Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh in Vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fructicosa (L.) Harms) (Khóa luận tốt nghiệp)

-NGUY N TH

Tên tài:

(Polyscias fructicosa (L.) Harms)

L I C

i thân

h c Nông lâm Thái Nguyên, Ban ch nhi m khoa Công ngh sinh h c và Công

u ki n thu n l em trong quá trình làm khoá lu n

DANH M C CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình Vi t Nam 5

Hình 2.2: M t s hình nh nh n d 7

Hình 4.1: M u l y t cây in vivo 39

Hình 4.2: Ch y 39

Hình 4.3: nh ch ng BAP các công th c thí nghi m (ch p sau c y 30 ngày) 41

Hình 4.4: nh ch ng kinetin các công th c thí nghi m (ch p sau c y 30 ngày) 43

Hình 4.5: C m ch i trên CT3 46

Hình 4.6: C m ch i trên CT4 46

Hình 4.7: Ch c c y hàng lo t o c m ch ng: MS + 2,5 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA 46

Hình 4.8: nh ch t h p BAP và NAA các công th c thí nghi m (ch p sau c y 45 ngày) 48

Hình 4.9: R ng b sung NAA ( nh ch p 45 ngày sau c y) 50

Hình 4.10: Tr ng thái r CT 3: MS + 1 mg/l BAP (ch p sau c y 30 ngày) 52

Hình 4.11: Tr ng thái r CT 6: MS + 2,5 mg/l BAP (ch p sau c y 45 ngày) 52

Hình 4.12: Hình thái r CT2 (ch p sau c y 45 ngày) 54

Hình 4.13: Hình thái r CT3 (ch p sau c y 45 ngày) 54

Hình 4.14: Cây hoàn ch nh trên 2 công th c t t nh t (CT3: trái và CT4: ph i) ( nh ch p sau c y 45 ngày) 56

Hình 4.15: Cây t CT 3 (ch p sau ra cây 1 tháng) 58

Hình 4.16: Cây t CT 3 (ch p sau ra cây 2 tháng) 58

Zeatin : 6-(4-hydoxy-3methylbut-2enyl)

M C L C

PH N 1: M U 1

t v 1

1.2 M c tiêu và yêu c u c tài 2

1.2.1 M c tiêu c tài 2

1.2.2 Yêu c u c tài 2

tài 2

1.3 c 2

1.3 c ti n 2

PH N 2: T NG QUAN TÀI LI U 4

2.1 Gi i thi u v chi .4

2.1.1 Ngu n g c và s phân b 4

2.1.2 V trí phân lo i 4

2.1.3 Các loài thu c chi Polyscias có Vi t Nam 4

2.2 Gi i thi u v cây .6

2.2.1 Mô t 6

2.2.2 Phân b , sinh thái 7

2.2.3 B ph n s d ng 8

2.2.4 Thành ph n hóa h c 8

2.2.5 Tác d c lý [2] 8

2.2.6 Tính v và công d ng 9

2.2.7 Nhu c u s d ng và kh n xu t n nay 10

2.3 T ng quan v nuôi c y mô t bào 12

2.3.1 Khái ni m 12

lý lu n c ng in vitro 12

m c ng in vitro 14

2.3.4 Quy trình nhân gi ng in vitro 17

2.3.5 ng d ng c a nhân gi ng in vitro trong nhân gi ng cây thu c 18

2.3.6 M t s y u t n quá trình nuôi c y mô t bào th c v t 19

2.4 Tình hình nghiên c u v cây trên th gi i và Vi t Nam 23

2.4.1 Tình hình nghiên c u v cây trên th gi i 23

2.4.2 Tình hình nghiên c u v cây Vi t Nam 25

PH N 3: NG, N U 30

ng và ph m vi nghiên c u 30

ng 30

3.1.2 Ph m vi nghiên c u 30

m và th i gian ti n hành 30

m 30

3.2.2 Th i gian nghiên c u 30

3.3 N i dung nghiên c u 30

3.3.1 N i dung 1: Nghiên c u ng c a n n kh in vitro 30

3.3.2 N i dung 2: Nghiên c u ng c a các ch n kh in vitro 30

3.3.3 N i dung 3: Nghiên c u ng c a các ch n kh o cây hoàn ch nh .31

3.3.4 N i dung 4: u qu các công th c t o r in vitro n t l s ng c a u ki n ex vitro 31

u 31

o m u vô trùng 31

trí thí nghi m 31

3.4.3 n hành thí nghi m 32

3.4 36

3.4.5 lý s li u 37

PH N 4: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 38

4.1 K t qu nghiên c u ng c a n n kh in vitro 38

4.2 K t qu nghiên c u ng c a các ch n kh in vitro 40

4.2.1 K t qu nghiên c u ng c a n n kh in vitro inh l 40

4.2.2 Nghiên c u ng c a n n kh in vitro

.42

4.2.3 K t qu nghiên c u ng c a t h n kh nhanh in vitro 45

4.2.4 K t qu nghiên c u ng c a t h n kh nhanh in vitro 47

4.3 K t qu nghiên c u ng c a các ch n kh hoàn ch nh .49

4.3.1 K t qu nghiên c u ng c a n n kh o cây inh hoàn ch nh .49

4.3.2 K t qu nghiên c u ng c a n IBA n kh o cây hoàn ch nh .51

4.3.3 K t qu nghiên c u ng c a t h n kh o cây hoàn ch nh 53

4.3.4.K t qu nghiên c u ng c a t h n kh o cây hoàn ch nh .55

4.4 K t qu giá hi u qu các công th c t o r in vitro n t l s ng c a cây u ki n ex vitro 57

PH N 5: K T LU NGH 60

5.1 K t lu n 60

ngh 60

TÀI LI U THAM KH O 61

I Ti ng Vi t 61

II Ti ng Anh 63

III Internet 65

PH N 1

1.1

Cây Polyscias fruticosa (L.) Harms) thu c h Nhân sâm

Polyscias fruticosa (L.) Harms). c bi t là r c ph n chính có

giá thành s n ph m c

quy nh s thành b i c a toàn b quy trình nuôi c y

Xu t phát t th c ti góp ph n hoàn thi n quy trình nhân gi ng in

vitro , chúng tôi xu tài: Nghiên c u ng c a

m t s ch ng th c v n quá trình nhân nhanh in vitro cây

1.3

s ch b nh, góp ph c nhu c u l n v gi

ng hi n nay

Th c hi tài giúp sinh viên hoàn thi n v c ki n th c lý thuy t l n

th c ti n, mang l i nh ng kinh nghi m và tác phong làm vi c khoa h c cho công tác sau này

PH N 2

T NG QUAN TÀI LI U

2.1

2.

Chi Polyscias Forst & Forst là m t chi trong th c v t có hoa thu c H Cu ng

[2] Chúng có các lá d ng lông chim Theo APG thì chi này là

m t nhóm c n ngành và có th s c chia tách (ho c h p nh t) v i m t s chi

- Polyscias balfouriana Bail.): Lá

- Polycias guilfoylei Baill): Lá kép có 7 lá chét;

- Polyscias filicifolia (Merr) Baill.): Lá kép có 11

(Polyscias balfouriana Bail.)

c

(Polycias guilfoylei Baill)

(Polyscias filicifolia (Merr) Baill.) (Polyscias fructicosa (L.) Harms)

2.2

phân nhánh, mang nhi u v t s o to, màu xám Lá to, m c so le, kép lông chim 2 - 3

phát tri n thành b to cu i [2]

Hoa-

Bao hoa: ài hoa

2-c 2-cây 2-con m 2-c t h e V i m t

r m m, nhi u ho t ch t, r a s ch R nh nguyên, r to ch dùng v r Thái r

2.2.4

h p ch t polyacetylen là panaxynol, panoxydol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn

- 3, 10 diol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on và heptadeca - 1,8 (Z)

- dien dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on Hai h p ch t sau ch

y có trong các cây thu c chi Panax và h Araliaceae Trong r

trùng tiêm mao Paramoecium caudatum và m t s ng v t nguyên sinh khác trong

c s ng ch ng choáng

l amip c p Sau 10 ngày h t tri u ch ng lâm sàng, và sau 16 ngày xét nghi m l i, trong phân h t th amip th c huy t, h t kén

ng kháng Entamoeba histolytica

kén và có tác d ng kích thích mi n d ch gây chuy n d ng lympho bào trong thí

nghi m nuôi c y in vitro.

vitro, t ch c não ho c gan v i d ch chi ng ho

inh [55].

và cs [40]

và 3

[28],[51]

WHO,

B n ch t c a quá trình này là m t quá trình ho t hóa, c ch các gen Trong

t bào xung quanh Khi t c tách riêng r , tác d ng c ch c a các t bào

công c vô cùng h u ích Trên th c t có nhi u loài th c v t nhân gi ng h u tính

ng h u tính b ng h t m c dù cho h s nhân gi ng cao,

cho ra các cây con không hoàn toàn gi ng b m c v hình thái và thành ph n hoá

nhân gi ng h u tính có s phân ly r t l n v ng và thành ph n tinh d u [47]

t ti n và k thu t cao nên ch có hi u qu i v i nh ng cây có giá tr cao ho c

Tuy v ng in vitro c s d ng r ng rãi

ph c v nh ng m

- Duy trì và nhân nhanh các ki u gen quý hi m làm v t li u cho công tác

ch n gi ng

- Nhân nhanh và duy trì các cá th u dòng t cung c p h t gi ng các

c li u thu c nhóm cây thân th o

- Nhân nhanh và kinh t các ki u gen quí hi m c a gi ng cây lâm nghi p và

- Nhân nhanh u ki n vô trùng và cách ly tái nhi m k t h p v i làm s ch virus

ph n trong ngân hàng gen

L y m u và x lý m u

l nhi m b nh th p [39]

Tái sinh m u nuôi c y

nghiên c u Quan tr ng nh t là c n c n tr ng thái sinh lý c a m u Kh

thành công c a nuôi c y mô, t bào ph thu c ch y u vào tr ng thái tu i c a tbào, càng g n tr ng thái phôi sinh bao nhiêu thì nuôi c y càng có kh

ngh (ch i nách)

Nhân nhanh ch i

sáng t i thi u là 1000 lux Ánh sáng tím là thành ph n kích thích phân hóa m nh, nhi thích h p t 20-300C

c s n xu t gi ng cây tr c th c hi n trên quy mô công

D.floribunda ch t o ra 8 - 10 cây trong m [38], và Cam th o ch cho 5 - 7 cây n u nhân gi ng b ng cành [48] H s nhân gi ng c a cây Hà th là 105/

rinh n hoàng cung, h s nhân gi ng vô tính truy n th ng là 6 - 7

in vitro h s này có th lên t i 2 x

-i cho qu thu ho ch và nhân g-i ng t h t

Nh t B

tr thành công c c n thi t trong công tác gi ng cây tr ng

2.3.6.

V t li u nuôi c y

V t li u nuôi c y là ngu n nguyên li u kh u cho nuôi c y mô t bào th c

v t V t li u dùng cho nuôi c y mô-t bào th c v t có th là h u h

trên cùng cây có th phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi c y, vì

v y vi c l a ch n v t li u nuôi c y ph vào tr ng thái sinh lý và tu i c a

và phát sinh hình thái, quy n thành công c a quá trình nuôi c y Thành

c y ngu n cacbon h u ki n b t bu c Ngu n cacbon thông d ng nh t

hi n nay là saccharose, ngoài ra có th s d ng glucose, maltose [12]

v ng nên c n b sung, nh t là nhóm vitamin B [31]

+ Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan tr ng trong nhi u ph n ng

i ch t [31]

Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia t o coenzyme c a chu i hô h p [31]

+ Myo-inositol: Có vai trò trong sinh t ng h p thành t bào, màng t bào,

- Các ch t h nhiên

D ch th y phân casein: Ch a nhi u amino acid [31]

bào, mô nuôi c y [31]

yrolodon (PVP), acid ascobic [31]

- pH c a ng

nuôi c y s n sinh ra các acid h

ng nuôi c y, có vai trò quan tr ng trong quá trình phát sinh hình thái th c v t

ng và y u t n i sinh c a m u c y [31]

D a vào ho t tính sinh lý phân ch ng thành 2 nhóm: Nhóm

nhà khoa h iên c u và d n m r ng hi u bi t v nhóm ch t này Auxin

th c v t t p trung nhi u các ch i, lá non, h t n y m m, trong ph n

c s d ng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân t o),

thành ch i bên và c ch ng dãn dài c a t

ch u ng c a cytokinin Ngoài ra, cytokinin còn làm ch m s già hóa [30]

d ng chính trong vi c ho t hóa phân bào c a mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây

2.

nên th gi i có r t ít công b nghiên c u v nó Tuy v y, t

n g t vài các công trình nghiên c u khác v loài này m i

c a mình v tác d ng l i ti u c a loài này [50] Nghiên c c th c hi n theo

chu t b b ng u ng Các tác d ng l i ti u c a d ch tri

b c ti ng natri và kali K t qu ch ra r inh

ng l i ti u v i các thu c l i ti u furosemid chu n

5,25% sodium hypochlorite), theo t l là 20, 25 và 30% trong th i gian 10, 15, 20

b sung BA m c 0,0;1,0; 3,0; 5,0 mg / l và kinetin m c 0,0; 0,5;1,0; 2,0; 4,0 mg / l, v i 3 g / l than ho t tính Các ch i tái sinh c c y chuy ng

0,0; 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 và 4,0 mg / l ho c IBA m c 0,0; 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 và 4,0 mg

t phù sa v i các t l 1: 0, 1: 1, 1: 2 hay 1: 3 K t qu cho th y, kh trùng b ng

n BA 3,0 mg / l và 2,0 mg / l kinetin cho th y t l ch i tái sinh cao nh i

ng có b sung NAA v i n 1,0 mg/l có s r và chi u dài r cao nh t

phân tích di truy n tác gi a ch c m u gi ng có ngu n g c t

n xu t thu c

u ki n in vitro, nhi u các công trình công b ch y u v nghiên c u

t bào cây Polyscias fruticosa (L) Harms [13] Các m u cây con inh

saccharose 30g/l

c m ng t o r K t qu cho th y, b sung 2,4 - D 2,0mg/l cho t l t o s o

ra nhi u K t qu này m ra tri n v ng trong nghiên c u nuôi c y r

V nhân gi ng

chí Khoa h c và Phát tri n công ngh 2013 Nghiên c u g m 4 thí nghi m nghiên

c u ng c a giá th , chi u dài cành, v trí cành giâm và n ch u

phát tri n cao nh t v chi u cao ch ng kính than (0,51 cm), slá/cây cao nh t (3 lá/cây) và s r (4,2 r /cây) S d ng cành thân có chi u dài cành

t o cây gi ng bán ra trên th ng Khi nhu c u gi ng

in vitro có nh v t ch t, trang thi t b , hóa ch t

lo t trên nhi u các báo, t p chí

ng t t sau 8 tu n nuôi c y và t o 2-3 ch i/m u sau 4 tu n ti p theo Giai

mg/l IBA cho t l t o c m ch t cao nh t 8,87 ± 1,60 ch i sau 10 tu n nuôi c y

-ng k t qu -nghiên c u này, tác gi cho r -ng có th hoàn thi n thành m t

ng nhu c u v ngu n nguyên li u cho ngành s n xu c ph

u s c tái sinh t t nh t và nhanh nh t

ng MS có b

trong th i gian 15 phút làm nguyên li u nuôi c y cho hi u qu cao v i m u vô trùng

(3,10), chi u cao ch i (3,83 cm/ch i), s lá (8,54), chi u dài là 2,24cm/lá và chi u

nhanh ch i là LV có b sung BA (0,3 mg/l) và sucrose (30g/l) cho hình thành 4,36

T các công b trên chúng tôi nh n th y các k t qu công b i

ng nghiên c u khác nhau nên m i tác gi ng cách b trí thí nghi m

c u mà s thi t k các thí nghi c l p v i các nghiên c u trên ch v i mong

trình nuôi c y

PH N 3

3.1.1.

cây thu c Hà N i - Vi c li ti n hành các thí nghi m nghiên c u

- Kh trùng m u: Ti n hành trong box c y vô trùng, kh trùng b ng HgCl2

3.4.2

và CNSH thu c Trung tâm Nghiên c u tr ng và ch bi n cây thu c Hà N i - Vi n

c li u - B Y t

Các thí nghi c b trí hoàn toàn ng u nhiên, m i công th c 3 l n nh c l i, m i

l n nh c l i 15 m u

ng nuôi c y

ng MS (Murashige và Skoog, 1962)

nhau tùy t ng thí nghi m

ng nuôi c c h p kh trùng 1210C, áp su t 1,1 atm trong 25 phút

u ki n nuôi c y: Các d ng c c s d ng trong nuôi c y: dao, kéo,

M u c y: Ng n ch t thân in vitro dài t 1 - 1,5 cm.

Môi ng n n: MS + 30 g/l saccaroza + 5,8 g/l agar

Thí nghi m 8 Nghiên c u ng c a IBA và kinetin n kh

Tiêu chu n cây: Cây kh e m nh, cao t 2,5 - 3 cm; có 6-8 lá; có 7-10 r ; r tr ng

c tr ng vào giá th t: tr u: phân vi sinh (6:3:1)

.

PH N 4

in vitro

i v i th c v t là kích thích s phân chia t bào m nh m ,

T l tái sinh ch i (%)

S ch i/

m u (ch i)

Chi u cao ch i (cm)

S lá/ch i (chi c)

Tr ng thái ch i

Hình 4.1: M u l y t cây in vivo Hình 4.2: Ch tái sinh sau 30

ngày nuôi c y

Qua b ng s li u b ng 4.1 cho th y:

h p là 0,69 ch i/ m u, ch ng ch i trung bình Khi b sung

t là 97,78% (CT 6)

t cao nh t là 1,33 ch i/ m u (CT 4), ch ng ch i t t Tuy nhiên, khi n ng BAP ti p t 2,5-3 mg/l thì s ch i/ m u tái sinh l i gi m xu ng còn 0,98

ch i/ m u (CT 6), ch ng ch i trung bình

V i giá tr LSD c a tái sinh là 5,72 thì t l tái sinh c a công th c 1 , công

cytokinin có vai trò trong vi c ho t hóa quá trình phân bào, nh ác d ng tái

qu cao nh t 1,33 ch i/ m u, ch ng ch i t p t ng

4.2.

in vitro 4.2

T l t o

c m ch i (%)

S ch i/

m u (ch i)

Chi u cao

ch i (cm)

S lá/ch i (chi c)

Tr ng thái ch i

Ch i t t (+++): Ch i kh e, m p, lá xanh th m; Ch i trung bình (++): Ch i

kh e, lá xanh; Ch i kém (+): Ch i y u, nh , lá kém xanh

công th c thí nghi m (ch p sau c y 30 ngày)

Qua b ng s li u trên cho th y:

Công th i ch ng (không b sung BAP) cho th y t l t o c m ch i là

lên 3 mg/l thì t l t o c m ch i l i gi m nhanh còn 64,46%, s ch i/m u gi m xu ng còn 2,92 ch i/ m u, ch ng ch i kém h n, bi u hi n là ch i nh , lá kém xanh

bào, nh ng c m ng t o c m ch i cho cây [22] Chính vì v

Trong nhóm cytokinin ngoài BAP còn có kinetin c dùng thông

nghi m sau 30 ngày nuôi c y c trình bày b ng 4.3

T l t o

c m ch i (%)

S ch i/

m u (ch i)

Chi u cao

ch i (cm)

S lá/ch i (chi c)

Tr ng thái ch i

Ch i t t (+++): Ch i kh e, m p, lá xanh th m; Ch i trung bình (++): Ch i

kh e, lá xanh; Ch i kém (+): Ch i y u, nh , lá kém xanh

công th c thí nghi m (ch p sau c y 30 ngày)

1,26 ch i/ m u (CT 2) lên 2,22 ch i/ m u (CT 6) Tuy v y, ch ng ch i

là 95% , giá tr LSD c m ch i là 0,18 thì công th c 5, công th c 6 có s

i m tin c y là 95% Do v y, chúng tôi k t lu n trong thí nghi m này n kinetin t t nh t cho s ch i trên c t cao nh t là 3,0 mg/l

t cytokinin có tác d ng phân chia t c bi t là ch i nách [30] Khi

n hi u qu c a quá trình nhanh nhanh in vitro.

4,78 ch i/ m u (2,60 cm) trong 45 ngày lên 4,80 ch i/ m u (3,00 cm) trong 60 ngày

h s nhân gi ng cao nh t và ch ng cây gi ng t t K t qu c a hai thí nghi m