Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)

Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)Phân lập và xác định đặc tính enzyme NacylLhomoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây (Luận văn thạc sĩ)

B GIÁO D O

VI N KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM

VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH V T

-*** -NGUY N TH THU HÀ

B GIÁO D O

VI N KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM

VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH V T

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L), thu c h Cà (Solanaceae) là loài

cây nông nghi p ng n ngày, tr ng l y c ch a tinh b t Khoai tây có ngu n

g c vùng cao thu c dãy núi Andes, Nam M

t m quan tr ng th ba sau lúa và ngô

Khoai tây có giá tr ng cao vì trong khoai tây có ch a các vitamin, khoáng ch t, caronoids và phenol t nhiên Khoai tây không ch c mà

c ph m M t nhà khoa h c c a Vi n Th c ph m Anh m n trong khoai tây ch a h p ch t sinh h c cucoamin có tác d ng làm gi m huy t áp

n ng xuyên Trong m t nghiên c u khác g

i h c Y Toronto Canada n th y trong khoai tây có nhi u

ch t ch ng oxy hóa Nó có kh a quá trình lão hóa, h n ch s phát

Theo thông tin c a C c Tr ng tr t, B Nông nghi p và Phát tri n Nông thôn, Vi t Nam là qu c gia có kh hát tri n m nh khoai tây, nhi u nh t

ng b ng B c B , mi n núi phía B c, B c Trung B và Tây Nguyên, v i

di c tính 200.000 ha Tuy nhiên, hi n nay di n tích tr ng khoai tây

ch t 30.000-35.000 ha, v t 10-11 t n/ha M t trong nh ng nguyên nhân d n gi t và di n tích tr ng khoai tây là do tình

tr ng gây h i c a sâu b c bi t là b nh th n Erwinia

gây ra, ph bi n nh t là loài Erwinia carotovora subsp carotovora (Ecc)

B nh gây ra ch y u trên các loài cây tr ng có giá tr kinh t cao thu c h cà,

h th p t , h b u bí, h hành, m t s nh gây h i cho cây t

c tr ng ng ru n khi thu ho ch và b o qu n

ch i thông tin gi a các t bào và ph thu c m qu n th ki m

c và các ho ng c a t bào vi khu n Trong

AHL-Bacillus sp

- Th nghi m hi u qu phòng tr b nh th khoai tây c a các

ki n phòng thí nghi m

tài

c

- Th c hi tài này giúp tôi có thêm kinh nghi m, ki n th c v các k

phân h y AHLs t vi khu n n ng quan tâm, ngoài ra còn cung c p thêm hi u bi t v các k thu t khác mà công ngh sinh h c hi n

khoa h c, các v nghiên c tài còn có ý

c ti n Các ch ng vi khu n có ích mang enzyme phân h y AHLs s d c ch s phát tri n c a vi khu n gây b nh th

nhi u loài cây tr ng có giá tr ho c chuy n nh ng gen mã hóa enzyme này vào cây tr ng giúp cây tr ng ch ng ch c v i b nh h i

1.1 T ng quan v cây khoai tây

1.1.1 Ngu n g a lý và s phân b c a cây khoai tây

tr c có t m quan tr ng th ba sau lúa và ngô Vi t Nam Tuy nhiên, theo th ng kê c a T ch p qu c (FAO),

nh n tích tr ng khoai tây ch ng trong kho ng 35.000 - 40.000 ha (B ng 1.1) n tích t p trung các t nh

th ph n ch y u b i côn trùng, ong vò v mang ph n hoa t n cây khác Sau khi khoai tây ra hoa, m t s gi ng cho ra qu màu xanh lá cây gi ng

ch a 300 h t (Wikipedia)

1.1.3 Vai trò c a cây Khoai tây

Khoai tây là m t ngu n cung c c d i dào Theo báo cáo c a

T ch c Nông p Qu c (FAO) s ng khoai tây toàn Th

ng c v cung c p 844mg Kali (g chu i), 28%

kh u ph n s t hàng ngày, 43% kh u ph n vitamin C, 35% kh u ph n vitamin B6 và nhi u ch

khi m t s nhà khoa h c c a Vi n Th c ph m Anh m n, trong khoai tây có h p ch t sinh h c cucoamin có tác d ng làm gi m huy t áp n u

Không ch c s d c và th c ph m khoai tây còn

c s d c Qua nghiên c u, GS Venket Rao, Khoa Dinh

i h c Y Toronto, Canada, phát hi n th y trong khoai tây có nhi u ch t ch ng oxy hóa Nó có kh a quá trình lão hóa, h n

và gây nhi cho công tác phòng tr và b o qu n Th i gian b nh

r t khó phát hi ng thi t h i l n trong th i k ng

i gian b o qu n, tr nông ph i v i nh ng khu

v c s n xu t thu c vùng nhi i b nh th khoai tây, cà r t, hành tây, b p c y u là do vi khu n Erwinia gây nên

Erwinia carotovora pv carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv atroseptica (Eca) và E chrysanthemi (Ech) Ecc

(Jerenial), (Randall và cs)

Ecc

(blackleg) trên khoai tây Tuy nhiên,

Vi khu n xâm nh p ch y u qua v t c Vi khu n t n

hay nh ph thu c vào nhi u y u t u t nhi m và ch t

ng c gi vai trò quy nh M gây h i c a b nh r t nguy hi m b i

vì vi khu n này có kh n l c ph m vi kí ch

Hình 1.3 n s ng trong chu k gây b nh c a vi khu n gây b nh

th các lo i rau c thu c chi Erwinia, Pectobacterium và Dickeya

(Allen và cs., 2009)

khoai tây sau thu ho ch b t n công b i Ecc Ti p theo, h

nh ng thi t h i nghiêm tr ng gây ra b i Ecc cho khoai tây sau thu ho ch t i

San Joaquin Valley (Farrar và cs., 2009)

c thông báo có m t t t c các vùng tr ng khoai tây trên c c

bi t do th i gian b o qu n khoai tây i dài (8- u

ki n th i ti t nóng m khi n cho b nh là m i nguy hi m nghiêm tr ng gây thi t

h t và ch ng c khoai tây Khoai tây gi ng sau 8 tháng b o

qu ng b hao h t kho ng 30-50%, th t lên t i 70%

t ng s khoai b o qu n M t trong nh ng nguyên nhân gây ra thi t h i này là do

thu ho ch cho th y b nh xu t hi n v i t l th p n tháng 3 do nhi t không thu n l i cho vi khu n xâm nh p gây b nh Trong nh ng tháng mùa hè

b nh th phát tri n m nh nh t, cao nh t c a b nh vào tháng 6, 7, 8

B nh ti p t c phát sinh gây h i m b nh gi m d u ki n ngo i

c nh không thu n l i (tháng 10 n tháng 12) (Tr n Th Thúy) B nh th

c t trong danh sách các b nh c n ph i ki m nghi m c gi ng khoai tây theo tiêu chu n qu c gia do B NN & PTNT và B Khoa h c và Công ngh ban hành (TCVN 8549-2011)

hi u bên trong vi khu n và c i hóa ho ng c a m t s c hi u

u hòa bi u hi n gen QS có s tham gia c a gen luxR và luxI mã hóa cho nhân t phiên mã LuxR và AHL synthase (LuxI) Phân t tín

hi t t c m ng (autoinducer) vì nó ki m soát quá trình t ng h p chính b n thân phân t u khi n gen sinh t ng h p AHL synthase H u h t vi khu n gây b nh s d ng h

c nghiên c u cho th y r n các gen gây b nh(Hình 1.4) (Coutteau và Goossens, 2013; Dong và cs., 2000; Whitehead và

Hình 1.4 Quorum Sensing vi khu n Gram âm

(r: gen mã hóa cho nhân t phiên mã LuxR (R);

i: gen mã hóa cho AHL synthase LuxI (I).

các loài vi khu n gây b nh thu c chi Erwinia có t n t i ít nh t hai h

th nh b i b n ch t c a các tín hi u hóa h c liên quan: acyl homoserine lactones (AHLs; còn g i là tín hi u AI- c t ng h p b i nhóm protein LuxI; và tín hi u AI- c t ng h p b

N-ng LuxS H th N-ng QS m t s loài Erwinia ng trong

u hòa bi u hi n gen, t ng h p các ch i th c p và kh nh trên cây ch Nghiên c u này c a chúng tôi t p trung chính vào kh n sinh phân t tín hi u AHLs c a loài vi khu n Erwinia carotovora subsp

(Barnard và Salmond, 2006; Engebrecht và cs., 1983; Nasser và cs., 1998; Schaefer và cs., 1996)

Hình 1.5 C u trúc phân t N-acyl homoserine lactones

(Barnard và Salmond, 2006)

Phân t tín hi u N-acyl homoserine lactones (AHLs)

b i m t vòng homoserine lactone b t bi n g n v i m t chu i bên N-acyl Các phân t tín hi u AHLs khác nhau v c u trúc c a chu i bên N-acyl có th thay

i (Hình 1.5) M i t bào trong qu n th vi khu u có kh n sinh

ra các tín hi u QS, cho bi t s hi n di n c a chúng v i các t bào khác trong

LuxI autoinducer synthase LuxI t ng h p N-AHLs:

N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C6-HSL), s d ng S-adenosyl methionine và

n t o ra các AHLs c n thi t -(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL), N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6- (Toth và cs., 2003; Val và Cronan, 1998)

N-acyl homoserine lactone

ng phân LuxR

ng c a QS

Erwinia nhóm 1

Ecc EC153 3-oxo-C8-HSL

và3-oxo-C6-HSL

AhlI ExpR T ng h p enzyme

ngo i bào

Ecc SCC3193 3-oxo-C8-HSL

và3-oxo-C6-HSL

AhlI ExpR1(ExpR)*,

ExpR2

Gây b nh, t ng

h p enzyme ngo i bào

Erwinia nhóm 2

Ecc ATCC39048 3-oxo-C6-HSL CarI CarR,

EccR(ExpR)*,VirR

T ng h p kháng sinh, gây b nh, t ng

h p enzyme ngo i bào

Ecc SCRI193 3-oxo-C6-HSL AhlI ExpR, VirR,

[CarR(cryptic)]

Gây b nh, t ng

h p enzyme ngo i bào

Ecc 71 3-oxo-C6-HSL AhlI

(HslI)*

ExpR1(ExpR)*,ExpR2

Gây b nh, t ng

h p enzyme ngo i bào

Eca SCRI1043 3-oxo-C6-HSL ExpI ExpR, VirR Gây b nh, t ng

h p enzyme ngo i bào

ExpI ExpR T ng h p enzyme

pectinase

ng 1.2 thì h u h t các loài thu c chi Erwinia có m i quan

h m t thi t gi a kh n sinh phân t tín hi u AHLs và kh

b nh trên cây ch chúng tôi ti n hành nghiên c u này

á

in vitro và in vivo

1.3

khoai tây

1.3.1 Quorum Quenching

Quorum quenching c n m t quá trình phá v h th ng QS

n phân t tín hi u AHLs (Yi-Hu Dong và cs., 2007) QS giúp

y u cho s s ng sót ho c sinh ng c a t bào vi khu n h

th ng QS có th c ch các ki u hình nh nh, ví d c tính

c a vi khu n gây b nh

g m: i) c ch sinh t ng h p AHLs b ng cách n ho ng c a protein AHL synthase (LuxI-type synthase); ii) Phá h y các phân t AHLs

b ng enzyme AHL-acylase và AHL-lactonase n tr quá trình tích

AHLs và iii) n s hình thành ph c h p AHL/LuxR (Hình 1.6)

Hình 1.6 Quorum Quenching

(Lade và cs., 2014)

c ba nhóm enzyme chính làm b t ho t

ch bi i/phân tách phân t AHL Enzyme AHL lactonase

acyl-homoserines (Dong và cs., 2000, 2001) phân h y

ph r ng các lo i phân t AHL không k c và v trí thay th trong chu i acyl Nhóm th hai là enzyme AHL acylase phân tách liên k t AHL amide t o ra axit béo t do và vòng homoserine lactone ring (Leadbetter và

t tín hi u (Bokhove, 2010) (Hình 1.7) Nhóm th ba là enzyme AHLoxidoreductase c l i v i enzyme AHL lactonase và AHL acylase, oxy hóa ho c kh chu i bên acyl c a phân t AHLs làm bi i phân t này Các

ph n ng này không phân h y phân t tín hi u mà s bi i phân t nh

tín hi u và th quan c a AHL (receptor)

Hình 1.7 phân h y AHL b ng enzyme (1) AHL lactonase và (2) AHL acylase

K t c phát hi n loài vi khu n Bacillus sp 240B1 (Dong và

cs., 2000), ho ng enzyme AHL lactonase v c ti p t c tìm th y và nghiên c u r t nhi u loài vi khu Agrobacterium tumefaciens

(Zhang và cs., 2002; Carlier A và cs., 2003), Arthrobacter sp và

Rhodococcus sp (Park và cs., 2003), R erythropolis (Uroz và cs.,

m c a QQ khi n cho nó tr thành chi c phòng tr b nh

tính nh n thu c, b i nhi m và kháng kháng th (Chen và cs., 2013)

1.3.2 ng d ng c a Quorum quenching

ng d ng công ngh sinh h c phân h y AHL, m i,

y h a h n cho vi u tranh v i vi khu n gây h u s quan tâm c a các nhà nghiên c u Vì nhi u vi khu n gây b ng

ng d u tiên c a chi c QQ trong vi c b o v cây tr ng

ch ng l i vi sinh v c ti n hành b i Dong và c ng s , 2000 Dong và

c ng s c gen aiiA240B1 mã hóa cho enzym AHL lactonase

AiiA t ch ng vi khu n Bacillus sp 240B1 Vai trò c a gen này trong sinh

t ng h c c ng c khi bi u hi n trong vi khu n gây b nh E.carotovora SCG1 K t qu cho th y vi khu n gây b nh bi u hi n gen aiiA240B1 gi m kh

i phóng AHLs và kh nh trên m t s loài cây tr

khoai tây, cà r aiiA c chuy n thành công vào tác nhân

gây b nh E carotovora làm gi m b nh th c i th o Ch ng vi

khu n B thuringiensis c phát hi n mang gen aiiA mã hóa enzyme

lactonase b i Lee và c ng s có kh y AHL E coli tái t h p

IBN110 v i E carotovora, ch ng AHLs

và ho t tính enzyme pectate lyase c a vi khu n gây b nh E carotovora trong

ng (Park và cs., 2003) Mei và c ng s n ra m t lo i

t ch ng vi khu n B macrorestinctum có kh y m nh phân t

AHLs Khi x lý B marcorestinctum lên lát c t c c nhi m vi

khu n gây b nh E carotovora subsp carotovora (Ecc), tri u ch ng th

ng lây nhi m v i Ecc (Park và cs., 2010).

Vi khu n Microbacterium testaceum c phân l p t b m t

lá khoai tây, có ho ng phân h y AHLs Gen aiiM t n gen c a

c phân l p Protein AiiM tinh s ch th hi n ho t tính phân h y AHLs

m nh c d ng chu i dài và ng n Phân tích s c ký l ng ch ng t r ng AiiM ho t

a vi khu n Ecc c

R t nhi u nghiên c u ng d ng QQ trên th gi p t c

c nghiên c u cho chúng ta th y t m quan tr ng c a vi c s d

nghiên c c ki m soát b nh h i b ng các tác nhân sinh h c

khôi ph c khi ti p xúc v i d ch nuôi c y ch ng vi khu n d ng d i không b

t bi n có ch a phân t AHLs Nghiên c u s d ng các phân t AHLs cho

th y r ng violacein có th c c m ng t ng h p b i các phân t AHLs

chu i ng n có chi u dài chu i N-acyl t 4-8 Cacbon và các phân t AHLs có chi u dài chu i N-acyl t n 14 Cacbon không có kh m ng

t ng h p s c t này Do v y, ch ng vi khu c s d ng làm ch

Ch t ch t bi n c a C violaceum không có

kh ng h p violacein Kh ng h p violacein c a ch ng vi khu c khôi ph c khi b sung các phân t AHLs chu i dài (chu i N-

acyl có chi u dài t 10- c ch t ng h p s c t này khi thêm các phân t AHLs chi u dài chu i N-acyl t 4-8 Cacbon Ch ng VIR07

có ph n ng t ng h p violacein khi AHLs khu ch tán t m t s ch ng vi khu n s n sinh AHLs ch Do v y, có th s d ng ch ng này làm

ch th sinh h nh kh n sinh AHLs chu i dài (Morohoshi

và cs., 2008).

T LI U, N PHÁP NGHIÊN C U

- M u cây cà d i không b b nh

- M u c khoai tây s ch b nh

- Ch ng vi khu n s n sinh AHLs gây b nh th E catovora subsp carotovora (Ecc)

- Ch ng vi khu n ch th C violaceum CV026, VIR07.

Các lo i hóa ch t thông d s d ng trong quá trình nghiên c u

mua t các hãng Merck, Sigma, Bio basic

Hóa ch t chuyên d ng: 3 lo i AHLs t ng h p: homoserine lactone (C6-HSL); N-(3-Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (C8-HSL); N-decanoy-L-Homoserine lactone (C10-HSL)

trùng Omron (Nh t B n t (Anh), máy vortex, t l nh b o qu n

m ch), t nuôi cây Jeiotech (Hàn Qu c), t s y Lenton (Anh), máy khu y t Fisher (M a B môn B nh h c Phân t - Vi n Di truy n Nông nghi p

Lu c th c hi n t i B môn B nh h c Phân t - Vi n Di truy n Nông nghi p t

- N i dung 1: Phân l nh kh y AHLs c a vi khu n n i sinh t cà d i

- N i dung 2: Th nghi m ng c a th i gian nuôi c y VKNS

- N i dung 3: Th nghi m các lo ng nuôi c y VKNS nh

n ho t tính enzyme AHL lactonase

- N i dung 4: nh ho t tính enzyme AHL lactonase c a các

chu n b c ti p theo Ngâm m u trong c n 70% trong 3 phút

c c trùng vào d ch nghi n và tr u t o thành dung d ch g c Chu n b 6 ng eppendorf 1.5ml, m i ng ch a 900 c c t kh trùng Hút

100 l d ch g c nh vào ng 1 tr u, ti p t c hút 100 l d ch t ng 1 nh

- i ch g m hai ch ng Ecc và CV026 c y sát nhau

- i ch ng âm là ch ng Ecc và ch ng CV026 c c y riêng bi t

u ý: Thí nghi c làm nh c l i 3 l n và k t qu c th hi n sau 24h.

h nghi m ng c a th i gian nuôi c y VKNS

n ho t tính enzyme AHL lactonase.

2.3.3.1 V t li u nghiên c u:

- Hóa ch t: AHL t ng h p C6-HSL

u:

ch -HSL 280C trong các kho ng th i gian khác nhau 1h, 6h và 24h

cách b sung vi khu n ch th CV026 và ti p t c nuôi c y trong th i

gian 24h N u xu t hi n màu tím ch ng t phân h y

h t

- Ho

tái t o vòng lactone c a phân t AHL trong dung d a

d ch nuôi c y VKNS ch -HSL 280C sau các kho ng

th i gian khác nhau 1h, 6h ho c 24h c tr n v ch 1N HCl sau khi 40

c b sung vào h n h t ng trung tính S

tái t o vòng lactone c a phân t AHL trong dung d ch axit c mô

ho c C10-HSL 28oC trong 6h

c tr n v i 10 µl dung d ch 1N HCl Sau khi 4oC trong 48h,

c b sung vào h n h

t ng trung tính

+ S có m t c a phân t AHL tái t o l i vòng lactone trong môi

nh b ng cách b sung ch ng vi khu n ch th

CV026/VIR07 và ti p t c nuôi c y l c 30oC trong 24h

- N u d ch nuôi c y chuy n sang màu tím ch ng t vòng lactone c a phân t c khôi ph c và ho t tính enzyme AHL lactonase

h nghi m hi u qu phòng tr b nh th khoai tây c a các ch ng vi khu n n i sinh có ho t tính enzyme AHL lactonase trong u ki n phòng thí nghi m.