Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii doty (doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty Doty bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biế

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận án này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sau đại học

và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho TS Đỗ Văn Ninh - Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Thái Bình Dương và TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Xin chân thành cám ơn: PGS TS Trang Sỹ Trung - Phó Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang, PGS TS Nguyễn Anh Tuấn - Bộ môn Công nghệ Chế biến Thủy sản và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu

để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Xin cám ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và các cán

bộ - Phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này

Xin chân thành cám ơn Ông Mai Thanh Quang - Giám đốc Sở Khoa học và Công nghệ Tỉnh Bà Rịa - Vũng Tầu đã tạo mội điều kiện thuận lợi cho tôi được

đi học và hoàn thành Luận án tiến sĩ

Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC HÌNH xiii

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xviii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN 4

1.1.1 Giới thiệu về rong sụn 4

1.1.2 Giới thiệu về carrageenan 5

1.1.3 Tính chất lý hoá của carrageenan 8

1.1.4 Giới thiệu một số kỹ thuật sản xuất carrageenan 11

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ OLIGOCARRAGEENAN 14

1.2.1 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở Việt Nam 14

1.2.2 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở nước ngoài 15

1.3 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE 16

1.3.1 Enzyme viscozyme L và khả năng sử dụng trong sản xuất carrageenan từ rong sụn 16 1.3.2 Enzyme Termamyl 120L và khả năng sử dụng trong thủy phân carrageenan 18

1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN 19 1.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA CARRAGEENAN 21

1.6 GIỚI THIỆU VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘC CHẤT 26

1.7 SURIMI VÀ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CARRAGEENAN, OLIGOCARRAGEENAN TRONG SẢN XUẤT SURIMI 28

1.7.1 Giới thiệu về surimi 28

1.7.2 Nghiên cứu ứng dụng carrageenan và oligocarrageenan trong đồng tạo gel thực phẩm 32

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu và phân tích 35

2.2.2 Phương pháp tinh sạch, xác định cấu trúc và độc chất 37

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 44

2.2.3.1 Nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan 49

2.2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình chế biến 52

2.2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông 56

2.4 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 59

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 60

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME VISCOZYME L TRONG SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY 61

3.1.1 Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme viscozyme L 61

3.1.2 Xác định chế độ chiết carrageenan 69

3.1.2.1 Xác định thời gian chiết carrageenan 69

3.1.2.2 Xác định nhiệt độ chiết carrageenan 71

3.1.2.3 Xác định tỷ lệ nước/rong thích hợp cho quá trình chiết carrageenan 73

3.1.2.4 Đề xuất quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L trong sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty 75

3.2 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN 80

3.2.1 Xác định nhiệt độ tinh sạch 80

3.2.2 Xác định nồng độ ethanol kết tủa protein trong tinh sạch carrageenan 81

3.2.3 Xác định chế độ kết tủa carrageenan trong dung dịch car sau kết tủa protein 83

3.2.4 Đề xuất quy trình tinh sạch carrageenan bằng ethanol 86

3.3 NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CARRAGEENAN THÀNH OLIGOCARRAGEENAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME POLYSACCHARASE 91

3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme polysaccharase thích hợp cho thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan 91

3.3.2 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân carrageenan thành oligocar bằng enzyme Termamyl 120L 93

3.3.2.1 Xác định nồng độ enzyme Termamyl 120L 93

3.3.2.2 Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân 94

3.3.2.3 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân 96

3.3.2.4 Xác định nồng độ carrageenan 98

3.3.2.5 Xác định thời gian thủy phân 99

3.3.2.6 Đề xuất quy trình thủy phân carrageenan bằng enzyme Termamyl 120L 101

3.4 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC CỦA OLIGOCARRAGEENAN 102

3.4.1 Xác định nhiệt độ tinh sạch 102

3.4.2 Xác định nồng độ ethanol kết tủa phân đoạn protein 103

3.4.3 Xác định chế độ kết tủa oligocarrageenan trong dung dịch oligocar sau kết tủa protein 105 3.4.4 Đề xuất quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng ethanol 108

3.4.5 Đánh giá độ sạch của oligocarrageenan tinh sạch 109

3.4.2 Xác định một số đặc tính cấu trúc của oligocarrageenan 112

3.5 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC CHẤT HỌC CỦA CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN 127

3.6 THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN TRONG SẢN XUẤT SURIMI TỪ CÁ ĐỔNG 140

3.6.1 Thử nghiệm sử dụng carrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng 140

3.6.2 Thử nghiệm sử dụng oligocarrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng 152

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 166

TÀI LIỆU THAM KHẢO 169

PHỤ LỤC 178

GLU: đường niệu

JECFA: Ủy ban Chuyên gia về Phụ gia Thực phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn 5

Bảng 1.2 Một số tính chất đặc trưng của các loại carrageenan 9

Bảng 1.3 Độ dịch chuyển hoá học sigma từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose 23

Bảng 2.1 Thành phần hóa học chính của cá Đổng cờ 35

Bảng 2.2 Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng 42

Bảng 2.3 Đánh giá các biểu hiện lâm sàng trên chuột thí nghiệm an toàn 42

Bảng 2.4 Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng không làm mù 43

Bảng 2.5 Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính 43

Bảng 2 6 Nhiệt độ và pH tối thích của các enzyme 51

Bảng 3.1 Điều kiện thí nghiệm được chọn 61

Bảng 3.2 Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 3 61

Bảng 3.3 Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme Viscozyme L theo hàm mục tiêu sức đông của carrageenan 64

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm leo dốc theo hàm mục tiêu hiệu suất thu carrageenan từ rong sụn 66

Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc của hàm chập YL 67

Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu YL 68

Bảng 3.7 So sánh các thí nghiệm leo dốc theo từng hàm mục tiêu 68

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá chất lượng carrageenan theo phương pháp xử lý bằng enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất 78

Bảng 3.9 Thành phần hóa học chính của carrageenanrageenan trước tinh sạch 80

Bảng 3.10 Nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ đông đặc của carrageenan thô 81

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong kết tủa và trong dung dịch car sau tinh chế 82

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa carrageenan và hàm lượng protein, lipid, carrageenan còn lại trong dung dịch 84

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa carrageenan 85

Bảng 3.14 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của carrageenan trước và sau tinh sạch 88

Bảng 3.15 Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của carrageenan trước và sau

tinh sạch 88

Bảng 3.16 Thành phần hóa học chính của mẫu oligocarrageenan trước tinh sạch 102

Bảng 3.17 Nhiệt độ đông đặc và tan chảy của oligocarrageenan thô 103

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong kết tủa và trong dung dịch oligocarrageenan sau tinh chế 104

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa oligocarrageenan và hàm lượng protein, lipid, oligocarrageenan còn lại trong dung dịch 106

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa oligocarrageenan 107

Bảng 3.21 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của oligocarrageenan trước và sau tinh sạch 110

Bảng 3.22 Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của oligocarrageenan trước và sau tinh sạch 110

Bảng 3.23 Kết quả phân tích thành phần hoá học của oligocarrageenan 115

Bảng 3.24 Một số dải hấp thụ chính trên phổ hồng ngoại 117

Bảng 3.25 Độ dịch chuyển hoá học 13C-NMR 118

Bảng 3.26 So sánh độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan chuẩn (của Hãng Sigma) [34] 120

Bảng 3.27 Độ dịch chuyển hóa học của các proton ở vị trí α [34] 121

Bảng 3.28 Liên kết từ phổ 1H-1H COSY 124

Bảng 3.29 Tương tác của các proton trên phổ ROESY 125

Bảng 3.30 Độ dịch chuyển hoá học 13C NMR và 1H NMR của oligocarrageenan 126

Bảng 3.31 Biểu hiện lâm sàng của chuột nhắt uống carrageenan và oligocarrageenan 128

Bảng 3.32 Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột lang 132

Bảng 3.33 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 21 ngày 134

Bảng 3.34 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 42 ngày 134

Bảng 3.35 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 21 ngày 135 Bảng 3.36 Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 42 ngày 136 Bảng 3.37 Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần giải phẫu thứ nhất (ngày 21) 137

Bảng 3.38 Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần giải phẫu thứ hai (ngày 42) 137 Bảng 3.39 Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm 151 Bảng 3.40 Kết quả đánh giá sản phẩm surimi bổ sung oligocarrageenan 164

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty 4

Hình 1.2 Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose 6

Hình 1.3 Cấu trúc của κ-carrageenan 7

Hình 1.4 Cấu trúc của -carrageenan 7

Hình 1.5 Cấu trúc của -carrageenan 7

Hình 1.6 Sự chuyển hóa mu-carrageenan thành κ-carrageenan trong môi trường kiềm 8

Hình 1.7 Sự chuyển hóa nu-carrageenan thành - carrageenan trong môi trường kiềm 8

Hình 1.8 Sự chuyển hóa -carrageenan thành theta-carrageenan trong môi trường kiềm 8

Hình 1.9 Vị trí tồn tại của carrageenan trong rong sụn 17

Hình 1.10 Quá trình thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan 18

Hình 1.11 Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase 19

Hình 2.1 Hình ảnh về nguyên liệu rong sụn K alvarrezii (Doty) Doty 34

Hình 2.2 Hình ảnh về cá đổng cờ (Nemipterus virgatus (Tanaka, 1916)) 34

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát của luận án 45

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn 46

Hình 2.5 Sản xuất carrageenan theo phương pháp xử lý rong bằng NaOH 49

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn được loại enzyme amylase thích hợp cho thủy phân car thành oligocarrageenan 51

Hình 2.7 Mô hình liên kết giữa carrageenan và protein 53

Hình 2.8 Quy trình công nghệ sản xuất surimi 54

Hình 2.9 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình chế biến 56

Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông 57

Hình 2.11 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình hấp đến hiệu suất thu hồi surimi theo thời gian bảo quản đông 58 Hình 2.12 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan,

oligocarrageenan đến độ đồng nhất của surimi trong quá trình bảo quản đông 59

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi carrageenan 69

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan 70

Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất thu nhận carrageenan 71

Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan 72

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến hiệu suất thu carrageenan 73

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến sức đông và độ nhớt của carrageenan 74

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình sản xuất carrageenan từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty bằng phương pháp sử dụng enzyme Viscozyme L 76

Hình 3.8 Hình ảnh vi ảnh hiển vi thành tế bào rong sụn sau khi xử lý NaOH và Viscozyme L 77 Hình 3.9 Hình ảnh về sản phẩm carrageenan sản xuất theo quy trình sử dụng NaOH và quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong sụn 78

Hình 3.10 Quy trình tinh sạch carrageenan bằng cách sử dụng ethanol 960 để kết tủa phân đoạn protein và carrageenan 87

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan ban đầu 89

Hình 3.12 Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan ban đầu 89

Hình 3.13 Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch 89

Hình 3.14 Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch 90

Hình 3.15 Ảnh hưởng của loại enzyme đến mức độ thủy phân carrageenan 91

Hình 3.16 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử tạo thành 92

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L 93

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến mức độ thủy phân carrageenan 93

Hình 3.19 Ảnh hưởng của pH đến đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Temamyl 120L 95

Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân carrageenanrageenan bằng enzyme Temamyl 120L 95

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Temamyl 120L 97

Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân carrageenanbằng enzyme

Termamyl 120L 97

Hình 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L 98

Hình 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến mức độ thủy phân car bằng enzyme Termamyl 120L 98

Hình 3.25 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L 100

Hình 3.26 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân bằng enzyme Termamyl 120L 100

Hình 3.27 Quy trình sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty 101 Hình 3.28 Quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng cách sử dụng ethanol 960 để kết tủa phân đoạn protein và oligocarrageenan 109

Hình 3.29 Phổ 1H, 13C-NMR của mẫu oligocarrageenan sau tinh sạch 111

Hình 3.30 Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ dung dịch oligocarrageenan 113

Hình 3.31 Phổ khối lượng của oligocarrageenan 114

Hình 3.32 Phổ sắc ký khí của mẫu oligocarrageenan nghiên cứu 115

Hình 3.33 Phổ hồng ngoại của mẫu oligocarrageenan 117

Hình 3.34 Phổ 13C-NMR của mẫu oligocarrageenan 118

Hình 3.35 Cấu trúc disaccharide của carrageenan lý tưởng [34] 118

Hình 3.36 Phổ 13C-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageeanan [34] 121

Hình 3.37 Phổ 1H-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageenan [34] 121

Hình 3.38 Phổ HSQC 122

Hình 3.39 Phổ 1H-1H COSY 123

Hình 3.40 Phổ HMBC của oligocarrageenan 124

Hình 3.41 Phổ ROESY của oligocarrageenan 125

Hình 3.42 Tương tác của các proton trên phân tử oligocarrageenan 126

Hình 3.43 Phổ 1H-NMR của oligocarrageenan 126

Hình 3.44 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt đực uống carrageenan 128

Hình 3.45 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt cái uống carrageenan 129

Hình 3.46 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt đực uống oligocarrageenan 129

Hình 3.47 Tăng trọng trung bình của chuột nhắt cái uống oligocarrageenan 129

Hình 3.48 Hình ảnh giải phẫu của chuột nhắt trong nghiên cứu tính an toàn 130

Hình 3.49 Trọng lượng trung bình của chuột uống carrageenan so với nhóm chứng 132

Hình 3.50 Trọng lượng trung bình của chuột uống oligocarrageenan so với nhóm chứng 132

Hình 3.51 Hình ảnh vi thể của gan, lách trong nghiên cứu độc tính 138

Hình 3.52 Hình ảnh vi thể của thận trong nghiên cứu độc tính 139

Hình 3.53 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến cường độ gel của surimi 141

Hình 3.54 Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến tổng điểm cảm quan của surimi 141

Hình 3.55 Biến đổi chất lượng cảm quan của surimi khi phối trộn carrageenan trong quá trình bảo quản đông 143

Hình 3.56 Sự biến đổi cường độ gel của surimi khi phối trộn carrageenan trong quá trình bảo quản đông 144

Hình 3.57 Sự biến đổi lượng dịch thoát ra sau rã đông surimi bảo quản lạnh đông 145

Hình 3.58 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đông và phụ gia sử dụng đến hiệu suất thu hồi surimi cá đổng sau hấp 147

Hình 3.59 Sự biến đổi hàm lượng protein tại các vị trí khác nhau của các mẫu surimi bảo quản lạnh đông 148

Hình 3.60 Sơ đồ quy trình sản xuất surimi cá đổng bổ sung carrageenan 150

Hình 3.61 Ảnh hưởng của nồng độ oligocarrageenan bổ sung đến cường độ gel của surimi cá đổng 153

Hình 3.62 Ảnh hưởng của nồng độ oligocarrageenan bổ sung đến chất lượng cảm quan của surimi cá đổng 153

Hình 3.63 Sự biến đổi chất lượng cảm quan của surimi bổ sung oligocarrageenan bảo quản đông 156

Hình 3.64 Sự biến đổi cường độ gel của surimi bổ sung oligocarrageenan bảo quản đông 157

Hình 3.65 Sự biến đổi lượng dịch thoát ra sau rã đông của surimi bổ sung oligocarrageenan bảo quản đông 158

Hình 3.66 Sự thay đổi hiệu suất thu hồi surimi cá đổng bổ sung oligocarrageenan bảo quản đông 160 Hình 3.67 Hàm lượng protein giữa các vị trí khác nhau của mẫu surimi sau quá trình bảo quản lạnh đông 161 Hình 3.68 Quy trình sản xuất thử nghiệm surimi cá đổng 163

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus

alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo

1) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sử dụng enzyme

Viscozyme L trong sản xuất carrageenan từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty nuôi trồng

tại đầm Thủy Triều, xã Cam Đức, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa: tỷ lệ nước/rong khô 20/1, nồng độ enzyme thích hợp 1,45%, pH môi trường 5,1, nhiệt độ thích hợp 420C, thời gian xử lý enzyme 60 phút; Sau khi xử lý enzyme, chiết carrageenan với tỷ lệ nước nấu/rong đã xử lý enzyme là 50/1, nhiệt độ chiết 900C, thời gian nấu 80 phút

2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho qui trình tinh sạch carrageenan theo phương pháp kết tủa phân đoạn các thành phần có trong dung dịch carrageenan 5% ở nhiệt độ 700C bằng ethanol 960: kết tủa phân đoạn protein hòa tan

và các tạp chất trong dung dịch carrageenan bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 25%, ly tâm loại bỏ kết tủa protein và tạp chất ở tốc độ 10.000 v/phút trong 15phút, thu dung dịch carrageenan và kết tủa carrageenan trong dung dịch bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 60% trong thời gian 40 phút, lọc thu kết tủa carrageenan và sơ bộ tách nước khỏi carrageenan bằng cách rửa kết tủa hai lần bằng ethanol 960, sấy khô kết tủa carrageenan bằng kỹ thuật sấy lạnh ở nhiệt độ 45±20C với tốc độ gió 2m/s Chế phẩm carrageenan sau tinh sạch đạt các chỉ tiêu hóa lý, tiêu chuẩn kim loại nặng cũng như đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật gây bệnh của sản phẩm carrageenan dùng trong thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế

3) Luận án đã xác định được các thông số tối ưu cho quy trình sử dụng enzyme polysaccharase thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan: nồng độ carrageenan

thích hợp 1%, nồng độ enzyme Termamyl 120 L thích hợp 0,5%, nhiệt độ thích hợp

850C, pH thích hợp 6,5, thủy phân trong 16 giờ Sản phẩm oligocarrageenan thu được

có từ 2 đến 10 monose và có khối lượng phân tử trung bình nhỏ hơn carrageenan khoảng 132 lần

4) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho qui trình tinh sạch oligocarrageenan theo phương pháp kết tủa phân đoạn các thành phần có trong dung dịch oligocarrageenan 5% ở nhiệt độ 600C bằng ethanol 960: kết tủa phân đoạn protein hòa tan và các tạp chất trong dung dịch oligocarrageenan bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 30%, ly tâm loại bỏ kết tủa protein và tạp chất ở tốc độ 10.000 v/phút trong 15phút, thu dung dịch oligocarrageenan và kết tủa oligocarrageenan trong dung dịch bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 80% trong thời gian 60 phút, lọc thu kết tủa oligocarrageenan, trước khi sấy khô dùng ethanol 960 để rửa kết tủa oligocarrageenan hai lần nhằm tách bớt nước khỏi kết tủa oligocarrageenan, sấy khô kết tủa oligocarrageenan bằng kỹ thuật sấy lạnh ở nhiệt độ 45±20C với tốc độ gió 2m/s Chế phẩm oligocarrageenan sau tinh sạch đạt các chỉ tiêu hóa lý, tiêu chuẩn kim loại nặng cũng như đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật gây bệnh của sản phẩm oligocarrageenan dùng trong thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế

5) Đã xác định được một số đặc tính cấu trúc của oligocarrageenan sản xuất như: oligocarrageenan có trọng lượng phân tử trung bình vào khoảng 1651Dalton bằng 1/132 lần khối phân tử trung bình của carrageenan ban đầu và có 2 đến 10 monosaccharide; các oligocarrageenan đều có cấu trúc gồm các disaccharid carrageenose đã bị sunphat hóa ở

vị trí C4 trong vòng galactose pyranose và là dạng κ-car

6) Luận án đã nghiên cứu thử nghiệm độc tính của carrageenan và oligocarrageenan trên chuột thí nghiệm cho thấy chế phẩm carrageenan và oligocarrageenan hoàn toàn không độc với chuột thí nghiệm

7) Luận án đã nghiên cứu thử nghiệm sử dụng carrageenan và oligocarrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng cho thấy bổ sung carrageenan 1% hoặc oligocarrageenan 0,2% vào surimi cá đổng có thể làm tăng chất lượng, tăng tính ổn định, hạn chế biến đổi chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông

Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh

TS Đỗ Văn Ninh PGS TS Vũ Ngọc Bội Bùi Huy Chích

MỞ ĐẦU

Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty được di nhập vào Việt Nam từ

những năm 90 của thế kỷ trước và hiện đang được phát triển nuôi trồng tại một số địa phương như Nha Trang - Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận Hiện rong sụn chủ yếu được người dân thương mại hóa dưới dạng rong khô nguyên liệu bán cho thương

lái nước ngoài, đặc biệt là thương lái Trung Quốc [21], [26], [39] Rong sụn K

alvarezii (Doty) Doty là loại rong giàu carrageenan - một loại polysacharid có hoạt

tính sinh học và được sử dụng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống Hàm lượng carrageenan của rong sụn lên tới 40% trọng lượng chất khô [2], [6], [34], [37] Hiện có nhiều nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn và đa số các nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn tại Việt Nam và trên thế giới đều sử dụng phương pháp hóa học để xử lý rong trong quá trình chiết carrageenan Từ carrageenan người ta

có thể thủy phân tạo thành oligocarrageenan - một loại oligosaccharide có hoạt tính sinh học và có nhiều ứng dụng trong dược học, y học và thực phẩm như làm tăng khả năng nhũ hóa thuốc, tăng khả năng tạo độ dẻo dai cho thực phẩm, kích thích sinh trưởng thực vật, hoạt tính chống oxy, hỗ trợ phòng chống và điều trị viêm loét dạ dày,

… [34], [35], [36], [38] Hiện có nhiều kỹ thuật thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan như: phương pháp hóa học, phương pháp sử dụng tia bức xạ hay phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase Phương pháp hóa học là phương pháp

sử dụng các chất hóa học để phân cắt carrageenan thành oligocarrageenan Phương pháp này có nhược điểm là sau khi sản xuất, hóa chất lẫn với oligocarrageenan nên quá trình tinh sạch oligocarrageenan tốn kém Trong khi đó, phương pháp sử dụng tia bức xạ đòi hỏi phải có thiết bị bức xạ mà các phòng thí nghiệm thông thường không

có Phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase xử lý rong sụn để sản xuất carrageenan và sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân carrageenan tạo ra các oligocarrageenan có ưu điểm là ít gây ô nhiễm môi trường và người ta dễ dàng tinh sạch carrageenan cũng như oligocarrageenan khỏi enzyme polysaccharase Chính vì thế, sản phẩm carrageenan và oligocarrageenan sản xuất theo phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase được gọi là sản phẩm sản xuất theo công nghệ “sạch” Vì thế, hướng nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase để xử lý rong sụn trong sản xuất carrageenan và sử dụng enzyme polysaccharase phân cắt carrageenan thành oligocarrageenan đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Do vậy, luận án tiến

hành “Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty

(Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi”

Mục tiêu chung của Luận án

Sản xuất carrageenan và oligocarrageenan từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty)

bằng phương pháp sử dụng enzyme và thử nghiệm sử dụng carrageenan, oligocarrageenan trong sản xuất surimi cá đổng

Mục tiêu cụ thể của Luận án

- Sản xuất được carrageenan từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase

- Sản xuất được oligocarrageenan từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp sửu dụng enzyme polysaccharase

- Đánh giá được khả năng ứng dụng carrageenan và oligocarrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng

Nội dung nghiên cứu

1) Nghiên cứu sử dụng enzyme Viscozyme L trong sản xuất carrageenan từ rong sụn K alvarezii (Doty) Doty

2) Nghiên cứu tinh sạch carrageenan thu nhận từ rong sụn

3) Nghiên cứu thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan bằng phương pháp

Lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme

polysaccharase trong thủy phân carrageenan từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) để

sản xuất oligocarrageenan cũng như lần đầu nghiên cứu tinh sạch và xác định cấu trúc của oligocarrageenan thu nhận bằng phương pháp enzyme Kết quả nghiên cứu của luận án là các dữ liệu mới và là nguồn tài liệu phục vụ cho giảng dạy thuộc lĩnh vực

chế biến, cho cao học viên, nghiên cứu sinh, các nhà nghiên cứu quan tâm đến lĩnh vực này

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra sản phẩm carrageenan và oligocarrageenan từ rong sụn theo phương pháp sử dụng enzyme nên sản phẩm carrageenan, oligocarrageenan là sản phẩm “sạch”, thân thiện với môi trường Mặt khác, kết quả nghiên cứu của luận án có thể được các doanh nghiệp ứng dụng để sản xuất và thương mại hóa sản phẩm oligocarrageenan Do vậy, luận án sẽ góp phần mở rộng đầu ra cho nghề nuôi trồng rong sụn, hạn chế tình trạng xuất khẩu rong nguyên liệu, tăng thu nhập cho nghề nuôi trồng rong sụn và tạo điều kiện cho nghề nuôi trồng rong sụn tại Việt Nam phát triển một cách bền vững

Họ: Areschougiaceae Giống: Kappaphycus Loài: bao gồm các loài alvarezii, cottonii,

inermis, interme, procrusteanum, striatum Trong đó loài Kappaphycus alvarezii

(Doty) Doty là loài có sản lượng cao nhất

Hình 1.1 Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty

Tháng 3/1993, trên cơ sở của chương trình hợp tác về Khu hệ và nguồn lợi rong biển kinh tế Việt Nam giữa Phân viện Vật liệu Nha Trang (nay là Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang) và Nhật Bản, Phân viện Vật liệu Nha Trang đã tiến hành di nhập rong sụn giống từ Nhật Bản để nghiên cứu nhân giống và thử nghiệm nuôi trồng rong sụn tại các vùng ven biển của tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận Kết quả thử nghiệm cho thấy rong sụn hoàn toàn thích nghi với điều kiện tự nhiên ở nước ta

Từ đó đến nay, nghề nuôi trồng rong sụn phát triển mạnh ở các tỉnh: Ninh Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Kiên Giang và hiện đang là đối tượng nuôi được nhiều tỉnh ven biển miền Trung từ Nghệ An trở vào phía Nam quan tâm Đến nay,

nuôi trồng rong sụn trở thành một nghề mới của Việt Nam, góp phần tạo công việc làm cho hàng ngàn lao động [21], [50], [98]

Rong sụn tươi thường có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll Rong sụn thuộc loài đơn trụ chia thành 2 phần:

Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn Xung quanh

có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thước lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dưỡng (carrageenan)

Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lượng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong [39]

Thành phần chính của rong sụn là carrageenan Hàm lượng carrageenan có thể chiếm đến 40% trọng lượng khô của rong sụn Trong đó, carrageenan tan chiếm khoảng 33%, carrageenan không tan chiếm 7% Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn nguyên liệu trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn [10]

Thành

phần

Hàm lượng

Đơn vị tính

Thành phần

Hàm lượng

Đơn vị tính

1.1.2 Giới thiệu về carrageenan

Carrageenan có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với liên kết luân

phiên của βD Galactose pyranose qua liên kết 1-3 và αD Galactose pyranose qua liên kết 1-4 (Hình 1.2) Các liên kết ở vị trí số 3 xuất hiện ở các gốc có 2 và 4 sunphat hoặc không có sunphat trong khi liên kết ở vị trí số 4 ở các gốc có 2 sunphat, gốc 2,6 anhydrit và 3,6 anhydrit-2-sunphat, gốc 2,6 disunphat, gốc 2,6 anhydrit và 3,6 anhydrit-2-sunphat Hợp phần cấu tạo của carrageenan gồm có D-Galactose (17 ÷ 31%) còn L-Galactose chiếm lượng rất nhỏ Do đó, carrageenan tạo thành chủ yếu bởi các mạch poly D-Galactose bị sunphat hoá có phân tử lượng 500 ÷ 700Dalton [16] Các phân tích bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy carrageenan

có nhiều dạng cấu trúc hoá học khác nhau Dựa vào cấu trúc hoá học, người ta có thể phân carrageenan thành các loại như sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sunphat hoá, vị trí sunphat hoá, mức độ dehydrat hoá của chuỗi polysacharid Khối lượng phân tử của đại phân tử carrageenan khoảng từ 105đến 106 phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu và quá trình chiết [50], [51], [65], [87]

Hình 1.2 Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose

pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose

Car tự nhiên từ các loài rong khác nhau có thể là hỗn hợp khác nhau của các loại carrageenan đã nêu ở trên Người ta phân chia carrageenan ra hai nhóm chính: nhóm 1 chứa các loại mu, nu, kappa, iota và các dẫn xuất của chúng Các carrageenan này tạo gel với ion K+ hoặc có thể xử lý kiềm để có tính chất tạo gel, chúng có đặc điểm là gốc đường có liên kết 1,3 hoặc không có nhóm sunphat hoá ở vị trí C4 Nhóm thứ 2 là lambda, xi, theta và các dẫn xuất của chúng Chúng không có khả năng tạo gel ngay cả trước và sau khi xử lý kiềm Đặc trưng của cấu trúc này là cả hai loại gốc đường liên kết 1,4 và 1,3 đều có nhóm sunphat ở ví trí C2 Ngoài ra, thành phần của carrageenan gồm

có H2SO4, Ca2+ và 3,6 anhydro D-Galactose Dạng tồn tại của carrageenan trong rong đỏ gắn với Ca2+, K+, Na+ như: R=(OSO3)2Ca hoặc R-OSO3Na, ROSO3K (R là gốc polysacharid) Hàm lượng SO3–2 cũng ảnh hưởng đến sức đông của carrageenan [16]

Về cơ bản carrageenan có 3 loại khác nhau là: κ-carrageenan, -carrageenan,

-carrageenan Trong đó, κ-carrageenan chiếm thị phần lớn nhất (80%) Mu và Nu là

chất ban đầu tổng hợp nên kappa và iota, việc chuyển đổi này là do enzyme dekinkase

có trong rong biển hay trong quá trình sản xuất khi dùng xúc tác để loại nhóm 6 sunphat [16]

* κ-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn, có cấu tạo xen kẽ giữa galactose-4-sunphat (GalS) và 3,6 anhydro D-galactose (GalA) (Hình 1.3) Cấu trúc phân tử của κ-carrageenan là vòng xoắn kép bậc III

D-Hình 1.3 Cấu trúc của κ-carrageenan

* -carrageenan: là một loại carrageenan có số lượng gốc sunphat nằm trung gian

giữa số lượng gốc sunphat của κ-carrageenan và -carrageenan (Hình 1.4) Khi tạo gel,

khối gel của -carrageenan có tính đàn hồi tốt hơn khối gel của các loại carrageenan khác

Hình 1.4 Cấu trúc của -carrageenan

* -carrageenan: trong mạch phân tử của -carrageenan, các đơn vị monomer gồm: D-galactose-2-sunphat (1,3) và D-Galactose-2-6-disunphat nối xen kẽ với nhau (hình 1.5)

Hình 1.5 Cấu trúc của -carrageenan

Các phân đoạn này đều có tính đa phân tán, nhưng chúng chỉ khác nhau về thành phần sunphat ester và gốc quay quang -carrageenan có khối lượng phân tử cao và mạch dài hơn κ-carrageenan Thành phần của phân đoạn này cũng phụ thuộc vào nhiệt

độ chiết và loại rong nguyên liệu [16], [57], [87]

Sự khác nhau của các loại carrageenan trên ở vị trí và số lượng nhóm ester

sunphat đính vào chuỗi polysacharid, do đó mỗi loại có tính chất vật lý và hoá học đặc trưng khác nhau

1.1.3 Tính chất lý hoá của carrageenan

* Tính chất của carrageenan

Môi trường kiềm có ảnh hưởng lớn đến trạng thái cấu tạo hoá học của carrageenan, cụ thể trong môi trường kiềm, nhóm (HOSO3-) bị khử tách dần khỏi cấu trúc của carrageenan Tùy thuộc vào mức độ tách nhóm (HOSO3-) từ carrageenan ban đầu sẽ hình thành nên cấu trúc của một loại carrageenan khác với ban đầu [16], [57], [87] Chẳng hạn: từ mu-carrageenan khi bị khử nhóm (HOSO3-) trong môi trường kiềm sẽ tạo thành κ-carrageenan (Hình 1.6)

Hình 1.6 Sự chuyển hóa mu-carrageenan thành κ-carrageenan trong môi trường kiềm

Từ nu-carrageenan khi bị khử nhóm (HOSO3-) trong môi trường kiềm sẽ tạo thành -carrageenan (Hình 1.7)

Hình 1.7 Sự chuyển hóa nu-carrageenan thành - carrageenan trong môi trường kiềm

Trong môi trường kiềm - carrageenan bị khử nhóm (HOSO3-) sẽ tạo thành carrageenan (Hình 1.8)

theta-Hình 1.8 Sự chuyển hóa -carrageenan thành theta-carrageenan trong môi

trường kiềm

Car là một polymer mang điện âm nên bị ngưng kết khi có mặt của các đại phân

tử mang điện tích dương như: metylen xanh, safranine, phẩm màu azo thiazo khác, tính chất này giống như một vài alkaloid và protein Mặt khác, carrageenan còn có khả năng kết tủa khi có mặt của ethanol nồng độ cao (ethanol đóng vai trò là tác nhân dehydrate hoá) Do vậy, người ta có thể sử dụng ethanol nồng độ cao để kết tủa thu carrageenan

Carrageenan là hợp chất cao phân tử (polysaccharide) có cực nên hydrat hóa và hòa tan tốt trong môi trường có cực, chẳng hạn như nước Khi carrageenan hút nước sẽ xảy ra hiện tượng hydrat hóa và dẫn tới sự hòa tan Khi hòa tan trong nước, carrageenan tạo thành dung dịch lỏng, sánh Do vậy, người ta sử dụng đặc tính này để làm tăng khả năng ổn định của các hỗn hợp thực phẩm lỏng hay dung dịch thực phẩm hoặc làm tăng khả năng hydrate hóa của các loại thuốc

* Tính tan

Carrageenan tan trong anhydrous hydrazine (N2H4), ít tan trong formamide (CH3NO) và methyl sulfoxide ((CH3)2SO), không tan trong dầu và dung môi hữu cơ Carrageenan tan trong nước, đặc biệt là nước nóng, tuy nhiên tính tan còn phụ thuộc vào loại carrageenan

Bảng 1.2 Một số tính chất đặc trưng của các loại carrageenan [28]

-carrageenan

Nước nóng Tan ở nhiệt độ trên 70oC Tan ở nhiệt độ trên

Nước lạnh

Tan trong dung dịch muối

Na+ Không tan trong dung dịch muối K+, Ca2+

Tan trong dung dịch muối Na+ Tan

Sữa lạnh

Không tan trong dung dịch muối Na+, K+, Ca2+

nhưng trương nở rõ ràng

Không tan Tan

Dung dịch đường Tan khi nóng Tan Tan khi nóng

* Sự tạo gel (gelation)

Khả năng keo hoá của carrageenan nằm trung gian giữa agar và gelatin, gần giống gelatin hơn Sự hình thành gel của dung dịch carrageenan là một quá trình nhiệt thuận nghịch Khi nhiệt độ cao hơn giá trị nhiệt độ tạo gel thì gel sẽ tan chảy (cân bằng

bị phá vỡ) Tuy nhiên, khoảng cách nhiệt từ trạng thái tạo gel đến tan chảy là một giá

trị không đổi Khả năng hình thành gel của carrageenan phụ thuộc vào nhiệt độ và

nồng độ dung dịch, loại và số lượng muối có mặt trong dung dịch Ngoài ra, tính chất tạo gel còn phụ thuộc vào loài rong, độ nhớt, công nghệ sản xuất, sự hình thành và phân

bố các gốc galactose trong mạch polymer Sử dụng đặc tính tạo gel của carrageenan, người ta đã ứng dụng carrageenan trong rất nhiều lĩnh vực của đời sống như làm chất nhũ hóa, tạo độ đặc, sánh, tạo cấu trúc và giúp phân bố và cố định đều trong thực phẩm[16], [57], [94]

* Tính bền acid: Trong môi trường có pH thấp cùng với sự tác dụng của nhiệt

độ cao thì sự thuỷ phân carrageenan xảy ra nhanh hơn Vì vậy, nên tránh chế biến dung dịch carrageenan ở pH thấp và nhiệt độ cao trong thời gian dài

* Tính hấp thu hồng ngoại và màu

Dung dịch carrageenan là một chất hữu cơ, nên có khả năng hấp thu phổ hồng ngoại có bước sóng trong phạm vi nhất định, phụ thuộc vào loại và thành phần carrageenan Dựa vào tính chất này, người ta có thể biết được carrageenan thuộc loại

-, -, - … Các loại polysaccharide thường cho bước sóng ở vùng hồng ngoại trong

khoảng 1000-1100cm-1, các loại carrageenan tạo gel cho mũi hấp thu cực đại (mũi hấp thụ trong khoảng rộng) ở 1065cm-1, loại không tạo gel ở vùng 1020cm-1

* Tính thuỷ phân và sự metyl hoá xác định công thức cấu tạo của carrageenan

Dung dịch carrageenan ít bị thủy phân ở môi trường pH 9 và pH 7; dung dịch muối natri carrageenan bị thoái hoá do phân tử carrageenan bị đứt liên kết 3,6-anhydrogalactose Từ phản ứng xác định tính thuỷ phân kiềm nhóm ester sunphat của carrageenan đã nói lên cấu trúc của carrageenan có nhóm ester sunphat gắn ở C4 trong gốc galactose Carrageenan, đặc biệt là phân đoạn -carrageenan sẽ bị thuỷ phân bởi enzyme Pseudomonate carrageenan hay appa-carovora Khi carrageenan (-, -) bị thuỷ phân bởi enzyme này thì độ nhớt của dung dịch giảm rất nhiều và làm tăng khả năng khử, tạo các sản phẩm thuộc dãy đồng đẳng của oligosaccharide sunphat, 3-6 - (3, 6- anhydrose-D-galactose pyranose)-D-galactose-4-6-sunphat (neocarrabiose-4-O- sunphat)

Carrageenan bị metyl hoá tạo ra các dẫn xuất methyl như 2, 3, 4, D(L)-galactose hoặc 2,4,6-tri-methyl-D(L)-galactose và dựa vào đặc tính này người ta

6-tetra-methyl-đã xác định thành phần cấu trúc của nó

* Độ nhớt

Độ nhớt của dung dịch carrageenan phụ thuộc rất lớn vào khối lượng phân tử, nồng độ carrageenan, nhiệt độ dung dịch và các yếu tố ảnh hưởng khác như sự có mặt của các muối trong dung dịch Độ nhớt dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch và

tỷ lệ nghịch với nhiệt độ Sử dụng khả năng tạo độ nhớt của carrageenan, trong thực phẩm, dược phẩm carrageenan được sử dụng như chất ổn định để làm tăng độ nhớt của pha liên tục, từ đó chúng đảm bảo chất béo không bị phân riêng trong dung dịch [94]

Từ các phân tích ở trên cho thấy carrageenan là một polymer tự nhiên có nhiều tính chất công nghệ đáng quý như khả năng tạo gel và đồng tạo gel, tạo độ nhớt cho dung dịch, làm tăng độ chắc và tính chất cơ lý của thực phẩm Ngoài ra, carrageenan còn có thể dùng để sản xuất thực phẩm chức năng hoặc ứng dụng trong y dược Tuy nhiên, đa số các công trình công bố nghiên cứu về carrageenan và cấu trúc của carrageenan là do các tác giả nước ngoài Do vậy, việc đầu tư nghiên cứu để làm chủ công nghệ sản xuất carrageenan tại Việt Nam và mở rộng ứng dụng carrageenan vào sản xuất và đời sống là cần thiết

1.1.4 Giới thiệu một số kỹ thuật sản xuất carrageenan

Hiện nay, trên thế giới có các phương pháp sản xuất carrageenan như: Phương pháp kết tủa, phương pháp đông lạnh, phương pháp PES, phương pháp ATC,… nhưng trong thực tế do tính chất đơn giản về công nghệ và hiệu quả kinh tế nên người ta chọn

để áp dụng hai phương pháp sản xuất carrageenan chính sau:

Phương pháp thứ nhất chỉ áp dụng từ cuối năm 1970 đến đầu năm 1980, carrageenan được tách ra từ rong đỏ bằng nước nóng, bã rong được lọc tách ra và dịch chiết chứa carrageenan được đem sấy khô trực tiếp trên thiết bị sấy kiểu “rulô” thu được carrageenan ở dạng màng mỏng, sau đó nghiền thành bột Một số cơ sở sản xuất tiến hành tinh chế dịch chiết trước khi làm khô, nhưng thực tế cho thấy sản phẩm vần còn nhiều tạp chất

Phương pháp thứ hai, rong được rửa sạch, sau đó xử lý bằng dung dịch kiềm KOH ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại rong cụ thể Việc sử dụng dung dịch KOH sẽ giúp loại bỏ các tạp chất như sắc tố, protein, muối khoáng Rong sau xử lý chủ yếu chứa carrageenan

và cellulose Sau đó, sấy khô rong và nghiền thành bột carrageenan bán tinh chế (SRS)

[50], [65], [82], [87]

Sự khác nhau cơ bản giữa carrageenan tinh chế và bán tinh chế là carrageenan bán tinh chế chứa cellulose, trong khi carrageenan tinh chế thì cellulose đã được tách hoàn toàn trong quá trình sản xuất Do vậy, khi hoà tan carrageenan bán tinh chế vào nước thường có hiện tượng dung dịch kém trong suốt

Đối với nước ta, những năm gần đây, các nhà khoa học tại một số cơ quan nghiên cứu và đào tạo như Trường Đại học Thủy sản (nay là Trường Đại học Nha Trang, Viện Hóa học, đã quan tâm nghiên cứu chế biến rong sụn và ứng dụng carrageenan vào sản xuất sản phẩm mới Công nghệ sản xuất carrageenan từ rong sụn đã được các nhà nghiên cứu trong nước tiếp thu từ nước ngoài và điều chỉnh cho phù hợp với các đặc điểm của nguyên liệu rong và điều kiện sản xuất ở nước ta Cụ thể như sau:

- Carrageenan được chiết từ rong Hồng Vân (Eucheuma gelatinae) bằng phương

pháp chiết trong môi trường nước nóng ở nhiệt độ 900C trong 2giờ [34]

Phương pháp sử dụng nước nóng để chiết carrageenan có nhược điểm là hiệu quả chiết rút không cao và để đảm bảo chiết rút triệt để carrageenan từ nguyên liệu đòi hỏi phải chiết nhiều lần Do đó, dung dịch carrageenan thu được có nồng độ carrageenan không cao và thể tích lớn gây khó khăn cho việc thu nhận carrageenan sau này và sản

phẩm carrageenan thu được lẫn nhiều tạp chất

- Chiết carrageenan bằng dung dịch NaOH có nồng độ 7 - 13%, kết hợp với nhiệt

độ [20] Hoặc sử dụng dung dịch NaOH để xử lý rong sụn trước, tiếp theo chiết

carrageenan trong môi trường nước nóng [22], [13] Ngoài ra, kết hợp sử dụng KOH và

acid HCl để xử lý rong trước khi chiết carrageenan trong môi trường nước nóng [26] Giảm thiểu các tạp chất phi carrageenan bằng công nghệ xử lý rong sụn trong môi trường kiềm nhẹ để sản xuất carrageenan bán tinh chế SRC, công nghệ có ưu điểm hiệu suất quy trình rất cao gần 70% [18]

Sản xuất carrageenan theo phương pháp trên có một số hạn chế là carrageenan thu được thường lẫn với hóa chất nên quá trình tinh chế gặp nhiều khó khăn, gây ô nhiễm môi trường, độc hại với người sản xuất

Với phương pháp sử dụng enzyme để xử lý rong, phản ứng xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, hiệu quả cao do tính đặc hiệu của enzyme, không độc hại cho người sản xuất và ít ảnh hưởng đến môi trường và đảm bảo an toàn thực phẩm, đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm Sau đây, xin giới thiệu một số kết quả nghiên cứu của thế giới về lĩnh vực này:

Zhao Mouming và cộng sự, có thể thu được carrageenan bằng cách xử lý rong với enzyme cellulase Nhược điểm của phương pháp làm cường độ gel của carrageenan giảm

nhẹ [108]

Tang và cộng sự (1998), đã mô tả kỹ thuật chiết carrageenan từ Eucheuma

cottonii và E okanurai bằng cách sử dụng enzyme cellulase và hơi nước áp suất cao

Phương pháp sử dụng cellulase cho hiệu suất thu nhận carrageenan cao hơn nhưng

cường độ gel thấp hơn so với phương pháp xử lý rong bằng hơi nước áp suất cao [95]

Soovendran A/l Varadarajan và cộng sự (2009) cho rằng hiệu suất thu nhận carrageenan từ rong bị ảnh hưởng nhiều bởi phương pháp xử lý rong trước khi chiết

Cụ thể, phương pháp xử lý rong bằng cellulase cho hiệu suất thu carrageenan cao nhất, sau đó đến đun sôi truyền thống và thấp nhất là xử lý rong bằng dịch chiết enzyme nấm mốc Tuy nhiên, độ nhớt của carrageenan sản xuất theo phương pháp xử lý rong bằng enzyme cellulase cao hơn so với carrageenan thu được khi xử lý rong bằng dịch chiết enzyme nấm mốc nhưng thấp hơn so với phương pháp sản xuất carrageenan truyền thống [93]

Từ các phân tích ở trên cho thấy các tác giả nước ngoài chủ yếu sử dụng enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào của rong để thu nhận dịch chiết carrageenan Việc sử

dụng enzyme cellulase vào sản xuất carrageenan đã nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm, khắc phục được việc sử dụng hóa chất gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, phương pháp sử dụng cellulase trong sản xuất carrageenan có nhược điểm là độ nhớt của carrageenan bị giảm Trong nước, các công trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong xử lý rong để sản xuất carrageenan không đáng kể Công nghệ sản xuất carrageenan từ rong sụn vẫn chủ yếu theo hướng sử dụng HCl và NaOH để xử lý rong nên chất thải quy trình sản xuất chắc chắn sẽ gây ô nhiễm môi trường và việc xử lý chất thải là một vấn đề phức tạp và tốn kém Do vậy, chúng ta cần đầu tư nghiên cứu

sử dụng các công nghệ sạch ít gây ô nhiễm môi trường trong sản xuất carrageenan từ rong sụn, đặc biệt là “ứng dụng công nghệ enzyme” để sản xuất carrageenan từ rong sụn nhằm tạo ra sản phẩm carrageenan đáp ứng tiêu chuẩn “xanh và sạch” cung cấp cho các ngành công nghiệp trong nước và hướng đến xuất khẩu, góp phần hạn chế tình trạng xuất khẩu rong nguyên liệu khô với giá rẻ và nhập khẩu carrageenan với giá cao như hiện nay Từ đó, góp phần giải quyết đầu ra cho nghề nuôi trồng rong sụn, nâng cao giá trị thương phẩm, thúc đẩy nghề trồng rong sụn tại Việt Nam phát triển bền vững

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ OLIGOCARRAGEENAN

1.2.1 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở Việt Nam

Tại Việt Nam có một số công trình nghiên cứu về oligocarrageenan như Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự nghiên cứu làm giảm khối lượng của carrageenan bằng chùm electron năng lượng thấp Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi đầu tư thiết bị bức xạ khá tốn kém và người tham gia sản xuất phải có trình độ kỹ thuật cao [85]

Bùi Huy Chích (2009) đã nghiên cứu và nhận thấy enzyme Termamyl 120L là

loại enzyme thích hợp cho thủy phân carrageenan từ rong sụn K alvarezii Ngoài ra,

kết quả nghiên cứu cũng cho thấy enzyme amylase chỉ cắt mạch liên kết glycoside mà không ảnh hưởng đến sự phá vỡ cấu trúc phân tử carrageenan [6], [23]

Trần Đình Toại và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thủy phân carrageenan chiết

từ rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae để tạo oligocarrageenan bằng phương pháp sử

dụng acid HCl Kết quả phân tích cấu trúc của sản phẩm oligocarrageenan thu được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối kết

hợp sắc ký lỏng (LC-MS) cho thấy thủy phân carrageenan không làm thay đổi cấu trúc của carrageenan mà chỉ phá vỡ các liên kết glycosid dẫn tới làm cắt ngắn mạch

polymer [35], [36]

Sử dụng acid HCl để thủy phân carrageenan là một phương pháp thường dùng trong nghiên cứu thủy phân carrageenan, phương pháp này có ưu điểm là đơn giản Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này để sản xuất oligocarrageenan có nhược điểm là gây nhiễm môi trường và độc hại cho người trực tiếp sản xuất

Trần Đình Toại và cộng sự (2009) đã tiến hành thủy phân carrageenan bằng enzyme Phitopain do trung tâm Kỹ nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học - Nga cung cấp Kết quả nghiên cứu cho thấy, thủy phân carrageenan bằng enzyme Phitopain làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của carrageenan, chỉ có tác dụng phá vỡ các liên kết glycosid, cắt

ngắn mạch tạo thành oligocarrageenan [38] Tuy nhiên, enzyme Phitopain không phải là

enzyme thương mại nên chưa có công bố về thành phần của enzyme và hiện không có bán

ở thị trường Việt Nam

Từ các phân tích ở trên cho thấy việc nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ carrageenan rong sụn K alvarezii (Doty) Doty theo phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase hiện chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam và chưa có tác giả nào công bố nghiên cứu một cách đầy đủ về lĩnh vực này

1.2.2 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở nước ngoài

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan với mục đích nghiên cứu cấu trúc và thử nghiệm ứng dụng trong phòng thí nghiệm Về phương pháp sản xuất oligocarrageenan có thể chia thành hai phương pháp chính:

Thứ nhất, dùng acid để thủy phân liên kết  -(1-3) glycosid Acid được nhiều

nghiên cứu sử dụng là acid HCl Cụ thể, nghiên cứu của Guangli Yu và cộng sự (2002)

[63], Astier và cộng sự (2012) [43], J Vera và cộng sự (2012) [72] đã sử dụng HCl để thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan

Thứ hai, dùng enzyme κ-carrageenase để thủy phân liên kết  -(1-4) glycosid của κ-carrageenan, sản phẩm tạo thành là neo-κ-carrabiose, -tetraose, -hexaose, -octaose và decaose sunphat Enzyme κ-carrageenase được sản xuất từ các loài vi khuẩn biển

Chẳng hạn, các tác giả J Weigl và W Yaphe (1966) [103], Maitland W Mc Lean và

cộng sự (1979) [81], Guibet và cộng sự (2006) [64], Lemoine và cộng sự (2009) [77],

Y X Ma và cộng sự (2010) [107], Jouanneau và cộng sự (2010) [75], Henares và

cộng sự (2010) [44] đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Pseudoalteromonas

carrageenovora để sản xuất enzyme κ-carrageenase dùng trong thủy phân

carrageenan Tác giả Jouanneau và cộng sự (2011) lại sử dụng vi khuẩn Alteromonas

fortis để sản xuất enzyme κ-carrageenase dùng trong thủy phân car [76] Trong khi đó,

tác giả Mou Haijin và cộng sự (2004) lại sử dụng vi khuẩn Cytophaga sp trong sản

xuất enzyme κ-carrageenase dùng thủy phân carrageenan [83] Tượng tự như vậy, tác

giả Barbeyron và cộng sự (2000) sử dụng vi khuẩn Zobellia galactanovorans [99], còn tác giả Ni Min (2008) lại sử dụng vi khuẩn Cellulophaga sp QY201 trong sản xuất enzyme κ-carrageenase dùng thủy phân carrageenan [86]

Từ các phân tích ở trên cho thấy việc nghiên cứu ứng dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan đã được các tác giả nước ngoài đề cập và các kết qủa nghiên cứu đều cho thấy việc sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân carrageenan tỏ ra có nhiều triển vọng và đảm bảo sản phẩm “xanh và sạch hơn” Do vậy, việc đặt vấn đề nghiên cứu lựa chọn một loại enzyme polysaccharase trong thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan của luận án là phù hợp xu thế của thời đại và hoàn toàn có tính khả thi

1.3 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE

1.3.1 Enzyme viscozyme L và khả năng sử dụng trong sản xuất carrageenan

từ rong sụn

Khi cắt dọc và ngang cây rong, có thể nhìn thấy vị trí tồn tại của chất keo có ở rong tại phần trung tâm của thân rong, lớp ngoài cùng là màng cellulose, sau đó đến lớp trong là các lớp tế bào nhỏ chứa đầy sắc tố và chất khoáng Trong phần lõi là các

lớp tế bào mỏng, lớn chứa đầy các chất keo rong [18] Do vậy, dùng enzyme phá hủy

lớp thành tế bào (thành phần chính là cellulose, araban,…), sẽ giúp cho việc chiết, thu nhận carrageenan dễ dàng hơn Vì thế, các tác giả nước ngoài chủ yếu sử dụng enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào của rong, sau đó chiết và sử dụng các dung môi để kết tủa thu sản phẩm carrageenan

Enzyme Viscozyme L là một sản phẩm của hãng Novozyme - Đan Mạch, được sản xuất từ Aspergillus aculeatus Dịch enzyme có màu nâu, điều kiện thích hợp cho

hoạt động của enzyme: pH 3,3 - 5,5 và nhiệt độ 45 - 550C, hoạt độ 100 FBG/g Enzyme cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh từ 1-100C Dịch enzyme chứa một hỗn hợp polysaccharase như: cellulase, hemicellulase, xylanase, β -glucanase, arabanase Cụ thể, enzyme cellulase thủy phân liên kết 1,4- β-glucoside trong cellulose nên sẽ phân cắt cellulose thành cellobiose và glucose tùy thuộc điều kiện thủy phân Hemicellulase thủy phân thành phần hemicellulose, xylanse thủy phân lớp xylan, arabanse thủy phân thành phần araban và β-glucanase có tác dụng thủy phân cellulose Như vậy, khi sử dụng hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase, xylanase, β -glucanase, arabanase

sẽ giúp cho việc thủy phân cấu trúc thân rong dễ dàng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thu nhận carrageenan từ rong sụn

Hình 1.9 Vị trí tồn tại của carrageenan trong rong sụn

Viscozyme L hiện đang được sử dụng trong việc tách bóc lớp vỏ cà phê, vỏ hồ tiêu Chế phẩm Viscozyme L chứa hỗn hợp đa enzyme nên hiệu quả thủy phân thân rong tốt hơn khi sử dụng một enzyme cellulase đơn lẻ Ngoài ra, sử dụng enzyme

Viscozyme L xử lý rong trong quá trình sản xuất carrageenan từ rong K alvarrezii

(Doty) Doty có nhiều ưu điểm so với phương pháp xử lý rong bằng NaOH Cụ thể, sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong cho hiệu suất quy trình và sức đông carrageenan cao hơn, khắc phục những hạn chế của quá trình sản xuất carrageenan theo phương pháp sử dụng NaOH xử lý rong như: carrageenan thu được thường lẫn hóa chất, quá trình tinh chế rất khó khăn, ô nhiễm môi trường, độc hại cho người sản xuất [8] Do vậy, luận án sẽ thử nghiệm sử dụng enzyme Viscozyme L nghiên cứu trong

Tế bào carrageenan

việc phá hủy lớp cấu trúc thân rong sụn tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết và thu nhận carrageenan sau này

1.3.2 Enzyme Termamyl 120L và khả năng sử dụng trong thủy phân carrageenan

Carrageenan thu nhận từ rong sụn có cấu tạo luân phiên đều đặn của disacarit: (1→3)--D-galactose(4SO3-)-(1-4)α-3,6 anhydro-D-galactose(1→3) hoặc →3)-β-D-galp 4S-(1-4)--3,6-An Galp (1→3) [96], [97] Ngoài ra, carrageenan trong dung dịch

có độ nhớt cao, ở nhiệt độ nhỏ hơn 440C [41] Do đó, đòi hỏi enzyme thủy phân carrageenan phải chịu được nhiệt độ cao trên 440C Qúa trình thủy phân carrageenan bằng enzyme được thể hiện trên hình 1.10

Hình 1.10 Quá trình thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan [16]

Enzyme Termamyl 120 L có dạng lỏng, màu nâu, tỷ trọng là 1,2g/ml, được

sản xuất từ chủng Baccillus licheniformis Termamyl 120 L là một endo-amylase, có

tác dụng thủy phân mối nối 1-4 α-glycosid (Qúa trình thủy phân bằng enzyme Termamyl 120L được thể hiện trên hình 1.11 dưới đây) Với cơ chất tinh bột, dưới tác dụng của Termamyl 120 L sẽ nhanh chóng tạo thành dextrin và oligosaccharid tan trong nước Điều kiện thích hợp cho chế phẩm enzyme này hoạt động: Nhiệt độtừ 40

 950C; pH từ 5,0  7,0 Đặc biệt, enzyme Termamyl 120 L có khả năng ổn định nhiệt

độ cực cao (105 đến 1100C), phạm vi pH hoạt động tương đối lớn và việc đòi hỏi canxi

của enzyme tương đối thấp [5]

Kết quả khảo sát tính chất của enzyme Termamyl 120L trên cơ chất carrageenan từ

rong sụn K alvarezii (Doty) Doty cho thấy enzyme Termamyl 120L hoạt động tối ưu ở

điều kiện: nhiệt độ 850C, pH 6,5, nồng độ enzyme Termamyl 120L 0,5% và nồng độ carrageenan 1% [7]

Hình 1.11 Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase [5]

Từ các phân tích ở trên cho thấy, việc sử dụng enzyme Termamyl 120L trong nghiên cứu thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan (microgel) là có cơ sở và khả thi

1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN

Việc sử dụng enzyme để phân cắt carrageenan thành oligocarrageenan sẽ thu được hỗn hợp các chất bao gồm carrageenan, oligocarrageenan và các tạp chất có trong carrageenan Vì vậy, để thu được sản phẩm carrageenan và oligocarrageenan tinh sạch người ta cần phải tiến hành tinh sạch để tách riêng carrageenan và oligocarrageenan ra khỏi các tạp chất

Để tinh sạch carrageenan và oligocarrageenan, người ta có thể sử dụng các phương pháp như: sắc ký lọc gel, chủ yếu để loại muối và monomer [63], [76], [43], [90], sắc ký trao đổi ion [4], [91], [92], màng siêu lọc để tách oligocarrageenan thành các phân đoạn có trọng lượng phân tử khác nhau [79] Các phương pháp tinh sạch trên tuy cho phép nhận được carrageenan và oligocarrageenan có độ tinh sạch cao và trọng lượng phân tử đồng đều, nhưng đòi hỏi thiết bị, dụng cụ và hóa chất chuyên dụng đắt

tiền, hiệu suất thấp, chỉ áp dụng ở quy mô phòng thí nghiệm

Một phương pháp khác hay được sử dụng để thu nhận cũng như tinh sạch carrageenan và oligocarrageenan, kể cả tiêu chuẩn của Châu Âu về carrageenan là sử dụng dung môi hữu cơ như: ethanol, isopropanol và xeton để kết tủa carrageenan, oligocarrageenan và tách ra khỏi dung dịch thu sản phẩm [16], [20], [84]

Với mục tiêu loại bỏ các thành phần không phải carrageenan (oligocarrageenan),

có khả năng ảnh hưởng đến tác dụng chức năng mong muốn của carrageenan

(oligocarrageenan) là ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi, hỗ trợ phòng chống

và điều trị bệnh viêm loét dạ dày, đồng thời gây khó khăn cho việc xác định cấu trúc của carrageenan (oligocarrageenan) Mặt khác, quá trình tinh sạch carrageenan phải phù hợp với thực tế sản xuất, có tính khả thi để áp dụng vào thực tế sản xuất một cách thuận lợi (không phức tạp, đòi hỏi thiết bị và công nghệ phức tạp, không yêu cầu đầu tư lớn dẫn đến làm tăng chi phí sản xuất…) Quá trình tinh sạch carrageenan ngoài các yêu cầu đã trình bày ở trên và để phù hợp với yêu cầu của đề tài là xây dựng quy trình tinh sạch carrageenan và oligocarrageenan ở quy mô pilot, tiến tới áp dụng trong thực tế sản xuất carrageenan và oligocarrageenan dùng làm thực phẩm chức năng ở quy mô công nghiệp, đồng thời còn cần đảm bảo an toàn, vệ sinh môi trường, an toàn cho người công nhân sản xuất, dư lượng trong sản phẩm không ảnh hưởng đến vệ sinh, an toàn thực phẩm, Luận án lựa chọn áp dụng kỹ thuật tinh chế carrageenan và oligocarrageenan bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ (ethanol) để kết tủa và tách carrageenan, oligocarrageenan ra khỏi dung dịch, một phương pháp đã được khá nhiều nghiên cứu sử dụng để tinh sạch carrageenan Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, cho phép nhận được sản phẩm có độ tinh khiết cần thiết dùng làm thực phẩm, có thể dễ dàng áp dụng trong thực tế sản xuất

Ngoài ra, để tinh sạch carrageenan và oligocarrageenan, cần phải tách protein và lipid ra khỏi các mẫu thô Để loại protein và lipid có nhiều phương pháp khác nhau

Cơ sở của các phương pháp này dựa trên khả năng tủa protein trong môi trường axit nhẹ và trong một số dung môi khác nhau Các tác nhân dùng để tủa protein thường sử dụng như hệ Trichloroacetic acid (TCA) - Na deoxycholate (DOC); tủa bằng TCA, acetone, ethanol, TCA-DOC/Acetone, acetone/methanol axit hóa, chloroform và methanol [104] Mục đích thu được sản phẩm tinh sạch dùng làm thực phẩm, vì vậy dùng ethanol để loại protein ra khỏi các sản phẩm thô, lipid không bị kết tủa cùng với protein bị loại ra cùng với dung dịch; khó khăn chính của phương pháp này là carrageenan, oligocarrageenan cũng bị tủa, vì vậy cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên khả năng tủa protein, carrageenan và oligocarrageenan Từ đó, tìm ra nồng độ ethanol chỉ kết tủa protein, không kết tủa với carrageenan hay oligocarrageenan Ngoài ra, quá trình kết tủa protein, carrageenan và oligocarrageenan chỉ thực hiện được khi carrageenan (oligocarrageenan) ở trạng thái dung dịch Theo một số công bố, carrageenan có nhiệt độ tan gel và nhiệt độ tạo gel nằm trong vùng

nhiệt độ (46 đến 520C) và (380C đến 440C) tương ứng [41] Để thuận lợi cho việc kết tủa protein, carrageenan và oligocarrageenan cần tiến hành trong điều kiện nhiệt độ carrageenan, oligocarrageenan có khả năng hòa tan tốt Do đó, cần xác định nhiệt độ tan gel và nhiệt độ tạo gel của chúng

Một trong những khó khăn trong công nghệ sản xuất polysaccharide từ rong biển nói chung và carrageenan nói riêng đó là độ nhớt cao, khả năng hòa tan hạn chế vì vậy

đòi hỏi thiết bị cồng kềnh [94] Để giảm độ nhớt và tăng độ hòa tan của carrageenan,

các nhà sản xuất thường cho thêm vào dung dịch carrageenan một lượng nhỏ axit để hạn chế khả năng tạo gel

1.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA CARRAGEENAN

1.5.1 Phương pháp phân tích thành phần và cấu trúc của carrageenan [74], [83]

Thông thường việc phân tích cấu trúc của polysaccharide gồm 5 bước chính sau: 1- Xác định thành phần monosaccharide bằng con đường thuỷ phân mạch cacbohydrat với việc cắt các liên kết glycosid Các nhóm thế có trong mạch được xác định bằng phổ hồng ngoại (IR)

2- Methyl hoá sản phẩm phân tích thông qua chuỗi phản ứng hoá học dẫn xuất hoá các monosaccharide, để việc xác định chúng có thể thực hiện bằng phổ khối (MS)

3- Ghi dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) với các tín hiệu cộng hưởng 1D và 2D NMR

4- Xác định trật tự liên kết glycosid và các vị trí nhóm thế

5- Nghiên cứu cấu trúc không gian polysaccharide bằng các thông số NMR được

hỗ trợ bởi kỹ thuật mô hình hoá phân tử Đây là hướng nghiên cứu còn rất mới mẻ

Sự kết hợp giữa các phương pháp nghiên cứu hóa học với sự phát triển hiện nay của các phương pháp hoá lý trong nghiên cứu cấu trúc đã hình thành nên các phương pháp phân tích thành phần và cấu trúc của carrageenan như sau:

* Phương pháp hoá học

Phương pháp hoá học là phương pháp khá phổ biến được sử dụng để xác định thành phần monomer của các polysaccharide Tính chất đặc biệt của carrageenan liên quan chủ yếu đến hàm lượng 3,6-D-anhydrogalactose và hàm lượng OSO3- có trong