Phân tách bằng các phương pháp sắc ký và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang

KếtquảsắckíởpH4,5 KếtquảphântáchproteinnọcrắnhổmangởgiátrịpH=4,5đượctrìnhbàyở dạngsắckýđồtrênhình3.3.

ờngđạihọcsphạmhànội2

1 LÝDOCHỌNĐỀTÀI

MỞĐẦU

Ribonuclease( R N a s e ) l à mộtt r o n g n h ữ n g n h ó m e n z y m e đ ư ợ c q

u a n t â m ng hi ên c ứ u nhiều.Đ â y l à n h ó m enzymec ó p h â n b ố rộngr ã i , đ ó n g v

a i tròq u a n trọngtrongq u á t r ì n h traođ ổ i c h ấ t củac á c a c i d n u c l e i c , t h ự c hiệnc h ứ

c n ă n g t i ê u h ó a vàthamgiavàophảnứngmiễndịchcủacơthể

Đặcbiệtl à trongnhữngthậpk ỷ gầnđây,cácnhàkhoahọcđ ã pháthiệnnhiềutínhchất(hayhoạttính)sinhhọcmớiquantrọngcủacácenzymethuộcsiêuh ọ RNaseA(đâylànhómRNasengoạitiếtởcácđộngvậtcóxươngsốngtừlưỡngcưđếnlớpthú),trongđócóhoạttínhgâyđộctếbào(hayhoạttínhcytotoxin),các hoạttínhkhángkhuẩnvàkhángv

irusvàmộtsốhoạttínhkhác.Vídụnhư:RNaset ừ mộtsốloàiếch(ếchđồngNhậtBảnR anajaponica,ếchbòRanacatesbeianavàế c h báophươngbắcRanapipens)đềucóhoạttín

ư ờ i ) cũngcó hoạttí nh chốngvirusv à chúnglà mộtbộphậncấut hà nh tronghệthốngchốngvirusởngườinhư2enzymeRNase2vàRNase3docácbạchcầuưae o s i n (bạchcầuưaacid)tiếtra

NhữngnămgầnđâyngoàiviệctìmramộtsốRNasenguồngốctựnhiêncóđặcđiểmnhưonconase &BS-

RNase,các nhàkhoahọccònnghiêncứutạoracácc h ế p h ẩ m RNasenhântạoc ó h o ạ t t í

n h c h ố n g u n g t h ư , nhờvậndụngc á c phươngphá p sinhhọcphântửvàcôngnghệgen.DạngbiếnthểcủaRNaseđượctạorabằngc á c h thaythếmộthoặcmộtvàigốcaminoacidcầnchotươngtácvớiproteinứcchế( R I ) hoặctạothêmliênkếtdisunfidelàmtăngđộbềnvữngcấutrúcvàgiảmbớtsựn h ạ y cảmvớiproteintrongtếbào.Cácnghiêncứunàyđãmởramộthướngnghiên

cứumớitrong lĩnhvựchóadược nhằmsảnxuấtranhữngchếphẩmdượccaocấpt r ê n cơsởRNaseđểphòngchốngungthư.

Nọcrắnl à nguồndượcl i ệ u cổtruyềnquý,khôngp h ả i ngẫunhiênmàbiểutượngcủatoànngànhYtrênthếgiớilàhìnhảnhconrắnđangnhảnọc

Nọcrắnxửlýhếtđộccótácdụng:

- Chốngđông,chốnghìnhthànhhuyếtkhối,giảmfibrinogen,độdínhcủamáu,độngưngkếtcủatiểucầu

- Nghiêncứumộtsốtínhchấtcơbảncủaenzyme

3 ĐỐITƯỢNGVÀPHẠMVINGHIÊNCỨU

- Đốitượng:RNasetừnọcrắnhổmang

- Phạmvinghiêncứu:Sửdụngcácphươngphápsắckíđểphântáchvàlàms ạ c h enzymeRNasetừnọcrắnh ổ mang,vànghiêncứumộtsốtínhchấtcủaenzymenày

4 PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

Thựcnghiệmvàápdụngcácbiệnphápphântáchhiệnđại(bằngmáysắckí)v à cácphươngphápnghiêncứuđộnghọcxúctácenzyme

5 GIẢTHIẾTKHOAHỌC

- RNasecómộtýnghĩahếtsứctolớnđốivớinhiềuloạibệnhtrongYhọc.N g o à i c

h ứ c năng tiêuhóav à t h a m g i a ( t r ự c t iế p h a y giántiếp)c á c h o ạ t độngsaomã,phiênmã,si nh tổnghợpprotein,c ác RNasecòn th ực hiệnnhiềuv a i t r ò trongphòngchốngvirus,vikhuẩn,khánggiun…

NồngđộvàhoạttínhcủaRNasetrongdịchbàovàcácdịchthểcóliênquanđếntrạngtháibệnhlýcủanhiềuloạibệnhkhácnhau:Nồngđộenzymetănglàkếtq u ả củaphảnứngcơthểchốnglạibệnhtật(vídụ:Bệnhtăngbạchcầutủymãntính,h ộ i chứng mệtmỏikinhniênđãpháthiện thấylượngRNase tănglêntrong cáctếb à o ngoạivi)

- Trongt ư ơ n g l a i nhiềudạngR N a s e vẫnsẽđ ư ợ c n g h i ê n c ứ u đ ể tạorac á c loạithuốctácđộnghiệuquảlênkhốiu.Nhiềubệnhhiểmnghèođượcphòngchốngv à chữatrịhiệuquả

v i r u s bằngnucleasen ó i chungv à R N a s e n ó i riêng[6461].Kếtquảbướcđầuchothấycácenzymenàycókhảnăngkìmhãmsựpháttriểncủamộtsốloạiv i r u s g â y bệnhn h ư ospovaxin,h e r p e s , adenovirus( c h ứ a ADN)hayvirusviêmnão,viêmtủy,viruscúm(chứaARN).Năm1958,SieK e v i t z P a l a d e đ ã x á c địnhn ơ i khưt r ú củaenzymen à y l

à t u y ế n tụynhờk ỹ thuậtk h á n g thểhuỳnhquang

Nhữngnăm1960-1970nhờưuthếvềnguồnvậtliệu,khảnăngtinhchếcũngn h ư kíchthướcphântửnhỏ(~14kDa),RNasetuyếntụybò(RNaseA,EC3.1.27.5)trởthànhmôhìnhmẫutrongcácnghiêncứuvềenzymenóiriêngvànghiêncứuvềproteinnóichung.RNaseAlàenzymeđầutiênđượcxácđịnhtrình tựaminoacidv à làenzymethứ3đượcxácđịnhcấutrúc3D(saulysozymevàcarboxy-

peptidaseA ) Vàon ă m 1 9 7 2 giảit h ư ở n g N o b e l hóahọcđ ã đ ư ợ c traoc h o StanfordMoor,W i l l i a m S t e i n v à C h r i s t i a n A n f i n s e n v ớ i nhữngc ô n g trìnhnghiênc

ứ u củah ọ v ề R N a s e N ă m 1 9 8 4 B r u c e Merifieldđ ã v i n h d ự n h ậ n giảit h ư ở n g c

a o q u ý n à y vớic ô n g trìnhnghiênc ứ u cũngl i ê n q u a n đ ế n RNaseA [ 5 0 , 51,52].Từn

h ữ n g n ă m c u ố i thậpk ỷ 8 0 tớinay,nhiềun g h i ê n cứuc ơ b ả n vàn g h i ê n cứutheohướn

gứ n g

dụngcủaRNaseđãđượctiến hànhsongsongvàliênquanchặt chẽvớinhau, đ ặ c b i ệ t lànhữngnghiêncứuvềmốiquanhệgiữacấutrúcvàchứcnăngsinhhọccủacác RNase.Kếtquảcácnghiêncứunàyđãmởratriểnvọngchonghiêncứunhằms ả n x u ấ t r a c á c d

ư ợ c p h ẩ m mớit r ê n c ơ s ở R N a s e c ó k h ả n ă n g chữatrịc á c bệnhh i ể m nghèonhưungthưvàcácbệnhdovirus[13,18,28,40,41,50]

1.2 TínhđặchiệucơchấtvàcơsởphânloạiRNase

Tínhđặchiệuc ơ chấtlà đ i ể m k h á c biệtchủyếug i ữ a enzymevớic á c chấtx ú c táckháccũngnhưgiữaenzymenàyvớienzymekhác.Nhómnucleasethamgiat r ự c tiếpvàoquátrìnhtraođổichấtcủaacidnucleic.Chúngđượcđặctrưngbởitínhđặchiệucơchấtrộngvàchephủ(chồngchéo)nhau

Việcphânl o ạ i c á c n u c l e a s e rấtkhókhănvàk h ô n g thốngn h ấ t N g o à i c á c

p h ả n ứ n g thủyp h â n , cácenzymet h u ộ c n h ó m n à y c ò n t h a m g i a x ú c t á c c á c p h ả

n ứngc h u y ể n nhóm:RNasetụytạot h à n h

2’,3’-monophosphatev ò n g nhờphảnứ n g c h u y ể n vịn ha nh hơnkhoảng1000lầnsovớiph ảnứngthủy p hâ n ởgiai đoạn sauc ủ a phảnứngtạothành3’-monophosphate[26]

Tronghệthốngphânloạienzymenăm1964,enzymenàycũngđượcxếpvàonhómtransferase(EC2.7.7.16vàEC2.7.7.17).Việcphânloạinàykhônghợplívìd e o x y R N a

s e ( D N a s e ) c ó c ù n g c h ứ c n ă n g s i n h họcvớiRNasel à t h ủ y phâna c i d nucleiclạiđượcxếpvàonhómhydrolase(EC3.1.4.6)[25]

Nhữngnghiêncứutiếptheochỉrarằngsựkhácbiệtnàychỉlàtươngđối,tùythuộcvàotừngenzymec ụ thể.Vídụở mộtsốv i khuẩnt ố c đ ộ chuyểnnhómv à thủyp h â n củaR N a s

e l à tươngđươngn h a u n ê n c á c chấttrunggian( n u c l e o t i d e vòng)khôngđượctíchlũytrongquátrìnhphảnứng.Đểđặctrưngchotínhđặchiệuc ủ a mộtenzymebấtkỳthuộcnhó

mn u c l e a s e , L a s k o v s k i đ ã đ ư a rac á c d ấ u hiệu( t ư ơ n g đốikhôngphụthuộc)khácnhau[20,23,24]

1 Theotínhđặchiệucủagốcđườngcấutrúcnênnucleotide,nucleaseđượcp h â

n chiathànhhainhómlớn:RNasevàDNase

2 Theov ị tríliênk ế t b ị t h ủ y phân,nucleaseđ ư ợ c p h â n chiat h à n h e xo nuc le

as e vàendonuclease

3 Theos ả n phẩmt h ủ y p h â n : L iê n kếtphosphodiesterb ị t h ủ y p h â n t ừ phían à

o củaphântửARN,tạothànhsảnphẩm5’-phosphateha y

3’-phosphate Mộtsốe x o n u c l e a s e chỉtácđộngvàophântửpolynucleotidetừphíađầu3’,sốkháclạichỉt á c độngvàophíađầu5’

4 Theotínhđặchiệuvớibazơtrongđơnvịnucleotideliềnkềvớinucleotideb ị thủyphân:Tínhđặchiệunàycủanhiềuenzymelàkhôngđángkể.ChẳnghạncácRNasethựcvậtv

àEscherichiacoli(EC3.1.27.1)thủyphâncácliênkếttheovịtrí3 ’ củacảpurinevàpyrim

idinenucleotide;RNasetuyếntụy(EC3.1.27.5)chiếmvịtrítrunggian:Thủyphâncácliênkếttheovịtrí3’củapyrimidinenucleotidebấtkỳ.T r o n g khiđó,enzymemãsốE C 3 1 2 7 3 làe n d o n u c l e a s e đ í c h thực,thủyp h â n A R N ởvịtrí3’củagốcGuaninenucleotide

5 Tínhđ ặ c hi ệu cấutrúc:mạchđ ơ n h a y mạchk é p (đasốcác n u c l e a s e thểh i ệ nđộđặchiệucaotheodấuhiệunày)

6 Tínhđặchiệutrìnhtựnucleotide…

Mộts ố d ấ u hiệut r ê n đượct í n h đ ế n trongh ệ thốngp h â n loạienzymev à o n ă

m 1978.Tronghệthốngphânloạimớinày,14phânnhómnucleaseđượcđưavàođ ể phânloạin u c l e a s e tốthơn.C h ắ c chắntrongt h ờ i g i a n tớih ệ t h ố n g phânl o ạ i n u c l e a s enóichungvàRNasenóiriêngcònthayđổikhicấutrúcvàchứcnăngcủanhiềuenzymeđượcpháthiệnthêm[20].Tuyvậy,trongmọitrườnghợpmộtRNase( h a y nuclease)bấtkỳmàtaquantâmluônnằmtrongsơđồchungphânloạin u c l e a s e nhưsau:

- Giaiđoạn1:Phâncắtchuỗipolymertạorasảnphẩmtrunggianlàphosphatevòngmàkhônggiảiphóngnhómacid.Tronggiaiđoạnnày,His-

12đóngv a i tròlàchấtxúctáckiềmchung(nhậnprotonH+ở

vịtrí2’)His-119đóngvaitròl à acidchung(protonhóanhómđikhỏiRNA-O-)diễnrakhánhanh

- Giaiđoạn2:Giảiphóngnhómacidthứhaithuộcgốcphosphatetrongquátrìnhthủyphândẫnxuấtphosphatevòng.Giaiđoạnnàydiễnrachậmhơntrongđóv a i tròcủahaigốcHis-12vàHis-119lạingượclại.His-

119tươngtácvớiH2Otheocơc h ế xúct á c kiềmc h u n g (nhậnproton)c ò n H i s

-1 2 đảmn h ậ n việcprotonh ó a nhómđikhỏi(sảnphẩm)ởvịtríC-2’

2 CẤUTRÚCPHÂNTỬCỦARNASE

RNaseAlàmộtenzymecókhốilượngphântửnhỏ(~14kDa)đượccấutạotừmộtmạchp ol yp ep ti de từ124gốcaminoacid, tr on g thànhphầnaminoac id củanóc ó 1 9trongtổngsố20loạiaminoa c i d cótrongp r o t e i n (khôngcóaminoa c i d Trytophan).Côngthứcp h â n tửở dạngkhôngtíchđiệncủaR N a s e A l à C575H907N171O192S12vớikhốilượngphântửchínhxácMr=13686Da[50,51,52]

Vềhìnhdạng,R N a s e Agiốngnhưq u ả thận,c á c gốcaminoa c i d củatrung

tâmhoạtđộng nằmtrongvùng“hốc”

(cleff)-làvùnglõmcủaquảthận[51].CấutrúcbậchaiđiểnhìnhcủaRNaseAgồm4phiếncấutrúc

nằmsongsongngượcc h i ề u kềbêncạnh3chuỗixoắnngắn.Trongphântửcó4cầunốidisulfideđượctạ o thànhtừ8gốcCysteineởcácvịtrí26-84,40-95,58-110và65-

72.Cáccầunốin à y

cóthểbịphávỡbởilượng-mercaptoethanoldưthừa,tạothành8nhómSHtựd o dẫntớisựbiếntínhvàlàmmấthoạttínhcủaenzyme[26,51]

HầuhếtcácRNasethuộcsiêuhọRNaseAđềucócấutrúcmonomer,duychỉcóR N a s

e t r o n g tinhdịchb ò ( B S - R N a s e ) c ó cấut r ú c bậc4 (dimer)[ 1 5 , 1 7 ]

BS-RNaseđượctáchraởdạngdimertrongđóhaitiểuđơnvịthànhphầnnốivớinhaub ở i haicầudisunfide[1917].EnzymenàylàmộtđồngđẳngcủaRNaseA,ởtrạngtháicânbằngmộthỗnhợpgồm2cấutrúcbậcIVhoàntoànkhácnhau[36]

Trungtâm hoạtđộngcủaRN as e An g o à i hainhómchứctham giatrựctiếpv à

o quát r ì n h x ú c t á c l à nhómi m i d a z o l c ủ a c á c gốcH i s - 1 2 v à

His-119( t r o n g đ ó m ộ t n hó m đóngva i trònhư mộtac id , mộtnhómđóng v ai trònhưmột

ba zơ 121vàm ạchcarbonchínhcủagốcPhevàGly-11[13,20,28]

trongquátrìnhxúctác)còncómạchbêncủacácgốcLys-7,Lys-41,Lys-66,Asp-3 TÍNHĐAHÌNHPHÂNTỬCỦARNASETRONGTẾBÀO

NhiềucôngtrìnhnghiêncứuvềRNasetiếnhànhởtrêncácnhómsinhvậttừdạngcócấutạođơngiảnnhưvikhuẩnđếncácsinhvậtbậccaonhưconngườiđãc h o thấysựmuônhìnhmuônvẻcủacácenzymethuộcnhómnày.TrongmộtcáthểcótồntạinhiềudạngRNase

khácnhau,vídụởvikhuẩnE.colicótới20loạiRNase[ 4 6 ] ; trongnọcrắnhổmangẤnĐộc

hứa2dạngRNaseliênhợp-phânli(phụthuộcv à o nồngđộNaCl)

[42];cáckếtquảnghiêncứubanđầuởViệtNamchothấycũngtồntạiítnhất2dạngRNasekhácnhautrongnọcrắnhổmangViệtNam[5,7]

Ởngười,tớinayđãpháthiệnđược8enzymekhácnhauthuộcsiêuhọRNase

A.Chúngđượcđánhsốtừ1đến8đểphânloạidựatrênsựkhácbiệtvềcấutrúcvàc h ứ c năngsinhhọc.Cácgenmãhóachocácproteinnàyliênkếtvớinhautrêncánhtaydàicủanhiễmsắcthểsố14[61].DướiđâylànhữngđặcđiểmchínhcủanhómRNaseởngườithuộcsiêuhọRNaseA

3.1 RNase1

RNasenàycó nhiềuở các cơ q u a n k h á c nhautrongc ơ thển h ư n g cónhiềun h ấ t

ở tuyếntụy.Trìnhtựaminoacid tươngđồngtới7 0% sovớiRNaseA.Ch ức n ă n g chínhcủaRNase1làtiêuhóa-thủyphânARNtrongthứcăn[55,61]

3.2 RNase2(EDN-eosinophilderivedneurotoxin)

RNase2đầutiênđượcpháthiệnlàmộtđộctốthầnkinhcónguồngốctừcáct ế bàobạchcầuưaacidnêncònđượcgọilàEDN.Đâylà1trong2proteincủatếbàol y m p h o c

ó ho ạt t í n h r i b o n u c l e o l y t i c Mộts ố gốcaminoa c i d n h ư : 7,A r g - 1 0 , Phe-120,A s p -

Gly-2,Lys-66,Lys-1 4 b ị thayđ ổ i khôngbảot h ủ đ ó n g v a i tròq u a n trọngvềchứcnăng;cácgốcaminoacidHis-12,His-119,Lys-

41vànhiềugốckhácđ ư ợ c giữlạitạonêntrungtâmhoạtđộng(TTHĐ)củaphântửenzyme[55,61]

3.3 RNase3(ECP-eosinophilcationicprotein)

CũnggiốngnhưRNase2,RNase3đầutiênđượcpháthiệnlàproteinmangđ i ệ n dươngcủatếbàobạchcầuưaacid,điểmđẳngđiệncủaproteinnàylàpI=10,8( e n z y m e nàylàmộtproteinrấtkiềm)vàtươngđồngtới70%vớiRNase2.ECPlàRNasengườiđầutiêncóhoạttínhkhángkhuẩn,khángcôntrùngvàđộcvớitếbàothầnkinh.H o ạ t t í n h n u c l e a s ecủaE CP thấph ơ n nhiềus o vớiRNase2 nhưng c á c đặctínhxúctácbìnhthườngthìgầnnhưkhôngđổisovớiRNase2.Tuyvậyhoạtt í n h ribonucleolyticcủaECPlạikhôngcầnthiếtchohoạttínhkhángkhuẩn[22,55,6 1]

3.4 RNase4

RNase4 c ó t r ì n h tựaminoa c i d t ư ơ n g đồng4 3 % v ớ i R N a s e 1,3 1 % v ớ

i RNase2và30%vớiRNase3.Enymenàycũngtương đồngvớiRNasegan bòvàg a n lợntới90%,điềunàychứngtỏtínhbảothủcủaRNaselàrấtlớn[55,61]

3.5 RNase5(Angiogenin)

Angiogenincótrọnglượngphântửlà14400DavàgiốngRNaseAtới65%v ề trìnhtựaminoacid,3trong4cầudisunfidevàcácgốcaminoacidchứcnăngchủyếutrongTTHĐcủaRNasevẫnđượcbảotồnỏangiogenin.SovớiRNase1,2và4thìtrìnhtựaminoa c i d củaa n g i

o g e n i n tươngđồngl ầ n l ư ợ t là 35%,27%và3 9 % A n g i o g e n i n cót í n h đặch i ệ u yếuvới c ơ chấtc h u ẩ n củaRN as e nhưngb ù lại,hoạtt í n h ri bo nu cl eo ly t i c củaa n g i o g i

e n i n lạirấtquant r ọ n g t r o n g việch ì n h thànhmạchmáumới[61]

3.6 RNase6(RNaseK6)

RNase6tồntạichủyếuởthậnvàmộtítởcáccơquankhácnhưnhauthai,tim,phổi.Genmãhóaproteinnàydài120KbvàmARNtươngứngcótrongcáctếb à o bạchcầutrungtínhvàcácbạchcầuđơnnhânmáungoạivi.TrongcácRNasen g ư ờ i thìRNase6gầnvới2proteincủatếbàobạchcầuacidnhất[55,61].

RNase8gồm154aminoacidvớiđoạnpeptidetínhiệudài27aminoacid;8g ố c Cys,1gốcLysvà2gốcHisnằmtrongTTHĐcủaenzyme.PhântửmARNmãh ó a enzymenàycókíchthướckhoảng1Kbchỉtìmthấyduynhấtởnhauthaimàkhôngcóởmộtmônàokhác.HoạttínhribonucleolyticcủaRNase8thấphơnhoạtt í n h củacácRNase1-

3,6,và7pháthiệntrướcđó[53,58]

NgoàicácRNasethuộcsiêuhọRNaseAởngườiđãkểởtrênthìtrongnhiềut ế b à o ,môv à c á c c ơ q u a n k h á c củan g ư ờ i c ò n c ó mặtn h i ề u e n z y m e thuộcc á c nhómlớnkhácn h ư : R N a s e H , R N a s e P, R N a s e L và mộts ố proteinc ó h o ạ t t í n h rib on u

cl eo ly ti c nhưLactoferrin,khángthể(ABzyme)[61]

4 CHỨCNĂNGSINHHỌCCỦARNASE

4.1 Thamgiavàoquátrìnhsinhtổnghợpacidnucleic

Mộtchứcnăngrấtquant r ọ n g củaRNasetrongtếb ào là thamgia trựctiếpv à o qu

át r ì n h s i n h tổnghợpADNv à ARN[ 4 1 , 50,6 1].Trongs ố c á c enzymeđ ó p h ả i kểđếnRNaseHtáchtừdòngtếbàoungthưK562ởngườicóhoạttính3’-và

5’-exonucleasethủyphânARNtrongthànhphầnphântửlaiADN-ARNtạonêncácđ o ạ n chứa5’-Pvà3’-OH.CóhailoạiRNaseHởngười:

- RNaseH1:Mr=89kDagiữ vaitròloạibỏc ác đoạnARNmồitrongquátrìnhs a o

c h é p ADN.Đểh o ạ t hóatốtRNaseH1cầnc ó c a t i o n hóat r ị 2 , e n z y m e p Hopt=8-8,5

o ặ c mononucleotidev à p h o s p h a t e v ô cơ.S a u đóc á c dạngn à y đ ư ợ c chuyểnhóanhờcácenzymetiêu hóakhácthànhnhữngsảnphẩmdễhấpthụ[55,61]

4.3 ThamgiavàoquátrìnhchếbiếnvàchíncủaARN

Quát r ì n h c h ế biến v à chín củaA R N l à nhữngquát r ì n h s i n h h ó a phứctạpvớisựt h a m g i a củanhiềuloạiR N a s e k h á c nhau.M ộ t trongnhữngR N a s e đ ó l à RNaseP.Enzymenàycómặtởcảcácsinhvậtthuộcnhómđơngiảnnhưvikhuẩncổ(Archaea),vikhuẩn(Bacteria)tớicácloàinhânchuẩn(Eucaria).RNasePlàmộtenzymecóhaithànhphầnchínhlàARNvàproteingắnvớinhau,trongđótiểuđơnv ị proteinchiếmkhốilượngphântửnhỏcòntiểuđ ơ n vịlớnARNđóngv a i tròlàtrungtâmhoạtđộngvàchiếmkhốilượngchủyếutrongthànhphầnenzyme.ARNcócấutrúcbậc2vàcóbiểuhiệnhoạttínhngaycảkhikhôngcótiểuphầnprotein

RNasePgiữ vaitrò thủyphânliênkếtphosphodiestetrên phântửtiềnchấttARN( p r e -

t A R N ) tạon ê n tARNh o ạ t độngthamg i a v à o quát r ì n h s i n h tổnghợpprotein.N g o à i

r a RNaseP c ò n cắtmARNđặchiệut r ì n h t ự b ằ n g c á c h dùngc á c trìnhtựđịnhhướngđểliênkếtvớicơchấtthôngquacácliênkếtcặpđôibase,sauđ ó cắtrồiphânlisảnphẩm[27,

4.4 Vaitròtrongcácphảnứngmiễndịchcủacơthể

Phảnứngmiễndịchcủacơthểxảyrađểchốnglạicácyếutốgâybệnhxâmn h ậ p vàocơthểnhưcácvisinhvật(vikhuẩn,virus),độctốvisinhvật,cácphântửl ạ …

NgoàiR N a s e L t h a m g i a v à o c á c p h ả n ứ n g miễnd ị c h đ ặ c hiệucủac ơ t h ể ch ố

ng viruscòncóRNase7vàcácRNasetừbạchcầuacidECPvàEDPthuộcsiêuh ọ RNaseAcủangườicũngthamgiavàophảnứngmiễndịchcủacơthể[21,22,6 1]

RNaseLlàendonucleaseđượctếbàotổnghợpcảmứngbởiinterferon,thamg i a thủyphâncảARNcủavirusvàc ủ a t ế b à o tạorasảnphẩmc ó đầuc u ố i 3 ’ -

mộtRNasecótínhđahìnhphântửrấtcaoởnhiềuloàithựcvậttươngứng[43,47]

Ởđộngvật,BS-RNasetáchtừtinhdịchbòcũngđóngvaitròđặcbiệtvềmặts i n h

sản.BS-RNaseứcchếphảnứngmiễndịchcủabòcáichốnglạitinhtrùngnênt ạ o điềukiệnchoquátrìnhthụtinhxảyra.Ngoàira,proteinnàycònthểhiệnhoạtt í n h chốngsinhtinhtrùng[36]

4.6 Hoạttínhcytotoxin

HoạttínhcytotoxinlàmộttrongcáchoạttínhsinhhọcquantrọngcủaRNase

[41,50]Trongsốhơn100enzymethuộcsiêuhọRNaseAđượcbiếtchođếnn a y , chỉcóBS-RNase(enzymetừtinhdịchbò)[11,14,36,49,]vàcácRNasetừ3

loàiếch:ếchbáophươngbắcRanapipiens[38,50],ếchbòRanacatesbeiana[32,5 0] vàếchđồngNhậtBảnRanajaponica[50]-

làcóhoạttínhcytotoxin.Cơsởcủah o ạ t t ín h cytotoxinl à k h ả năng thoátk hỏ is ự kiểmsoátcủaproteinứ c c h ế RNase( R I ) trongbàotương[12,28,29,44,45],nhờđóRNasedễdàngphâncắtcơchấtA R N đặch i ệ u trongtếbào,giúpdiệthiệuquảk h ố i u H a i enzymec

ó hoạtt í n h c y t o t o x i n đượcnghiêncứunhiềulàonconase(ONC)vàBS-RNase

- OnconasekìmhãmsựphânchiatếbàoởgiaiđoạnG1bằngcáchliênkếtv ớ i cácvịtríđặchiệutrênmànghuyếttươngcủatếbàođíchglioma(môđậmthầnk i n h ) SauđóONCtiếpcậnvớiARN tếbàođíchrồiphân giảiARNq ua đóngăn c ả n quátrìnhtổnghợpproteinlàmchotếbàobịtiêudiệt[35]

HoạttínhcytotoxincủaO N C c ó thểb ị ứ c c h ế b ở i N a N O3và2

-d e o x y g l u c o z e KhảnăngứcchếquátrìnhtổnghợpproteincủatếbàocủaONCđãb ịankylhóagiảmtới100lầntươngứngvớihoạttínhribonucletyliccònlạikhoảng2 % sovóidạngbanđầu[56]

-

BS-RNaselàđồngđẳngvớiRNaseAđượctáchtừtinhdịchbòcóhoạttínhđ ộ c vớicácđộngvậtcóvú.Hoạttínhcytotoxincủaenzymenàyphụthuộcvàocấutrúcbậc4củanó:dạngBS-RNasemonomerkhôngđộcvớitếbàovìchúngliênkếtchặtchẽvớichấtứcchếRItrongtếbàochất.ChỉcódạngBS-

RNasedimermớicóh o ạ t t í n h g â y đ ộ c tếbào.T r o n g h a i dạngdimercủaB S

-R N a s e t h ì dạngt r a o đổic h é o MxMcóhoạttínhcytotoxincaohơnvìnótồntạibềnvữngtrongmôitrườngkhửcủabàotương[36]

Hiệnnay,ngoàicácRNasetựnhiêncóhoạttínhchốngungthưngườitađãt ạ o r a nhiềudạngbiếnt h ể ( v a r i a n t ) củaRNaseA v à R N a s e tụyn g ư ờ i mangh o ạ t t í n h cytotoxin,kểcảởdạngdimer[18,54]vàmonomer[28,39,40]

4.7 Cácchứcnăngsinhhọckhác

Ngoàin h ữ n g c h ứ c n ă n g c h í n h đ ã k ể trên,RNasecònbiểuhiệnnhiềuhoạtt í n hsinhhọcđặcbiệtkhácnhư:

- Thamgiavàosựhìnhthànhmaomạch(angiogenin)[31,33,61]

- Gâyứcchếmiễndịch(BS-RNase)[36]

- Thểhiệnđộctínhchọnlọckhángcôntrùng(ECP,EDP)…[61].

BêncạnhcácRNase,trongcơthểngườicòncómộtsốproteinbiểuhiệnhoạtt í n h ribonucleotylicnhưlactoferrin,ABzyme…

LactoferrinlàproteinliênkếtFecótrongs ữ a , h u y ế t t h a n h v à dịchngoạit i ế t c ủ a c ơ thể,g i ữ v a i t r ò diệtkhuẩn,t ă n g cườngs ự p h â n c h i a tếbào,điềuh ò a quátrìnht ạ o n g u y

ê n b à o tủyx ư ơ n g v à k í c h t h í c h miễndịch.ABzymelàkhángthểthủyphânARNcótrongmáucácbệnhnhânmắcchứnglaobanđỏ,bệnhtựmiễnvàtrongsữangười.Ngườitagiảđịnhrằngcáck h á n g thểnàylàcácantidiotypethứcấpbắtchướctrungtâmhoạtđộngcủaRNase[61]

Hiệnnay,ngàycàngnhiềuproteincóhoạttínhRNasevớichứcnăngbảovệđượ ctìmthấyởcảvisinhvậtvàthựcvậtnhưcácribotoxin-

sarcintừnấmmốcAsper gi llu s giganteus,a n t i g e n Aspf1c ủ a A s p e r g i l l u s fu migatus…

gópp h ầ n đadạnghóanguồnRN a s e tựn h i ê n t ạ o cơ s ở choc á c n g h i ê n c ứ u v à ứngdụngtrongđ i ề u trịbệnh

5 RNASETỪNỌCRẮN

5.1 Kháiquát

Từxưachotớinay,ngườit a vẫns ử d ụ n g gầnn h ư t o à n t h â n c o n rắn:thịt,x ư ơ n g, da,mật,mỡ,máu,nọc…

là m nguồnthựcphẩmvàdượcliệuquíđểbồibổsứckhỏevàchữatrịbệnhtật.Trongcácsảnphẩmtừrắnthìnọcrắnđượcquantâmn g h i ê n cứunhiềuhơncả,đặcbiệtlànọccủaloàirắnđộc

uchấtcóhoạtt í n h sinhhọc,trongđóchủyếulàcácenzymenhưproteinase,phospholipase(A,B,

C,D),ATPase,hydrolase,phosphatasekiềm,phosphataseacid,DNase,RNase,A T P a s e, cholinesterase…

T r o n g sốc á c enzymecủan ọ c rắn,c h ỉ c ó p h o s p h o l i p a s e v à p r o t e a s e l à đ ư ợ c nghiênc ứ u nhiềuc ò n R N a s e t h ì mớibắtđ ầ u đ ư ợ c q u a n t â m n g h i ê n cứutrênthếgiớicũngnhưởViệtNam.Độctốchủyếucủanọcrắngâyrab ở i các toxinmangbảnchất peptidevàcácproteinphân tửlượngthấpnhưđộctốn e u t o t o x i n , độctốcardiotoxin,laticotoxin,erabutoxinb,cácchấtgâychảymáuvàc h ố n g đôngmáu,c ác chấtgâydịứng.Chúngtác độnglên hệcơ,hệthầnkinh,hệ t i m mạch,hệhôhấp…

gâynênnhiềutriệuchứngnhưtêliệtthầnkinhcơ,giảmkhản ă n g đôngmáu,tổnthươngthànhmạchmáutrong,tantiểucầudẫnđếnxuấthuyếtở phổi,màngbụngvàtim

Nọcrắnđượcsửdụnglàmthuốcchữabệnhnhư:Thuốcgâymê,thuốcgiảmđ a u saumổ,thuốcanthần,thuốcchốngviêm…

5.2 MộtvàiđặcđiểmvàtínhchấtquantrọngcủaRNasetáchtừnọcrắn

TheocácnghiêncứuvềRNasetáchtừnọccủaloàirắnhổmangvùngTrungÁ củaLiênXôtrướcđâyvàẤnĐộthìhoạttínhRNasetrongnọccủabaloàirắnởv ùng T r u n g Á

v à L i ê n X ô l à V i p e r a , Le le et in a, N a j a o x i a n a v à Echiscorinatuscóthểkhácbiệtnh autới10lần,trongđóRNasecủaNajaoxianacóhoạttínhcaonhất.

Cáct á c giảVasilenko vàBabkinađãtách chiết,là m sạchvànhận đượcc h ế phẩmRNasecópHopt=7,6-

7,8,đượchoạthóabởiionMg2+vàkhôngthủyphânADN.Độbềnnhiệtcủaenzymenàykhôngcao,mất50%hoạttínhkhiđuncáchthủy5’ở50oCvàmấthoàntoànhoạttínhkhixửlýnhưvậyởnhiệtđộ70oC.Sảnphẩmcủap h ả n ứngthủyphândoenzymenàyxúctáclàhỗnhợpcácoligonucleotidetừdimerđếnhexamer,chủyếulàdimervàtrimer[59,60].Chếp

hẩmRNasetinhkhiếttácht ừ nọcrắnhổmangMajanajavùngGunturẤnĐộlạicónhững

biểuhiệnkhác:dảinhiệtđộhoạtđộngtốtlà37-60oCvớitốiưunhiệtđộlà37oC,RNasenàyrấtbềnv ớ i urea,hoạttínhcựcđạiởnồngđộurealà2,5M;cácionkimloạicũngảnhhưởngp h ứ c tạptớihoạttínhRibonucleolyticcủaenzyme:ionMg2+g i ú ptăngcườnghoạt

động;K+v àCa+ởnồngđộthấp0,2mMvà0,4mMthìứcchếenzymenhưngởnồng

ế[42]

CácnghiêncứuởViệtNammớiđâychothấynguồnenzymetừnọcrắnhổmangViệtNamcónhiềuđiểmkhácbiệtsovớicácRNaseđãđượcnghiêncứutrênthếg i ớ i : p Hopt=2,620,6;RNaserấtbềnvớinhiệtvàMg2+khôngph ải l à chấth o ạ t hóaRNase…

[2,3,7].Nhữngkếtquảtrênchothấyởcácloàirắnkhácnhauthìtính đặctrưngcủaRNasecũngkhácnhauvàcóthể tồntạinhiềudạngphântửRNasenọcrắnvớibảnchấtproteinkhácnhau

6 NHỮNGỨNGDỤNGCỦARNASETRONGYHỌC

RNasec ó mộtý nghĩahếts ứ c t o lớnđ ố i vớin h i ề u loạibệnhtrongy học.N g o à i c

h ứ c n ă n g t i ê u h ó a vàt h a m g i a vàocáchoạtđ ộ n g saomã,p h i ê n mã,s i n h tổnghợpprotein,cácRNasecònthựchiệnnhiềuvaitròtrongphòngchốngvirus,vik h u ẩ n , khánggiun…

Nồngđộv à h o ạ t t í n h củaR N a s e trongdịchb ào v à c á c dịchc ơ t h ể c ó l i ê n q u a

n tớitrạngtháibệnhlýcủanhiềuloạibệnhkhácnhau:Nồngđộenzymetănglàkếtquảphảnứngcủacơthểchốnglạibệnhtật.ĐôikhichínhRNaselạilàtácnhâng â y bệnhvìchúnggâyđộccơthể

NhữngứngdụngtrựctiếpcủaRNasetrongđiềutrịbệnhviruschongườivàvậtnuôiđãđư ợc tiếnhành ở L i ê n Xôvàonhữngnăm70 củathế kỷtrước Trongliệup h á p n g

ư ờ i t a c ó th ể d ù n g n h ữ n g chấth o ạ t hóa,c h ấ t ứcc h ế haythậmchícản h ữ n g RNasevàdạnghợpthểcủaRNaseđểtrịbệnh

Víd ụ : c h ấ t ứ c c h ế khôngc h ọ n lọcenzymep h o t p h o d i e s t e r a s e l à teophilinh a y chấtứcchếchọnlọcrolipramcótácdụnggiảiphóngcácneurotoxinECP,EDNt ừcácbạchcầuaxitgiúpgiảmhiệuứngngộđộcthầnkinh.ChấtứcchếRNasecủan g ư ờ i l à

m g i ả m hiệuứ n g gâyd ị ứngcủacáct á c n h â n g â y d ị ứ n g c ó hoạtt í n h RNaseởmộtsốloàithựcvật.ChếphẩmorangehoạthóaRNaseLcóthểbảovệtếb à o khỏinhiễmtrùngvirus

Nhữngnămgầnđây,ngoàiviệctìmđượcmộtsốRNasenguồngốctựnhiêncónhiềuđ

ặ c t í n h q u ý b á u (nhưonconase,B S - R N a s e ) c á c nhàkhoah ọ c còntập

trungsảnxuấtracácchếphẩmRNasenhântạocóhoạttínhchốngungthưnhờviệcvậndụngthànhc ô n g c ác k ỹ thuậtvà phươngphápc ô n g nghệsinh họchiệnđạiở mứcđộphântử.DạngbiếnthểcủaRNaseđượctạorabằngcáchthaythếmộthaym ộ t vàigốcaminoa c i d c ầ

n c h o s ự t ư ơ n g t á c R I - R N a s e hoặctạot h ê m liênkếtdisunfidetrongtếbào

CácbiếnthểcủaRNasecũngđượctạorabằngcáchgắnđặchiệuvàoRNasen h ữ n gphântửproteinliênkếtchặtchẽvớinhữngtếbàonhấtđịnhchophéptạoran h ữ n g toxinchọnlọchiệuquả

Kếtluận:Nhữngdẫnliệutrênđâychochúngtathấykhảnăngứngdụngvàt r i ể n vọngc ủ a R N a s e đ ố i v ớ i Y h ọ c Trongt ư ơ n g lai,nhiềudạngR N a s e v ẫ n s ẽ đ ư ợ c nghiêncứuđểtạoracácloạithuốctácđộnghiệuquảlêncáckhốiu,cácthuốcc h ữ a dịứng,cáctestchuẩnđoáncũngnhưcáchệthốngtruyềntínhiệuđịnhhướngv à chọnlọc.Nhiềubệnhhiểmnghèosẽđượcphòngchốngvàchữatrịhiệuquả

- Dungdịchđ ệ m g l y c i n e ( G l y ) 1 0 mM,p H 2 , 5 , mộts e r i h ỗ n hợpđệm4 thànhphầnGlycine-Citrate-Phosphate-

Tristổngnồngđộ40mM,mỗichấtvớinồngđ ộ 10mM

2.2 CÁCPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

Hoạtt í n h RNaseđượcđ o t r ê n máyq u a n g p h ổ U V

-v i s a b l e S p ect roph ot om e te r

x)ldungdịchcơchất,màkhôngphảilàgiátrịOD260c ủ ahỗnh ợ p phảnứngtạithờiđiểmbắtđầuphảnứng,bởivìkhichothêmxldungdịch

enzymev à o đ ể bắtđầup hả n ứ n g t h ì hỗnhợpphảnứ n g bịp h a l o ã n g r a mộtchút ChonênđểtínhđượcgiátrịOD260thựccủahỗnhợpphảnứngtínhtạithờiđiểmbắtđầuphảnứng,thìphảitínhđếnsựphaloãngnày.Đâychínhlànguyênnhânvìsaop h ả i sửdụnghệsốđiềuchínhk.Hệsốkđượcxácđịnhnhưsau:

…)làmtăngmậtđộquangcủahỗnhợpphảnứng(1ml)lên1đơnvịO D260sau30giâyphảnứng(thờigianphảnứngtínhtừlúcbắtđầuchoenzymevàohỗnhợpphảnứngchứacơchất).[1]

2.2.2 CácphươngphápsắckíphântáchRNasenọcrắnhổmang

2.2.2.1PhươngphápsắckýtraođổiiontrêncộtSPSepharose4FastFlow

-Cơsở:Phươngphápsắckítraođổiiondựatrêncơsởcủaphảnứngtươngt á c tĩnhđiệnion-iongiữaprotein-

enzymetantrongdungdịchđệmloãngvớinhựat r a o đổii o n (chấtmang),cụt h ể l à sựp h

â n t á c h c á c proteint r o n g mộth ỗ n hợpproteind ự a t r ê n sựkhácb i ệ t trongđiệntíchb

ề mặtc ủ a c á c p h â n tửcủac h ú n g ở m ộ t giátrịpHnhấtđịnh.Phươngphápnàykhôngchỉlàmộtkhâuquantrọngtrongq u á trìnhtáchchiếtmàcòngiúpđánhgiáđượcmộtvàitínhchấthóalýcủaenzymeq u a n tâm[62,63]

Sắckítraođổiionđượctiếnhànhtrêncột(kíchthước0,920cm,tứclàthểt í c h cộtg

e l khoảng1 4 cm3)vớichấtmangl à S P s e p h a r o s e 4 FastFlow.Q u á trìnhsắckítraođổiionđượctiếnhànhởcácgiátrịpHkhácnhautrongvùngpH=4,07,5.Trongmỗithínghiệmđãsửdụngkhoảng70mgnọcrắnđôngkhôđểchol ê n cột

+Đ ầ u tiên cộ tđ ượ c cânbằngvớidu ng dịchđệmb a n đ ầ u ( đ ệ m citrateh a y đệmphosphate,xemphầntrên)

+Chuẩnbịmẫunọcrắn:trướckhichạysắckí1hcânkhoảng70mgnọcrắnh ổ mangđôngkhôvàhòatantrong~1,5mldungdịchđệmbanđầu,sauđólitâmtrong10phútvớitốcđộ12000vòng/phútở4oC,loạicặn,thulấyphầndịchlitâmc h ứ a enzymeđểcholêncột

SắckíởcácgiátrịpHtừ4,0đến6,0đượctiếnhànhtrongđệmcitrate,còns ắ c kíởcácgiátrịpHtừ6,5đến7,5–

trongđệmphosphate.Khisắckíởcácgiátrịp H từ4,0đến6,5quátrìnhsắckíđượctiếnhànhnhưsau:saukhichomẫulêncột,r ử a cộtbằng36mldungdịch,mốiphânđoạnthu3ml(gồm15mldungdịchbanđầu–

du ng dịchA , v à 21mldungdịchb a n đầuc h ứ a 0,15MNaClc ó g i á t r ị pHt ư ơ n g ứng),sauđóchạygradientnồngđộNaCl0,150,80Mvớithểtíchchungcủagradientbằng150ml,mốiphânđoạnthu2ml.SaukhikếtthúcchạygradientNa Cl, rửatiếpcộtbằng60mldungdịchB,mỗiphânđoạnthu3ml.sắckíởgiátrịp H =7,0,toànbộquátrìnhsắckíđượctiếnhànhtươngtự,chỉkhácởđiểmlàthay

đệmb a n đầuc h ứ a 0,15M N a C l d ù n g đ ể rửacộtbằngđệmb a n đầuchứa0,10MN a C l vàthaygradient0,150,80Mbằnggradient0,150,7

MNaCl,cònkhisắck í ởgiátrịpH=7,5thìchỉdùngdungdịchđệmbanđầu(dungdịchA)đểrửacộtv à thaygradient0,150,80Mbằnggradient0,00,60MNaCl

Toànb ộ q u á t r ì n h s ắ c k í đượctiếnhànhtựđ ộ n g t r ê n thiếtbịF P L C t h e o chươngtrìnhphầnmềmsau:

Main

0.00BaseVolume

0.00Bl o c k D i e u k i e n b a n d a u ( D i e u k

i e n b a n d a u )0.00BaseSameAsMain0.00Alarm_PressureEnabled,3{MPa},0.00{MPa}

0.00Alarm_UVDisabled,3000{mAU},0{mAU}

0.00Flow1.00{ml/min}

0.00BufferValveAA10.00ColumnPositionPosition20.00End_Block

0.00BlockLoadmau( Lo ad m au)

0.00BaseSameAsMain0.00InjectionValveLoad0.00SampleFlow1{ml/min}

0.00Fr action ation Stop

2.00End_BlockB l

o c k R u a c o t(Ruacot)0.00BaseSameAsMain0.00SampleFlow0.00{ml/min}

0.00InjectionValveInject0.00Fractionation18mm,3.000{ml},FirstTube,Volume36.00End_Block

0.00Bl oc kc ha ygra di ent ( C h a y g r a d

i e n t )0.00BaseSameAsMain0.00Gradient65,0{%B},150{Base}

0.00Fractionation18mm,200{ml},NextTube,Volume150.00End_Block

0.00BlockHaugradient(Haug

radien)

0.00BaseSameAsMain0.00Gradient100.00{%B}45{Base}

0.00Fractionation18mm,3.000{ml},Next Tube,Volume60.00End_Block

0.00BlockTaisinhcot(Taisinh

cot)

0.00BaseSameAsMain0.00Gradient0.00{%B}45{Base}

0.00FractionationStop600.00End_Block

2.2.2.2 PhươngphápsắckísànglọcphântửtrêncộtSuperdex75

Cơsở: Phươngp h á p sắckí sànglọcphântử(hay còngọilàsắckílọcgel) d ự a

tr ên sựk h á c biệttronghìnhdạngv à k í c h t h ư ớ c p hâ n tửcủacá c proteinkhácn h a u trongmộthỗnhợpprotein.Khichomộth ỗ n hợpproteincó kíchthướcphânt ử khácnhauđiquacộtlọcgel,thìnhữngproteincókíchthướcphântửlớnhơnlỗc ủ a cáchạtgelsẽkhôngđivàobêntrongcáchạtgel,vàrakhỏicộttrongcáigọilàthểtíchtựdocủacột;cònnhữngproteincókíchthướcphântửnhỏhơnkíchthướcl ỗ củacáchạtgel,vàchúngsẽđivàobêntrongcáchạtgel,tứclàchúngđượcphânb ố giữa2pha–

bêntrongvàbênngoàicáchạtgelvớicáchệsốphânbốtươngứng.C á c proteinnàysẽđirakhỏicộtlọcgeltheothứtựngượcvớikíchthướcphântửc ủ a chúng,tứclàcácproteinnàocókíchthướcphântửlớnthìrakhỏicộttrướcvàn h ữ n g proteinnàocókíchthướcphântửnhỏhơnsẽrasau,cácchấtmuối(thường

cómặtt ro ng cá c chếphẩmprotein)r a khỏicộtsaucùng (chínhvìvậymàcộtlọcg e l thườngđượcsửdụngđểloạimuốikhỏicácdungdịchprotein)[62,63].

Phươngphápsắckísànglọcphântửcũngđượctiếnhànhtựđộngtrênthiếtb ị sắckíFPLC.Trongphạmviluậnvănnàychúngtôichỉtiếnhànhsắckísànglọcp h â n tửchếphẩmnọcrắnhổmangđôngkhôở2giátrịpHkhácnhaulà5,5(trongđ ệ m citrate10mM)và7,5(trongđệmphosphate10mM).Trongmỗithínghiệmđãsửdụngkhoảng20mgnọcrắnđôngkhôđểcholêncột

+Đ ầ u tiên cộ tđ ượ c cânbằngvớidungdịchđệmb a n đ ầ u ( đ ệ m citrateh a y đ ệ m phosphate,xemphầntrên)

+Chuẩnbịmẫunọcrắn:trướckhichạysắckí1hcânkhoảng20mgnọcrắnh ổ mangđôngkhôvàhòatantrong~1,5mldungdịchđệmbanđầu,sauđólitâmtrong10phútvớitốcđộ12000vòng/phútở4oC,loạicặn,thulấyphầndịchlitâmc h ứ a enzymeđểcholêncột

~18cm3),từmlthứ15trởđibắtđầuthucácp h â n đ o ạ n , t h ể tíchmỗip h â n đ o ạ n l à 1 ml(thukhoảng6 5 –

7 0 p h â n đoạn).Q u á trìnhsắckílọcgel(sànglọcphântử)đượctiếnhànhtựđộngtrênmáysắckíFPLCtheochươngtrìnhphầnmềmsau:

Main

0.00BaseVolume

0.00Bl o c k D i e u k i e n b a n d a u ( D i e u k

i e n b a n d a u )0.00BaseSameAsMain0.00Alarm_PressureEnabled,3{MPa},0.00{MPa}

0.00Alarm_UVDisabled,3000{mAU},0{mAU}

0.00BufferValveAA10.00Flow1.00{ml/min}

0.00End_Block

0.00BlockLoadmau( Lo ad m au)

0.00BaseSameAsMain0.00SampleFlow1.00{ml/min}

0.00InjectionValveLoad2.00End_Block

0.00Blockchaycotlocgel( C h a y c o t l o c g e

l )0.00BaseSameAsMain0.00InjectionValveInject0.00Fractionation18mm,100{ml},TubeNumber[B9],Volume75.00End_Block

0.00BlockTaisinhcot(Taisinh

cot)

0.00BaseSameAsMain0.00InjectionValveInject0.00FractionationStop300.00End_Block

Hàmlượngproteinđượcghitựđộngliêntụctrênmáysắckí.Tuynhiên,saukhiquátrìnhsắckíkếtthúcđãtiếnhànhđohoạttínhRNasevàhàmlượngproteintrongtấtcảcácphânđoạnthuđược

2.2.2.3 Phươngphápphântíchkếtquảphântáchprotein

Nhưđãđểcậptớiởtrên,hàmlượngprotein đượcxácđịnhliêntụcvàđượcg h i lạitự

đ ộ n g t r ê n m á y s ắ c kí,dovậysắckíđ ồ p h â n t á c h proteinl à mộtđ ư ờ n g c o n g liêntụcđượcghilạitrênmáysắckí.Hơnnữa,trênthiếtbịFPLCcòncóphầnmềmxửlícáckếtquảphântáchproteinnhậnđượcsausắckí:chỉcầnđặtcontrỏvàovùngsắckíđồvàkíchphảilàhiệnlênmenu,sauđókíchtiếpvàohàng“peaki n t e r g r a t e ”làmáysẽtựđộngvẽbaselineởvùngchâncủacácđỉnhproteinởdạngm ộ t đườngg ạ c h đ ứ t quãng,đ ồ n g t h ờ i trêns ắ

c k í đ ồ x u ấ t hiệns ự p h â n c h i a r a n h g i ớ i giữacác đỉnhprotein,trên mỗiđỉnhproteinđềucóghisốchỉthểtích rakhỏic ộ t củađỉnhproteintươngứng,đặcbiệtlàtrênmànhìnhởphiadướisắckíđồcòn

xuấthiệnmộtbảnglớntổngkếtkếtquảphânt á c h proteinc ủ a th í nghiệm đãcho,c h ứ a cácthôngsốchínhsaubaogồm4cộtsau:

- Chỉmộtxungđ ộ n g nhỏ,v í dụn h ư tựn h i ê n á p s u ấ t bịtụtxuốngbằng0 ( đ i ề u nàyđôikhixảyratrongquátrìnhsắckí)cũngđượcghilạiởdạngmộtvạchthẳng( c ó đ ộ c a o

k h á c nhau tùythuộct ừ n g thờiđiểm)t r ê n s ắ c k í đ ồ v à vạchn à y đ ư ợ c máyn h ậ n biếtnhưl à mộtđỉnhprotein;n h ữ n g đỉnhgiản à y đươngn h i ê n bịloạibỏ

tínhcủaenzymevàopH(vàcảtìmpHoptc ủ acácchếphẩmRNasenọcrắnhổmangt ư ơ n g ứngvớicácđỉnhRNaseđãnhậnđược),chúngtôitiếnhànhđohoạttínhcủaenzymet h e o phươngp h á p đãmôt ả ở t r ê n tronghỗnhợpđệmGly- C i t r a t e - P h o s p h a t e –Tris40mMtạicácgiátrịpHtrongvùngpH=19,vớicácgiátrịpHk h á c nhaucáchnhautừ0,25-0,5đơnvịpH.

Chuẩnbị cá c dungdịchc ơ chấtvới nồngđộthíchhợptrongcác dung dịchđ ệ m tươngứng(cácdungdịchcơchấtcóOD0260(-E)=2,0-2,1)

-TiếnhànhđohoạttínhenzymeởcácgiátrịpHkhácnhaunhưđãtrìnhbày

ởtrên

- TínhAhayPnhưđãtrìnhbàytheocôngthức(1)ởtrang19

- Từc á c kếtq u ả n h ậ n đ ư ợ c x â y dựngđ ồ t hị biểudiễnmốiphụthuộch o ạ ttínhcủaenzymevàopH(đồthịA–pHhayP–pH);

- TừđồthịtrênxácđịnhđượcgiátrịpHoptcủaenzyme

2.2.3.2 Phươngp h á p n g h i ê n cứuđộnghọcbãoh ò a e n z y m e bởicơchất( đ ộ n g học P–S)

ĐểnghiêncứuđộnghọcbãohòaRNasebởicơchất,chúngtôitiếnhànhđoh o ạ t t í

n h củaenzymetrongh ỗ n h ợ p đệmGly- C i t r a t e - P h o s p h a t e –

T r i s 4 0 m M ( m ỗ i thànhphầncónồngđộ10mM)cógiátrịpHtươngứngvớipHoptc ủ acácđỉnhR N a s e , vớinồngđộcơchấtt r o n g khoảngtừ0,25đến2,5đơnv ị O D260.P h ư ơ n g p h

Tris40mMcógiátrịpHtươngứngvớipHtốiưucủacácđỉnhRNaseđãchuẩnbịởbướctrên;

- Phac á c seridungdịchc ơ chấtvới c á c nồngđộc ơ chấtkh ác nhautừc ác d u n g dịchcơchất-dungdịchmẹtươngứngđốivớimỗiđỉnhRNase;

- Đoh o ạ t t í n h c ủ a c á c đỉnhRNasev ớ i mỗis e r i dungdịchcơchấtc ó pHt ư ơ n

Đểchothuậntiện,trongc á c t h í nghiệmv ề nghiêncứumốiphụthuộchoạtt í n h củaR

N a s e v à o pHvàn g h i ê n c ứ u độnghọcb ã o h ò a enzymebởic ơ chất,cản ồ n g đ ộ c ơ chất( A R N ) s ả n phẩmcủaphảnứ n g đềuđượcbiểudiễnbằngđ ơ n vị( đ v ) OD260.TừđơnvịODnàydễdàngtínhđượcnồngđộcơchất(ARN)tronghỗnh ợ p phảnứngtheocôngthứcsau[

MộtđơnvịRNase(1U)làlượngenzymeRNasexúctácphảnứngthủyphânc h ế phẩmARNtừnấmmentrongcác điềukiệntốiưu,làmtăngODcủahỗnhợpp h ả n ứnglên1đơnvịOD260.Điều kiệnphảnứng:nồngđộcơchấtbãohòa,nhiệtđ ộ phòng,phảnứngthựchiệntrongđệmGlycine10mM,pH2,5vớithểtíchchungc ủ a hỗnhợpphảnứnglà1mlvàthờigiantiếnhànhphảnứnglà30s[1]

2.2.4 Cácphươngphápxácđịnhhàmlượngprotein

-Trongtấtcảcácthínghiệmvềsắckíhàmlượngprotein đượcghitựđộngl i ê n tụcởbướcsóng280nmbởithiếtbịtựghicủamáysắckíFPLCtrongsuốtquátrìnhsắckí.Tuynhiên,hàmlượngproteintrongcác phânđoạnnhậnđượcsausắck í đềuđượcxácđịnhbằngphươngphápquangphổtheohấpphụcủacácdungdịchproteint ư ơ n g ứ n g ở cácb ư ớ c s ó n g280và2 6 0 nm.Sauđ ó đ ư ợ c t í n h t h e o c ô n g thức:

[Pr]=1,45.OD280–0,74.OD260 (mg/ml) (4)

hoặcđượcthínhtheobiểuđồ(haynomogram)tươngứng[62,63]

Chương3 KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN

RNaselà nhóm enzyme đ ư ợ c nghiêncứurấtnhiều,n h ư n g R N a s e từn ọ c rắnn ó ichungcòn ítđượcnghiêncứu.Chođếnnaychỉ cóRNasetừnọcrắnhổmangc ủ a ẤnĐộlànhậnđượcởdạngcóđộsạchcao.CònRNasetừnọcrắncủacácloàih ổ mangkhácmớichỉđượclàmsạchmộtphần.RNasetừnọcrắnhổmangởnướct a vẫnchưađượcnghiêncứu,ứngdụngvìvậynhữngđặctínhcủaenzymenàynhưp Hopt,độbềnnhiệt,khảnănghấpthụtrêncácloạigelnhưgelCa-

P,khảnăngtươngt á c vớichấtmangtraođổiion,khốilượngphântử đềuchưađượcbiếtđến

Tronggiớihạnkhoáluậnnày,chúngtôimớibướcđầunghiêncứumộtsốtínhchấthoálývàxúctáccơbảncủaenzymevàsửdụngmộtsốphươngphápkỹthuậtthôngthườngđ ư ợ c ápdụngđ ể t in h chếvàlàmsạchproteinnóichungv à enzymen ó i riêngnhằmtáchRNaserakhỏicácproteinkháccủanọcrắnhổmangvớimụcđ í c h tìmquytrìnhs ơ bộđ ể là m sạche n z y m e này.Sauđónghiêncứumộtsốt í n h chấthoálývàxúctáccủaRNasetừnọcrắnhổmangởViệtNam

3.1 KẾTQUẢPHÂNTÁCHRNASENỌCRẮNBẰNGCÁCPHƯƠNGPHÁPSẮCKÍ

3.1.1 KếtquảphântáchRNasenọcrắnbằngphươngphápsắckýtraođổiionN h ư ch

úngtabiếtrằngcác proteinkhácnhauc ó điệntích tổngsốkhácnhau

vàsựkhácbiệttrongđiệntíchbềmặtlàcơsởđểphântáchcácproteinkhácnhaubằngphươngp h á p s ắ c kít r a o đổiion.M ặ t k h á c , điệntíchtổngs ố b ề mặtcủaproteinlạiphụthuộcrấtmạnhvàopHcủamôitrường.Dođómộttrongcácvấnđềđặtrakhisửdụngphươngphápsắckítraođổiionđểphântáchmộtenzymerakhỏih ỗn hợpproteinphứctạplàtìmgiátrịpHmàtạiđósựphântáchđạthiệuquảtốtn h ấ t Chínhvìvậymàmộttrongnhữngnhiệmvụquantrọngcủaluậnvănlàtốiưuh o á điềukiệnphântáchenzymeRNasecủanọcrắnhổmangtheogiátrịpHvàtốiưuhoáđiềukiệnphảnhấpthụenzymekhỏicộttraođổiionđểchocácđỉnhenzymet á c h rakhỏinhauvàtáchrakhỏicácđỉnhproteinkhácnhaucàngxacàngtốt

Đểđạtđượcmụcđíchnêutrên,trongnghiêncứunàychúngtôisửdụngnhựatraođổii o n S P S e p h a r o s e 4 F a s t F l o w ( S u l f o p r o p y l -

S e p h a r o s e 4 F a s t Flow),một

chấtmanglàmviệctrongvùngpHrộng(từpH=2,0đếnpH=13)vàcónhiềutínhchấtc ơ l í tốtchot h ự c hiệnquát r ì n h sắckít r a o đổiion(nhưđ ộ bềnc ơ h ọ c c a o , khôngbịcongótởnồngđộmuốicao…)

QuátrìnhsắckíđãđượctiếnhànhtrongvùngpH=4,07,5(cụthểlàởcácgi á trịpHbằng4,0;4,5;5,0;5,5;6,0;6,5;7,0và7,5)

3.1.1.1 KếtquảsắckíởpH4,0

Kếtquảphântáchproteinnọcrắnhổmangở giátrịpH=4,0đượctrìnhbàyt r ê n hình3.1(hàmlượngproteinđượcghitựđộngliêntụctrênmáysắckí)

TriSPNRHM141009001:1_UV TriSPNRHM141009001:1_Conc TriSP NRHM141009001:1_UV@01,BASEM

%B

18.32

113.79 133.69 80

60 19.92

40

165.28

Cácsốtrênđầumỗiđỉnhc hỉthểtíchrakhỏicộtsắckí củađỉnhproteintươngứn g.

20

-1.816.75

0 26.56

56.8465.1 1

183.20 222.15233.75

A TriSPNRHM1410090 01:1_UV

TriSPNRHM1410090 01:1_Conc TriSPNRHM141009001:1_UV@01,BASEM

%B

18.32 80

Hình3.1.S ắ c kíồph ân tách proteinn

ọ c r ắ n h ổ mangt r ê n cộtS P S e p h a r

o s e 4 F a s t Flowở g i á t r ị pH= 4,0(A)vàphóngđạiphầnđầucủasắck í đ ồ n à y (

B ) T r ụ c hoànhl à thểt í c h , ml;trụct u n

g l à g i á trịO D280;đ ư ờ n g c o n g liềnlàprotein,đườngchéolàgradient nồngđộNaCl;đườngcong

&6vớithểtíchrakhỏicộttươngứnglà18,32và165,28ml),cácđỉnhproteincònl ạ i lànhữngđỉnhnhỏ;nếutínhtheochiềucaocủađỉnhthìđỉnhprotein1caotươngđ ư ơ n g với2 đỉnhlớn.Ngoàira cầnphảinhậnx é t rằngđỉnhproteint h ứ 2nằmrấtgầnđỉnh1,chonêntrênsắckíđồtoànphần(hình3.1,A)khôngthểnhậnthấyđỉnhproteinn à y , màđỉnh2 chỉđượcpháthiệ

nk h i phóngđạip h ầ n sắck í t ư ơ n g ứ n g ( h ì n h 3.1,B).Trênphầnsắckíđồphóngđạinàyđãnhìnrõđỉnhprotein2làphầnnhôcaolênởbênvaiphảicủađỉnh1

Kếtquảx á c địnhh o ạ t t í n h R N a s e trongc á c p h â n đoạns ắ c k í đượct ó m tắttrongbảng3.2(xemtrangsau)

Cáckếtquảtrongbảng3.2cùngvớikếtquảxácđịnhproteintrongtừngphânđ o ạ n đượctrìnhbàyởdạngsắckíđồtrênhình3.2.Kếtquảtrongbảng3.2vàsắckíđồt rê n hình3

2 chothấyởg i á trịpH= 4,0RNasenọcrắnh ổmangphântá ch ra đ ược thànhítnhất5đỉnhenzymekhácnhau,trongđócó3đỉnh2,3và4tươngđốiđ ố i xứng,còn2đỉnh1và5khôngđốixứng(đềucóvaibêntráiđượckéodàira).Haiđỉnhenzymekhôngđốixứngnàycũnglànhữngđỉnhenzymelớnnhất.Ngoàir a , giữa2đỉnh2&3cóthểcòncó1đỉnhenzymenhỏnữa

pH 4,0 Pr A

A/phđ Pr, mAU

Gradient

Bảng3.2.KếtquảxácđịnhhoạttínhRNasetrongcácphânđoạnsắckín ọ c rắn

hổmangởgiátrịpH=4,0(Ghichú:Cácphânđoạnkhôngcóhoạttínhenzymekhôngđượcghitrongbảngnày) Phânđ

oạn

V,

ml

A, U

Phânđ oạn

V, ml

A, U

Phânđ oạn

V, ml

A, U

Phân đoạ n

V, ml

A, U D7 95 0,1329 F11 135 0,1192 G4 163 3,1182 H1 211,5 0,3450 D6 97 0,1329 F10 137 1,0712 G5 165 3,7609 I1 214,5 0,3474 D5 99 0,6054 F9 139 1,5020 G6 167 3,9929 I2 217,5 1,6510 D4 101 0,6782 F8 141 1,7694 G7 169 2,7609 I3 220,5 2,2454 D3 103 1,4748 F7 143 0,8860 G8 171 2,4689 I4 223,5 3,2902 D2 105 2,7508 F6 145 0,3026 G9 173 1,6529 I5 226,5 3,4982 D1 107 3,1108 F5 147 0,3334 G10 175 1,0574 I6 229,5 5,1610 E1 109 3,9929 F4 149 0,6492 G11 177 1,4284 I7 232,5 5,5742 E2 111 4,9129 F3 151 1,2812 G12 179 1,4183 I8 235,5 5,8454

E3 113 5,3748 F2 153 1,2932 H12 181 2,0444 I9 238,5 5,5582 E4 115 5,6748 F1 155 1,0132 H11 183 4,2331 I10 241,5 3,0730 E5 117 4,2462 G1 157 1,1272 H10 185 5,8010 I11 244,5 0,8294 E6 119 2,4828 G2 159 1,4569 H9 187,5 3,2853

100 4

80 3

[NaCl], M 0,492 0,605 0,718 0,796 1,000

1 2 3 4 5

115,0 141,0 167,0 185,0 235,0

35,56 5,98 28,40 18,40 37,42

125,76

28,28 4,76 22,58 14,63 29,76 100,0 Tổng hoạt tính:

85.79

130.34 16.72

72.33 62.89 174.04 198.11 220.77 234.725.92 51.11

22.23 -2.03

3.1.1.2 KếtquảsắckíởpH4,5

KếtquảphântáchproteinnọcrắnhổmangởgiátrịpH=4,5đượctrìnhbàyở dạngsắckýđồtrênhình3.3

TriSPNRHM081009001:1_UV TriSPNRHM081009001:1_Conc TriSPNRHM081009001:1_UV@01,BASEM

22.23

Hình3.3.Sắckíđồphântáchproteinn ọ

c r ắ n h ổ m a n g t r ê n c ộ t S P S ep h

a ro se 4 F a s t Flowở g i á trịpH= 4 ,5 (ghichúnhưtrênhình3.1)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 ml

B

Theokếtquảtínhtoán t r ê n máysắckíFPLC(xembảng2phần phụlục)ởg i á t r ị p

H = 4,5p r o t e i n n ọ c rắn h ổ mangp h â n t ác h r a đ ư ợ c t h à n h 19đỉnhlớnb é khácnhau.Tuynhiên,cũnggiốngnhưtrườnghợpsắckíởpH4,0chúngtôichỉtính1 3 trongsố19đỉnhnày(cácthôngsốchínhcủanhữngđỉnhproteinnàyđượcdẫntrongbảng3.4),sốcònlạikhôngđ ư ợ c t í n h đếnd o c á c n g u y ê n nhânđãnêutrongphầnphươngphápnghiêncứu

Nếut í n h t h e o chiềucaoc ủ a đỉnht h ì đỉnhprotein3 c a o tươngđươngv ớ i đỉnh3và8.Ngoàirađỉnhprotein2nằmrấtgầnđỉnh3vàtrênsắckíđồchỉthấyởdạngvait rá i củađỉnhprotein 3(hình3 3 A),mớic hỉ tá ch đượcph ần đầu đỉnhr a k h ỏ i đỉnhprotein3 (xemphóngđạicủaphầns ắ c k í t ư ơ n g ứngtrênhình3.3.B).T r ê n sắckíđượcvẽtheonồngđộ

proteincủatừngphânđoạnthìđỉnhprotein2nàyh o à n tòankhôngthấy(xemhình3.4ởdưới).

KếtquảxácđịnhhoạtđínhRNasetrongcácđoạnphânđoạnsắckíđượctómt ắ t ởbảng3.5

Bảng3.5.KếtquảxácđịnhhoạttínhRNasetrongcácphânđoạnsắckínọcrắnhổmangởgiátrịpH=4,5(ghichúnhưởbảng3.2)

pH 4,5

A/phđ Protein

Phân đoạn

V, ml

A, U

Phân đoạn

V, ml

A, U

Phân đoạ n

V, ml

A, U C4 67 0,6542 D5 99 0,8569 E12 131 2,3752 G12 179 0,4740 C5 69 0,8925 D4 101 0,8872 F12 133 3,4592 H11 183 0,5140 C6 71 0,0449 D3 103 1,2112 F11 135 3,8384 H8 190,5 0,5057 C7 73 0,4037 D2 105 2,7752 F10 137 3,6272 H7 193,5 1,5144 C8 75 0,7956 D1 107 4,1752 F9 139 2,7420 H6 196,5 2,2758 C9 77 1,0822 E1 109 4,4384 F8 141 1,2344 H5 199,5 4,0037 C10 79 3,2681 E2 111 3,6020 F7 143 0,0380 H4 202,5 3,9678 C11 81 5,9649 E3 113 2,2624 G1 157 0,0616 H3 205,5 4,3757 C12 83 8,0449 E4 115 1,2816 G3 161 0,0180 H2 208,5 6,0558 D12 85 8,3982 E5 117 1,9112 G5 165 0,5664 H1 211,5 7,4358 D11 87 8,6209 E6 119 2,2201 G6 167 0,9420 I1 214,5 8,7917 D10 89 7,9072 E7 121 1,3632 G7 169 2,0675 I2 217.5 8,1700 D9 91 5,1649 E8 123 1,7032 G8 171 2,7424 I3 220.5 7,2460 D8 93 2,3529 E9 125 1,8544 G9 173 1,9736 I4 223.5 6,6979 D7 95 1,7142 E10 127 1,9201 G10 175 2,1931 I5 226.5 1,5557 D6 97 0,9201 E11 129 2,0832 G11 177 1,4692

e n ọ c rắnh ổ mangcũngp h â n t á c h r a đ ư ợ c thànhí t nhất5 đỉnhenzyme

[NaCl], M

Tổng hoạt tính 173,45 100,00

khácnhau,trongđócó2đỉnhlớnvà3đỉnhnhỏ,đỉnh1và2làtươngđốiđốixứng,c á c đỉnhcònlạilàkhôngđốixứng,đỉnh5còncóvaitráikhárõràng(vainàythựcr a làmộtđỉnhenzymenữachưađượcphântáchrakhỏiđỉnhenzymechính).Tổngh ợ p kếtquảphântáchRNasenọcrắnhổmangđượctómtắttrongbảng3.6

TriSPNRHM06100 9 0 0 1 : 1 _ UV TriSPNRHM06100 9 0 0 1 : 1 _ Conc TriSPNRHM061009001:1_UV@01,BASEM