Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)

Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (Luận văn thạc sĩ)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-

VŨ KỲ LIÊN

XÁC ĐỊNH GENOTYPE HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS)

Ở MỘT SỐ PHỤ NỮ TỚI KHÁM TẠI KHOA SẢN CỦA

BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA THÁI

NGUYÊNNHIỄM VIRUS BẰNG KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ

REVERSE DOT BLOT

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH Ệ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

DANH MỤC BẢNG vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 HPV – Human Papilloma Virus 3

1.1.1 Đặc điểm HPV 3

1.1.2 Bộ gen HPV 4

1.1.3 Phân type HPV 9

1.1.4 Chu kỳ sống 10

1.2 Ung thư cổ tử cung do HPV ở người 13

1.2.1 Các bệnh do HPV 13

1.2.2 Ung thư cổ tử cung 14

1.2.3 Dịch tễ học HPV 18

1.3 Các phương pháp phát hiện HPV 20

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 24

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm 26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol - chloroform 26

2.3.3 Phương pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA 27

2.3.4 Phương pháp lai Reverse Dot Blot (RDB) 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số và phát hiện HPV-DNA 31

3.2 Kết quả xác định type (genotype) virus HPV 34

3.2.1 Kiểu type HPV được phát hiện 36

3.2.2 Sự phân bố của các types HPV được phát hiện 37

3.2.3 Sự đồng nhiễm các type HPV 38

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 41

KẾT LUẬN 41

KHUYẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

1 ASCUS Atypical Squamous cell of

Intraepithelial Lesion

Tổn thương biểu mô lát

mức thấp

12 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

14 SIL Squamuos Intraepithelial

Lesion

Tổn thương biểu mô vảy

15 URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa thượng

nguồn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sự hình thành capsid của genome HPV 3

Hình 1.2 Hình dạng HPV 4

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gene HPV 5

Hình 1.4 Bộ gene HPV dạng mạch thẳng 6

Hình 1.5 Cấu tạo hạt giả virus 6

Hình 1.6 Hình ảnh HPV gây mụn cóc trên da và sùi mào gà miệng 14

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt cơ chế gây ung thư của HPV 15

Hình 1.8 Hình ảnh ung thư cổ tử cung 17

Hình 1.9 Hình ảnh tế bào biểu mô cổ tử cung bình thường (trái) và tế bào ung thư cổ tử cung (phải) 18

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV trên mẫu bệnh phẩm 26

Hình 3.1 Kết quả phát hiện HPV (HPV-DNA dương tính) 32

bằng kỹ thuật Realtime-PCR 32

Hình 3.2 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dương 32

Hình 3.3 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE 33

của chứng âm 33

Hình 3.4 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE 33

của mẫu xét nghiệm 33

Hình 3.5 Sơ đồ vị trí gắn các mẫu dò probes đặc hiệu cho 24 types HPV trên màng lai 36

Hình 3.6 Biểu đồ phân bố các types HPV 37

Hình 3.7 Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV 39

Hình 3.8 Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ thấp (type 6, 11 và 81) 40

Hình 3.9 Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ cao (type 16 và 18) 40

Hình 3.10 Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ thấp-thấp 40

Hình 3.11 Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ cao-thấp 40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng 2.2 Các thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 25

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm các type HPV 37

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm các types HPV 38

Bảng 3.3 Tỷ lệ đồng nhiễm các types HPV 38

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hiện nay ung thư cổ tử cung là loại ung thư xếp thứ hai trong các bệnh ung thư phổ biến của phụ nữ trên thế giới nhưng lại chiếm vị trí đầu trong các bệnh ung

thư của phụ nữ ở các nước đang phát triển HPV (Human Papilloma Vius) đã và

đang là mối nguy hiểm đe dọa sức khỏe của những người phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung hoặc những phụ nữ mang virus này HPV được định type (genotype) dựa trên

sự khác biệt về trình tự DNA của virus Đến nay các nhà khoa học đã xác định được trên 100 type HPV khác nhau trong đó hơn 80 type đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen và các type còn lại cũng đã được giải mã một phần Dựa trên khả năng gây ra các tổn thương mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thư cổ tử cung, HPV được chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các type HPV16,

18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70 trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ cao nhất Các type HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương nghiêm trọng và phát triển thành ung thư cổ tử cung Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các type HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64 phổ biến nhất là HPV6, 11 Các type nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng sùi mào gà sinh dục (HPV6, 11), mụn cóc ở chân (HPV1), mụn cơm ở tay (HPV2)

và các dạng viêm nhiễm khác

Mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung đã được xác định từ những năm 70 của thể kỷ trước, theo đó HPV gây ra rối loạn sinh sản của tế bào biểu mô cổ tử cung, với diễn tiến tự nhiên từ viêm nhiễm mạn tính, đến dị sản nhẹ,

dị sản vừa, dị sản nặng, rồi ung thư cổ tử cung Tuy hầu hết (khoảng 98%) tình trạng nhiễm HPV sẽ tự khỏi, nhưng các types HPV thuộc nhóm nguy cơ cao có thể làm tổn thương cổ tử cung nặng hơn hoặc thành ung thư, thường sau khoảng 10 năm Khi đã bị nhiễm và có tổn thương do HPV, không có thuốc điều trị đặc hiệu cho HPV, để tránh nguy cơ tổn thương diễn tiến nặng hơn, chỉ có một cách điều trị

là lấy đi tổn thương này

Hạn chế quan hệ tình dục sớm, không quan hệ tình dục với nhiều người và tình dục an toàn là những cách có thể giúp giảm nguy cơ nhiễm HPV Tuy nhiên, cách phòng ngừa nhiễm HPV hiệu quả nhất là tiêm ngừa vacxin, hiện nay ở Việt Nam đang lưu hành

3 loại vacxin phòng 4 types HPV phổ biến (type 6, 11, 16 và 18) đó là vacxin Vacxin Gardasil (MERCK &CO., Inc.,) và vacxin Cervarix (GlaxoSmithKline) Với những tiến

bộ của y khoa hiện đại, ung thư cổ tử cung có thể được chữa khỏi nếu bệnh được phát hiện sớm Do đó bên cạnh việc tầm soát ung thư cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học

cổ tử cung (xét nghiệm PAP) thì việc phát hiện tình trạng nhiễm HPV và định type virus này cũng có vai trò rất quan trọng

Trên cơ sở các kết quả thu được từ những đề tài nghiên cứu về HPV trước đây,

chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số

phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot”

2 Mục tiêu nghiên cứu

1 Phát hiện được HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR

2 Xác định được genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu và phát hiện tình trạng nhiễm HPV ở nhóm phụ nữ được lựa chọn bằng kỹ thuật Realtime-PCR

- Xác định các genotype HPV ở những trường hợp nhiễm virus này bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HPV – Human Papilloma Virus

1.1.1 Đặc điểm HPV

Human Papilloma Virus (HPV) là nhóm virus có kích thước nhỏ, mang vật

liệu di truyền là DNA, gây bệnh ở người thuộc họ Papovaviridae HPV có cấu trúc capsid không vỏ và đối xứng xoắn ốc, đường kính hạt virus khoảng 52- 55nm chứa DNA dạng vòng, mạch đôi, liên kết với protein giống histone Vỏ capsid được tạo thành từ 72 đơn vị capsomere, mỗi đơn vị là một pentamer của protein cấu trúc L1

và một protein cấu trúc L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong miễn dịch đặc hiệu) Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus Protein capsid phụ (L2) chiếm khoảng 20% Riboxom có hệ số lắng là 21S Tiểu phần lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chịu trách nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ được gọi là Virion giả hay Pseudovirion

Hình 1.1 Sự hình thành capsid của genome HPV

Hình 1.2 Hình dạng HPV

HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, do

đó muốn thực hiện đề tài này chỉ có thể dựa trên nghiên cứu invivo trên người bị nhiễm và những mẫu bị nhiễm sẽ được lưu giữ ở nhiệt độ -700C trong một thời gian

dài mà không làm ảnh hưởng tới khả năng hoạt động của virus [22]

1.1.2 Bộ gen HPV

Genome của HPV là một phân tử ADN kép không hoàn chỉnh, siêu xoắn vòng tức là capsome sắp xếp xung quanh theo chiều xoắn của acid nucleic (ở đây là DNA) tạo thành ống giống như cầu thang xoắn, chiều dài của capsid phụ thuộc chiều dài sợi acid nucleic, bộ gen virus chiếm 12% trọng lượng hạt virus, có kích thước nằm trong khoảng 7,2 kb đến 8,1 kb (trong đó các base Guanine và Cytosine chiếm 42%), 10 khung đọc mở ORF Khung đọc mở mã hoá cho toàn bộ protein của HPV nằm trên một mạch của phân tử ADN kép, tức là sự sao chép, phiên mã xảy ra trên một mạch và chỉ theo một chiều duy nhất [22]

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gene HPV

Dựa theo chức năng, genome của HPV đƣợc chia thành ba vùng chính:

Vùng gene mã hoá cho protein muộn bao gồm các gene mã hoá cho các

protein cấu trúc L1 và L2 hình thành vỏ capsid của virus Gene L1 và L2, vùng L1

mã hóa protein L1 là thành phần chủ yếu cấu tạo vỏ capsid của virus, đây là vùng bảo tồn nhất của virus và cũng là vùng để phát hiện cũng nhƣ phân loại virus L1 có trọng lƣợng phân tử 56-60 kDa, đƣợc phosporyl hóa yếu và không gắn với DNA Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lƣợng phân tử 49-60 kDa, lại đƣợc phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA [22]

Hình 1.4 Bộ gene HPV dạng mạch thẳng

Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả virus hoặc phân tử giống virus (Virus like particles - VLPs), các thành phần này khó phân biệt với virus thực

sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất virus, sản xuất vaccine

Hình 1.5 Cấu tạo hạt giả virus

Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhƣng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid L1 và L2 bộc lộ đặc hiệu trong hầu hết lớp ngoài cùng của tế bào sừng (nơi giải phóng các virus mới đƣợc hình thành) Mặc dù L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhƣng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của virus do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với PML, cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm [22]

Vùng gene mã hoá cho các protein sớm gồm 6 gene: E1, E2, E4, E5, E6 và E7 và khung đọc mở ORF Các gene này mã hóa cho các protein có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus và sự tiến triển của ung thư cổ tử cung

- Gene E1 là một trong 2 vùng bảo tồn nhất ở HPV (cùng với vùng L1)

Chức năng chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA, Gene E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách DNA (helicase) và giúp các chuỗi gene của virus duỗi ra trong quá trình sao chép E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của virus [22]

- Gene E2, ngoài chức năng trong sao chép DNA của virus, E2 là gene mã

hóa chủ yếu cho các nhân tố phiên mã của tế bào, duy trì chuỗi gene virus ngoài nhiếm sắc thể Chức năng điều hòa giải mã của gene E2 được thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gene của virus có ái lực với gene E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của gene E2 trong quá trình giải mã Bên cạnh đó, E2 còn tương tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép và có thể bắt đầu sao chép tăng cường hơn [22]

Gene E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình nhân lên của virus Gene E2 còn có khả năng gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 - E2BSs) và protein E1 Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gene E1 điều chỉnh Trong quá trình sao chép virus, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gene E1 như DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao chép A vì gene E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này [22]

- Gene E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò trợ giúp trong sự trưởng thành

và phóng thích HPV ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ

- Gene E5 tổng hợp protein E5 một protein chuỗi đôi kỵ nước, kích thước

nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lưới nguyên sinh chất của tế bào, giúp HPV xâm nhập và tồn tại trong tế bào chủ Protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu của

sự xâm nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của nhân tố tăng trưởng và biệt hóa, từ đó kích thích sự phát triển của tế bào và giúp virus lẩn trốn khả năng

miễn dịch của tế bào chủ Protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chương trình của tế bào khi có sự sai hỏng DNA do chính virus gây ra [22]

- Gene E6 mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thư,

nhất là ở những types được xếp vào nhóm nguy cơ cao gây ung thư Protein E6 gồm

151 amino acid hình thành 4 cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm điều hòa Ba chức năng chủ yếu của E6 cũng là những chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào chủ: Thứ nhất, liên kết hoặc không liên kết với protein E7 đều có khả năng kích thích tế bào chủ phân bào mạnh mẽ và sự phân chia là mãi mãi gây bất tử hóa tế bào Thứ hai, gắn kết với protein p53 (một protein ức chế khối u của tế bào) và làm tăng sự phân giải của protein p53 bởi hệ thống protein ubiquitin của tế bào và làm tăng khả năng ức chế khối u của protein này, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển của protein PDZ, một protein được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào Thứ

ba, là liên kết với gene ras trong quá trình bất tử hóa tế bào, kích thích sự phát triển của tế bào NIH 3T3, hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus [22]

- Gene E7, tuy nhỏ hơn E6, protein E7 được mã hóa từ gene này chỉ gồm 98

amino acid và hình thành 2 cấu trúc gắn kẽm, nhưng E7 cũng có vai trò không kém phần quan trọng trong việc gây ung thư ở tế bào chủ Trước hết là sự tương đồng ở cấu trúc gắn kẽm với E6, đều là cấu trúc Cys-X-X-Cys, góp phần liên kết chặt chẽ với E6 hơn, hỗ trợ nhau tác động lên sự bất tử hoá tế bào chủ Nếu như E6 cản trở quá trình tự sửa sai của tế bào chủ thông qua liên kết với p53 thì E7 thực hiện vai trò này thông qua kiên kết với pRB, cũng là một gene ức chế khối u Ái lực liên kết này cao gấp 10 lần ở những types thuộc nhóm nguy cơ cao so với nhóm nguy cơ thấp Điều này làm giải phóng số lượng lớn nhân tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào [22]

Vùng điều hoà ngược còn gọi là vùng điều khiển dài (LCR) không có chức

năng mã hoá (chứa DNA không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép

và quá trình phiên mã), vùng này có kích thước 400-1000 bp Vùng LCR mang các trình tự điều khiển quá trình sao chép của HPV Vùng điều hòa thượng nguồn URR

(Upstream Regulatory Region) hay cũng còn gọi là vùng điều hòa dài LCR (Long Control Region): Chiếm 10% chiều dài bộ gene, chứa khoảng 800-1000 cặp base tùy từng type Đây cũng là vùng biến động nhất trong bộ gene HPV Trình tự của vùng bao gồm:

- Trình tự tăng cường: Là nơi gắn của các nhân tố phiên mã (TEF1, TEF2, YY1 )

- Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu cho quá trình phiên

Dựa trên khả năng gây ra các tổn thương mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thư cổ tử cung, HPV được chia làm hai nhóm:

Nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các types HPV16, 18, 31,

45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70 Trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ cao nhất Các types HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương nghiêm trọng và phát triển thành ung thư cổ tử cung

Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các types HPV1, 2, 6, 8, 9,

11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64 phổ biến nhất là HPV6, 11 Các types nguy cơ thấp

là tác nhân gây nên đa số các dạng mụn cơm, mụn cóc sinh dục (HPV6, 11), sùi mào gà ở chân (HPV1), sùi mào gà ở tay (HPV2) và các dạng viêm nhiễm khác

Và có một nhóm chưa xác định được nguy cơ (Unknown-risk type): Gồm đa

số các genotype HPV chưa xác định được khả năng gây ung thư như: HPV 2a, 3, 7,

10, 13, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74…

Điều dẫn đến sự khác nhau trong hoạt động của chúng là do vùng gene E6, E7 Ở nhóm nguy cơ thấp, protein E6, E7 liên kết rất yếu với p53, pRb của người và không có khả năng gắn xen vào DNA tế bào chủ [32]

1.1.4 Chu kỳ sống

Ung thư cổ tử cung là một hệ quả tất yếu có sự lan truyền lây lan qua đường tình dục Thời gian từ lúc tiếp xúc với mầm bệnh cho tới khi xuất hiện mụn cóc là khoảng 3 tháng, cũng có thể là vài tuần hoặc có thể là vài chục năm do tùy vào tình trạng sức khỏe và đặc điểm sinh lý của mỗi người Sự biểu hiện này có thể chỉ thoáng qua và được xử lý bởi hệ miễn dịch của vật chủ Sau đó, HPV sẽ vào giai đoạn tiềm ẩn Tuy nhiên, đối với những người có quan hệ tình dục bừa bãi, sự biểu hiện có thể sẽ vượt khỏi sự kiểm soát của hệ miễn dịch và dẫn đến sự chuyển từ dạng ôn hoà sang dạng ác tính, đó là bước tiếp theo cho sự tấn công của virus [21] HPV không giết chết tế bào chủ Thay vào đó, nó điều khiển tế bào chủ thông qua yếu tố gây mưng mủ tế bào biểu mô tự nhiên Sau đó, chúng sản xuất protein capsule trên lớp biểu mô bề mặt để bảo vệ DNA của nó trong quá trình di truyền Với sự loại bỏ bề mặt nhuộm tự nhiên này, các tế bào chuyên chở HPV như là một vector di truyền

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sau khi lây nhiễm vào cơ thể, các gene gây ung thư (oncogen) của các virus này sẽ tương tác với các yếu tố có mặt trong tế bào chủ

để thúc đẩy sự chuyển dạng tế bào Sau khi tích hợp vào hệ gene vật chủ, cấu trúc của gene E2 trong genome HPV bị phá vỡ và không còn khả năng kiểm soát hai gene gây ung thư E6 và E7, do đó hai gene này được sao mã và tổng hợp các

protein tương ứng Hai protein E6 và E7 sẽ tương tác với hai protein của tế bào là protein RB (điều hoà chu trình tế bào) và protein p53 (điều hòa sinh trưởng khối u) Kết quả là tế bào bị nhiễm HPV sinh sản tự phát, không bị kiểm soát và phát triển thành tế bào ung thư HPV kìm chế hoạt động của hàng loạt các gene có vai trò trong quá trình sinh trưởng của tế bào và đáp ứng interferon chống virus, đồng thời cũng làm tăng biểu hiện của hàng loạt các gene có vai trò trong hình thành các khối

u Có thể chia chu kỳ sống của HPV thành 4 giai đoạn chính sau:

Giai đoạn xâm nhập: Chỗ xâm nhiễm đầu tiên của HPV là những tế bào

nằm ở những vị trí dễ bị thương (tế bào lớp đáy), có thể chỉ là những vết thương rất nhỏ gây ra do quan hệ tình dục Khả năng virus xâm nhập vào những tế bào cơ bản này là rất cao Sau đó, chính sự lành lặn lại ở chỗ vết trầy xướt này bằng việc kích thích sự phân chia những tế bào cơ bản ban đầu đó sẽ dẫn đến làm tăng nhanh thêm

sự sao chép của HPV trong tế bào chủ vì đây là giai đoạn mà HPV chỉ sao chép khi

tế bào chủ sao chép Chính vùng dễ bị tổn thương nhất trong quan hệ tình dục trở thành nơi phổ biến nhất cho virus phát triển [21]

Giai đoạn tiềm ẩn: DNA HPV có thể tồn tại rất lâu với số lượng ít và không

sao chép, không tạo các hạt virus Các gene E1, E2 rất cần thiết cho sự nhân lên của

virus ở giai đoạn này Đây là giai đoạn có sự xâm nhiễm của HPV nhưng các kỹ

thuật xét nghiệm tế bào, hình thái, soi phóng đại đều cho kết quả bình thường Chỉ những xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao như PCR, lai phân tử mới có khả năng phát hiện HPV Thời kỳ này có thể kéo dài 1-8 tháng, tuỳ tình trạng sức khoẻ mỗi người và người ta không xác định được là hệ miễn dịch có hoạt động hay không Cũng có ý kiến cho rằng lúc này hệ miễn dịch không hoạt động vì đòi hỏi sự phát triển số lượng virus và những sản phẩm xâm nhiễm đến một giới hạn nào đó mới kích thích được hệ miễn dịch hoạt động Hầu hết những bệnh nhân đều chỉ có những biểu hiện thoáng qua và không xác định được [21]

Giai đoạn nhân bản mạnh: Nếu như ở giai đoạn trên, HPV chỉ sao chép

cùng tế bào chủ thì bước vào giai đoạn này, HPV sẽ là tác nhân kích thích tế bào chủ phân chia mạnh Từ sự hiện diện thấp lượng DNA virus ở những tế bào cơ bản,

sẽ có sự gia tăng mạnh số lượng DNA virus lẫn những sản phẩm xâm nhiễm ở những tế bào biểu mô gần bề mặt nhất (sự tích lũy protein và những dạng virion của chúng…) Sự xâm nhiễm có hiệu lực 3-8 tháng trước khi hệ miễn dịch bắt đầu hoạt động Chúng phát triển mạnh các mạch máu bao quanh (nhất là ở những types 6, 11) hình thành mụn nhỏ, dẹt, phẳng hoặc lồi, đến những biểu hiện ban đầu của bệnh condyloma, acanthosis, koilocytosis, nuclear attypia….[21]

Giai đoạn có hoạt động của tế bào chủ: Đây là giai đoạn quan trọng quyết

định sự thành công hay thất bại của hệ miễn dịch khi đối phó với virus Thời gian này thường từ 3-6 tháng, sau khi đã qua giai đoạn nhân bản mạnh của virus, có thể nhanh hơn hoặc là không bao giờ Nguyên nhân là vì HPV không xuyên xuống màng nền biểu mô, chúng chỉ xâm nhập vào các tế bào biểu mô lớp trên, mà các tế bào này lại rất kém trong hoạt động trình diện kháng nguyên Nhờ đó, HPV có nhiều thuận lợi không bị hệ miễn dịch của tế bào chủ nhận diện và tiêu diệt Chúng chỉ việc tồn tại an toàn trong những tế bào biểu mô nguyên vẹn Chỉ khi có những tổn thương tế bào (do cọ xát hay hóa chất điều trị) làm lộ HPV cho hệ miễn dịch nhận diện Khi đó, hệ thống miễn dịch sẽ được hoạt hóa và tấn công các tế bào bị nhiễm, khởi đầu là hoạt động của các bạch cầu đa nhân (macrophages), bạch cầu đơn nhân (monocytes)… Chúng sẽ giải phóng các cytokine như interferon a, b, g, interleukine… Interferon có tác dụng làm chậm sự phát triển của virus, làm giảm những sản phẩm xâm nhiễm của chúng Cytokine thì tấn công như là một tác nhân hóa học bằng những phần tử dính kết lên tế bào cạnh mạch máu, kêu gọi bạch cầu đến tiêu diệt vùng bị nhiễm Kết quả của tất cả những hoạt động này là sự gia tăng cytokine của những tế bào langerhan hay tế bào dendritic Tế bào dendritic hoạt động di chuyển qua kênh lymphatic đến vùng hạch lympho, nơi mà chúng thể hiện kháng nguyên HPV lên bề mặt để lympho T nhận diện Khi đó sẽ hình thành các dòng lympho T đặc hiệu HPV, chúng di chuyển theo dòng máu đến vùng bị nhiễm Đầu tiên, chúng sẽ tiếp cận các tế bào endothelial trong những mạch máu bên dưới vùng rối loạn do HPV gây ra thông qua phân tử dính kết trên bề mặt kháng nguyên,

từ đó, theo grandient nồng độ cytokine qua thành mạch máu vào bên trong biểu mô

nhiễm HPV Tế bào T đặc hiệu và tế bào giết tự nhiên (natural kill cell) sẽ vào bên trong những mụn cóc, tiêu diệt tế bào bị nhiễm HPV Bạch cầu đơn nhân và đa nhân

sẽ tiêu huỷ những mảnh vụn tế bào, bao gồm cả DNA của HPV Sự liên kết những yếu tố này giúp làm giảm kích thước mụn cóc, làm sạch vùng bị nhiễm Tế bào T đặc hiệu sẽ trở thành tế bào nhớ ngăn chặn sự xâm nhiễm trở lại Sau khoảng 9 tháng, bệnh nhân được chia thành 2 nhóm là hết bệnh hoặc bệnh vẫn tiếp diễn Tuy nhiên ở những bệnh nhân hết bệnh, khả năng hết hoàn toàn HPV và khả năng HPV quay lại giai đoạn tiềm ẩn là không xác định được, nên vẫn phải tiếp tục theo dõi và hạn chế lây nhiễm Còn ở những bệnh nhân không thuyên giảm thì khả năng chuyển sang ung thư ác tính là cực kỳ cao [21]

1.2 Ung thư cổ tử cung do HPV ở người

1.2.1 Các bệnh do HPV

Trên 99% ung thư cổ tử cung là liên quan đến HPV, điều đó cho thấy mức độ

tác động và tầm quan trọng của HPV đối với các tổn thương ở vùng cơ quan sinh dục Bên cạnh đó, HPV còn gây các bệnh rối loạn khác Trên da, chúng gây các mụn cóc phẳng, dẹt, đôi khi nổi to thành những u sần, thậm chí dày đặc mà người ta gọi là dạng hoa súp lơ Khi có những tác động bất lợi như: Hệ miễn dịch của cơ thể

kém, vùng da chịu tác động nhiều, lâu ngày của tia UV, các hoá chất gây ung thư…

khả năng chuyển thành ung thư da là rất cao Các types gây bệnh này chiếm tỷ lệ khoảng 10% Thường gặp như types: 1, 3, 4, 60, 65, 49, 29 Một bệnh cũng khá phổ biến do HPV gây ra là EV (Epidermaldysplasia Verruciform): Khoảng 20% types HPV là nguyên nhân gây ra EV Đây là một bệnh rối loạn mụn cóc dạng biểu

mô 30% bệnh nhân EV chuyển sang ung thư da tế bào vảy Phổ biến nhất là HPV types 5 và 8 Các bệnh ung thư (ung thư cổ tử cung, ung thư thanh quản…) phần lớn là do các types HPV nhóm nguy cơ cao làm rối loạn quá trình tế bào của tế bào

chủ đẫn đến ung thư ở các vùng chúng xâm nhiễm đặc thù

Hình 1.6 Hình ảnh HPV gây mụn cóc trên da và sùi mào gà miệng

Hiện nay virus HPV đang là nguyên nhân gây ra một số bệnh như ung thư hậu môn, vòm họng còn nhanh và mạnh hơn uống rượu bia, ung thư dương vật ở nam giới và đặc biệt HPV đang được coi là “thủ phạm” của nhiều bệnh ung thư nguy hiểm như: Ung thư cổ tử cung, ung thư âm hộ, ung thư âm đạo, ở phụ nữ Trong nhiều nghiên cứu cho thấy virus HPV có trong 93% các ca ung thư cổ tử cung

1.2.2 Ung thư cổ tử cung

Là loại ung thư mà tế bào đầu tiên chuyển thành tế bào ung thư là những tế bào ở vùng cổ tử cung, chủ yếu là tế bào biểu mô vảy Đó là những tế bào dẹt, mỏng, hình chữ nhật, lót bên trong bề mặt cổ tử cung Khả năng ung thư cổ tử cung

do virus HPV gây nên là rất cao Tùy từng type HPV xâm nhiễm, đặc điểm sinh lý

và lối sống của mỗi người, vùng cổ tử cung bị nhiễm HPV có thể hình thành khối u lành hay ác tính Các khối u ác tính có thể di căn đi bất cứ vùng nào của cơ thể Nguy cơ cao nhất là mắc phải các types thuộc nhóm nguy cơ cao Gene E6, E7 đóng vai trò là các oncogen (gene gây ung thư) Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình xâm nhiễm, khi có sự mất kiểm soát của tế bào chủ và lượng HPV vẫn còn duy trì

được ở mức cao, đồng thời với những tác nhân hỗ trợ khác, bộ gene HPV có thể gắn xen vào bộ gene người Khi đó, bộ gene virus bị mất tại vùng gene E1, E2 làm mất khả năng kiểm soát gene E6, E7 Gen E6, E7 tái biểu hiện, sản xuất nhiều protein E6, E7 Protein E6 tạo thành phức hợp với protein p53 của người qua trung gian E6-AP, còn E7 protein lại liên kết với pRB [23]

Tóm tắt cơ chế phát triển khối ung thư do HPV sát nhập bộ gene vào tế bào chủ gồm 2 tác nhân E6 và E7 được mô tả như trong sơ đồ sau:

Bộ gene HPV

E2 E2

xxxx xxxx

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt cơ chế gây ung thư của HPV

Sự tiến triển của bệnh: Để phân chia các giai đoạn phát triển của bệnh từ

bình thường đến ung thư, có 3 hệ thống Tất cả các hệ thống này đều dựa trên cơ sở

sự thay đổi hình thái tế bào học quan sát được Mức độ 1: Các tế bào đều bình

thường khi quan sát bằng các phương pháp tế bào học (pap’smear, soi phóng đại…)

Mức độ 2: Có sự xuất hiện các tế bào vảy không điển hình, có sự nghi ngờ bước

đầu, cần theo dõi và làm các xét nghiệm cụ thể hơn Mức độ 3: Có sự thay đổi bước đầu về hình dạng, kích thước, số lượng tế bào cổ tử cung Mức độ 4: Xuất hiện một

số lượng lớn tế bào trên bề mặt cổ tử cung có những thay đổi bất thường, nhưng chúng chỉ khu trú tại vùng này mà không lan rộng hay ăn sâu hay di căn vào những

vùng khác Mức độ 5: Đây là giai đoạn ung thư đã tiến triển mạnh, các tế bào ung

thư lan nhanh, xâm lấn vào lớp sâu và các vùng khác của tử cung, cũng như khả

năng di căn là khó tránh Nhìn chung, diễn tiến ung thư cổ tử cung có đặc trưng là khu trú tại vùng là rất lâu [23]

Các tế bào không điển hình

CIN 1 CIN 2 CIN 3 Ung thư

Tế bào vảy không điển hình

Loạn sản nhẹ

Loạn sản vừa

Loạn sản nặng

Ung thư xâm lấn

xâm lấn

Bảng 1.1 Quá trình tiến triển của bệnh từ bình thường đến ung thư [23]

Qua tiến triển của bệnh người ta phân chia ung thư cổ tử cung thành bốn giai đoạn cụ thể sau:

Giai đoạn 1: Là bị nhiễm HPV Khoảng 99,7% các trường hợp ung thư cổ tử

cung là do nhiễm HPV nhưng không phải bất cứ ai bị nhiễm HPV đều tiến triển thành ung thư cổ tử cung Sau khi bị nhiễm HPV, một trong hai khả năng sẽ xảy ra: Hoặc virus tồn tại trong tế bào nhưng không gây tác hại hoặc virus sẽ tiến triển và gây nên tình trạng “tiền ung thư”

Giai đoạn 2: Là tiền ung thư Đây chính là giai đoạn mà y khoa muốn xác

định các triệu chứng của bệnh và ngăn ngừa bệnh trước khi tế bào phát triển thành

ung thư Thời gian từ khi bị nhiễm HPV đến tiền ung thư kéo dài từ 5 đến 10 năm Trung bình chỉ có khoảng 12% bệnh nhân ở giai đoạn này sẽ phát triển thành ung thư chưa di căn

Giai đoạn 3: Là ung thư chưa di căn (carcinoma in-situ) Ở giai đoạn này, tế

bào có dấu hiệu ung thư nhưng khi điều trị kịp thời sẽ cho nhiều kết quả khả quan

Giai đoạn 4: Là ung thư di căn Chỉ khoảng 1% trường hợp từ giai đoạn 2

phát triển thành loại ung thư nguy hiểm ở giai đoạn cuối này

Quá trình hình thành và tốc độ biến chuyển của ung thư cổ tử cung còn tùy thuộc vào hệ thống miễn dịch của người bị nhiễm mạnh hay yếu Và đồng nhiễm HPV với các tác nhân gây bệnh khác như Human Immunodeficiency Virus (HIV), Herpes Simplex 2, Cytomegalovirus (CMV), Human Herpesvirus 6 (HHV6) hoặc là Human Herpesvirus 7 (HHV7) sẽ làm tăng khả năng tiến triển ung thư cổ tử cung Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy đồng nhiễm nhiều types HPV với sự có mặt ít nhất một type nguy cơ cao sẽ làm tăng khả năng tiến triển ung thư cổ tử cung Tuy các types nguy cơ thấp hầu như không gây ung thư khi lây nhiễm độc lập, nhưng khi đồng nhiễm cùng các types nguy cơ cao chúng sẽ làm tăng nhanh sự chuyển dạng tế bào và rút ngắn thời gian tiến triển thành ung thư cổ tử cung [23]

Hình 1.8 Hình ảnh ung thư cổ tử cung

Hình 1.9 Hình ảnh tế bào biểu mô cổ tử cung bình thường (trái) và tế bào ung thư

Á (38%), Châu Úc và Châu Á (21%) Ở nhóm tuổi từ 35 đến 50, tỷ lệ nhiễm HPV

có sự thay đổi ở các khu vực, đặc biệt ở khu vực châu Phi và châu Âu Châu Âu có

tỷ lệ nhiễm HPV giảm rõ rệt theo độ tuổi tăng dần của phụ nữ (15%) nhưng ngược lại, Châu Phi lại có tỷ lệ nhiễm HPV tăng cao hơn so với phụ nữ trẻ tuổi dưới 25 (20%) Theo giới, nam giới được coi là nguồn mang HPV không triệu chứng và là điều kiện làm lây lan HPV trong cộng đồng Tỷ lệ nhiễm HPV chung ở nam trên toàn thế giới trung bình khoảng 7,9%, dao động từ 3,5 - 45% tùy theo độ tuổi và ở các quốc gia khác nhau, trong đó, tỷ lệ các types “nguy cơ cao” từ 2,3% đến 34,8%

và HPV 16 là type thường gặp nhất Tỷ lệ nhiễm types “nguy cơ thấp” từ 2,3% đến 23,9% Tình trạng đa nhiễm các types HPV ở nam cũng chiếm tỷ lệ tương đối cao (3,4 - 22,6%) Như vậy, tỷ lệ nhiễm chung ở nam (7,9%) thấp hơn so với ở nữ (17,9%) Tỷ lệ nhiễm HPV không chỉ thay đổi theo các lứa tuổi mà còn khác nhau giữa các khu vực địa lý, đỉnh tuổi nhiễm HPV thay đổi tùy địa phương, thí dụ: Như

ở Phần Lan, nhiễm HPV thường xảy ra trong độ tuổi 20-29 tuổi Nghiên cứu trên 10.758 phụ nữ tuổi từ 20-29 của Susanne K Kjaer ở Copenhagen tỷ lệ nhiễm HPV

là 14% cũng như một nghiên cứu khác của Anna R.Giuliano ở vùng biên giới Hoa

Kỳ - Mexico cho tỷ lệ nhiễm HPV là 14,4% trong nhóm 2319 phụ nữ từ 15-79 tuổi Khi điều chỉnh theo khu vực thì tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ trong cộng đồng trên toàn cầu là 10,41% (95% CI: 10,2 - 10,7%) với khoảng giao động rộng từ 2 đến 44% và tỷ lệ nhiễm chung ở nam giới là 7,9% [31]

Hầu hết các trường hợp nhiễm HPV không có triệu chứng Đó là lý do tại sao

số trường hợp mắc bệnh không được ghi nhận Ngoài ra, những xét nghiệm tầm soát HPV cũng mới được thực hiện nên những báo cáo về các trường hợp bệnh mới mắc thường thấp hơn thực tế Vì vậy, dự đoán về số ca mới hàng năm vào khoảng 9000.000 người Theo thống kê có được thì có vào khoảng 269 triệu phụ nữ trên thế giới nhiễm HPV Tình trạng viêm nhiễm này dẫn đến 440.000 người bị ung thư cổ

tử cung hàng năm (Châu Âu có 23.000 - 35.000 ở Châu Mỹ Latin và 18.000 người

ở Bắc Mỹ) Số phụ nữ có nguy cơ nhiễm HPV khoảng 2 tỷ người Có nghiên cứu cho thấy nguy cơ nhiễm HPV là 79% Phụ nữ Cách truyền bệnh chủ yếu qua quan

hệ tình dục [31]

* Ở Việt Nam:

Tại Việt Nam, ung thư cổ tử cung là căn bệnh gây tử vong hàng thứ 2 ở phụ

nữ, sau ung thư vú Tỷ lệ mắc tuổi chuẩn là 17,3/100.000 so với ung thư vú là 17,4/100.000 Chi phí điều trị cao nhất là 53 tỷ đồng/năm Số phụ nữ trong độ tuổi tầm soát: 1,32 - 1,92 triệu người Số phết cổ tử cung tầm soát định kỳ thực hiện vào năm cao nhất: 0,85 - 1,05 triệu phết Chi phí 1 ca tầm soát: 15.000 đồng Chi phí tầm soát định kỳ hằng năm cho tất cả phụ nữ năm cao nhất: 12,75 tỷ đồng Một điểm đặc thù mà do thói quen lối sống, điều kiện sinh hoạt mà miền Nam Việt Nam

có tỷ lệ ung thư cổ tử cung cao nhất nước với tỷ lệ mắc tuổi chuẩn là 26,0 Ngược lại, ở miền Bắc ung thư cổ tử cung lại xếp hàng thứ 2 sau ung thư vú với tỷ lệ mắc tuổi chuẩn là 6,8 (kém 4 lần so với miền Nam) [12]

1.3 Các phương pháp phát hiện HPV

Ở các phương pháp chẩn đoán lâm sàng, kết quả xác định là dựa trên sự thay đổi bất thường của tế bào khi có virus nhiễm gây ra Còn ở phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng, kết quả xác định dựa trên sự có hay không có DNA của virus trong mẫu bệnh phẩm, bất kỳ mẫu bệnh phẩm đó đang ở giai đoạn phát triển nào của bệnh Các phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng này được gọi chung là phương pháp “xét nghiệm HPV” (HPV testing) ra đời từ những năm đầu thập niên 1990 và không ngừng phát triển Sự ra đời của các phương pháp chẩn đoán đều nhằm mục tiêu có thể phát hiện sự nhiễm HPV ở giai đoạn sớm Điều này giúp bệnh nhân có một hướng điều trị kịp thời cũng như ngăn chặn sự lây nhiễm HPV

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Một số kỹ thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được

phát triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của HPV-DNA trong tế bào cổ tử cung Các kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác định được các types và phân biệt các thương tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09 - MY11 (Bauer & cs, 1991) [13] và hệ GP5+-GP6+ (Snijders & cs, 1990) [20] Các hệ primer này được thiết kế dựa trên trình tự gene L1, cho phép phát hiện

sự hiện diện của nhiều types HPV trong bệnh phẩm Nhằm xác định chính xác các types HPV hiện diện trong mẫu khảo sát, nhiều công trình sử dụng phối hợp các bộ mồi consensus và mồi đặc hiệu type trong phản ứng nested PCR (Harwood & cs, 1999) [18] hoặc phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzyme cắt giới hạn (Nelson &

cs, 2000) [26] Hybrid Capture Test (Digen Corporation), đã được thương mại hóa ở Hoa Kỳ, là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa mẫu dò (probe) với HPV-DNA phát hiện bằng kháng thể với phản ứng hóa quang Nhiều công trình khác định type bằng cách sử dụng phối hợp PCR với lai phân tử, trong đó sản phẩm PCR consensus được lai với các probe đặc hiệu cho type được cố định trên giá thể rắn, kiểu lai có tên là reverse blotting (Ylitalo & cs, 1995 [35]; Gravitt & cs, (2000) [16]) Những công trình sau đó so sánh hiệu quả phát hiện và định type của các