Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)

THÁI NGUYÊN - 2015

Chuyên ngành

: K43 - CNSH

: 2011 2015 : ThS

Khoa CNSH-CNTP

THÁI NGUYÊN - 2015

-2009 13

2009 14

2009 .15

15

(Hung và cs, 1999b), (Hung và cs, 2004) [28], [29] 27

28

29

: .32

B ng 4.1: K t qu u cam sành huy n Quang Bình, t nh Hà Giang 34

B ng 4.2: K t qu u chanh, quýt và cam thu t i Hà N i, L Nguyên 35

B ng 4.3: K t qu so sánh s bi u hi n b nh qua tri u ch ng b n ngoài và gi i ph u mô t bào th c v t 38

B ng 4.4: K t qu nh b nh vàng lá greening cam, quýt và chanh 43

18

Hình 4.1 M u lá cây có múi thu th nh b nh vàng lá greening 33

Hình 4.2 Hình nh gi i ph u mô t bào m u lá cam sành 36

Hình 4.3 Hình nh gi i ph u mô t bào lá quýt ng t 37

Hình 4.4 Hình nh gi i ph u mô t bào lá có bi u hi n nghi nhi m 37

Hình 4.5 K t qu tách chi t DNA t ng s 40

Hình 4.6 n di s n ph m PCR m nh b nh greening .41

Cs

CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA : Deoxyribonucleic Acid

EDTA : Ethylene diamine tetraacetate

FAO : Food and Agriculture Organization

NN&PTNT

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic Acid

1 1 1

2

2

3

3

n 3

: 4

4

4

5

7

9

10

12

16

2 .16

16

19

greening 21

R 21

22

22

22

23

23

27

27

28

28

28

29

29

29

30

3.4 32

Ph n 4: K T QU VÀ TH O LU N 33

4.1 K t qu thu th p m u v t li u 33

4.2 K t qu nh m bi u hi n c a b nh .34

4.2.1 K t qu nh s bi u hi n c a b nh thông qua các tri u ch ng bên ngoài 34

4.2.2 K t qu nh s bi u hi n c a b nh thông qua quan sát hình thái mô t bào th c v t 36

4.3 K t qu nh b nh vàng lá greening b ng k thu t PCR v i c p m c hi u 39

4.3.1 Tách chi t DNA t ng s m u lá 39

4.3.2 K t qu n gen 16s rDNA 40

Ph n 5: K T LU N VÀ KI N NGH 45

5.1 K t lu n 45

5.2 Ki n ngh 45

erytreae) hi (Hung.T.H và cs, 2004) [29 reening là

- Hoàn

]

162 loài (Specias

1 C.sisnensis Osbeck Sweets Orange

2 C.aurantium L Sour Orange Cam chua

3 C.reticulata Blanco Mandarin Quýt

6 C.aurantifolia Swingle Lime

3) [3]

ra oxy trong không khí làm không khí

2003) [3]

[5].

-Preslay.D, 1993) [34]

2009 /ha)

2002 2005 2006 2007 2008 2009

75,7 87,2 84,8 100,4 117,3 111,2

87,85 99,41 98,07 102,48 98,85 117,3470,0 606,4 611,0 662,0 670,2 683,3

4) [1]

ha

2.2.2.1 Nguyên nhân gây b

Liberibacter gây ra, dòng châu

Á có tên là Liberibecter asiaticum và dòng châu Phi có tên là Liberibacter africanum Dòng châu Á là dòng c 32oC, dòng

1999b) [28]

c y

(Aubert.B, 1987) [19

(Aubert.B, 1988) [18]

(1991)-

B c Vi t Nam và cho k t qu (Lê Mai Nh t, 2014) [8].

Diaphorina Citri

Liberibacter asiticum (Hung và cs, 1999a) [27]

Su.H.J (2008)

n (Su.H.J, 2008) [35]

::

:

:

(Su.H.J, 2008) [35]

in vitro.

226 bp (Hung.T.H và cs, 1999b) [28] Trong khi Bové và cs

có múi khác nhau (Su.H.J, 2008) [35]

nhanh chóng và chính xác (Bové và cs, 1980) [20], (Su.H.J và cs, 1993) [36]

82,5% (Hà Minh trung, 2003) [14]

60%, Hà Giang: 63%, Hòa Bình: :

Diaphorina citri Quýt Ponkan và cam Tangelo Orlando là

vàng lá greening trên cây có múi

vàng lá greening

TP Thái Nguyên

g STT

2 Chanh thanh yên

nilon

- Trong quá chúng tôi

c 2: Dùng dao lam c t lát m ng ngang ph n gân lá

c 3: Ngâm các m nh lá v a c c javen t 10 - 15 phút

c 4: R a s c javen b c c t

c 6: R a m u b ng dung d ch Acid axetic 1- 2 l n

c 7: R a s ch Acid axetic nhi u l n b c c t

c 8: Nhu m h ng m u trong Carmin t 30 phút 1h

c 9: Lo i b h t Cácmin và nhu m Xanh methylen trong 1 phút

c 5: Hút 700µl d ch ly tâm sang ng eppendorf m i và b sung 700µl

phút Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút L p l c này 2 l n

c 6: Hút 350µl dung d ch pha trên sang ng eppendoft m i, b sung Isopropanol theo t l 1 : 1 + 50µl NaCl 5M - 20oC

c 7: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, lo i b ph n d ch và thu l y

ph n c n t a

c 8: B sung 1ml c r a t a, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút L p l c này 2 l n

c 9: Hút lo i b toàn b c khô t a DNA trong box c y

c 10: Hòa tan DNA trong 60µl TE 1X (pH 8.0) 80oC trong 10 phút

13.8µl-Thermo cycle)

94oCtrong 4 phútDNA 94oC trong 1 phút

Trong khuôn kh c tài, sau m t th i gian nghiên c u, thu th p m u v t

c m t s k t qu

4.1 K t qu thu th p m u v t li u

ti nh cây b b nh vàng lá greening, công vi c thu th p m u lá

c th c hi n t i nh tu i khác nhau Cam Sành trên

thu m u lá c a nh ng cây có bi u hi c mô t có v t l m

ng H ng D t, 2003) [3]

t s hình nh minh ch ng cho k t qu thu th p m u v t li u t a khác nhau

Hình 4.1 M u lá cây có múi thu th nh b nh vàng lá greening

A- Lá cam Canh (Ngu n Lê Mai Nh t, 2014)[8]; B - Lá chanh Thanh Yên (Vi n B o V Th c V t, Hà N i); C, G Lá và cây cam Sành (Quang Bình, Hà

Giang); D, H Lá và cây Quýt ng t (B ); E, F - Lá cam Vinh và lá

chanh Gi y (Quy t Th ng, Thái Nguyên)

c n, mà ch t p trung vào các tri u ch n hình c a b nh vàng lá greening K t qu nh s bi u hi c th hi n trong b n 4.1 và 4.2.

B ng 4.1: K t qu u cam sành huy n Quang Bình, t nh Hà Giang

m ng n Cây S lá K t qu

Vi n b o v Th c

v t TP Hà N i

Chanh Thanh Yên 1

Các k t qu bi u hi n thông qua các tri u ch ng bên ngoài không

các t bào trong lá khi cây b nhi m b nh Vì v y c n ti nh các bi u

hi n c a b nh thông qua gi i ph u hình thái mô t bào th c v t c tác nhân gây b nh vàng lá greening, nghiên c n hành gi i ph u gân lá K t

qu gi i ph u gân lá c c th hi n hình 4.2.B và hình 4.2.C K t qu nghiên c u c a Jeong-Soon Kim và cs, 2009, hình 4.2.A cho th y

ph n m ch m ch d n (phloem) tích t tinh b t d n thoái hóa m ch d n, l c l p trong lá b ng nghiêm tr ng D n lá b b ng không có kh

quang h p, h p thu và v n chuy ng theo m ch d n B

c t m u siêu m ng nhu m carmin 3% và xanh methylen k t h p v i kính

Hình 4.2 Hình nh gi i ph u mô t bào m u lá cam sành

A - Cam Ng t (Jeong-Soon Kim và cs, 2009)[33]; B, C Cam Sành Hà Giang, 2014 Hình nh k t qu gi i ph u gân lá b b i kính hi n t

100 l n Ph n tinh b t có vi khu n t p trung m ch d n (Phloem)

hình A và B Hình C không có vi khu n t p trung m ch d n (m u lá kh e).

m nh (Hình 4.3B).

Hình 4.4: Hình nh gi i ph u mô t bào lá có bi u hi n nghi nhi m.

A: Chanh gi y (Thái Nguyên); B: Chanh thanh yên (Hà N i); C: Cam vinh (Thái

Nguyên)

T nh ng hình nh gi i ph u mô t bào có th th y s bi u hi n c a các mô

t bào trong c ba m u lá Chanh gi y, chanh thanh yên và cam vinh có bi u hi n nghi nhi m b ng Các t u b bi i t o ra các l tr ng

u còn l i, vì v y mà trên v trí bi u hi n b nh hình 4.4C v n có thnhìn th

5 Lá vàng, gân xanh T bào ch ng chéo lên nhau +

7 Lá vàng gân xanh Không có bi u hi n

-8 Lá vàng gân xanh T bào bi n d ng v hình thái +

9 Lá vàng gân xanh T bào bi n d ng v hình thái +

Chú thích: (+), Có tri u ch ng, bi u hi n trên mô t bào;(-), có tri u ch ng, không

bi u hi n trên mô t bào i ch ng.

tr ng hay các t bào n m ch n l n là s

bi n d ng c a các t bào Khi ti n hành gi i ph u 33 m u v t li u có bi u hi n tri u

ch ng b nh bên ngoài có 29 m u cho th y s bi u hi n b nh trên mô t bào (+), và

4 m u không có bi u hi n b nh trên mô t bào (-), u này cho th y s bi u hi n

b nh bên ngoài và s bi u hi n b nh trong mô t bào không có s ng nh n hình là các m u Cam sành (m u 6, 12), quýt ng t (m u 6), cam vinh (m u 3) có

bào M t khác các m u có tri u ch ng b nh bên ngoài gi t

qu gi i ph u không gi c l i, nhìn trên b ng ta th y m u Cam sành s u có bi u hi n bên ngoài là lá vàng, gâ t qu gi i

ph u xu t hi n m u s 2 và các t bào bi n d ng v hình thái m u s 3, m u s 4 cho k t qu gi i ph u gi ng v i m u s u

ch ng bên ngoài lá vàng l m, s bi u hi n trên các m u còn l

T nh ng k t qu này m t l n n a cho th y vi bi u

hi n b nh thông qua các tri u ch ng bên ngoài và gi i ph u mô t bào th c v tkhông có s ng nh tin c y cao trong nh b nh vàng lá greening, vì v y c n ti n hành nh ng bi n pháp nh b nh vàng lá greeningcho k t qu

t DNA t ng s c ti n hành dCTAB c a Saghai maroof, 1984 (Jame.C, 2008) [32] Có m t vài c i ti n

Hình 4.5 K t qu tách chi t DNA t ng s

A, Cam Sành (Hà Giang); B, Chanh Thanh Yên (Vi n B o v Th c v t

Hà N i); C, Quýt Ng t (huy n B c S , t nh L D, Chanh Gi y và Cam Vinh ( xã Quy t Th ng, TP Thái Nguyên, t nh Thái Nguyên) A, C và D: Các

ng ch y trên b ng v i s m u thu t i Hà Giang, L

Hình 4.6 n di s n ph m PCR m nh b nh greening.

A Cam sành (huy n Quang Bình, t nh Hà Giang) 2/12 m ; B

Thanh Yên (Vi n B o V Th c V t, Hà N i) 5/5 m ; D Chanh Gi y

và cam vinh (xã Quy t Th ng, TP Thái Nguyên) 1/2 m u chanh gi y và 5/5 m u

DNA nhi m b nh t Vi n B o v Th c v t Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t

s 6 và 7 có bi u hi i b nh greening v i hình 4.6.B, 4.6.C

c 226 bp, bên c nh m u chanh Gi y ½ m u b nhi m b nh greening ng

2/12 m u,(16,6%).

5/5 m u, (100%)

v c nh b nh vàng lá greening trên cây cam

5.1 K t lu n

1 Thu th c các m u v t li ng cây có múi cam,

13 m u cam Sành, 11 m u quýt Ng t, 5 m u chanh Thanh Yên, 2 m u chanh

, tháng 6/1996, trang 228-229

, Nxb Lao -

18 Aubert.B, Garnier.M, Cassin.J.C, Bertin.Y (1988), Citrus greening disease

survey in East and West African countries South of Sahara, Proceeding of

10 th conference of IOCV, IOCV, Riverside 1988, 231 237.

19 Aubert, B (ed) (1987), Regional Workshop on citrus greening Huanglongbin

disease, Review and Abstract FAO-UNDP, China.Dec.6-12/1987.

20 Bové.J.M, P Bonnet, M.Garnier and B Aubert (1980), Pennicilin and

tetraciline treatment of greening disease affected citrus plants in the glasshouse and the bacterial nature of the procaryote associated with greening In proc 8 th conf IOCV, IOCV, Riverside.tr.91-102.

in the Arabian peninsula In Proc.9th Conf IOCV, IOCV, Riverside Tr 109-114.

23 Bové.J.M Nguyen Minh Chau, Ha Minh Trung, Bourdeaut.J and Garier.M

asiaticum by DNA-Hybridization with probe in 2.6 and PCR Ampification of 16S Ribosomal DN Thirteenth IOCV Conference, 1996-Procaryotes and

blight, 258-266

24 Brlansky.R.H and Rogers

and Education Center, University of Florida-IFAS.

25 FAOSTAT (2015), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org

26 Garnier.M, Daniel.N and Bové.J.M (1984), An etiology of citrus greening

diseases Ananals of Microbiology, tr.169-179.

27 Hung.T.H, H.L Wu and H.J.Su (1999a)

Ann Phytopathol Soc.Jpn.65:14-146.

28 Hung.T.H, Wu.H.L and Su.H.J

the diagnosis of citrus greening disease usi

Journal of Phytopathology.147: 599-604.

29 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J

PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen

Plant pathology.53:96-102.

huanglongbing (gre International Journal of Systematic Bacteriology.47:224-227.

32

Brief No, 37, International Service for the Acquisition of Agri- Biotech application, Ithaca, NY, USA.

Phytopathology, 99:50-57 Dept of primary Industries,

Queensdland

35 Su.H.J (2008), Production and Cultivation of virus-free citrus sapling for citrus

Rehabilitation in Taiwan, Asia-pacific Consortium on Agricultural

Biotechnology, New Delhi and Asia-pacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok.P51

36 Su.H.J, Ting-Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), Detection of the fastidious

bacteria causing The Asia citrus greening by DNA probes, In Proc 12th

Conf.IOCV, Riverside(Abs), 466

37 Tanaka (1979), Edible plant collection, Tokyo, Japan.

38 Tatineni.S, Sagaram.U.S, Gowda.S, Robertson.C.J, Dawson.W.O, Iwanami.T,

Real-Time

Phytophatology, 85:592-598

Journal of Bacteriology 173:

697-703

A B

Hình n thu m u

A n cam Sành (huy n Quang Bình, t nh Hà Giang); B n quýt Ng t (huy n

B , t nh L C: Cây cam Sành (t nh Hà Giang); D: Cây quýt Ng t