải miên hay động vật thân lỗ (Porifera) là một ngành động vật đa bào nguyên thuỷ, thuộc giới phụ Parazoa, ngành Porifera Chúng có cấu trúc tế bào tách biệt và phần lớn là sinh sống ở ven biển

Giống với các loài động vật khác, bọt biển là động vật đa bào, dị dưỡng, không

có thành tế bào và có thể sản xuất tế bào tinh Tuy nhiên, khác với các loài động vật khác, bọt biển không có các mô và cơ quan thật, cơ thể không có tính đối xứng

1.1.1 Sự phân bố của bọt biển

Bọt biển có sự phân bố rộng lớn, được tìm thấy ở các đại dương từ vùng cực đến vùng nhiệt đới Hầu hết bọt biển sống ở vùng nước tĩnh và sạch để tránh việc các trầm tích dưới đáy biển bị khuấy động bởi sóng và bịt kín các lỗ của bọt biển, gây khó khăn cho quá trình lấy thức ăn và hô hấp Phần lớn bọt biển được tìm thấy trên các bề mặt chắc chắn như đá, tuy nhiên một số cũng có thể bám vào các trầm tích mềm nhờ bộ phận tương tự như rễ (Krautter 1998; Weaver et al 2007)

Sự phân bố của các loài bọt biển khác nhau phụ thuộc vào điều kiện môi trường sống Có thể kể ra như lớp Calcarea được tìm thấy ở độ sâu dưới 100 mét so với mực nước biển Hay lớp bọt biển thủy tinh (hải miên sáu tia/ hải miên thủy tinh) sinh sống

ở những vùng biển nước sâu Lớp Demosponges là lớp bọt biển phong phú nhất, phân

bố từ vùng biển, đến vùng nước hơi mặn và có 150 loài thuộc lớp này là bọt biển nước ngọt, được tìm thấy ở những vùng triều đến cả những vực sâu, và các loài bọt biển ăn thịt cũng thuộc lớp này, được tìm thấy ở độ sâu khoảng 8840 mét

1.1.2 Phân loại bọt biển

Theo cách phân loại truyền thống, bọt biển được chia ra làm ba lớp theo cấu tạo

gai xương và gồm: lớp Calcarea, lớp Hexactinellida và lớp Demospongia (Bergquist

1978)

 Lớp Calcarea (Hải miên đá vôi): Ðặc điểm là các gai xương cấu tạo

bằng chất vôi màu trắng đục Gồm hầu hết bọt biển có gai xương bằng canxi carbonate (CaCO3)sống bám trên đá ven bờ biển

 Lớp Hexactinellida (Hải miên sáu tia /Hải miên thủy tinh): Gồm các

bọt biển có gai xương trong suốt như thủy tinh, gai đặc trưng là có dạng sáu tia và được cấu tạo bằng silic dioxit (SiO2)

 Lớp Demospongiae (Hải miên sừng): Gồm các bọt biển có gai xương

cấu tạo bằng SiO2 hoặc sợi collagen protein (spongin) hoặc cả hai loại Một vài loài không có gai xương Lớp này chiếm 80% số lượng loài bọt biển và khoảng 50 loài tìm thấy ở nước ngọt

Hình 1.1 Cấu tạo gai xương các lớp bọt biển

(http://chucksaddiction.thefishestate.net/sponges.html )

Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu ở cấp độ phân tử sau đó của Borchiellini và cộng

sự đã chỉ ra sự hình thành của lớp Homoscleromorpha (thuộc lớp Demospongiae theo kết quả phân loại trước đó) bắt nguồn từ một nhánh hoàn toàn độc lập với lớp Demospongiae, do đó đã tách Homoscleromorpha thành một lớp riêng Như vậy hiện

nay có thể chia bọt biển ra làm bốn lớp: lớp Calcarea, lớp Hexactinellida, lớp

Demospongiae và lớp Homoscleromorpha (Borchiellini et al 2012)

1.2 Tổng quan về lectin

1.2.1 Định nghĩa

Thuật ngữ “Lectin” (Lectin bắt nguồn từ chữ “Lectus”, dạng quá khứ của động từ

“Legre”, trong tiếng Latin có nghĩa là “lựa chọn”) - được Boyr và Shapleigh bắt đầu sử dụng vào năm 1954 để chỉ nhóm các chất từ thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu nhóm máu, đây có thể được coi là khái niệm đầu tiên về lectin (Boyd et al 1966)

Sau đó, có thêm nhiều định nghĩa khác về lectin Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đã đưa ra định nghĩa “Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” Khái niệm này đồng nhất với định nghĩa về lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm 1982: “Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” Năm 1995, Peuman

và Van Dame đã đưa ra một khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến tính chất của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường”(Goldstein et al 1980; Peumans and VanDamme 1995)

Và một trong những định nghĩa khá đầy đủ về lectin như sau: “Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau” (Lezica 2014)

1.2.2 Sự phân bố lectin trong sinh giới

Lectin được phát hiện ở gần như tất cả các sinh vật ở mọi cấp bậc phân loại

từ virus đến vi khuẩn, thực vật và động vật

Ở thực vật: Lectin có sự phân bố khá rộng ở các loài thực vật từ bậc thấp đến

bậc cao, từ trên cạn xuống dưới nước Hơn 1000 loài được phát hiện có sự có mặt của lectin, tuy nhiên mới chỉ biết rõ 4-5% lectin ở những họ thực vật có hoa Đa số các lectin được nghiên cứu chi tiết nhất đều thuộc họ đậu, chiếm 60% các lectin được nhiều người biết đến Lectin được phát hiện ở hầu hết các mô thực vật, nhưng sự phân

bố của chúng trong các mô thay đổi theo các họ đã được nghiên cứu Chúng có nhiều ở hạt (họ đậu, họ đại kích, hòa thảo), quả và củ (họ cà, họ hành), rễ (họ bầu bí, họ đậu),

ở chồi và lá (họ xương rồng và họ lan) (Balzarini et al 1991) Không chỉ ở thực vật bậc cao, lectin còn được tìm thấy ở nhiều loài thực vật bậc thấp như ở một số loài nấm, địa y và rong Vẫn còn nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu, tuy nhiên, những dẫn chứng khoa học được công bố đã cho thấy được sự phân bố khá rộng của lectin ở các loài thực vật (Đặng Thị Thu 2009)

Ở động vật: lectin cũng đã được nghiên cứu ở một số đối tượng và chúng được

phát hiện ở hầu hết các sinh vật có xương sống lẫn không xương sống Lectin ở sinh vật không xương sống có chủ yếu ở dịch hoặc dịch tiết, như huyết thanh cá, nọc rắn, tinh dịch, huyết tương Lectin ở động vật có xương sống tồn tại ở dạng tự do hoặc protein cấu trúc màng ở dịch phôi, các cơ quan và mô ở cơ thể trưởng thành (Teixeira

et al 2007)

Ở vi sinh vật: Lectin có nguồn gốc từ vi sinh vật được Alfred Gottschalk phát

hiện lần đầu tiên trên virus cúm vào đầu những năm 1950 và được Don Wiley cùng cộng sự kết tinh cũng như xác định cấu trúc vào năm 1981 Sau đó, một lượng lớn các hemagglutinin từ virus đã được phát hiện và kết tinh Sự có mặt hemagglutinin trên virus cúm đã mở ra một cái nhìn mới về sự hiện diện của hợp chất này trên vi khuẩn

và động vật nguyên sinh (Varki et al 2009) Trên đối tượng vi khuẩn, các nghiên cứu

về lectin bắt đầu vào những năm 1950 bởi nhóm nghiên cứu của Duguid ở Anh và Brinton ở Mỹ Theo đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu được thể hiện ở nhiều loài vi

khuẩn, phần lớn thuộc họ Enterobacteriacae Lectin ở vi khuẩn liên quan đến các

fimbrae (hay còn gọi là pili) trên bề mặt tế bào vi khuẩn Lectin giữ vai trò quan trọng

trong cơ chế bám dính của vi khuẩn vào tế bào chủ - tạo điều kiện tiên quyết cho quá trình gây bệnh của vi khuẩn (Sharon 1987)

1.2.3 Vai trò sinh học của lectin

Ở động vật: lectin phục vụ nhiều chức năng sinh học quan trọng như quyết định

độ bám dính của tế bào; tham gia vào quá trình tổng hợp glycoprotein; điều chỉnh lượng protein trong máu Lectin có thể liên kết được với các glycoprotein nội và ngoại bào Một số lectin liên kết đặc hiệu với đường galactose cũng được tìm thấy trên bề mặt tế bào gan của động vật có vú Những lectin này đóng vai trò như những thụ thể

bề mặt tế bào và có khả năng loại bỏ một số glycoprotein nhất định trong hệ tuần hoàn Thêm vào đó, lectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch của động vật

Ở thực vật có hai giả thuyết về vai trò của lectin Một giả thuyết cho rằng giúp thực vật chống lại vi khuẩn gây bệnh và các sinh vật gây hại Giả thuyết này được đưa

ra dựa trên quan sát ở Rehovot cho thấy lectin ức chế quá trình tạo bào tử nấm Ngoài

ra, một quan sát của Lierner về sự chết của ấu trùng bọ cánh cứng khi ăn thức ăn có lectin đậu đen cũng góp phần làm rõ thêm cho giả thuyết này (Janzen et al 1976) Giả thuyết thứ hai là sự kết hợp đặc hiệu của một giống đậu nào đó với một số vi khuẩn cố

định đạm nhất định Thành phần đường của các polysaccharide hoặc lipopolysaccharide trên màng tế bào các loài vi khuẩn là khác nhau, và khả năng liên kết của lectin của các họ đậu khác nhau với các gốc đường này cũng có sự khác biệt (Sharon and Lis 2004)

Lectin cũng đóng vai trò quan trọng đối với quá trình gắn virus vào tế bào vật chủ, mở đầu cho quá trình tấn công tế bào vật chủ của virus

1.2.4 Một số ứng dụng của lectin

Lectin chủ yếu được ứng dụng trong một số lĩnh vực sau:

 Phát hiện, cô lập và nghiên cứu cấu trúc của glycoprotein

 Nghiên cứu carbohydrate trên bề mặt tế bào và các bào quan, hóa mô học và hóa tế bào học

 Kích thích phân bào đối với bạch cầu (trong nghiên cứu lâm sàng)

 Nghiên cứu sự sinh tổng hợp glycoprotein…

Lectin kit đã được thương mại hóa để phục vụ cho mục đích nghiên cứu Một ví

dụ của nó là Lectin-Narcisssus-Pseudonarcissus Apoptosis-Necrosis-Detection Kit của công ty Biocat, Đức Trong đời sống, sự hiểu biết về lectin và sự tương tác đặc hiệu của nó với các gốc đường có thể giúp tránh những trường hợp ngộ độc thức ăn đáng tiếc ở một số người dị ứng với lectin Ở động vật, lectin cũng có thể gây ra ngộ độc thức ăn thông qua thực vật mà chúng tiêu thụ

1.3 Tổng quan lectin từ bọt biển

Ở động vật, các nghiên cứu về lectin chỉ mới được tiến hành ở một số ngành Số lượng các lectin phân lập được từ các loài động vật không xương sống là tương đối nhỏ so với từ thực vật và chủ yếu được tìm thấy ở các loài nhuyễn thể và động vật giáp xác Sự hiện diện của lectin trong bọt biển được nhóm nghiên cứu của Dodd công bố lần đầu tiên vào năm 1986, đây có thể được coi là một trong những nghiên cứu sớm nhất về lectin từ bọt biển (Dodd et al 1968)

1.3.1 Các dạng lectin ở bọt biển

Kết quả nghiên cứu của Gardères đã chỉ ra ở bọt biển gồm các dạng lectin: lectin dạng S (galectin); lectin dạng C; tachylectin và lectin dạng F (fucolectin) (Gardères et

al 2015)

 Lectin dạng S (Galectin): đây là loại lectin ít được tìm thấy ở động vật

Galectin có khả năng liên kết đặc hiệu với đường β-galactoside và hoạt tính không phụ thuộc vào ion Ca2+ Dựa vào cách xây dựng cấu trúc, galectin được chia ra 3 họ nhỏ là proto- (vùng liên kết đường ở dạng monomer hoặc homodimer), chimera- (vùng liên kết đường và một chuỗi không có khả năng liên kết đường ở đầu N nằm trên cùng một chuỗi) và tandem-repeated (hai vùng liên kết đường riêng biệt nằm cùng trên một chuỗi) Galectin có khả năng tạo thành các phân tử lớn phức tạp khi có mặt của ion

Ca2+ nhưng ion Ca2+ không quyết định khả năng liên kết giữa galectin và đường Galectin có ái lực cao với các đường có chứa gốc N-acetyl-galactosamine Galectins được cho là tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý khác nhau như sự phát triển, hình thái học, miễn dịch (Cummings and Liu 2009)

 Lectin dạng C: đây là loại lectin phổ biến nhất, có mặt ở cả thực vật,

động vật và vi khuẩn Hoạt tính của lectin dạng C phụ thuộc Ca2+, hay nói cách khác, hoạt tính của lectin dạng C chỉ được thể hiện khi có sự hiện diện của ion Ca2+ trong môi trường Khi có mặt Ca2+, lectin dạng C thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như sự bám dính, nhập nội bào (endocytocyte) và trung hòa mầm bệnh (pathogen neutralization) Lectin dạng C được chia thành 17 nhóm phụ (subgroup) Các họ lớn của lectin dạng C gồm collectin, selectin, thụ thể ngoại bào, và proteoglycan

 Tachylectin-like: tachylectin là lectin được phát hiện trong hồng cầu

một loài sam biển Nhật Bản, gồm 5 loại từ tachylectin-1 đến tachylectin-5 Ở bọt biển, lectin thuộc họ này là các protein có sự tương đồng cao với tachylectin-1 Tachylectin

1 có khả năng tác động lên vi khuẩn gram âm thông qua 2-keto-3-deoxyoctonate trên lớp LPS của vi khuẩn Tachylectin 1 cũng có thể gắn với các polysaccharide như agarose hay dextran với tính đặc hiệu tương đối cao Họ lectin này có khả năng liên kết với N-acetylglucosamine và N-acetylgalactosamine và liên quan đến miễn dịch tự nhiên (Saito et al 1995; Beisel et al 1999; Kawabata and Iwanaga 1999b)

 Lectin dạng F (fucolectin): gồm các protein liên kết đặc hiệu với

fucose Lectin dạng F được tìm thấy ở nhiều sinh vật từ vi khuẩn đến động vật có xương sống, không hiện diện ở thực vật, nấm, động vật có vú và bò sát Sự liên kết giữa lectin dạng F và các gốc đường không đòi hỏi sự có mặt của ion Ca2+ trong môi trường, nhưng ion Ca2+ giúp cấu trúc của lectin dạng này bền hơn (Ogawa et al 2011)

1.3.2 Một số đặc điểm của lectin từ bọt biển

Một protein là một lectin khi nó có các đặc điểm sau: có ít nhất một vùng nhận diện đường (CRD – carbohydrate recognizing domain), không có nguồn gốc miễn dịch

và không có hoạt tính xúc tác Nhiều lectin từ bọt biển có bản chất là glycoprotein với

tỉ lệ đường trong thành phần cấu tạo chiếm từ 0,5 đến 27,6% (Gadelha et al 2014)

1.3.2.1 Trọng lượng phân tử

Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định trọng lượng phân tử protein như phương pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis), phương pháp phổ khối ion hóa phun điện tử MS-ESI (electron spray ionization-mass spectrometry)… Trong đó, phương pháp điện di SDS-PAGE được sử dụng khá phổ biến để xác định trọng lượng phân tử trong các nghiên cứu về lectin từ bọt biển Bằng điện di SDS-PAGE, Moura và cộng sự (2006) đã xác định được trọng

lượng phân tử của lectin CvL thu nhận từ loài bọt biển Cliona varians là 114 kDa và

gồm 4 monomer giống nhau (Moura et al 2006) Hay cũng bằng phương pháp tương

tự, Fenton và cộng sự cũng đã xác định được trọng lượng phân tử của 2 loại lectin thu

nhận được từ loài bọt biển Spheciospongia vesparia lần lượt là 13300 và 13900 Da

So với trọng lượng phân tử của lectin từ một số loài sinh vật biển khác, như

lectin từ rong biển (trọng lượng phân tử bé nhất là lectin của Hypnea japonica thuộc

dòng rong Đỏ, khoảng 4,2 kDa và trọng lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc dòng rong

Đỏ, Ptilota plumose, gồm một chuỗi polypeptide khoảng 170 kDa (Rogers and Fish

1991; Han et al 2011), thì trọng lượng phân tử của lectin từ bọt biển cao hơn Tuy nhiên, trọng lượng phân tử lectin của bọt biển lại thấp hơn so với lectin từ một số loài

động vật biển khác như lectin từ sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus) có trọng

lượng phân tử lên đến trên 700 kDa

1.3.2.2 Trình tự và cấu trúc

Kết quả nghiên cứu về lectin từ các loài bọt biển khác nhau cho thấy thành phần các amino acid trong cấu tạo các phân tử lectin từ bọt biển là như nhau, gồm các loại amino acid Lys, His, Arg, Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Cys, Val, Ile, leu, Tyr, Phe, Try, Met Tuy nhiên, tỉ lệ các loại amino acid sẽ có sự khác nhau ở các lectin Ví

dụ như ở lectin H-2 từ loài bọt biểnHaliclona caerulea, các amino acid chiếm tỉ lệ cao

gồm Ser, Gly, Val và Tyr ; lectin từ loài bọt biển Craniella australiensis, các amino

acid chiếm tỉ lệ cao là Thr, Glx, Asx, Pro, hay amino acid Gly, Leu và Ala trong phân

tử lectin từ bọt biển Pellina semitubulosa (Engel et al 1992; Xiong et al 2006;

Sampaio et al 2013)

Trình tự sắp xếp các amino acid (cấu trúc bậc 1) của nhiều lectin ở bọt biển đã

được xác định như lectin H-2 ở loài Haliclona caerulea, CchG ở Cinachyrella sp., hay lectin thu nhận từ loài Aphrocallister vastus… Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu mô tả về

đặc điểm cấu trúc của lectin từ bọt biển CchG-1, một galectin từ bọt biển thuộc chi

Cinachyrella, là lectin đầu tiên từ bọt biển được xác định cấu trúc bậc 3 bằng phương

pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction)

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của lectin CchG từ bọt biển Cinachyrella sp

[ http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=4AGG ]

Cấu tạo của lectin từ bọt biển rất đa dạng, có thể do một hoặc nhiều mạch polypeptide tạo thành Mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn

vị có thể có trọng lượng phân tử bằng hoặc khác nhau Ví dụ như lectin H-1 từ bọt

biển Haliclona caerulea có cấu tạo dạng monomer với trọng lượng phân tử là 15kDa, trong khi đó lectin từ loài bọt biển Cinachyrella apion lại có cấu tạo dạng octamer, và

trọng lượng phân tử các đơn phân đều bằng nhau và bằng 15,5 kDa Trong cùng một loài bọt biển có thể có nhiều hơn một loại lectin, và cấu tạo của các lectin này có thể

giống nhau (2 lectin CchG-1 và CchG-2 từ loài bọt biển Cinachyrella sp đều có cấu tạo tetramer) hoặc khác nhau (lectin H-1 từ bọt biển Haliclona caerulea có cấu tạo

monomer, trong khi đó lectin H-2 từ bọt biển này có cấu tạo dimer) (Gardères et al 2015)

Bất kì một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc 1 hoặc cấu trúc không gian phức tạp đều chứa ít nhất một trung tâm hoạt động, đó là vùng nhận diện đường (CRD – carbohydrate recognition domain), và đây cũng là vùng quan trọng nhất, quyết định các hoạt tính sinh học của lectin Một lectin có thể có một hoặc nhiều vùng liên kết đường Thành phần các amino acid cấu tạo nên vùng liên kết đường ở các nhóm lectin khác nhau cũng khác nhau Tuy nhiên, ở mỗi nhóm lectin sẽ có một số lượng các amino acid có độ bảo tồn cao và chính các amino acid này tạo nên các trung tâm liên kết đường của nhóm lectin đó Ví dụ như các lectin dạng C sẽ có 115 đến 130 amino acid được bảo tồn, và số lượng này là 130 amino acid ở các lectin dạng S (galectin)… (Ogawa et al 2011)

Trong nghiên cứu của mình, Gundacker đã tổng hợp kết quả nghiên cứu của các nhóm Weis et al 1991, Hansen and Holmskov 1998, Drickamer et al 1986 và Holmskow 1998 khi nghiên cứu về khả năng liên kết đường của một lectin dạng C bằng phương pháp phân tích cấu trúc tinh thể và gây đột biến cho thấy: nếu ở vị trí

aa185 là Glu và aa187 là Asn thì lectin này ưu tiên liên kết với mannose hoặc glucose, nếu ngược lại thì lectin này liên kết đặc hiệu với galactose Cũng từ một lectin dạng C

thu nhận từ loài bọt biển Aprocallister vatus được đánh giá khả năng liên kết đường

dựa trên 2 amino acid là aa153 và aa155, kết quả xác định trình tự cho thấy aa153 là Gln

và aa155 là Asp, vì vậy lectin được dự đoán liên kết đặc hiệu với galactose Kết quả thực nghiệm đã chứng minh hoạt tính NKHC của lectin này bị ức chế bởi đường galacotse mà không bị ngưng kết bởi đường mannose Như vậy, khả năng ưu tiên liên kết hay đặc hiệu liên kết của lectin với một loại đường cũng có thể bị ảnh hưởng vào thành phần và vị trí của một loại amino acid nào đó Cho đến nay, các vấn đề liên quan đến trung tâm liên kết đường của lectin vẫn còn rất phức tạp (Gundacker et al 2001)

1.3.2.3 Tương tác giữa lectin với các loại đường

Cơ chế của sự tương tác giữa đường và lectin rất phức tạp và có ý nghĩa cực kì quan trọng trong các nghiên cứu về lectin Một trong những phương pháp xác định sự tương tác giữa đường và lectin vẫn đang được sử dụng hiện nay là xác định hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin khi có mặt một loại đường nào đó Trường hợp hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn chứng tỏ lectin đã liên kết với đường khảo sát và mất hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu Ngược lại, hoạt độ lectin vẫn ổn định chứng tỏ đường không ức chế lectin (Hori et al 1990) Tính đặc hiệu liên kết giữa lectin với một loại đường nào đó là một trong những cơ sở để phân loại lectin, cũng như định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng lectin đó

Lectin từ bọt biển có khả năng liên kết với nhiều loại đường khác nhau bao gồm các loại đường đơn (Galactose, Glucose, Glucoronic acid…), đường đôi (Maltose, Sucrose, Lactose…), và một số glycoprotein (fetuin, procine stomach mucin, asialo procine stomach mucin…) Theo các công bố trên thế giới, trong số các loại đường, lectin từ bọt biển luôn nhận diện được galactose và chỉ một lectin nhận diện được GalNAc nhưng không nhận diện galactose là lectin HoL-I từ loài bọt biển

Halichondria okadai (Kawagishi et al 1994; Rômulo Farias Carneiro et al 2013;

Ueda et al 2013)

1.3.2.4 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và người Và phản ứng gây ngưng kết hồng cầu cũng là phương pháp đặc hiệu để nhận biết sự hiện diện của lectin Các lectin khác nhau sẽ có khả năng gây ngưng kết các tế bào hồng cầu động vật và người khác nhau Theo Sharon, lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi (Sharon and Lis 2003)

1.3.2.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt độ của lectin

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt độ của chúng Hoạt tính NKHC của lectin từ bọt biển nhìn chung được duy trì ở

nhiệt độ trong khoảng 60 °C trở xuống Tuy nhiên, nhiều lectin từ bọt biển cũng đã được chứng minh có khả năng duy trì được hoạt tính NKHC ở nhiệt độ tương đối cao

từ 70 °C trở lên và thậm chí lên đến 100 °C, như lectin CchG1 và CchG2 từ loài bọt

biển Cinachyrella sp chỉ bị mất hoàn toàn hoạt tính ở 100 °C (Moura et al 2006;

Vozári-Hampe et al 2008; Rômulo Farias Carneiro et al 2013; Gadelha et al 2014)

Khả năng chịu nhiệt của lectin từ bọt biển được cho là do trong cấu trúc phân tử

có chứa các liên kết disulfide giúp cho cấu trúc protein bền chặt và duy trì được hoạt tính ở nhiệt độ cao (Sampaio et al 2013; Gadelha et al 2014)

thấp như lectin AcL II thu nhận từ loài bọt biển Axinella corrugata có khoảng pH hoạt

động thích hợp từ 2 đến 6, hay những lectin có khả năng giữ được hoạt tính NKHC ở

pH rất cao như lectin HcL từ loài bọt biển Haliclona cratera có pH hoạt động thích

hợp lên đến 10,2 (Gardères et al 2015)

Ảnh hưởng của một số nhân tố khác

Ảnh hưởng của enzyme: các enzyme như trypsine, papain có khả năng làm tăng hoạt độ lectin, do khi hồng cầu được xử lý bằng enzyme, chính enzyme đã thủy phân giới hạn một số glycoprotein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm đường của nó, vì vậy lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, đồng thời dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên

Ảnh hưởng của các ion kim loại: khác với lectin từ một số loài thực vật và rong biển, nhiều loại lectin từ bọt biển chỉ thể hiện được hoạt tính ngưng kết hồng cầu khi

có mặt của các ion kim loại hóa trị 2 đặc biệt là Ca2+ , điển hình là các lectin dạng C

1.3.3 Một số hoạt tính sinh học của lectin từ bọt biển

1.3.3.1 Tác động đến sự phân chia tế bào

Một trong những hoạt tính sinh học nổi trội nhất được gây ra bởi lectin là kích

thích quá trình nguyên phân Lectin từ bọt biển, như lectin từ loài Axinella corrugata

(ACL-1), Craniella australiensis, Pallina semitubulosa và Cinachyrella alloclada có

thể kích thích quá trình nguyên phân ở các tế bào đơn nhân, tế bào lách, tế bào lympho

ở chuột và tế bào lympho người (Gadelha et al 2014)

1.3.3.2 Gắn kết với tế bào

Đặc tính này của lectin có thể được sử dụng trong việc chẩn đoán phát hiện sớm

sự xuất hiện của các tế bào ung thư Như phức lectin ACL-1 và biotin có khả năng phát hiện các dòng tế bào T-47D, MCF-47 (tế bào ung thư vú), HT-29 (tế bào ung thư ruột kết (đại tràng)), H460 (tế bào ung thư phổi), OVCAR-3 (tế bào ung thư buồng trứng) và tế bào ung thư bàng quang T-24 nhờ khả năng liên kết với các đường GalNAc và GlcNAc trên bề mặt các dòng tế bào ung thư này (Vozári-Hampe et al 2008; Gadelha et al 2014)

Halichondria crater là một ví dụ về khả năng gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào u

ác tính là FemX và HeLa (Pajic et al 2002) Lectin từ loài Cliona varians(CvL) và lectin từ loài Cinachyrella apion (CaL) cũng có đặc tính tương tự (Queiroz et al 2009;

Rabelo et al 2012)

1.3.3.4 Sản sinh cytokine

Các lectin từ thực vật đã được chứng minh có khả năng kháng viêm, tuy nhiên, đặc tính này vẫn chưa được tìm thấy ở lectin từ bọt biển Thay vào đó, một số lectin từ bọt biển đã được chứng minh có khả năng tham gia vào quá trình tiền kháng viêm (pro-inflammatory) Ví dụ như lectin CvL có thể gây ra di căn bạch cầu trong trường hợp cấp tính và mãn tính, tuy nhiên quá trình này sẽ bị gián đoạn khi có mặt của galactose, fructose và sucrose (Gadelha et al 2014) Hay lectin ACL-1 có thể kích thích sự di chuyển của neutrophil, tuy nhiên khi có mặt GlcNAc thì cơ chế này bị ức chế Khả năng kích thích quá trình sản sinh ra interleukins 1 và 2 (IL-1 và IL-2) của

lectin từ bọt biển Pellina semitubulosa cũng đã được công bố, và những interleukins

này có liên quan đến sự viêm (Engel et al 1992; Vozári-Hampe et al 2008)

1.3.3.5 Kháng vi sinh vật

Tương tác protein – đường là cơ chế của hoạt tính kháng vi sinh vật của lectin Các gốc đường trên bề mặt các vi sinh vật chính là điểm nhận diện của các lectin Và nhờ khả năng nhận biết và liên kết với các loại đường khác nhau nên lectin từ bọt biển

có khả năng ức chế các nhóm vi khuẩn khác nhau Như lectin CvL từ loài bọt biển

Cliona varians có khả năng ức chế mạnh nhóm vi khuẩn Gram dương mà không tác

động lên nhóm vi khuẩn Gram âm Trong khi đó, lectin từ loài Suberites domuncula

lại ức chế sự phát triển của các vi khuẩn nhóm Gram âm (Wiens et al 2005; Moura et

al 2006; Gardères et al 2015)

Về khả năng kháng virus, đặc biệt là virus HIV của lectin từ các sinh vật biển đã

được nhiều nghiên cứu quan tâm như lectin thu nhận từ rong đỏ Griffithsia sp., hay từ sâu biển Chaetopterus variopedatus (CVL)… (Moura et al 2006; Bun et al 2015)

Tuy nhiên, hoạt tính này của lectin từ bọt biển thì chỉ có một số ít nghiên cứu đề cập

đến Như lectin từ loài bọt biển C.nucula đã được chứng minh có khả năng làm chậm

sự phát triển của virus HIV-I nhờ khả năng tăng sự biểu hiện của enzyme (2’-5’) oligoadenylate synthase trong tế bào người bị nhiễm virus (Schröder et al 1990; Gardères et al 2015)

Khả năng kháng nấm của một số loại lectin từ bọt biển cũng đã được nghiên cứu Lectin II được coi là có liên quan đến chức năng phòng vệ chống lại các loài nấm kí

sinh của loài bọt biển A.corrugata, do lectin này có khả năng gắn một cách đặc hiệu

với chitin (được tạo thành từ các gốc N-acetyl-glucosamine), là polymer hiện diện nhiều trên thành tế bào của các loài nấm

Kháng các vi sinh vật gây bệnh và tham gia vào cơ chế phòng vệ của cơ thể vật chủ là một trong những hoạt tính sinh học có lợi của lectin từ bọt biển Tương tác protein - đường không chỉ giữ vai trò trung gian trong các phản ứng phòng vệ của các động vật không xương sống biển đối với các vi sinh vật gây bệnh, mà còn đóng vai trò trung gian cho sự bám dính của các sinh vật gây bệnh vào các cơ quan trong cơ thể vật chủ (Kim 2016)

1.3.4 Ứng dụng sinh học của lectin từ bọt biển

Lectin liên kết với các đường nhờ có vùng nhận diện đường (CRD – carbohydrate recognition domain) và không cần bất cứ tác nhân xúc tác nào Vai trò

của tương tác lectin – đường trong các nghiên cứu sinh học đường (glycobiology) đã được phát triển, và một loạt các hoạt tính sinh học của lectin cũng đã được giải thích dựa trên tương tác này (Gadelha et al 2014; Kim 2016)

Lectin rất phổ biến trong tự nhiên và các tính chất cũng như hoạt tính sinh học của các loại lectin cũng đã được làm rõ ở nhiều nghiên cứu Tuy nhiên, chỉ một số ít tài liệu nói về tương tác lectin – đường ở động vật thân mềm biển Nhiều lectin trong

đó giữ vai trò như một phân tử bảo vệ chống lại những kẻ săn mồi hay các sinh vật gây bệnh, và nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng khác (Gadelha et al 2014; Kim 2016)

1.3.5 Tình hình nghiên cứu lectin từ bọt biển

Trên thế giới

Các lectin được nghiên cứu nhiều nhất cho đến nay là các lectin thuộc họ Đậu

(Leguminosae) Trong khi đó, ở động vật, số lượng các nghiên cứu về sự hiện diện và

phân bố của lectin chỉ được tiến hành trên một số ngành Và cụ thể ở ngành động vật không xương sống, số lượng các lectin được phân lập là rất ít so với tổng số lượng các lectin đã được phân lập Ở bọt biển, những mô tả đầu tiên về lectin nằm trong nghiên cứu của Dodd và cộng sự năm 1968 Lectin đã được phát hiện ở hai loài bọt biển

Cliona celata và Axinella sp khi thực hiện thử nghiệm phản ứng ngưng kết hồng cầu

ngỗng Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của hai loại lectin này có sự khác nhau khi thử nghiệm trên hồng cầu của một số loài động vật, tuy nhiên, lại không có sự khác biệt khi thử nghiệm trên hệ máu người A, B, O Sự khác biệt về ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, pH lên hoạt tính ngưng kết hồng cầu cũng đã được xác định đối với từng loại lectin này (Dodd et al 1968)

Sau nghiên cứu của Dodd, các nghiên cứu khác về sự hiện diện cũng như hoạt tính của lectin từ bọt biển đã được tiến hành ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp thế giới Trong đó, có thể kể đến nghiên cứu của Mebs và cộng sự đã công bố sự hiện diện của lectin ở hơn 20 loài (chiếm 42%) trong số 48 loài bọt biển được thu nhận tại biển

Đỏ, rạn san hô của Australia và Florida (Mebs et al 1985) Hay trong nghiên cứu của mình, Miarons cũng đã công bố sự hiện diện của lectin trong số 10/22 loài thuộc 12 họ bọt biển vùng nhiệt đới (Miarons and Fresno 2000)

Các nghiên cứu về lectin từ bọt biển trên thế giới không chỉ dừng lại ở bước sàng lọc, mà đã đi sâu vào nghiên cứu về tính chất và xác định cấu trúc của nhiều loại

lectin, như việc xác định trình tự amino acid của các lectin như H-2 từ bọt biển

H.caerulea, lectin CchG-1 và CchG-2 từ bọt biển Cinachyrella sp hay xây dựng được

cấu trúc bậc 3 của lectin CchG-1 (Ueda et al 2013; Sampaio et al 2013; Gadelha et al 2014) Cùng với đó, một loạt các hoạt tính sinh học như kháng vi sinh vật, kháng u, kháng viêm, tác động đến sự phân chia tế bào… của nhiều loại lectin từ bọt biển cũng

đã được chứng minh

Tại Việt Nam

Các nghiên cứu về lectin tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào các lectin có nguồn gốc từ thực vật mà phần lớn là từ rong biển của Lê Đình Hùng tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang (2009 và 2012) (Hung et al 2009; Hung et al 2012), hay các nghiên cứu về lectin trên một số cây họ đậu của Nguyễn Quốc Khang (Nguyễn Quốc Khang 1983; Nguyễn Quốc Khang 1985), lectin từ hạt đậu đỏ tây của Phan Thị Việt Hà (Phan Thị Việt Hà 2011) Đối với động vật thân mềm biển thì số lượng các nghiên cứu về lectin còn hạn chế, và chỉ có một số ít kết quả được công bố như nghiên

cứu của tác giả Nguyễn Quốc Khang về lectin từ sam biển Tachypleus tridentatus, hay

gần đây nhất là kết quả sàng lọc sự hiện diện của lectin ở 22 loài động vật hai mảnh vỏ được thu nhận tại vùng biển Nha Trang (Nguyễn Quốc Khang và Brossmer 1997; Trần Thị Ngọc Kiều 2016) Còn ở bọt biển thì hoàn toàn chưa có nghiên cứu hay công bố chính thức nào về lectin từ đối tượng này tại Việt Nam

1.4 Phương pháp thu nhận lectin

1.4.1 Các kỹ thuật chiết lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể được thực hiện bằng cách dùng các dung môi cơ bản trong nghiên cứu protein như dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết khác nhau như nước cất, dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%; dung dịch đệm phosphate; đệm Tris-HCl…

1.4.2 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị 1, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2O4, Na2SO4… Các protein khác nhau được kết tủa

ở những nồng độ bão hòa khác nhau của các muối trung tính Người ta sử dụng kỹ thuật này trong các quy trình nghiên cứu protein với mục đích cô đặc dung dịch protein cần thu nhận

1.4.3 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Một số dung môi hữu cơ dễ tan trong nước như axetone, polyethylene glycol hay ethanol sẽ làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể bị kết tủa nhanh chóng Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là rất dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp (0 – 4 ºC)

1.4.5 Các kỹ thuật tinh sạch bằng sắc ký

Sắc ký lọc gel

Hệ thống sắc ký lọc gel gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng lưới (rây) & lỗ rây Kích thước của các lỗ rây này là khác nhau tùy theo loại gel sử dụng, còn pha chuyển động là đệm hay một loại dung môi thích hợp Các chất khi đi qua hệ thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc: các phân tử có kích thước to hơn lỗ rỗng (lỗ rây) không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng sẽ đi len qua phần kẻ hở giữa các hạt gel và nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột Các phân

tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần hoặc bán phần lọt vào lỗ rỗng, cuối cùng theo dòng chảy đi ra khỏi cột

Các gel hay dùng trong sắc ký lọc gel là các dẫn xuất dextran (sephadex), agarose (sepharose, superose) hay polyacrylamide (bio-gel) hay dạng kết hợp giữa dextran và polyacrylamide (sephacryl, bio-gel)

Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Lợi dụng tính chất này người

ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh sạch lectin Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi cation Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh sạch lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu: 16 mẫu bọt biển - thuộc bộ sưu tập mẫu bọt biển của

Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

 Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang,

Khánh Hòa

 Thời gian nghiên cứu: hai năm 2016-2017

2.2 Vât liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

 Vật liệu nghiên cứu

16 mẫu bọt biển được thu tại một số địa điểm thuộc biển Nha Trang (Khánh Hòa)

và Vĩnh Hy (Ninh Thuận)

Hồng cầu động vật do viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp Hồng cầu các nhóm máu A, B, O do Trung tâm Huyết học và truyền máu tỉnh Khánh Hòa cung cấp

Các chủng vi sinh vật kiểm định thuộc bộ sưu tập vi sinh vật của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang và Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III được sử dụng trong nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của lectin

 Hóa chất

 Các loại đường và glycoprotein: Glucose, Mannose, D-Galactose, Xylose, Nitrophenyl-galactopyranoside, Nitrophenyl-glucopyranoside, Nitrophenyl-manopyranoside, NANA (N-acetylneuraminic acid hay Sialic acid), transferrin, fetuin, thymoglobulin, procine stomach mucin; Yeast mannan… (Merck-Đức)

 Nhựa sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala – Thụy Điển)

 Nhựa sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala – Thụy Điển)

 Enzyme trypsine, papain (Sigma – Mỹ)

 Thuốc thử Folin (Merck – Đức)

 BSA (Bovine serume albumin) (Đức)

 Hóa chất phân tích các loại: NaCl, CuSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, (NH4)2SO4, NaOH, Na2CO3…

 Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

7 Thiết bị thu phân đoạn tự

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

16 mẫu bọt biển sử dụng trong nghiên cứu được thu tại các địa điểm khác nhau ở vịnh Nha Trang (Khánh Hòa) và Vĩnh Hy (Ninh Thuận) Các mẫu bọt biển được thu vào tháng 04/2016 cùng với sự tham gia của các chuyên gia Hàn Quốc về sinh vật biển trong phạm vi đề tài hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang (NITRA) với Viện Khoa học và Công nghệ Hải Dương Hàn Quốc (KIOST)

và sự hỗ trợ của các cán bộ nghiên cứu Viện Hải Dương Học Mẫu sau khi thu được cho vào các túi nylon có khóa kéo, kí hiệu mẫu và được bảo quản trong thùng nhựa chứa mẫu có đặt các túi đá gel nhằm duy trì nhiệt độ lạnh, bảo đảm mẫu không bị hư hỏng trong suốt quá trình thu và vận chuyển về phòng thí nghiệm

Tại phòng thí nghiệm, mẫu được giữ trong tủ đông có nhiệt độ -20 °C đến khi sử dụng

2.3.2 Phương pháp định danh mẫu bọt biển

Tiêu bản khung xương và gai xương được sử dụng trong phân loại bọt biển Tiêu bản khung xương được cắt theo bề mặt và vuông góc với bề mặt Tiêu bản gai xương được phá hữu cơ bằng NaClO Toàn bộ các tiêu bản được cố định vào lam kính bằng Canada balsam Các đặc điểm phân loại được quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympic BX41, hình ảnh khung xương và gai xương được chụp bằng máy ảnh kĩ thuật

số qua vật kính 4x, 10x và 40x So sánh hình thái ngoài và giải phẫu của mẫu vật với các tài liệu đã công bố về thành phần loài bọt biển Việt Nam

2.3.3 Quy trình nghiên cứu tổng quát lectin từ bọt biển

Hình 2.1 Quy trình tổng quát nghiên cứu lectin từ bọt biển

Bọt biển

Chiết Giã nhuyễn (xay nhuyễn)

Lọc, ly tâm thu dịch chiết

Kết tủa dịch chiết

Ly tâm, thu tủa

Hòa tan tủa, thẩm tách

Ly tâm, thu dịch trong

Sắc ký trao đổi ion

Thu các phân đoạn có lectin,

cô đặc Sắc ký lọc gel

Thu các phân đoạn có lectin,

Điều kiện chiết

 Dung môi chiết

 Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

 Thời gian chiết

 Nhiệt độ chiết

Muối ammonium sunfate

(NH4)2SO4

Cặn

Giải thích quy trình:

Mẫu bọt biển được giã nhuyễn bằng cối và chày chuyên dụng trước khi tiến hành chiết (đối với những mẫu bọt biển dai sẽ được xay nhỏ bằng cối inox có bổ sung Nitơ lỏng)

Quá trình chiết lectin được bố trí với các yếu tố thích hợp bao gồm dung môi chiết; tỉ lệ nguyên liệu:dung môi; thời gian chiết và nhiệt độ chiết Dịch chiết được lọc thô bằng rây hoặc vải lọc, sau đó tiếp tục ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút

để loại bỏ hoàn toàn bã, kết thúc quá trình chiết

Bổ sung muối ammonium sunfate với nồng độ bão hòa thích hợp vào dịch chiết

để kết tủa lectin Dịch tủa sau đó được ly tâm ở tốc độ 7000 vòng/phút trong 30 phút thu tủa có chứa lectin Loại bỏ dịch trong Sử dụng đệm với lượng ít nhất để hòa tan hết tủa thu được Dịch tủa sau đó được thẩm tách bằng túi thẩm tách có kích thước 10 kDa ở 4 °C

Dịch tủa sau thẩm tách được li tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút trước khi tiến hành sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose Các phân đoạn có hoạt tính NKHC sau khi tiến hành sắc ký trao đổi ion được thu nhận, cô đặc bằng màng siêu lọc kích thước 10 kDa, thẩm tách loại muối, sau đó tiến hành sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 Các phân đoạn có hoạt tính NKHC sau sắc ký lọc gel cũng được thu nhận, cô đặc bằng màng siêu lọc kích thước 10 kDa, thẩm tách trong nước cất

Lectin thu nhận được sau sắc ký lọc gel được mang đi khảo sát một số tính chất như đặc tính liên kết carbohydrate, hoạt tính kháng khuẩn và đánh giá ảnh hưởng một

số yếu tố lên hoạt tính NKHC của lectin như pH, nhiệt độ, cation hóa trị 2

Tiến hành điện di SDS-PAGE để đánh giá mức độ tinh sạch của lectin và xác định trọng lượng phân tử của lectin thu nhận được

2.3.4 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp Ngưng kết hồng cầu

Hoạt độ lectin được xác định dựa trên phương pháp Ngưng kết hồng cầu của Hori và cộng sự (Hori et al 1990)

Tiến hành

 Cho 25µl NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V

 Thêm 25µl mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha loãng là 1/2n

(n: số lần pha loãng)

 Tiếp tục cho 25µl hồng cầu vào tất cả các giếng

 Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 1 giờ

Đánh giá kết quả:

 Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ

 Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50%

Đơn vị hoạt độ

1 đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ NKHC trên 1 ml (HU/ml) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng

Hoạt độ lectin được xác định theo 2 chỉ số:

Hoạt độ tổng (U tổng ): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất

định Đơn vị: HU

U tổng = V 2 n

Hoạt độ riêng (U riêng): là số đơn vị hoạt độ lectin có trong 1mg protein Đơn vị:

HU/mg

Trong đó: U tổng : tổng số đơn vị hoạt tính Protein tổng: tổng hàm lượng protein

2.3.5 Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Lowry

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry (1951), dùng Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn (Lowry et al 1951)

Nguyên tắc: Protein tác dụng với thuốc thử Folin tạo thành sản phẩm màu xanh

Đây là sản phẩm khử của phosphomolipden – phosphovolframate bởi phức chất đồng

– protein và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm (A750) Dùng máy so màu để xác định cường độ màu trong các mẫu và so sánh với dịch protein chuẩn (BSA).

 Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường

 Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị và tiến hành theo quy trình trên và đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính giá trị protein

Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry

y = 0,0026x + 0,0187 R² = 0,9953

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

2.3.6 Phương pháp khảo sát các yếu tố cho quá trình chiết lectin từ bọt biển

Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách chiết

như dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết… thì các yếu tố còn lại được cố định Yếu tố nào đã hoàn thiện phần khảo sát thì sẽ được cố định ở giá trị thích hợp đã lựa

chọn để tiếp tục khảo sát đến các yếu tố còn lại

2.3.6.1 Khảo sát dung môi chiết

Tiến hành chiết lectin từ bọt biển bằng 4 loại dung môi khác nhau gồm: nước cất, đệm PBS (đệm phosphate 0,02M 0,85% NaCl, pH: 7,2), đệm TBS (Tris-HCl 0,02M 0,85% NaCl, pH: 7,5) và ethanol 30% (E30) với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) là 1:4, nhiệt độ chiết 4 °C, thời gian chiết 4 giờ Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết

Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng dịch chiết So sánh và chọn loại dung môi chiết thích hợp

2.3.6.2 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v)

Tiến hành chiết lectin từ bọt biển bằng dung môi thích hợp đã khảo sát ở các tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) khác nhau: 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, nhiệt độ chiết 4 °C và thời gian chiết là 4 giờ Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết

Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng dịch chiết So sánh, chọn

ra tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) thích hợp

2.3.6.3 Khảo sát thời gian chiết

Tiến hành chiết lectin từ bọt biển với các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8,

10, 12 (giờ), với dung môi, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) thích hợp đã được xác định ở nhiệt độ chiết 4 °C Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết

Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng dịch chiết So sánh và chọn ra thời gian chiết thích hợp