Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để chữa bệnh. Ngày nay với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, việc nghiên cứu các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên nhằm mục đích dẫn đường cho việc tổng hợp thuốc đã và đang diễn ra mạnh mẽ. Các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học lí thú và hoạt tính sinh học đa dạng đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học nhằm tìm ra các loại thuốc có giá trị trong điều trị bệnh cho con người, đặc biệt là các bệnh nan y. Trong các loài thực vật có giá trị trong y học phải kể đến các loài cây lá kim (Conifer). Các loài này là nguồn nguyên liệu chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao ví dụ các hợp chất taxol được phân lập từ loài thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia), Hoa Kỳ đã tạo tiền đề cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc Paclitaxel chống ung thư vú (David et al., 2000) hay hợp chất homoharringtonine được phân lập từ nhiều loài trong chi Cephalotaxus được phát triển thành thuốc omacetaxine mepesuccinate sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu mãn tính. Khí hậu Việt Nam phân hóa đa dạng theo địa hình, có 4 miền là khí hậu miền Bắc, miền Nam, khí hậu Đông Trường Sơn và khí hậu biển Đông. Đặc điểm địa hình và thời tiết đó đã tạo ra một thảm thực vật vô cùng đa dạng phong phú. Các loài cây lá kim là những loài cây quan trọng cả về sinh thái, kinh tế và văn hóa tại nhiều địa phương như Lâm Đồng, KomTum, Gia Lai, … Các loài lá kim không chỉ giữ vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái rừng trên các vùng núi cao mà còn là nguồn nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, xây dựng, công nghiệp chất béo, hóa mỹ phẩm, dược phẩm…), đặc biệt một số loài còn được dùng trong các bài thuốc dân tộc. Theo số liệu thống kê của Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự (2005), trong số 34 loài lá kim ở Việt Nam có tới 15 loài ở Tây Nguyên (chiếm 44,11%). Vì thế mà Tây Nguyên được coi là “cái nôi” của loài lá kim có tính đa dạng vào hàng thứ hai của Việt Nam, đặc biệt là tại Đắk Lắk, Kon Tum và Lâm Đồng. Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) là những loài cây lá kim có giá trị kinh tế của khu vực Tây Nguyên, Việt Nam. Tuy nhiên, cho tới nay loài Kim giao núi đất vẫn chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cả trong và ngoài nước, trong khi Đỉnh tùng mới chỉ được nghiên cứu hạn chế tại một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản và chưa được nghiên cứu tại Việt Nam, Hoàng đàn giả mới chỉ có nghiên cứu thành phần hóa học qua tinh của dầu lá.Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài lá kim trên có nhiều triển vọng tìm ra chất có cấu trúc mới và có hoạt tính sinh học lý thú làm tiền đề cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc chữa bệnh góp phần nâng cao giá trị nguồn tài nguyên sẵn có ở vùng Tây Nguyên. Kết hợp với kết quả nghiên cứu về đa dạng nguồn gen di truyền tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc khai thác, phát triển bền vững và bảo tồn các loài cây lá kim tại khu vực Tây Nguyên, Việt Nam. Xuất phát từ các cơ sở khoa học nêu trên chúng tôi lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam”

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

………

NGUYỄN THỊ LIỄU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ ĐA DẠNG NGUỒN

GEN DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI LÁ KIM

Ở TÂY NGUYÊN, VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62440114

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.TSKH Trần Văn Sung

2 PGS TS Đinh Thị Phòng

HÀ NỘI - 2017

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về 3 loài lá kim nghiên cứu 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật và tình trạng bảo tồn 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia 9

1.2 Ứng dụng kĩ thuật phân tích ISSR và SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật 27

1.2.1 Kỹ thuật ISSR ( Inter Simple Sequence Repeat ) 27

1.2.2 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) 27

1.2.3 Một số thành tựu về nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài thuộc chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia 28

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 32

2.1 Nguyên liệu thực vật 32

2.1.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 32

2.1.2 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền 32

2.2 Hóa chất và thiết bị 33

2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 33

2.2.2 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền 34

2 3 Chiết tách các chất từ 3 loài lá kim nghiên cứu 34

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.2 Phân lập, tinh chế các chất từ 3 loài lá kim 35

2.4 Hoạt tính sinh học 53

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa 53

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào [63-67] 54

2.5 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền 56

2.5.1 Các cặp mồi ISSR và SSR 56

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu 56

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58

3.1 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 58

3.1.1 Hoạt tính sinh học của các dịch chiết 58

3.1.2 Xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch tách được từ 3 loài lá kim 59

3.1.3 Hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập từ 3 loài lá kim 117

3.2 Đa dạng di truyền nguồn gen của ba loài lá kim nghiên cứu 125

3.2.1 Đa dạng di truyền 126

3.2.2 Cây phát sinh chủng loại của 3 loài lá kim 126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 132

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 135

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 136

TÀI LIỆU THAM KHẢO 137

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Nuclear

MagneticResonance Spectrocopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectrocopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

carbon

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer Phổ DEPT HMBC Heteronuclear MultipleBond

HSQC Heteronuclear SingleQuantum

COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương tác proton

MS Mass Spectrocopy Phổ khối lượng

ESI-MS Electron Spray IonizationMass

Spectrocopy

Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử

HR-ESI-MS High Resolution ElectronSpray

Ionization- Mass Spectrocopy

Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử

NOESY Nuclear Overhauser Effect

ISSR Inter Simple Sequence Repeat Lặp lại trình tự đơn giản ở giữa

IR Infrared Spectrocopy Phổ hồng ngoại

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế có hiệu lực 50%

cá thể

ED50 Effective dose Nồng độ có hiệu quả 50% cá thể

KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô

HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người

Lu-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi

MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú

SW626 Human ovarian adenocarcinoma Ung thư buồng trứng

SW480 Human colon adenocarcinoma Ung thư đại tràng ở người HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung bạch cầu cấp tính

SK-Mel2 Human malignant melanoma Ung thư hắc tố

COLO-205 Ung thư ruột kết

PIC Polymorphic Information

Content Hàm lượng thông tin đa hình DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài thực vật thuộc chi Cephalotaxus 4 Bảng 1.2 Các loài thực vật thuộc chi Dacrydium 5 Bảng 1.3 Các kiểu khung carbon của các hợp chất alkaloid được phân lập từ

chi Cephalotaxus 10 Bảng 1.4 Các alkaloid khung homoerythrine phân lập từ một số loài thuộc

chi Cephalotaxus 16 Bảng 1.5 Bảng giá trị IC50 thử hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào

L1210 và KB của các alkaloid phân lập từ lá của loài C harringtonia var nana [15] [20] 25 Bảng 2.1 Nguồn gốc và ký hiệu của các mẫu thuộc 3 loài lá kim dùng trong

nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen 32

Bảng 2.2 Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô cây Hoàng đàn giả 42 Bảng 2.3 Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô cây Kim giao núi đất 46 Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết từ loài Kim

giao núi đất 58

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết HTE tổng và

dịch chiết HĐE với 4 dòng tế bào ung thư 58

Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của HĐ1và Lambertic acid 83

Bảng 3.11 Dữ liệu phổ NMR của HĐ2, Salvinolone [106] và Montbretol 87

Bảng 3.12 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13CNMR, HMBC, NOESY của HĐ2 đo trong CDCl3 88

Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của HĐ4 và Ponasterone A 92

Bảng 3.14 Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất HĐ5 và 20-hyđroxyecdysone 95

Bảng 3.15 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của HĐ6 và ajugasterone C 98

Bảng 3.16 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của KG1 và Amentoflavone 100

Bảng 3.17 Số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của các chất KG1, KG2, KG3 103

Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR của KG4 và 3β-hydroxytotarol 105

Bảng 3.19 Dữ liệu phổ NMR của KG5 và totarol-19-carboxylic acid 107

Bảng 3.20 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của KG6 và Ferruginol 109

Bảng 3.21 Dữ liệu phổ NMR của KG7 và Sugiol 112

Bảng 3.22 Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của chất DT4 117

Bảng 3.23 Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các chất sạch phân lập từ loài Kim giao núi đất 117

Bảng 3.24 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của DT4 với 4 dòng tế bào ung thư 118

Bảng 3.25 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập từ loài Hoàng đàn giả 118

Bảng 3.26 Hoạt tính gây độc tế bào của các chất KG1, KG4, KG5, KG8 và KG9 119

Bảng 3.27 Tổng kết các hợp chất phân lập được từ 3 loài lá kim nghiên cứu 121

Bảng 3.28 Một số thông số di truyền của 3 loài lá kim phân tích tổ hợp với hai chỉ thị ISSR và SSR 126

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Đỉnh tùng (C mannii) Tà Nung, Lâm Đồng và mẫu tiêu

bản 4

Hình 1.2 Cây Hoàng đàn giả (D elatum) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản 6

Hình 1.3 Cây Kim giao núi đất (N wallichiana) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản 8

Hình 1.4 Các hợp chất cephalotaxine không có mạch nhánh tại C-3 12

Hình 1.5 Các hợp chất harringtonine phân lập từ chi Cephalotaxus 14

Hình 1.6 Các hợp chất alkaloid khung Drupacine phân lập từ chi Cephalotaxus 15

Hình 1.7 Cấu trúc các hợp chất homoerythrina alkaloid 16

Hình 1.8 Các hợp chất flavonoid phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus 19

Hình 1.9 Các hợp chất diterpenoid và norditerpen phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus 21

Hình 1.10 Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ loài C mannii 22

Hình 1.11 Các hợp chất từ một số loài thuộc chi Dacrydium 23

Hình 1.12 Kỹ thuật ISSR và SSR [53] 28

Hình 2.1 Sơ đồ chiết alkaloid tổng từ lá và cành của Đỉnh tùng 36

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn alkaloid tổng của lá và cành Đỉnh tùng 37

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các chất từ vỏ Đỉnh tùng 38

Hình 2.4 Sơ đồ chiết từ mẫu thân và cành Hoàng đàn giả 42

Hình 2.5 Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc mẫu thân và cành Hoàng đàn giả 43

Hình 2.6 Sơ đồ chiết từ mẫu lá và cành Kim giao núi đất 47

Hình 2.7 Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết n-hexane lá và cành Kim giao núi đất 47

Hình 2.8 Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết MeOH lá và cành Kim giao núi đất 48

Hình 2.9 Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc lá và cành Kim giao núi đất 50

Hình 3.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất DT1 61

Hình 3.2 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT1 61

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của hợp chất DT2 64

Hình 3.4 Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT2 64

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT3 67

Hình 3.6 Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT3 67

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của hợp chất DT4 69

Hình 3.8 Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT4 70

Hình 3.9 Phổ khối phân giải cao HR- ESI- MS của DT5.1 và DT5.2 73

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR của DT5.1 và DT5.2 73

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR giãn của DT5.1 và DT5.2 74

Hình 3.12 Phổ 13C-NMR và DEPT của DT5.1 và DT5.2 74

Hình 3.13 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT6 76

Hình 3.14 Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT6 76

Hình 3.15 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT7 78

Hình 3.16 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT8 80

Hình 3.17 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT8 80

Hình 3.18 Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ1 84

Hình 3.19 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ1 84

Hình 3.20 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất HĐ1 85

Hình 3.21 Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ2 đo trong CDCl3 89

Hình 3.22 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất HĐ2 đo trong CDCl3 89

Hình 3.23 Phổ HMBC của hợp chất HĐ2 đo trong CDCl3 90

Hình 3.24 Phổ NOESY của HĐ2 trong CDCl3 90

Hình 3.25 Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ4 93

Hình 3.26 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ4 94

Hình 3.27 Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất HĐ4 94

Hình 3.28 Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ5 96

Hình 3.29 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ5 96

Hình 3.30 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất HĐ5 97

Hình 3.31 Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ6 98

Hình 3.32 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ6 99

Hình 3.33 Phổ 1H-NMR của KG1 101

Hình 3.34 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG1 102

Hình 3.35 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất KG4 106

Hình 3.36 Phổ 13C-NMR và DEPT của KG4 106

Hình 3.37 Phổ 1H-NMR của hợp chất KG5 108

Hình 3.38 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG5 108

Hình 3.39 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất KG6 110

Hình 3.40 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG6 111

Hình 3.41 Phổ 1H-NMR của KG7 112

Hình 3.42 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG7 113

Hình 3.43 Phổ 1H-NMR giãn vùng trường cao của KG8 114

Hình 3.44 Phổ 1H-NMR giãn vùng trường thấp của KG8 114

Hình 3.45 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG8 115

Hình 3.46 Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 34 mẫu Đỉnh tùng phân tích với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu ở Hiệp An, b: mẫu ở Tà Nung) 127

Hình 3.47 Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Hoàng đàn giả phân tích với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu ở Sơn Lang, A Yun và Kon Chư Răng (Gia Lai); b: mẫu ở Hòa Sơn (Đắk Lắk); c: mẫu ở Đa Chais (Lâm Đồng); d: mẫu ở Xã Hiếu (Kon Tum) 128

Hình 3.48 Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Kim giao núi đất với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu thu ở A Yun, b: mẫu thu ở Hòa Sơn, c: mẫu thu ở Đa Chais, d: mẫu thu ở Tà Nung, e: mẫu thu ở Xã Hiếu 129

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để chữa bệnh Ngày nay với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, việc nghiên cứu các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên nhằm mục đích dẫn đường cho việc tổng hợp thuốc đã và đang diễn ra mạnh

mẽ Các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học lí thú và hoạt tính sinh học đa dạng đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học nhằm tìm ra các loại thuốc có giá trị trong điều trị bệnh cho con người, đặc biệt là các bệnh nan y Trong các loài thực vật có giá trị trong y học phải kể đến các loài cây lá kim (Conifer) Các loài này là nguồn nguyên liệu chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao ví dụ các

hợp chất taxol được phân lập từ loài thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia), Hoa Kỳ đã

tạo tiền đề cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc Paclitaxel chống ung thư vú

(David et al., 2000) hay hợp chất homoharringtonine được phân lập từ nhiều loài trong chi Cephalotaxus được phát triển thành thuốc omacetaxine mepesuccinate sử

dụng trong điều trị bệnh bạch cầu mãn tính

Khí hậu Việt Nam phân hóa đa dạng theo địa hình, có 4 miền là khí hậu miền Bắc, miền Nam, khí hậu Đông Trường Sơn và khí hậu biển Đông Đặc điểm địa hình

và thời tiết đó đã tạo ra một thảm thực vật vô cùng đa dạng phong phú Các loài cây

lá kim là những loài cây quan trọng cả về sinh thái, kinh tế và văn hóa tại nhiều địa phương như Lâm Đồng, KomTum, Gia Lai, … Các loài lá kim không chỉ giữ vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái rừng trên các vùng núi cao mà còn là nguồn nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, xây dựng, công nghiệp chất béo, hóa mỹ phẩm, dược phẩm…), đặc biệt một số loài còn được dùng trong các bài thuốc dân tộc Theo số liệu thống kê của Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự (2005), trong số 34 loài lá kim ở Việt Nam có tới 15 loài ở Tây Nguyên (chiếm 44,11%) Vì

thế mà Tây Nguyên được coi là “cái nôi” của loài lá kim có tính đa dạng vào hàng

thứ hai của Việt Nam, đặc biệt là tại Đắk Lắk, Kon Tum và Lâm Đồng

Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) là những loài cây lá kim có giá trị kinh tế của khu

vực Tây Nguyên, Việt Nam Tuy nhiên, cho tới nay loài Kim giao núi đất vẫn chưa

được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cả trong và ngoài nước, trong khi Đỉnh tùng mới chỉ được nghiên cứu hạn chế tại một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản và chưa được nghiên cứu tại Việt Nam, Hoàng đàn giả mới chỉ có nghiên cứu thành phần hóa học qua tinh của dầu lá.Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài lá kim trên có nhiều triển vọng tìm ra chất có cấu trúc mới và có hoạt tính sinh học lý thú làm tiền đề cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc chữa bệnh góp phần nâng cao giá trị nguồn tài nguyên sẵn có ở vùng Tây Nguyên Kết hợp với kết quả nghiên cứu về đa dạng nguồn gen di truyền tạo cơ

sở khoa học vững chắc cho việc khai thác, phát triển bền vững và bảo tồn các loài cây

lá kim tại khu vực Tây Nguyên, Việt Nam Xuất phát từ các cơ sở khoa học nêu trên

chúng tôi lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và

đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam”

 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

- Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim:

Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao

và có cấu trúc hóa học lí thú

- Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim trên cơ sở phân tích hai chỉ thị ISSR và SSR nhằm cung cấp thông tin khoa học có giá trị giúp cho công tác bảo tồn các loài lá kim – một loài cây quan trọng của vùng Tây Nguyên,

Việt Nam

 Nội dung luận án

1 Phân lập các hợp chất từ bộ phận lá, thân cành và vỏ của 3 loài Đỉnh tùng

(Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) bằng phương pháp sắc ký cột

2 Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ IR, MS, 1D-NMR, 2D-NMR

3 Thử hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các chất sạch phân lập được

4 Đánh giá tính đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim nghiên cứu

khổng lồ như Cụ Tùng (Sequoia gigantea) ở vùng núi Sierra Nevada (Hoa Kỳ) có chiều cao tới 142 m với tuổi thọ đạt 3000 - 4000 năm, hay loài Ngân Hạnh (Ginkgo biloba) ở Sơn Đông, Trung Quốc cao tới 25 m với chu vi thân đạt tới 16 m Nhưng trong đó cũng có loài lại được trồng làm cây cảnh như Thanh tùng (Juniprus chinensis), Tùng xà (Juniperus squamata), Thông la hán (Podocarpus chinensis),…

ở Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [2]

Tại Việt Nam, đã phát hiện và xác định được khoảng 34 loài thuộc 5 họ trong lớp Thông (Pinopsida) Trong số đó 15 loài được tìm thấy ở khu vực Tây Nguyên (gồm các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lăk, Đắc Nông và Lâm Đồng) đó là:

Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Pơ mu, Bách xanh núi đất, Thông nước, Du sam

núi đất, Thông đà lạt, Thông ba lá, Thông hai lá, Thông lá dẹt, Thông lông gà,

Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum), Kim giao núi đất (Nageia wallichiana), Thông

tre lá dài, Dẻ tùng nam và Thông đỏ nam Các loài này đều có giá trị kinh tế và ứng dụng trong y học [3] [4]

1.1.1.1 Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii)

Đỉnh tùng: Tên khoa học Cephalotaxus mannii Hook.f (Taxaceae)

Năm 1995 tác giả K E Tripp đã xác định chi Cephalotaxus có mười loài [5] Đến năm 1999 các tác giả L Fu, N Li và R R Mill đã xác định thêm một loài là C latifolia Cheng and Fu [6] Như vậy hiện nay trên thế giới chi Cephalotaxus được công nhận gồm 11 loài Ở Việt Nam có 2 loài là C mannii và C oliveri [7]

Bảng 1.1 Các loài thực vật thuộc chi Cephalotaxus

1 C fortune Hooker 7 C latifolia Cheng and Fu

2 C griffithii Hooker 8 C mannii Hooker

3 C hainanensis Li 9 C oliveri Masters

4 C harringtonia (Fobers) Koch 10 C sinensis (Rehder and Wilson) Li

5 C koreana Nakai

11 C wilsoniana Hayata

6 C lanceolata Feng

 Mô tả hình thái: Cây gỗ nhỏ, thường xanh, cây trưởng thành có thể cao từ

10 - 15 m Thân tròn, vỏ trơn nhẵn (vỏ non có màu đỏ, vỏ già bong thành mảng màu trắng) Cành mảnh, mọc đối và xòe ngang Lá mọc xoắn ốc, xếp thành 2 dãy, hình dải, dài 2 - 4cm, rộng 0,2 - 0,4cm, thẳng hay hơi cong ở gần đầu, ở mặt dưới có 2 dải lỗ khí màu trắng Mùa ra nón tháng 3 - 5, mùa quả chín tháng 8 - 10 năm sau Đỉnh tùng tái sinh bằng hạt tốt, mọc rải rác trên các sườn và đỉnh núi đất và núi đá vôi với đội cao từ 600 - 1400 m [7]

 Phân bố: Trên thế giới Đỉnh tùng phân bố ở khu vực Nam và Đông Nam Á bao gồm: Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Bắc Myanmar, Bắc Thái Lan Tại Việt Nam loài này được ghi nhận có ở Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Cao Bằng, Hòa Bình, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng và Thanh Hóa [7]

Hình 1.1 Cây Đỉnh tùng (C mannii) Tà Nung, Lâm Đồng và mẫu tiêu bản

(nguồn Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam)

 Công dụng: Gỗ Đỉnh tùng có chất lượng cao, chịu mối mọt, được sử dụng làm đồ gỗ cao cấp, đồ mỹ nghệ và cán công cụ Vỏ cây được dùng chữa sốt tại đảo Hải Nam, Trung Quốc Nó còn được sử dụng làm cây cảnh do các cây có hình dáng

đẹp và độc đáo [7]

 Đánh giá tình trạng bảo tồn: Trong sách Đỏ Việt Nam (2007) [8], loài Đỉnh

tùng được đánh giá là sẽ nguy cấp VU A1,c,d, B1+2b,c Trong danh lục đỏ của

IUCN năm 2012, loài này được xếp VU A1d ở phạm vi toàn cầu Căn cứ vào các dẫn liệu thu thập được qua khảo sát, nghiên cứu ở các điểm còn rừng nguyên sinh ở hầu khắp nước ta trong nhiều năm qua và đối chiếu với tiêu chuẩn của các thứ hạng trong Danh lục đỏ của IUCN nhận thấy loài Đỉnh tùng đáp ứng được các tiêu chuẩn

VU A4a,c,d, B1,2a,b, C (sự suy giảm quần thể trong quá khứ, hiện tại và dự đoán

tương lai nhiều nhất > 30%, EOO < 20.000 km2, AOO < 2.000 km2,, số lượng tiểu quần thể ≤ 20); tuy nhiên số lượng cá thể trưởng thành ước tính ≤ 2.500, thuộc

khung EN chứ không phải VU) [3] [4]

1.1.1.2 Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum)

Hoàng đàn giả còn có các tên gọi khác Hồng tùng, Bạch đàn, tên khoa học là

Dacrydium elatum Wall.ex Hook (Podocarpaceae) [7] Chi Dacrydium là một chi

tương đối lớn, hiện nay chi này gồm 21 loài đã được xác định [9] Ở Việt Nam theo tác

giả Phạm Hoàng Hộ chỉ tìm thấy 1 loài là D elatum [7]

Bảng 1.2 Các loài thực vật thuộc chi Dacrydium

 Mô tả hình thái: Cây gỗ mọc đứng với thân ít cành nhánh, các cành mọc hướng lên tạo thành tán hình vòm nhỏ, chiều cao tới 30 m với đường kính ngang ngực tới 0,8 m Cây mọc trong rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp, đôi khi ở vùng đất thấp hoặc núi trung bình trên các sườn núi (nhiệt độ trung bình năm khoảng 16-22oC, lượng mưa trên 1700 mm) trên cả đất phong hóa từ granit hoặc các đá silicat khác cũng như trên các động núi đá vôi kết tinh trắng bị bào mòn mạnh Gặp chủ yếu ở độ cao 700-2000 m trên mặt biển, hoặc

có khi xuống gần mực nước biển như Kiên Giang (đảo Phú Quốc, nơi có nhiệt độ trung bình năm 26oC, lượng mưa năm trên 3000 mm) Trên thế giới, loài này chỉ hạn chế ở các vùng núi có độ cao trên 1000 m trên mặt biển Ở các vùng núi thấp và

trung bình loài này mọc cùng với Thông lá dẹt (Pinus krempfii), Thông đà lạt (Pinus dalatensis), Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius), Pơ mu (Fokienia hodginsii)

và Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus) [7]

 Phân bố: Trên thế giới loài Hoàng đàn giả được tìm thấy ở Myanmar, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia Ở Việt Nam loài này phân bố rộng khắp

từ Hà Giang, Lai Châu, Tuyên Quang, xuống dọc dải Trường Sơn, từ Bắc (Hà Tĩnh) qua Trung (từ Quảng Bình, Kon Tum đến Gia Lai) đến Nam (Đắk Lắk, Lâm Đồng, Khánh Hòa và Ninh Thuận) và kết thúc ở Nam Đông Dương (Kiên Giang) [7]

Hình 1.2 Cây Hoàng đàn giả (D elatum) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản

(Nguồn Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam)

 Công dụng: Gỗ Hoàng đàn giả chịu ngâm và được sử dụng làm thuyền và cầu, đóng đồ gỗ Nhựa dùng làm hương Loài này còn có thể là nguồn cung cấp hoạt chất làm thuốc trừ sâu Một số nơi ở Việt Nam loài này được dùng kết hợp với những cây khác để chữa kiết lị [9]

 Đánh giá tình trạng bảo tồn: Căn cứ vào các dẫn liệu thu thập được qua khảo sát, nghiên cứu ở các điểm còn rừng nguyên sinh ở hầu khắp nước ta trong nhiều năm qua và đối chiếu với tiêu chuẩn của các thứ hạng theo danh lục đỏ của

IUCN thấy loài đáp ứng được các tiêu chuẩn sẽ nguy cấp: VU A4a,c,d, B2b(ii, iii,

v), C (sự suy giảm quần thể trong quá khứ, hiện tại và dự đoán tương lai nhiều nhất <

30%, EOO < 20.000 km2, AOO < 1.000 km2,, số lượng tiểu quần thể ≤ 20, số lượng

cá thể trưởng thành ≤ 2500) [3] [4]

1.1.1.3 Kim giao núi đất (Nageia wallichiana)

Kim giao núi đất hay Thông mụ có tên khoa học là Nageia wallichiana (Presl)

O Ktze (Podocarpaceae), các tên đồng nghĩa khác là Podocarpus wallichianus (Presl), Decussocarpus wallichianus (Presl) de Laubenf [7]

Chi Kim giao (Nageia) là một chi nhỏ gồm 5 loài là N nagi, N wallichiana,

N fomosensis, N motleyi và N fleuryi [10] Ở Việt Nam theo tác giả Phạm Hoàng

Hộ chi này có 2 loài là N nagi và N wallichiana [7]

 Mô tả hình thái: Cây gỗ mọc đứng, đơn tính khác gốc với tán hình nón, đạt chiều cao tới 30 m với đường kính ngang ngực tới 1 m Vỏ màu nâu thẫm hay nâu xám, nhẹ, nhẵn, bóc tách thành các mảnh lớn không đều Lá mọc đối hay gần đối nhau, chéo chữ thập, màu xanh đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn, dài tới 16 cm và rộng 5 cm ở cây trưởng thành, hình bầu dục hay hình trứng (dài tới 23 cm và rộng 7

cm ở cây non) với đỉnh nhọn, các dải lỗ khí ở cả hai mặt Nón phân tính khác gốc Cấu trúc mang hạt đơn độc ở nách lá, cuống dài tới 1,7 cm, đế phình ra dưới hạt, màu đen khi chín, phần quanh hạt màu đỏ hồng Nón đực ở nách lá, cụm 3 - 5, dài tới 5 mm Hạt hình cầu, đường kính 1,5 - 1,8 cm, có một mỏ nhỏ ở gần đầu Cây gặp trong rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗ giao và cây lá rộng nhiệt đới gió mùa núi thấp và núi trung bình (nhiệt độ trung bình năm 14-230C, lượng mưa trên 1700 mm) trên đất phong hóa từ granit hoặc các loại đá silicat khác ở

độ cao 500-2100 m trên mặt biển Đôi khi gặp ở mức mặt nước biển Mọc cùng với

Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus), Đỉnh tùng (C mannii), Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius), Thông đỏ nam (Taxus wallichiana) (phía Nam Việt Nam)

Thỉnh thoảng có tái sinh tự nhiên, cây con hiếm (mặc dù gặp tương đối ít ở khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống) [7][10]

 Phân bố: Trên thế giới loài này được bắt gặp ở Brunei, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Myanmar, Malaysia, Indonesia, Philippine, và Papua New Guinea Trong nước ở Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Quảng Ninh, Phú Thọ, Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên–Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Phước và Kiên Giang [7][10]

Hình 1.3 Cây Kim giao núi đất (N wallichiana) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản

(nguồn Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam)

 Công dụng: Gỗ Kim giao núi đất có giá trị cao, dùng làm nhạc cụ, đũa, đồ

mỹ nghệ và các công cụ gia đình Lá có thể dùng trong phương pháp chữa bệnh truyền thống chữa ho và cây đẹp trồng làm cảnh [7][10]

 Đánh giá tình trạng bảo tồn: Độ suy giảm quần thể Kim giao núi đất ở Việt Nam trong quá khứ, hiện tại và tương lai ước tính không vượt quá 30% nên không thể

xếp vào mức bị đe dọa theo tiêu chuẩn A (độ suy giảm quần thể) trong danh lục IUCN

Phân tích gần 50 số hiệu tiêu bản N wallichiana được thu ở 36 điểm khác nhau trên 22

tỉnh trải dài từ Bắc vào Nam thì dễ dàng tính được phạm vi phân bố địa lý (EOO >20.000

Km2) Mặc dù quần thể Kim giao núi đất này có nơi cư trú đạt tiêu chuẩn B2 = AOO <

2000 Km2 và đang bị suy giảm, nhưng do các tiểu quần thể này không bị chia cắt mạnh, xuất hiện ở trên 12 điểm và không có sự dao động quá mạnh về khu phân bố, nơi cư trú, tiểu quần thể và số lượng cá thể trưởng thành nên quần thể Kim giao núi đất này được

xếp ở thứ hạng sắp bị đe dọa (NT) [3] [4], thứ hạng gần đạt được là sẽ nguy cấp: VU

Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia, chỉ có các loài thuộc chi Cephalotaxus đã được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học, trong khi chi Dacrydium mới chỉ có

các phân tích sơ bộ về thành phần hóa học tinh dầu của lá bằng phương pháp sắc ký khí (GC/MS) Số lượng các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi

còn rất hạn chế Đặc biệt chi Nageia cho đến nay chưa có nghiên cứu cả trong và

ngoài nước về thành phần hóa học của tất cả các loài

Thành phần hóa học của các loài trong chi Cephlotaxus đã được quan tâm nghiên cứu sớm, từ những năm 60 của thế kỉ 20 gồm các loài như C harringtonia, C fortunei, C hainanensis, C wilsoniana, C sinensis, C oliveri [11] Trong đó loài Đỉnh tùng (C mannii) cũng đã được nghiên cứu song chưa nhiều Các kết quả nghiên cứu cho thấy lớp chất chính trong các loài thuộc chi Cephalotaxus là các alkaloid

Đến nay có hơn 100 hợp chất alkaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc Ngoài

ra còn có các lớp chất khác như: flavonoid, diterpenoid, ligan, tropone… song không nhiều [11]

Các alkaloid được tìm thấy trong trong chi Cephalotaxus chủ yếu là các hợp

chất có cấu trúc khung carbon kiểu Cephalotaxine, ngoài ra một số ít hợp chất alkaloid có cấu trúc kiểu Drupacine và Homoerythrina [15-18]

Bảng 1.3 Các kiểu khung carbon của các hợp chất alkaloid được phân lập từ chi Cephalotaxus

Khung carbon Cấu trúc cơ bản

Cephalotaxine

Drupacine

Homoerythrina

Cephalotaxine (1) là thành phần hóa học chính của loài C harringtonia var

drupacea và C fortune, đã được Paulder và cộng sự công bố vào năm 1963 [12]

Cấu trúc của 1 sau đó được xác định bởi Powell có bộ khung cơ sở là tetracyclic

alkaloid gồm 1 đơn vị azaspiro [4.4] nonane và một hệ vòng benzazepine [13] Đến nay đã có rất nhiều các hợp chất alkaloid có cấu trúc khung carbon cephalotaxine được phân lập, xác định cấu trúc hóa học và thử hoạt tính sinh học Có thể phân chia các hợp chất này thành 2 nhóm chính một là các hợp chất không có mạch nhánh tại C-3, hai là các hợp chất ester của cephalotaxine tại C-3 đó là các alkaloid harringtonia

Các hợp chất Cephalotaxine không có mạch nhánh tại C-3 đại diện là các

chất từ (1-18, hình 1.4) Cấu trúc trúc phân tử của chúng khác nhau bởi các nhóm

thế tại vị trí C2, C3, C11 thường là các nhóm thế hydroxy (-OH), methoxy (-OCH3), hoặc các hợp chất cephalotaxine N-oxide Năm 2016 khi nghiên cứu khả năng trừ

sâu của thực vật loài C sinensis, một loại cây dược liệu quan trọng ở Trung Quốc

nhằm phát hiện ra thuốc trừ sâu mới, các nhà nghiên cứu đã cô lập được 5 hợp chất

alkaloid đó là cephalotaxine (1); 11-hydroxycephalotaxine (2); hydroxycephalotaxine (3); isocephalotaxine (4) và cephalancetin (5) [14] Ba alkaloid mới là cephalezomin G (8), H (9), J (7) và demethylcephalotaxinone (6), đã

4-được phân lập từ lá của loài C harringtonia var nana [15] Các hợp chất

epicephalotaxine (10), demethylcephalotaxine (11) và cephalotaxinone (12) được

phân lập từ loài C fotunei [16] Năm 2016 trong một báo cáo các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã phân lập được từ cành và lá của 2 loài C lanceolata và C fortune

var alpine các hợp chất cephalotine C (16), isocephalotaxinone (14) và

demethylcephalotaxine (15) [11] Các hợp chất cephalotaxine N- oxide (16-18) đã

được Jossang và cộng sự xác định năm 2003 từ hạt của loài C fortune là cephalotaxine-α-N-oxide (16), Cephalotaxine-β-N-oxide (17), 11-β-

hydroxycephalotaxine- β-N-oxide (18) [17] Năm 2013 trong một báo cáo về thành

phần hóa học của loài C lanceolata các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã cô lập và

xác định cấu trúc của 13 alkaloid trong đó có hợp chất mới là cephalancetines A

(19) và 2 hợp chất đã biết thuộc loại không có mạch nhánh tại C-3 là cephalotaxineamide (20), 4-hydroxycephalotaxine (21), 2 hợp chất dimer không đối xứng thuộc loại này là cephalancetine D (22) và cephalancetine C (23) [18]

O O

21

O O

N

HO

O O

N HO

H O

O O

(24-51, hình 1.5) Năm 1996 trong một công bố kết quả nghiên cứu về thành phần

hóa học của loài C harringtonia var drupecea các nhà khoa học Nhật Bản đã phân

lập được 8 alkaloid trong đó có 4 hợp chất là harringtonine (24), isoharringtonine (25), deoxyharringtonine (26), homoharringtonine (30) tại vị trí C-4’ nhóm

carboxylic đã bị ester hóa và bốn hợp chất có chứa nhóm carboxylic (COOH) dạng

tự do tại vị trí C-4’ là 5’-des-O-methylharringtonine (27),

3’S-hiđroxy-methylharringtonine (28), methylisoharringtonine (29), methylhomoharringtonine (31) [19] Kobayashi và cộng sự (2000 và 2002) đã phân

5’-des-O-lập từ lá của loài C harringtonia var nana 6 hợp chất mới là cephalezomine C, D,

E, F (32-35) [20] và cephalezomine K, L (36a/b) [15], cấu trúc của chúng được xác

định bằng phương pháp đo phổ Trong một nghiên cứu khác từ lá và thân loài C

drupacea đã phân lập được các hợp chất: nordeoxyharringtonine (37),

homodeoxyharringtonine (38) và bishomodeoxyharringtonine (39) là các chất có

mạch nhánh khác nhau về chiều dài và mức độ oxi [21] Trong hai năm 1996 và

1997 các nhà nghiên cứu Nhật bản đã phân lập và xác định cấu trúc của các hợp

chất là ester cephalotaxine từ loài C harringtonia var drupacea gồm:

neoharringtonine (40), homoneoharringtonine (41), 3’S-hyđroxyneo harringtonine (42) [22] và 11α-hydroxyhomodeoxyharringtonine (43), 11-β-

hydroxyhomodeoxyharringtonine (44), và 11β-hydroxy-deoxyharringtonine (45)

[23] Các hợp chất dimer alkaloid cũng được cô lập đặc biệt là các hợp chất

heterodimer có tên là bis-cephalezomine A–E (46-51) được cô lập từ C

harringtonia var nana [24]

Hình 1.5 Các hợp chất harringtonine phân lập từ chi Cephalotaxus

43 n=2, α-OH

44 n=2, β-OH

45 n=1, β-OH

Các hợp chất alkaloid drupacine cũng có cấu trúc khung carbon của cephalotaxine thêm một cầu nối oxi giữa C-11 với C-2 hoặc C-3 đại diện cho các hợp

chất này là các alkaloid (52-58, hình 1.6) Các hợp chất drupacine không có mạch nhánh (52- 55) gồm drupacine (52) được phân lập từ loài C.sinensis [14] và C harringtonia var nana [20]; 2 hợp chất là cephalotine A (53), cephalotine B (54) được

phân lập từ các loài C lanceolata và C fortune var alpina [11] ; cephalancetine B

(55) phân lập từ loài C. lanceolata [18] Các hợp chất ester có mạch nhánh tại C-3 lần

lượt là drupangtonine và cephalezomines A, B (56-58) phân lập từ C drupacea [23]

và C harringtonia var nana [20] Các hợp chất này chiếm một lượng nhỏ trong các hợp chất alkaloid được phân lập từ các loài thuộc chi Cephalotaxus

Hình 1.6 Các hợp chất alkaloid khung Drupacine phân lập từ chi Cephalotaxus

Các hợp chất Homoerythrina alkaloid lần đầu tiên được báo cáo từ chi

Cephalotaxus vào năm 1972 bởi Powell [12] Tuy nhiên kể từ đó đến nay số lượng

các hợp chất này tăng lên không nhiều Chúng chiếm thành phần nhỏ trong các dịch

chiết của các loài thuộc chi Cephalotaxus Về cấu trúc cơ bản các hợp chất này gồm

một hệ thống 4 vòng ngưng tụ 6/7/5/6 trong đó vòng 5 cạnh chứa dị tố nitơ Đại

diện các hợp chất này bao gồm các chất (59-77)

53 α-OH

54 β-OH

Hình 1.7 Cấu trúc các hợp chất homoerythrina alkaloid

Bảng 1.4 Các alkaloid khung homoerythrine phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus

R3=R4= OCH3 C fortune var

Ngoài các alkaloid, thành phần hóa học của chi Cephalotaxus còn có các lớp

chất khác như flavonoid, diterpenoid, tropone…

Đặc biệt là các hợp chất flavonoid thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đa dạng

Mười ba flavonoid (78-90) được phân lập từ lá và cành loài C lanceolata, trong đó

có hai hợp chất mới là 6-C-methyl-7,4’,4”’-tri-O-methylamentoflavone (78) và apigenin-6-C-methyl-7-O-β-D-glucopyranoside (79) và 12 hợp chất đã biết là

C koreana trong đó có 1 flavone glycoside mới là hợp chất 86 và 4 hợp chất đã biết

là quercetin 3,7-di-O-glucoside (91), quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside (92) , quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (93), và quercetin 3-O-(6”-O-acetyl)-β-D-

glucoside (94) [30] Từ dịch chiết ethanol của loài C wilsoniana đã phân lập được

các hợp chất flavone bị methyl hóa tại một số vị trí khác nhau đó là

taiwanhomoflavone-B (95), 7,4’,7”-tri-O-methylamentoflavone (96), và O-β-D-glucoside (97), cấu trúc của chúng được xác định bằng phương pháp phổ [31]

apigenin-7-Sáu hợp chất biflavone khung amentoflavone được cô lập từ dịch chiết EtOAc của

loài C koreana Nakai gồm bilobetine (98), ginkgetine (83),

4’,7”-di-O-methylamentoflavone (99), 7-O-methyl-isoginkgetine (100), sciadopitysine (101), và

OH

O

O

OH OH OH

OH

O

87

O OH

O

O OH

OH OH HO

H

Abietane là một diterpenoid thơm được tìm thấy trong một số loài thuộc chi

Cephalotaxus Năm 2003, Politi và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất abietane

diterpenoid (103-108) từ hạt của loài C harringtonia trong đó có 2 hợp chất mới là

8β-hydroxy-9(11),13-abietadien-12-one (105) và 5,6-didehydroferruginol (108), bốn hợp chất đã biết được xác định là ferruginol (103), sugiol (104), montbretol

(106), và abieta-8,11,13-trien-7β-ol (107) [33] Năm 2011 từ lá và thân của loài C

fortune, Zhang và cộng sự đã tách được một hợp chất mới là

20(105)-abeo-4,5-seco-5(10),6,8,11,13-abietapentaene-3-one (109) và 6 hợp chất abietane diterpenoid đã biết gồm: 12-hydroxyabieta-6,8,11,13-tetraen-3-on (110), hinokiol (111), abietatrien-3β-ol (112), 11,12-dihydroxy-8,11,13-abietatrien-3,7-dione (113), 11-hydroxy-12-

methoxyabieta-8,11,13-trien-3,7-dione (114) và 3β, 8,11,13-trien-7-one (115) [34]

11-dihydroxy-12-methoxyabieta-Các hợp chất tropone thuộc nhóm chất norditerpene (C19), đại diện cho một lớp

chất nhỏ thuộc chi Cephalotaxus Cấu trúc đã được xác định gồm một bộ khung

tropone chức năng oxi hóa như một lacton và một vòng tetrahydrofuran hoặc ancol

Năm 1978, Buta báo cáo đã cô lập được một terpenoid mới từ hạt loài C haringtonine

có tên harringtonolide (116) [35] Vài năm sau trong một báo cáo cấu trúc của hợp chất tropon mới là hainanolidol (117) cũng đã được xác định [36] Trong cấu trúc của hợp chất 10-Hydroxyhainanolidol (118) có thêm một nhóm hydroxyl (-OH) trên C-10 so

với hợp chất (117) đã được mô tả bởi Yoon từ loài C koreana [37]

Hình 1.9 Các hợp chất diterpenoid và norditerpen phân lập từ một số loài thuộc chi

Cephalotaxus

Loài nghiên cứu: Năm 1979 từ dịch chiết chloroform của thân và rễ

Richard G Powell và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất là cephalomannine (119) , baccatine III (120) và taxol (121) [38] Đồng thời với việc xác định cấu trúc các

chất này cũng được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào Kết quả cho thấy hợp

chất cephalomannine (119) khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu

mô KB [38] Tuy nhiên đến nay ở Việt Nam loài này chưa được nghiên cứu về

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Vì vậy việc nghiên cứu loài Đỉnh tùng (C

mannii) nói chung là rất cần thiết với triển vọng tìm được các hợp chất có cấu trúc

mới và hoạt tính sinh học cao góp phần nâng cao giá trị của loài cây này ở Tây Nguyên, Việt Nam

Hình 1.10 Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ loài C mannii

Chi Dacrydium là một chi tương đối lớn gồm 21 loài, thành phần hóa học

của một số loài trong chi này chủ yếu được xác định bằng phương pháp GC/MS tinh dầu của lá cho thấy sự xuất hiện của lớp chất sesquiterpen, diterpenoid Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi

Dacrydium còn hạn chế Do đó cần sự quan tâm của các nhà nghiên cứu đối với

thành phần hóa học của các loài trong chi này

Trong một nghiên cứu nhằm tìm ra các tiền chất để thiết kế thuốc chống virút gây bệnh sốt xuất huyết (DV-NS5 RdRp) có nguồn gốc từ thiên nhiên, các nhà nghiên cứu đã

xác định được 9 hợp chất trong dịch chiết lá của loài D balansae bao gồm 4 hợp chất

biflavonoid đó là amentoflavone (122), podocarpusflavone A (123), isoginkgetine (124), hinokiflavone (125); 3 hợp chất sterol là 6-hydroxystigmast-4-en-3-one (126), 3-

hydroxystigmast-5-en-7-one (127), β-sitosterol (128) và 2 dẫn xuất của stilbene là 3,5,4′-trimethoxystilbene (129) và cis-3,5,4′-trimethoxystilbene (130) [39]

trans-Năm 1994, các nhà khoa học ở trường Đại học Otago, New Zealand đã công

bố phân lập từ lá của loài D.cupressium được một hợp chất sesquiterpene hiếm gặp

9-epi-β-caryophyllene (131) Cấu trúc của hợp chất đã được xác định bằng kĩ thuật

phổ 2D NMR [40]

H H

O

H H

HO H

Hình 1.11 Các hợp chất từ một số loài thuộc chi Dacrydium

Loài nghiên cứu: Năm 1996 tác giả Trần Thu Hương đã phân tích tinh dầu

từ lá loài Hoàng đàn giả (D elatum) vùng Hữu Lũng, Lạng Sơn bằng phương pháp

GC/MS, kết quả cho thấy sự xuất hiện của các lớp chất sesquiterpen ở loài này [41] Khi nghiên cứu thành phần hóa học của các bộ phận thân và cành từ loài Hoàng đàn

giả (D elatum) ở Tây nguyên chúng tôi hi vọng sẽ tìm được các hợp chất có cấu

trúc lí thú và hoạt tính sinh học cao

Chi Nageia là một chi nhỏ chỉ gồm 5 loài [10] Cho đến nay trên thế giới và ở

Việt nam chưa có báo cáo nào về nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi này

Loài nghiên cứu: Loài Kim giao núi đất (N wallichiana) đến nay vẫn chưa

được nghiên cứu ở Việt nam và thế giới Việc nghiên cứu về thành phần hóa học

của loài này sẽ giúp các nhà nghiên cứu có dữ liệu ban đầu về chi Nageia

1.1.2.2 Hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học nổi bật của các hợp chất trong thành phần chi Cephalotaxus

là hoạt tính gây độc tế bào Năm 1970, 1972 trong báo cáo của R.G.Powell và cộng

sự các hợp chất ester của cephalotaxine như là harringtonine (24), homoharringtonine (29), isoharringtonine (30) [42] và deoxyharringtonine (26) [43] thể hiện hoạt tính ức

chế tế bào bạch cầu P388 ở chuột Từ đó đến nay đã có nhiều công trình công bố về hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất trên có thể kể đến như: Hợp chất

isoharringtonine (30) phân lập từ loài C harringtonia có nguồn gốc ở các tỉnh phía

nam của Trung Quốc đã được quan tâm nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào Năm

2008 bằng phương pháp thử nghiệm trên in vitro các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã

kết luận hợp chất 30 thể hiện khả năng ức chế phosphatidylinositol 3-kinase / Akt-1

một chất cần thiết cho sự sống và phát triển của tế bào u tủy ở người [44] Trong một

nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng hợp chất homoharringtonine (29) có hiệu quả trong

điều trị bệnh bạch cầu tủy xương cấp tính (AML), bệnh bạch cầu tủy bào mãn tính (CML) và hội chứng rối loạn nhịp myeline (MDS) Cơ chế tác động chính của hợp

chất 29 là ức chế tổng hợp protein theo liều và thời gian bằng cách tác động lên

ribosome của tế bào ung thư Nó ngăn chặn sự tiến triển của tế bào từ pha G1 vào

pha S và từ pha G2 vào pha M [45] Hai hợp chất 24 và 30 là hai alkaloid được

phân lập từ vỏ cây thường xanh C hainanensis Li vào những năm 70, sau đó hai

hợp chất này đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu bởi hoạt tính sinh học cao của chúng Năm 1994 các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu về khả năng ức chế hoạt động của tế bào ung thư bạch cầu ở người (HL-60) Các thí nghiệm chứng minh rằng tại nồng độ 2.10-7 mol.L-1 đối với chất 24 và

10-7mol.L-1 đối với chất 30 có thể gây chết tế bào HL-60 khi các tế bào được tiếp

xúc với 2 chất trong 4 giờ [46] Mười ba hợp chất alkaloid cephalotaxus được phân

lập từ lá và cành của loài C lanceolata, một loài cây thuộc tỉnh Vân Nam, Trung

Quốc Tất cả các hợp chất được thử hoạt tính gây độc tế bào đối với 4 dòng tế bào

ung thư là ung thư phổi A549 và SK-BR-3, ung thư biểu mô ruột HCT116, và ung

thư gan Hep G2, trong đó 2 hợp chất harringtonine (24), homoharringtonine (29)

thể hiện các hoạt tính đáng chú ý đối với cả 3 dòng tế bào là A549, HCT116 và Hep G2 với giá trị IC50 lần lượt là 0,15±0,07; 0,054±0,016; 0,38±0,09 μg / mL đối với

chất 24 và 0,085±0,018; 0,001±0.002; 0,087±0,024 μg / mL đối với chất 29 Đặc biệt đối với tế bào HCT116 hợp chất 29 thể hiện hoạt chất kháng tế bào ung thư

mạnh hơn 85 lần so với chất đối chứng doxorubicin (DOX) 0,085±0,008[18]

Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của 16 hợp chất alkaloid được

phân lập từ lá của loài C harringtonia var nana đối với 2 dòng tế bào bạch cầu (L1210) ở chuột và tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) ở người (Bảng 1.5) So

sánh kết quả thử hoạt tính với cấu trúc hóa học của các chất cho kết luận: các hợp

chất alkaloid có cấu trúc kèm theo chuỗi bên gồm (57, 58, 32, 33, 34, 35, 24, 38, 26,

30) cho hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn các chất không có chuỗi bên trong phân

tử (52, 15, 1, 2, 59, 60) [20]

Bảng 1.5 Bảng giá trị IC50 thử hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào L1210 và

KB của các alkaloid phân lập từ lá của loài C harringtonia var nana [15] [20]

Bằng phương pháp thử nghiệm trên in vitro: các alkaloid cephaltaxine 43, 44,

45 thể hiện khả năng chống lại tế bào bạch cầu ở chuột P388 với giá trị IC50 lần lượt

là 0,38; 0,33; 0,17 µg / mL [23] Các hợp chất dimer alkaloid (46-51) thể hiện hoạt

tính yếu chống lại dòng tế bào bạch cầu ở chuột L1210 với giá trị IC50 1,9-3,7 µg /

mL [24] Trong một nghiên cứu khác về hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập

từ dịch chiết chloroform lá và gỗ của loài C wilsoniana bằng phương pháp MTT, kết

quả cho thấy hợp chất C-3-epi-wilsonione (69) có hoạt tính trung bình đối với 3 dòng

tế bào thư nghiệm là tế bào ung thư gan ở người Hep G2 và Hep 3B, ung thư vú MCF-7 và ung thư tuyến giáp ở nam giới HT-29 với giá trị IC50 lần lượt là 52,0; 42,0; 52,0 và 24,4 µg / mL [26] Năm 1979 trong một nghiên cứu nhằm tìm ra chất chống ung thư có nguồn gốc thiên nhiên các nhà khoa học đã cô lập được alkaloid

mới là cephalomannine (119), chất này thể hiện hoạt tính chống tế bào ung thư biểu

mô miệng ở người KB với giá trị LD50 = 3,8.10-3,8 μg / mL và khả năng ức chế tế bào bạch cầu PS ở chuột [38] Năm 2003 Jossang và cộng sự đã cô lập được các hợp chất

cephalotaxine N-oxit (16-18), các chất này thể hiện hoạt tính yếu chống lại tế bào ung

thư biểu mô ở người với giá trị IC50 lần lượt là 30; 14; 31µg / mL [17] Trong một

nghiên cứu khác các hợp chất 26, 37, 38, 39 thể hiện hoạt tính mạnh trong ức chế sự

phát triển của tế bào ung thư bạch cầu ở chuột P-388 với giá trị IC50 lần lượt là 0,0075; 0,027; 0,056 và 0,024μg / mL [23]

Bên cạnh các alkaloid thì hoạt tính sinh học của các hợp chất khác như flavone,

diterpenoid…của chi Cephalotaxus cũng được nghiên cứu Năm 2000 từ dịch chiết

ethanol loài C wilsoniana đã cô lập được hợp chất Taiwanhomoflavone-A (82), chất

này thể hiện hoạt tính chống tế bào ung thư biểu mô vòm họng, tế bào ung thư ruột kết COLO-205, tế bào ung thư gan Hepa-3B và tế bào ung thư cổ tử cung Hela với giá trị

ED50 lần lượt là 3,4; 1,0; 2,0; 2,5 µg / mL [32] Taiwanhomoflavone-B (95) cũng được

cô lập từ loài trên có hoạt tính chống tế bào ung thư biểu mô ở miệng KB và tế bào ung thư gan Hep 3B với giá trị ED50 lần lượt là 3,8; 3,5 µg / mL [47]

Harringtonolide (116) thể hiện hoạt tính sinh học đa dạng cả tính chất chống

ung thư và hoạt động kháng vi-rút, hoạt động ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô phổi: Lewis, Walker, Sarcoma-180, L-1210, L-615, ức chế tế bào bạch cầu ở

chuột P-388 [48] Nghiên cứu in vitro cho thấy 116 có thể kháng lại loại cúm A, viêm

não Nhật Bản B và virut vaccinia [49]

1.2 Ứng dụng kĩ thuật phân tích ISSR và SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật

Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở sinh vật nằm ở thứ tự nucleotide trên các phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng Việc phân tích đa đạng di truyền của

vi sinh vật nói chung và thực vật nói riêng bằng các kĩ thuật sinh học phân tử có ý nghĩa thiết thực cho việc bảo vệ nguồn gen và chọn giống Bảo tồn nguồn gen trong thực vật là bảo tồn các đa dạng di truyền cần thiết cho các loài phục vụ cho công tác cải tạo giống

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, nhiều loại chỉ thị phân tử đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền làm cơ sở cho nghiên cứu bảo tồn và tái tạo nguồn gen ở đối tượng sinh vật nói chung và ở các loài cây lá kim nói riêng Trong các loại chỉ thị thì chỉ thị ISSR (Inter Sequence Simple Repeat) và SSR (Sequence Simple Repeat) đang được ứng dụng rộng rãi và

có hiệu quả trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở cả mức độ quần thể và loài

1.2.1 Kỹ thuật ISSR ( Inter Simple Sequence Repeat )

Kỹ thuật do Zietkiewicz và cộng sự phát hiện năm 1994 [50] Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân thật tồn tại một loại các trình tự nucleotide lặp lại, chúng thường đặc trưng cho loài Trình tự này gồm từ 2 đến 5 nucleotide lặp lại nhiều lần, ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n và nằm rải rác trong hệ genome của thực vật bậc cao Kỹ thuật ISSR thường tạo ra một dấu vân tay di truyền tương tự kỹ thuật AFLP-PCR, nhưng lại chỉ sử dụng các mồi đơn (có độ dài từ 19 nucleotide đến 25 nucleotide) Khoảng cách giữa các trình tự lặp khác nhau làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau

và đặc trưng cho mỗi cá thể Vì thế, các mồi ISSR có một tiềm năng lớn để xác định mối quan hệ loài và mức độ đa dạng đi truyền nguồn gen [51]

1.2.2 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat)

Kỹ thuật SSR hay microsaterlite (vi vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản trên gen của sinh vật, đây là những trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp bazơ, ví dụ (AT)n; (AG)n; (AGTC)n) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ

2 đến 40 đơn vị Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và thực vật, mật độ các trình tự dao động rất lớn, phân bố trong hệ gen và có tính đặc trưng cho từng loài [52] Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA ở hai đầu của các đoạn lặp lại và thiết kế mồi Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR Vì vậy SSR là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen

cũng như lập bản đồ hệ gen ở sinh vật

Mồi

Phân tử

nhiều đối tượng khác nhau Tuy nhiên các nghiên cứu trên một số loài thuộc 3 chi

Cephalotaxus, Dacrydium, Neagia còn rất ít, mới chỉ tập trung ở một số quốc gia

như Trung Quốc, Hàn Quốc và trên đối tượng chủ yếu là các loài trong chi

Cephalotaxus Chẳng hạn, năm 2008 Yingang và cộng sự đã đánh giá tính đa dạng nguồn gen di truyền của loài C fortune ở Trung Quốc bằng chỉ thị ISSR Kết quả cho thấy quần thể C fortune nghiên cứu có tính đa dạng di truyền cao, tổng mức độ

thay đổi phân tử giữa các quần thể là 25,9% và giữa các cá thể trong quần thể là 74,1% Thông qua kết quả nghiên cứu nhóm tác giả cũng chỉ ra chính các yếu tố như kích thước và sự phân mảnh quần thể, quá trình di nhập gen bị hạn chế đã dẫn đến sự khác biệt di truyền đáng kể giữa các quần thể (25,9%) [54]

Pan và cộng sự (2011) đã phát triển được 13 chỉ thị SSR đặc hiệu cho loài C oliveri ở Trung Quốc Trên cơ sở đó nhóm tác giả đã nghiên cứu sâu hơn về hệ

thống giao phối, di truyền quần thể và các ảnh hưởng di truyền của sự phân mảnh môi trường sống của loài Các kết quả thu được rất hữu ích cho các nhà nghiên cứu trong hoạch định chiến lược bảo tồn hiệu quả cho loài nguy cấp này Các chỉ thị

SSR đã được thiết kế cho loài C oliveri cũng được ứng dụng trong đánh giá đa dạng di truyền quần thể loài C fortunei và nhiều loài khác trong chi Cephalotaxus

cũng đã chỉ ra tính hiệu quả của các chỉ thị [55] Tương tự, năm 2012 nhóm tác giả Miao và cộng sự cũng đã phát triển thêm được 15 chỉ thị SSR đa hình đặc hiệu cho

loài C oliveri Các chỉ thị SSR này cũng có thể ứng dụng trong đánh giá đa dạng di truyền quần thể các loài khác trong chi Cephalotaxus [56]

Năm 2016 Wang và cộng sự đã ứng dụng chỉ thị ISSR để đánh giá mức độ

biến đổi di truyền của 22 quần thể C oliveri, có nguy cơ tuyệt chủng ở Trung Quốc

C oliveri là loài có môi trường sống bị ảnh hưởng sâu sắc bởi các yếu tố khí hậu như nhiệt độ và lượng mưa Kết quả đã xác định được 14 locus trong 22 quần thể C oliveri, trong đó có 5 locus có liên quan đến yếu tố nhiệt độ và lượng mưa Bằng

cách tìm ra những locus thích ứng với môi trường, các tác giả đã xác định được mối liên hệ giữa biến đổi khí hậu với các locus thích nghi Kết quả nghiên cứu cũng phần nào giúp chúng ta hiểu được sự ứng phó của loài là kim với biến đổi khí hậu

từ đó có những chiến lược cụ thể để quản lý và bảo tồn loài [57]

Đối với chi Dacrydium, các nghiên cứu chủ yếu trên loài D pectinatum năm

2010, Su và cộng sự đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh giá mức đa dạng di truyền của

17 quần thể D pectinatum trên đảo Hải Nam, Trung Quốc Kết quả nghiên cứu cho

thấy mức độ thay đổi phân tử tương đối cao bêntrong quần thể và thấp giữa các quần thể Các đặc điểm sinh thái và lịch sử môi trường sống đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc di truyền và sự khác biệt di truyền giữa các quần thể Các kết quả của nhóm nghiên cứu đã góp phần cải thiện công tác quản lý để phục

hồi loài D Pectinatum [58]

Hay như nhóm tác giả Huang và cộng sự (2014) đã phát triển được 15 chỉ thị

SSR cho loài D pectinatum, là loài duy nhất trong chi Dacrydium ở Trung Quốc,

trong đó có 12 chỉ thị chỉ ra tính đa hình Thông qua các kết quả phân tích các tác giả cũng đã tìm thấy sự mất cân bằng liên kết và mức sai lệch đáng kể so với cân bằng

Hardy-Weinberg trong quần thể D pectinatum Các kết quả thu được giúp chúng ta

hiểu biết toàn diện về các yếu tố thúc đẩy quá trình tiến hoá của quần thể và sự thích ứng của loài tại địa phương, điều này cũng góp phần quản lý và bảo tồn loài một cách hiệu quả [59]

Tuy nhiên đối với các loài thuộc chi Nageia, trên thế giới và Việt Nam hầu

như chưa có một nghiên cứu phân tử nào để đánh giá mức đa dạng nguồn gen di truyền của các loài trong chi

Quá trình tổng quan tài liệu chúng tôi nhận thấy các loài cây lá kim có vai trò quan trọng trong đời sống và nghiên cứu Các lớp chất có hoạt tính sinh học cao

được tìm thấy trong các loài thuộc chi Cephalotaxus như alkaloid, flavonoid,

diterpenoid…trong khi ở Việt Nam thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của

loài Đỉnh tùng (C mannii) chưa được nghiên cứu Loài Kim giao núi đất (N wallichiana) chưa được nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam Hoàng đàn giả (D elatum) mới chỉ nghiên cứu thành phần hóa học qua phân tích GS / MS tinh dầu của

lá Mặt khác những nghiên cứu về đa dạng nguồn gen di truyền có vai trò rất quan trọng trong công tác bảo tồn đối với các loài cây lá kim đang bị đe dọa tuyệt chủng

Vì vậy, nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim là Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất ở Tây