Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men tạo màng biocellulose từ phế phụ phẩm của cây lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN THỊ THÙY TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TỪ PHẾ PHỤ PHẨM CỦA CÂY LÚA Chuyên ngành: Sin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ THÙY

TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG

LÊN MEN TẠO MÀNG BIOCELLULOSE

TỪ PHẾ PHỤ PHẨM CỦA CÂY LÚA

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 6042 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2016

LỜI CẢM ƠN

B ả , x y ế ế PGS TS Đ T ị K N ,

E x ả !

i ng th ng 12 năm 2016

H v ê

Nguyễn Thị Thùy

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý ề 1

2 Mụ ê ứ 2

3 N ệ vụ ê ứ 2

4 Đố v ạ v ê ứ 2

5 Đ ể ủa vă 2

PHẦN NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1 1 Vị v ặ ể ạ ủa Gluconacetobacter 3

1 1 1 Vị ạ ủa Gluconacetobacter 3

1 1 2 Đặ ể ạ 4

1 2 Đặ ể v ế Biocellulose 4

1 2 1 Đặ ể v ứ ụ ủa Biocellulose 4

1 2 2 C ế ổ Biocellulose 5

1 3 T ê ứ Gluconacetobacter ê ế v ở V ệ Na 7

1 3 1 T ê ứ Gluconacetobacter ê ế 7

1 3 2 T ê ứ Gluconacetobacter ở V ệ Na 11

1 4 S về , ạ 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2 1 N yê ệ v ế ị ê ứ 14

2 1 1 G ố 14

2 1 2 Hóa v ế ị 14

2 1 2 1 Hóa 14

2 1 2 2 T ế ị 14

2 1 3 Mô 15

2 1 3 1 Mô ữ ố (MT1) 15

2 1 3 2 Mô ố (MT2) 15

2 1 3 3 Mô ê (MT3) 15

2 2 P á ê ứ 15

2 2 1 P á v 15

2 2 1 1 P , yể ủ Gluconacetobacter á yề ố (P á V a v B j ) 15

2 2 1 2 P á ê ứ ặ ể á v á xế ế ê ê ả ộ é 16

2 2 1 3 P á ả q ả ủ ố ê ô ạ ê 17

2 2 1 4 P á yể ủ v ẩ Gluconacetobacter cho 17

2 2 1 5 P á xá ị ố ế v ẩ 17

2 2 2 P á óa 18

2 2 2 1 P á ể a ạ a a a 18

2 2 2 2 P á ể a ả ă x óa a ax ax 18

2 2 2 3 Xá ị ả ă xy óa ax ax 18

2 2 2 4 Xá ị ả ă yể óa y y xya 19

2 2 2 5 S ở ê ô H y 19

2 2 2 6 Xá ị ả ă ổ 19

2 2 2 7 Xá ị ả ă ổ ax ẩ ộ 19

2 2 3 P á xá ị ủa Biocellulose 20

2 2 4 P á ê ứ ả ở ủa ồ a , ế ả ă ạ Biocellulose 20

2 2 4 1 P á ê ứ ả ở ủa ồ a 20

2 2 4 2 P á ê ứ ả ở ủa ồ 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3 1 P ủ v ẩ ó ả ă ạ Biocellulose ừ ế

ụ ẩ y a 23

3 1 1 P v ẩ ó ả ă ạ Biocellulose ừ ế ụ ẩ y a 23

3 2 T yể á ủ Gluconacetobacter ạ Biocelullose 28

3 2 1 K ả á ả ă ạ Biocellulose ủa ủ Gluconacetobacter T4 v N7 29

3 2 2 K ả ă ax ax 30

3 2 3 N ê ứ ộ ố ặ ủa ủ Gluconacetobacter T4 v N7 31

3 2 3 1 K ả ă ồ á ồ Ca 31

3 2 3 2 K ả ă ồ á ồ 33

3 2 3 3 Ả ở ủa ệ ộ 34

3 2 3 4 Ả ở ủa ộ H ô ế ả ă ở ủa ộ ố ủ Gluconacetobacter 35

3 3 N ê ứ ả ở ủa ộ ố yế ố ô ế ự

Biocellulose ủa ủ Gluconacetobacter T4 v N7 36

3 3 1 Ả ở ủa ồ 36

3 3 2 Ả ở ủa ồ (NH4)2SO4 37

3 3 3 Ứ ụ Biocellulose ự ẩ ay ế

nilon 39

3 3 3 1 K ả á ả ă ă ả v v v ủa Biocellulose 39

3 3 3 2 K ả á ả ă ả q ả a q ả Biocellulose 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kế 42

2 K ế ị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC BẢNG

Bả 1 1 Đặ ể á ủa ủ v ẩ Gluconacetobacter 7

Bả 1 2 Đặ ể óa ủa á ủ ộ Acetobacter 8

Bả 1 3 Cá ặ ể ệ Acetobacter v Gluconobacter 1

Bả 1 4 Đặ ể ệ á ộ A a a a [38] 2

Bả 3 2 H á ẩ ạ v ế ủa 16 v ẩ ax 24

Bả 3 3 Đặ ể Biocellulose ủa 6 ủ 29

Bả 3 4 H ax ax ạ ủa 6 ủ 30

Bả 3 5 K ả ă ồ á ồ a ủa ủ Gluconacetobacter T4 v N7 32

Bả 3 6 K ả ă ồ á ồ N ủa ủ 33

Bả 3 7 Ả ở ủa ệ ộ ế ả ă ở ủa 34

Bả 3 8 Ả ở ủa ộ H ô ế ả ă ở ủa 35 ủ Gluconacetobacter T4 v N7 35

Bả 3 9 Ả ở ủa ế ố ủa 36

Bả 3 10 Ả ở ủa (NH4)2SO4 38

ế ả ă ạ Biocellulose ủa ủ G T4 v N7 38

Bả 3 11 K ả ă ă ả v v ủa Biocellulose 39

Bả 3 12 S á a ả q ả ộ ố ạ q ả

Biocellulose v ố ứ 40

DANH MỤC HÌNH

H 1 1 Tế v ẩ Gluconacetobacter 4

H 1 2 S ủa Biocellulose v ủa ự v 5

H 1 3 Sự ữ ả Biocelulose ủa 6

H 1 4 C yể óa a Gluconacetobacter 7

H 3 1 Mộ ố a yê ệ 23

H 3 2 C yể á ê y ax ax ủa v ẩ ax 26

H 3 3 K ả ă xy á axê a ủa v ẩ Acetobacter 27

H 3 4 K ể a ạ a a a 27

H 3 5 M á ủ v ẩ T4, N7 ê ề ặ ô ị ể 30

H 3 6 K ả ă ă ả v v ủa Biocellulose 39

H 3 7 Bả q ả ộ ố ạ q ả Biocellulose 41

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CS : Cộ ự

CFU : C y F U ( vị ẩ ạ ) / : a ê

ê ạ Biocellulose ừ ộ ố ô ừa v ạ

v a ô ộ ế ồ yê ệ ẻ ề ê

ạ H ệ ay v ệ ố ạ ữ y ùa a y ô

ễ ô ê , ả ở ế ộ ố ủa

Biocellulose ủa ủ Gluconacetobacter T4 v N7.

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

“Approved list of bacterial names” (S a v ; 1980) [48] v “Berge ’s

manual of systematic bacteriology” (J G Holt, N R Krieg; 1984) [35]

N y ay, ồ ạ ề ữ q a ể á a v ệ ạ v

ẩ ax ó v Gluconacetobacter ó ê V ề y v a y

ề a , ả ó ề ữa ữ ê ứ ế ụ

1.1.2 Đặc điểm phân loại

* Đặc điểm hình thái - tế bào học

* Đặc điểm nuôi cấy

Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter phân biệt với

các loài khác trong cùng một chi:

Quan điểm 1: Dựa v ả ă xy óa ax ax , B j (1898)

a á A a 2 ó :

hóm 1: Có ả ă xy á ax ax CO2 v H2O + Sử ụ ố a (NH4+) ồ y (Sinh trưởng trên

môi trường o er) Acetobacter aceti.

Acetobacter, P a a a , ộ P a a , S z y Đặ

ể ệ v á ủ á ù ộ y ở ả 1 1 y:

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

Quan điểm 3: Theo Bergey (1974) [19], Gluconacetobacter ộ

ủa Acetobacter aceti, chi Acetobacter v ó v ữ ô õ

ồ ố Đặ ể ệ v á á ù ộ y

ở ả 1 2

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng thuộc chi Acetobacter

Loài 1.Acetobacter aceti 2 Acetobacter pasterianus 3 Acetobacter

Chú thích:

+ : Kế q ả 2a: subsp pasteurianus

- : Kế q ả 2b: subsp lovaniensis

1a: subsp aceti 2c: subsp estunensis

1b: subsp orleanensis 2d: subsp ascendens

1c: subsp xylinum 2e: subsp paradoxus

1d: subsp liquefaciens

Quan điểm 4: Theo Bergey (1984) [35], Gluconacetobacter xế v

Acetobacter ộ A a a a H v ẩ y ồ 2 Acetobacter v Gluconobacter Đặ ể ệ ữa 2 y ả 1 3:

Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

Chi Acetobacter ồ ề : Acetobacter aceti, Gluconacetobacter,

Acetobacter oxydans… Đặ ể ạ ủa Gluconacetobacter ự q a ể

ủa F a (1950)

Quan điểm 5: Theo Bergey (2005) [32], Acetobacter xylinum ổ ê

Gluconacetobacter xylinus v xế v Gluconacetobacter ộ v ẩ

A a a a H y ồ 6 : Acetobacter, Axitomonas, Asaia, Gluconobacter,

Gluconacetobacter v Kozakia Đặ ể ạ ữa á y ở ả

1.4:

Bảng 1.4 Đặc điểm phân biệt các chi thuộc họ Acetobacteraceae [38]

Oxy óa a ax axetic + + -/w + + +

Oxy óa ax axetic CO2 v

-

+/- +

-

+ +

-

- + +

Chú thích:

(1): Acetobacter +: Kế q ả nh

Chi Gluconacetobacter ồ 10 á a , ặ ể ệ ủa

Gluconacetobacter xylinus (Gluconacetobacter) v á á a ồ

1.2 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Biocellulose

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc và ứng dụng của màng Biocellulose

Biocellulose ả ẩ a ổ ứ ở ộ ố v

zoogloea, Sarcina ( Canale-Pa a v W f , 1960), Salmonella, Rhizobium ( Napoli et al; 1975), Pseudomonas (Spiers et al 2003), Escherichia, Agrobacterium (Matthysse et al; 1995), Aerobacter, Achromobacter, Azotobacte,r Alcaligenes v

Sợi cellulose của màng Biocellulose Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.2 Sợi cellulose của màng Biocellulose và sợi cellulose của thực vật

N ữ ộ ặ ệ ó Biocelulose ứ ụ

ề á ĩ vự ô ệ á a : ù á q á

xử ý , a ặ ệ á v ă ế (Brown, 1989) [16], ù ế ổ ộ ả x á yề q a ,

* Hệ enzyme tham gia xúc tác quá trình tổng hợp cellulose

Theo Alina Kry y w v ộ ự (2005) [11] ó 4 zy “ a óa"

a 2000) N ữ ả ừ ế y ẩy a ẽ ê ế v v ữ

ả ủa ế á ê ế y ặ Va Va ạ ạ ệ ( ) ay ộ K ê ủa ă ê q ầ ể v

ẩ ở N ữ ể ạ Biocellulose ó ể x ệ , v

ế Biocellulose ở ộ [11], [21].

Hình 1.4 Con đường chuyển hóa cacbon trong Gluconacetobacter [49]

1.3 Tình hình nghiên cứu Gluconacetobacter trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Gluconacetobacter trên thế giới

C y (1961); Ca v S w (1961); L ya aya (1962); Ja (1962); T z Urakami (1989); Si v (1994); Ka a v L ya (1998)…

Thứ nhất, ê ứ ả ă ổ ủa á ủ Gluconacetobacter, ả ở ủa ô v ề ệ ô y ế

q á ổ Mở ầ ữ ê ứ ủa S H trin; M

Sc a v ộ ự [33], [46], [47] Nă 1947, H a ô

q á ổ B a ồ 2% , 0,5% Pepton, 0,5% Cao men, 0,27% Na2HPO4; 0,115% C ax y a , H ố

4,5 (môi trường S) Mô y ử ụ ầ ế á ê

q á y v yể óa a v ẩ Gluconacetobacter

ầ á á ê ứ ủa T (1998) [51], Makoto Soda (2005), Alina Krystynowicz (2005) [12] v S a aw B v ộ ự (2005) [49]

Thứ tư, ê ứ về ổ ở Gluconacetobacter N ữ

ê ứ về y ỉ x ệ ầ ỷ 90 ó ự ỗ ủa ữ

ế ộ ử V ầ y ê ứ yể ổ

ủa Gluconacetobacter v Escherichia coli ủa á ả A a R za v

ộ ự (2005) v v Synechococcus leopoliensis ủa Dav R N v R M B w

A a ủa Ca E S (1993), G ff v ộ ự (1994, 1996, 1997), K J Edwards (1999) hay Takehiko Ishida (2002) [32]…

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Gluconacetobacter ở Việt Nam

ê q a ế ự Biocellulose v ứ ụ Biocellulose Nă 1997,

ó ô ủa N yễ L Dũ , N yễ T ị Mù ê ứ ô á

ỗ ay ế ừa ả x ạ ừa ừ v ẩ Gluconacetobacter Nă

ề ó ồ ố ê ê ô y a á v ô ứa á yế ố y

ứ a, v v y ù ể ă ừa ế ứ ễ ù vế , ạ ề ệ ủ vế , q a ó, a ề ị

P ị ủy v ế á NO2, NO3, SO2… ay ê T

ỉ ó ạ P , K, Ca v S … ĩa á ị về ặ á , ữ

ô ề S ế ộ ạ xử ý ó ó

ả x ô ệ ặ ệ ầ y ồ ó a ộ , ủ yế ử ụ vô v ố ả vệ ự v Cá y

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

- KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH

- Blue Bromophenol, lugol, fuchsin, a , a

C ẩ ị 10 ố ệ ó ô , y vô ù , v ỗ ố ệ 9 , y ô , a ù ồ ữ ở 1210

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phương ph p kiểm tra hoạt tính catalase

ề ệ Q a á y ô yể a v ,

ô ổ

2.2.2.3 X c định khả năng oxy hóa axit axetic

Sử ụ ô a ể ử ả ă xy óa ax ax ủa v ẩ yể

ô 6-7 y ở ề ệ Q a á ệ : ế x q a ẩ ạ

ó v ữa ả ứ (a a ị xy óa, a ả ó ạ a ữa), ế ô

2.2.2.4 X c định khả năng chu ển hóa glycerol th nh dihydroxyaceton

Để ử ả ă y xya ừ y , ô ế

ê ô a ồ á ầ a : G y : 4% ( / ); CaCO3: 0,3% (g/l); (NH4)2SO4:0,1% ( / ); a : 0,3% ( / ); a ô: 3% ( / )’ H2O: 1000ml; pH

ê ó ị lugol v H2SO4 60% yể óa xa a

2.2.2.7 X c định khả năng tổng hợp axit bằng chuẩn đ

Cho 10 ị ê v a á 100 , ê v ó 1-2 ị a 0,1%, ẩ ộ ị NaOH 0,1N

ẹ ị yể a ồ ạ T ố a ax ax ạ trong 10 ị ê ( ế 1 NaOH 0,1N ứ v 0,006 ax axetic ) [4]:

* Trung bình bình phương các sai lệch:

*Sai số đại diện của trung bình cộng:

* Hệ số biến thiên trung bình cộng: