Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy Phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. (Khóa luận tốt nghiệp)

L I C

c h t tôi xin g i l i c c t i PGS.TS Nghiêm

Ng c Minh và TS Lê Th Nhi Công ng d n và dìu d t tôi trong quá trình nghiên c u, h c t p và hoàn thành khóa lu n này

ng và cùng toàn th các cán b nhân viên c a c bi t

là Thanh và ch b o tôi trong su t quá trình nghiên

c u hoàn thành khóa lu n c a mình

Nguy n Th và các th y cô Khoa Công ngh Sinh h c và Công ngh Th c

ph i h c Nông Lâm cùng v i o Vi n Công ngh Sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam u ki tôi trong su t

th i gian h c t p, nghiên c u t i Vi n

tôi r t nhi tôi có th hoàn thành t t khóa lu n này

Tôi xin chân thành c

Sinh viên

Nguy n Th

DANH M C CÁC B NG

B ng 2.1 Vai trò c a m i ngo i bào trong màng sinh h c 11

B ng 3.1 Danh m c m t s hóa ch t s d ng 20

B ng 3.2 Các lo ng nuôi c n 20

B ng 3.3 Danh m c m t s máy móc và thi t b s d ng 21

B ng 3.4 Các thành ph n c a ph n ng PCR 28

B ng 4 m, hình thái khu n l c các ch ng vi khu n phát tri ng khoáng Gost có b sung 50 ppm phenol (có và không có glucose) 34

B ng 4.2 M ng c a trình t n gen 16S rRNA ch ng VTPG5 so v i m t s ch ng vi khu n 41

DANH M C CÁC HÌNH

Hình 2.1 C u trúc hóa h c c a phenol 4

Hình 2.2 C u trúc không gian c a biofilm v i m i ngo i bào xung quanh 12

chu trình nhi t ph n ng PCR 28

Hình 4.1 M c nhi m d u l y t bãi sau thành ph 32

Hình 4.2 M ng khoáng Gost d ch có b sung 50 ppm phenol (có và không có glucose) 33

Hình 4.3 T ng khoáng Gost th ch b sung 50 ppm phenol (A) m u làm giàu không có glucose và (B) m u làm giàu có glucose 33

Hình 4.4 Kh t gi tím tinh th c a màng sinh h c các ch ng vi khu n sau 48h nuôi c y 35

Hình 4.5 Kh o màng sinh h c c a các ch ng vi khu n 36

Hình 4.6 Kh ng c a các ch ng vi khu ng khoáng Gost d ch có b sung 50 ppm phenol 37

Hình 4.7 Hình thái khu n l c (A) và hình thái t bào (B) c a ch ng VTPG5 38

DNA t ng s c a ch ng vi khu n 38

s n ph n gen mã hóa 16S rRNA c a ch ng vi khu n VTPG5 39

Hình 4.10 s n ph m PCR c a ch ng VTPG5 c tinh s ch 40

Hình 4.11 Kh t gi tím tinh th c a màng sinh h c ch ng Rhodococcus sp VTPG5 các nhi khác nhau sau 48 gi nuôi c y 42

Hình 4.12 Bi m quang h nh ng c a nhi n kh o màng sinh h c c a ch ng vi khu n Rhodococcus sp VTPG5 43

Hình 4.13 Kh t gi tím tinh th c a màng sinh h c ch ng Rhodococcus sp VTPG5 các pH khác nhau sau 48 gi nuôi c y 44

Hình 4.14 Bi m quang h ng c n kh o màng sinh h c c a ch ng vi khu n Rhodococcus sp VTPG5 44

Hình 4.15 Kh t gi tím tinh th c a màng sinh h c ch ng Rhodococcus sp

VTPG5 các n mu i NaCl khác nhau sau 48 gi nuôi c y 45

Rhodococcus sp VTPG5 các n phenol khác nhau sau 7 ngày 49

màng sinh h c ch ng vi khu n Rhodococcus sp VTPG5 các n phenol khác nhau 50Hình 4.24 Bi th hi n kh y phenol c a màng sinh h c ch ng vi khu n Rhodococcus sp VTPG5 sau 7 ngày nuôi c y 50

DANH M C CÁC T , C M T VI T T T

Biofilm : Màng sinh h c

Bp : Base pair (c p base)

cm, mm : centimeter, milimeter

DDBJ : DNA Data Bank of Japan

DNA : Deoxyribonucleic acid

i ch ng (m u không có vi sinh v t)EPS : Extracellular Polymeric Substances (h p ch t ngo i bào)kDa : KiloDalton

mg, g, kg : milligram, gram, kilogram

nm, µm : nanometer, micrometer

NOMs : Natural Organic Matters (các ch t h nhiên)

OD : Optical Density (m quang h c)

PAHs : Polycyclic Aromatic Hydrocarbon

PCR : Polymerase Chain Reaction (ph n ng chu i trùng h p)

RNA : Ribonucleic acid

rRNA : Ribosomal ribonucleic acid

µl, ml, l : Microliter, milliliter, liter

M C L C

PH N 1 M U 1

1.1 t v 1

1.2 M c tiêu và n i dung c tài 2

1.3 tài 3

PH N 2 T NG QUAN TÀI LI U 4

2.1 khoa h c c tài 4

2.1.1 m chung c a phenol 4

2.1.2 Màng sinh h c (biofilm) 9

2.1.3 ng c u ki n kh o màng sinh h c (biofilm) c a vi sinh v t 12

2.1.4 i vi sinh v t 15

2.2 Tình hình nghiên c c 16

2.2.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i 16

2.2.2 Tình hình nghiên c c 17

PH N 3 NG, N U 19

3.1 ng và ph m vi nghiên c u 19

ng nghiên c u 19

3.1.2 Ph m vi nghiên c u 19

3.2 m và th i gian th c hi tài 19

3.2.1 m 19

3.2.2 Th i gian 19

3.3 V t li u, hóa ch t và thi t b s d ng 19

3.3.1 V t li u 19

3.3.2 Hóa ch ng 19

3.3.3 Thi t b và d ng c 21

3.4 N i dung nghiên c u 21

3.5 u 22

3.5.1 Thu th p m u 22

3.5.2 Phân l p các ch ng vi khu n có kh d ng phenol 22

3.5.3 o màng sinh h c c a các ch ng vi khu n 23

3.5.4 Kh o sát kh ng và phát tri n c a các ch ng vi khu n t o màng t t trên ngu t phenol 25

3.5.5 Nghiên c u m t s m sinh h c và phân lo i ch ng vi khu n VTPG5 25

3.5.6 ng c u ki n kh o màng sinh h c (biofilm) c a ch ng vi khu n 29

3.5.7 y phenol c a màng sinh h c vi khu n 31

PH N 4 K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 32

4.1 Phân l p và tuy n ch n m t s ch ng vi khu n v a có kh y phenol và v a có kh o biofilm 32

4.1.1 Phân l p các ch ng vi khu n có kh y phenol 32

4.1.2 Kh o biofilm c a các ch ng vi khu c phân l p 35

4.1.3 Kh o sát kh ng và phát tri n c a các ch ng vi khu n t o màng t t trên ngu t phenol 36

4.2 m hình thái và phân lo i ch ng vi khu n VTPG5 37

4.2.1 m hình thái khu n l c và hình thái t bào 37

4.2.2 Phân lo i phân t ch ng VTPG5 d a vào vi nh trình t n gen 16S rRNA 38

4.3 ng c a u ki n s hình thành màng sinh h c ch ng vi khu n l a ch n 42

4.3.1 ng c a nhi 42

4.3.2 nh ng c a pH 43

4.3.3 ng c a n mu i NaCl 45

4.3.4 ng c a carbon 46

4.3.5 ng c 47

4.4 y phenol c a màng sinh h c ch ng vi khu n l a ch n .49

PH N 5 K T LU N VÀ KI N NGH 53

5.1 K t lu n 53 5.2 Ki n ngh 53

TÀI LI U THAM KH O

PH L C

PH N 1

1.1.

T i Vi t Nam, ngành công nghi p d u m n m nh m , s ng

i cho Qu c gia ngu n l i ích kinh t vô cùng to

l n Bên c nh ngu n l i v kinh t mà ngành công nghi p này mang l i là m i hi m

c ti n hành trên bi n, không tránh kh i nh ng s c gây ô nhi m d u m

tràn d u, dò r m tàu ch d u, v ho c dò r ng d n d u ng m trong lòng

c, sinh v t Nh ng ch t gây ô nhi m nghiêm tr c

ng hô h p ng, ho c ti p xúc tr c ti p qua da H u qu l i là vô

i m y tri n v ng cho ngành công ngh sinh h ng và thu hút

c r t nhi u s quan tâm c a các nhà nghiên c u khoa h c trong c

B n ch t c a màng sinh h c (biofilm) là m t t p h p các vi sinh v t g n trên

m t b m t c a v t th r n ho c b m t ch t l ng, t o thành l p màng bao ph trên

b m p màng này b o v các t bào vi sinh v t bên trong nó kh i các tác nhân có h i t ng bên ngoài, h n ch s ng t nh ng bi ng vnhi , pH, n mu i, t dòng ch y và t ng ô nhi m Do m các

vi sinh v t trong biofilm cao nên chúng h tr và liên k t v i nhau m t cách ch t

n nay biofilm c ng d ng r t nhi u trong vi c x lý

c nhi m d u m

chung, chúng tôi ti n hành th c hi tài: Nghiên c u kh o màng sinh

h c c a ch ng vi khu n phân h y phenol phân l p t c nhi m d u b bi n

, t nh Bà R a

-1.2.

M c tiêu c tài:

Phân l p, tuy n ch c ch ng vi khu n v a có kh o màng sinh h c

y phenol c a màng sinh h c ch ng vi khu

u ki n t

1.3.

hoa h cPhân l c ch ng vi khu n v a t o màng sinh h c v a có kh y

o màng sinh h c là ti trong vi c nghiên c u th c hi n ngoài hi ng sau này

c ti nPhát tri c công ngh sinh h ng v i s thành công trong vi c

s d ng màng sinh h c tìm ra các ch ng vi khu n có kh o màng sinh h c

t t giúp x lý ngu c ô nhi m d u ch a h p ch c h i Góp ph n

PH N 2

T NG QUAN TÀI LI U 2.1.

ng, có nhi u lo i vi sinh v t có kh d ng hydrocarbon

ng duy nh a, m các vi sinh v t trong biofilm cao nên chúng h tr và liên k t v i nhau m t cách ch t ch t o thành c u trúc b n v ng giúp kh

hi n nay biofilm c ng d ng r t nhi u trong vi c x c nhi m phenol

c th i nhi m d u nói chung

2.1.1.1.

Phenol là h p ch t h c a chúng có nhóm hydroxyl (-OH) liên

k t tr c ti p v i nguyên t cacbon c a vòng benzen (hình 2.1)

Công th c phân t : C6H6O; công th c c u t o: C6H5OH

Hình 2.1 C u trúc hóa h c c a phenol

2.1.1.2.

u ki ng, phenol là ch t r n, không màu, nóng ch y 43oC, nhi sôi cao 182oC Kh ng riêng 1,06 g/cm3, kh ng phân t 94,11 g/mol, kh

ch y r a, th m màu d n do hút m và phenol chuy n thành màu h ng do b oxi hóa

ch ng ng i mùi c a phenol là 0,04 ppm Phenol ít tan

c l nh, tan nhi u trong m t s h p ch t h

tan vô h n 66oC Phenol r c, r t d cháy, gây b ng n ng khi b

K , 2000) [8]

2.1.1.3 henol

Ngu n g c t nhiên

H p ch c sinh ra t nhiên t s phân h y c a th c v t, các h p ch t

và d u m c t o ra do s t cháy các nguyên li u hóa th ch, do

nhi m ngu n t Chúng không nh ng gây ô nhi ng sinh thái mà

2.1.1.4.

n h sinh tháiPhenol và các d n xu t c c x p vào lo i ch t c cao

a ánh sáng

v i da, m t, màng nh y c i, gây kích ng da và gây ho i t (Clayton và cs,

n hi ng ch i v i nh ng tri u ch t, không có kh

ki m soát, hôn mê d n t i r i lo n hô h p Phenol còn làm ng t i gan, th n,

tu n hoàn máu, ng h th n kinh Li u th p nh t có th gây t vong b ng

ng tiêu hóa là kho ng 4,8 g trong th n 19 phút Nh ng tri u

ch ng do hít ph i phenol trong kho ng 30 - 60 ppm có th gây t i,

m cân, nh u, chóng m t, tê li t chân tay (Bidleman và cs, 1993)

phân lo i là ch t nguy hi m (Aksu và cs, 1990) [11] N i ti p xúc trong

th i gian dài v i các h p ch t phenol có th d n s phát tri n m t cách ch m

,053; 0,044 và 0,033 mg/l (Huang

và cs, 2003) [28] N phenol trong không khí th kho ng 1 mg/m3

t trong th c ph m

v c làng ngh t, nhu m, nh a, gi y, d u ng mang tính t phát, quy mô

nh , thi t b s n xu t th công, l c h u, m t b ng s n xu t nh h p Tình tr ng ô

tình tr ng ô nhi m phenol ngày càng nhi u là do ý th c c i, ý th c b o

v ng c a các ch s n xu t, kinh doanh, nhà máy, xí nghi p

các s c ngoài ý mu n T nh ng h n ch nêu trên d n tình tr ng ô nhi m môi

ng - c bi t nhi m phenol và các ch c h i nguy hi m (SS, BOD5, COD,

v t lý, hóa h c, phân h y sinh h c M i bi i

hi u qu x lý nh nh

t ô nhi c s d phân h y phenol trong m t s ng h p nh nh

t lý: s d ng tia UV hay than ho x lý ngu n ô

h p ph trên v t li u có c u trúc mao qu

i chi phí l n và có th gây ra ô nhi m th

c p Hi u qu không tri vì sau khi qua các v t li u l c v n còn t a phenol và m t khá nhi u th i gian x lý

i v i phenol, phân h y sinh h c th c hi n ch y u làm phá v

c u trúc phân t c a chúng b ng cách s d ng các enzyme m vòng do các ch ng vi khu n t i chính khu v c ô nhi m sinh ra.

hi u qu phân h y sinh h c cao nh t có th c coi là chìa khóa c a công ngh phân h y sinh h ng và cs, 1998) [2]

2.1.2.

2.1.2.1 Khái ni m v biofilm

Màng sinh h c (biofilm) là m t t p h p các vi sinh v t g n trên m t b m t c a

v t th r n ho c b m t ch t l ng, t o thành l p màng bao ph trên b m(Morikawa, 2006) [41] Ph n l n các vi sinh v ng bán

l u có kh o màng sinh h c H vi sinh v t trong biofilm có kh

máy l ng ng d t n t u ki n b t l i (thi u dinh

ng, s c nh tranh ) vi sinh v t ph i h c cách bám trên b m t, c ng sinh v i

bám dính c a t bào vi khu n vào m t b m t ph thu c tính k c c a

b m t t bào, s hi n di n c a lông roi, tiên mao và ch t k t dính, protein màng tbào và s s n xu t m i ngo i bào (Dolan, 2000) [21]

- Thành ph n t bào: g m t p h p các t bào c a m t hay nhi u lo i vi sinh v t

m, vi khu n, vi t o, x khu n, bám dính trên b m t nh nh (Burmolle và cs, 2006) [15] Trong màng sinh h c các t bào t p h

thành màng sinh h c cho t ng loài vi sinh v t (Kumar & Anand, 1998) [32 m

tr cho vi c bám dính c a các t bào khác lên b

m t giá th , liên k t v c ng sinh và t b o v mình

- M i các ch t ngo i bào (extracellular polymeric substances EPS) bao quanh các t bào t o nên c

[13] Bao g m các thành ph

nhiên thành ph n EPS r ng nó còn tùy vào t ng loài vi sinh v t, d ng biofilm

u ki n hình thành Trong các thành ph n chính thì polysaccharide chi m kho ng 40-95%, protein kho ng 1-60%, 1-10% là axit nucleic và 1-40% là lipit (Czaczyk, 2007) [18] Các h p ch i theo không gian và th i gian t n

ng EPS càng nhi u M t bào t p trung cao nh t l nh c a

vùng phía trong c a màng sinh h c Thành ph n EPS trong h u h

khác bi t so v i vi khu n d ng s ng t do Nh ng thành ph c xem xét trong m t biofilm bao g m polysaccharide, protein và DNA (b ng 2.1)

B ng 2.1 Vai trò c a m i ngo i bào trong màng sinh h c (Donlan, 2002) [22]

ng c a m ng

i ngo i bào Thành ph n

Vai trò trong màng sinh h c

Ki n t o Polysaccharide, Amyloid C u t o nên c u trúc biofilm

C u trúc biofilm bao g m thành ph n t bào liên k t v i nhau m t cách ch t ch

và có tr t t m b o s i thông tin liên t c gi a các t bào C u trúc biofilm

có t ch c thù và ph n ánh các ch nh c a màng sinh h c, chúng

bi n m t khi các thành ph n c a ch t gian bào b lo i b nh t ng c a

h i t m n vài cm tùy thu c vào loài vi sinh v t, tu i c a màng sinh h ng và áp l c dòng ch y (Cheng và cs, 2010) [19], (Jomeo, 2008) [29].

t ph n ng c a các enzyme mà ki m soát s phát tri n c a h th ng sinh lý và

sinh hóa c a vi khu n Nhi i t ph n ng c a enzym do

n s phát tri n c a t bào, t n quá trình hình

v t lý c a các h p ch t bên trong và xung quanh t bào (Garrett và cs, 2008) [24]

pH

ng t t pH 7 và b c ch ng u ki n quá axit ho c quá

màng sinh h c c a vi sinh v t N H+n m trong thành ph ng làm

i tr ng thái di n tích c a thành t bào Tu theo n c a chúng mà làm

th i, t bào vi khu n có các kênh protein liên k t v i màng sinh ch t ng

ng vi khu i pH bên trong và bên ngoài t bào thông qua s u

ch nh các ho ng, t ng h p các proteins và liên quan tr c ti n quá trình s n

xu t các polymer ngo i bào (Garrett và cs, 2008) [24]

Các ngu ng ch y u c n thi t cho quá trình sinh t ng h p c a vi sinh

h nên biofilm (Hijnen và cs, 2009) [26]

Carbon là nguyên t c n nh t t o nên các thành ph n c a t bào vi

t c n thi t cho quá trình hình thành

m i các h p ch t ngo i v i phân h y sinh h c ng d ng màng sinh

s hình thành màng sinh h c t

i v i vi sinh v c tìm th y trong các protein, enzyme, các thành ph n

t bào và acid nucleic Các mu ng trong vi c t ng h p

protein c a vi sinh v n ph i cung c t, vì không có

n hóa c a vi sinh v t s b ng khi n m i các ch t ngo c hình thành S t ng h p m i ngo i bào c a các t bào

t o màng sinh v t thu n l i (Sleytr, 1997) [46] Vì v y, khi ngu

làm gi m kh o màng c a vi khu n

N mu ng tr c ti p lên s hình thành màng sinh h

ng m t s nh s hình thành phát tri n màng sinh h ng gián

m sinh lý c a sinh v phân lo i, c th :

- m v hình thái: hình d c, màu s c c a khu n l c; hình

d ng, kích c c a t bào vi sinh v t, cách th c di chuy n c a t bào

sinh hóa c a vi sinh v t v i các ch t khác nhau, các ph n ng mi n d ch c a các kháng nguyên là thành ph n c u t o c a t bào

nhóm khác (vi khu n Gram âm) H n ch c i truy n

th ng d n nhi ng h p ph nh l i tên phân lo i c a m t s vi sinh

v t

2.1.4.2 i b ng sinh h c phân t

pháp sinh

2.2.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i

thermoleovorans v a có th t o màng sinh h c v a có th phân h y các alkan m ch

c biofilm do h n h p các vi sinh v t t o thành Biofilm này có kh y

lên t i 20 µg/ml pyrene và 39 µg/ml phenanthrene sau 60 ngày nuôi c y Nhóm vi sinh

v c nghiên c nh thu c các chi Polaromonas, Sphingomonas, Alcaligenes, Caulobacter, Variovorax và Pseudomonas (Eriksson và cs, 2002) [23]

2008, Rodgers và c ng s u h th ng l c ngang c a k thu t bofilm

và c ng s u nhóm vi sinh v t t o màng sinh h c thu c b

Bacillales và Rhodobacterales x c th i nhi m d u cho hi u qu x t 74% COD, 94% ammonia nitrogen (NH3-N), 98% ch t r ng (Liu và cs, 2013) [37]

ng vi khu n quy mô 5 lít v u ki n th nghi m khác nhau là:

có giá th a và không có giá th , có s c khí và không s c khí Sau 9 ngày

h ng trong mô hình không có giá th , có giá th không s c khí và có giá

th s c khí (Le Thi Nhi Cong và cs, 2012) [35 Lê

Th Nhi Công và c ng s l i ti p t c nghiên c u m t s y u t sinh lý sinh hóa nh

ng t i kh o màng sinh h c ch ng n m men Trichosporon asahii QN-B1

phân h y phenol phân l p t H Long, Qu c bi t, ch ng n m men này

có kh i cao (trên 90% v i n u là 200 ppm) (Lê Th Nhi Công và cs, 2013) [4].

Nhóm nghiên c u ng khoa h c t nhiên - i h c Qu c gia Hà N i, Nguy n Quang Huy và c ng s c 2 ch ng vi khu n là

Bacillus U1.3 và Bacillus U3.7 có ho t tính t o màng sinh v t (biofilm) và tác d ng kháng khu n Sau 7 ngày nuôi c y, ch ng Bacillus U1.3 có ho t tính m i v i

E coli và Phytophthora sp., còn Bacillus U3.7 có ho t tính m i v i Samonella

ch ng Bacillus licheniformis A4.2 phân l p t i Vi t Nam Sau 7 ngày nuôi c

2014) [5]

u này cho th y, ti ch ng lo i vi sinh v t v a có kh

o màng sinh h c v a có kh y các hydrocarbon trong các m u

m ra kh ng d ng vai trò c a các vi sinh v i v i các h sinh thái và môi

PH N 3

3.1.

Màng sinh h c c a ch ng vi khu n phân h y phenol

Quy mô phòng thí nghi m

3.2.

3.2.1.

Phòng thí nghi m Công ngh sinh h c m ng Vi n Công ngh sinh h c

-Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh -Vi t Nam

Các hóa ch t s d nghiên c u là các hóa ch tinh khi t cao c a

B ng 3.1 Danh m c m t s hóa ch t s d ng

SDS (Sodium dodecyl sulfate),

NaCl, NaOH, Ethanol tuy i, Clorofrom

Trypton, Cao n m men, Agar, EDTA

Isoamyl alcohol, Axit acetic, Methanol

Glycerol

Proteinase K, thang chu n DNA

Taq - DNA polymerase

Fermentas (M )

Bio basic (Canada)

c)Merck(M )Fermentas (M )Thermo Scientific(M )

B ng 3.3 Danh m c m t s máy móc và thi t b s d ng

T l nh -4oC, -80oC, Máy Votex

T c y vô trùng AVC 4A1

n t

Máy l c n nhi t

Máy ly tâm l nh Centrifuge 5417R

Máy PCR (Themo cycle)

Bàn soi UV ECX F15M

B n di ELITE 300 PLUS

Nuaire (M )ESCO (Singapore)Ohaus (M )ThommasScientific(M )N-Biotek (Hàn Qu c)ThommasScientific(M )ThommasScientific(M )

c)Vilberlourmat (Pháp)

3.4.

- Phân l p và tuy n ch n các ch ng vi khu n v a có kh o màng t t, v a

có kh ng và phát tri n t t trên ngu t phenol

- Phân lo nh tên ch ng vi khu n l a ch n

thông tin: tên m u, th i gian m l y m i l y m u M u l y v c

t i phòng Công ngh sinh h c m ng Vi n Công ngh sinh h c Vi n

phân tích Phân tích trong vòng 24 gi

Nguyên t c

vi sinh v t t m u thu th ng có ch t quan tâm là phenol

c ti n hành

- Làm giàu l n 1: Hút 5 ml m u vào 2 bình tam giác 250 ml ch a 50 ml môi

- Nuôi c y các t t o khu n l c riêng r , thu

ch ng thu n

Ti n hành

- Sau khi pha loãng t i 10-8 d ch làm giàu l n 3, hút 0,1 ml d ch m

ng khoáng Gost th ch b sung 50 ppm phenol

- Dùng que trang tr u m u kh p m t th ch

pha loãng khác nhau

- c c y tr i c bao gói c n th n và nuôi c y t m 30oC

d a vào hình thái và màu s c c a khu n l c ng vi khu c c y

ng hi u khí t ng s th ch nghiêng b o qu n l nh ph c v cho các nghiên c u ti p theo

- Sau 14-16 gi nuôi c p l i 3 l n) 4000 vòng/phút, 4oC, trong

10 phút, lo i b d ch, thu sinh kh i (ly tâm và r c c t 2 l n v i th

hành pha loãng t i h c sóng 600 nm, pha loãng d ch sinh kh i

phát tri n c a các ch ng vi khu n

- B sung d ch sinh kh i m i ch ng vào bình tam giác dung tích 100 ml, có ch a

20 ml khoáng Gost d ch, 0,1% vitamin, 50 ppm phenol, 0,1% glucose c

30oC, 200 vòng/phút và quan sát s ng sinh kh i bám trên thành bình trong quá trình nuôi kho ng 7 ngày

- C sau 24 gi nuôi c y, l y 1 ml d ch nuôi và ki m tra m quang ph

nh kh ng và phát tri n c a các ch ng vi khu n trên ngu t phenol M i thí nghi c l p l i 3 l n

- Nh 1 gi c vô trùng lên lam kính, dùng que c trùng l y 1 ít sinh