Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sử dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuyển hóa phế phẩm của ngô làm thức ăn chăn nuôi gia cầm (Luận văn thạc sĩ)

BỘ TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỦNG NẤM TRICHODERMA 1432

CHUY N H PH PHẨM CỦ NGÔ LÀM THỨC ĂN

BỘ TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỦNG NẤM TRICHODERMA 1432

CHUY N H PH PHẨM CỦ NGÔ LÀM THỨC ĂN

CHĂN NUÔI GI CẦM

NGUY N TH THU HƯ NG

CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

MÃ SỐ: 60440301

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHO HỌC

GVHD 1: TS LÊ THANH HUYỀN

GVHD 2: PGS.TS DƯƠNG MINH LAM

HÀ NỘI - NĂM 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

Cán bộ hướng dẫn chính: GVHD 1: TS Lê Thanh Huyền

GVHD 2: PGS TS Dương Minh Lam

Cán bộ chấm phản bi n 1: PGS.TS Mai V n Tr nh

Cán bộ chấm phản bi n 2: TS Lê Ng c Thuấn

Luận v n thạc sĩ được bảo v tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

Ngày tháng 12 n m 2017

LỜI C M ĐO N

Em xin cam đoan luận v n Thạc sĩ l kết quả th c hi n của riêng em Kết quả nghiên cứu trong luận l trung th c v th c hi n trên cơ sở nghiên cứu l thuyết, nghiên cứu trong ph ng thí nghi m vi sinh - Trường Đại h c Sư phạm

H Nội v áp dụng th c tế tại đ a phương dưới s hướng dẫn khoa h c của

TS Lê Thanh Huyền, PGS.TS Dương Minh Lam, ThS Trương Th Chiên Nội dung luận v n c tham khảo v s dụng các t i li u th ng tin được đ ng tải trên các trang web theo danh mục t i li u luận v n

i ng y 15 tháng 12 n m 2017

Tác giả luận v n

Nguy n Th Thu Hương

LỜI CẢM N

Lời đầu tiên cho em xin ch n th nh cảm ơn an giám hi u v to n th

qu thầy, c giáo trong khoa M i trường Trường Đại h c T i nguyên v M i trường H Nội, ộ m n CNSH trường Đại h c Sư phạm H Nội đ giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt quá trình h c tập v rèn luy n, c ng như đ tạo điều

ki n cho em được th c hi n thí nghi m tại ph ng thí nghi m bộ m n CNSH trường Đại H c Sư phạm H Nội

Đặc bi t xin g i lời cảm ơn s u sắc nhất tới giáo viên hướng dẫn TS Lê Thanh Huyền, PGS.TS Dương Minh Lam đ tận tình hướng dẫn, g p v truyền đạt nh ng kiến thức bổ ích c ng như nh ng đ nh hướng chuyên đề cho

em Với luận v n n y, em c ng đ củng cố, hi u biết v đ o s u thêm nh ng kiến thức đ h c, kinh nghi m th c tế đ áp dụng trong c ng vi c c ng như cuộc sống h ng ng y

Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy c ộ m n CNSH trường Đại H c

Sư phạm H Nội đ tạo điều ki n đ em nghiên cứu, cảm ơn ThS Trương Th Chiên đ giúp đỡ trong suốt thời gian l m thí nghi m tại ph ng thí nghi m giúp em ho n thi n b i luận v n của mình

Tác giả xin cảm ơn s hỗ trợ kinh phí từ đề t i cấp ộ Giáo dục v Đ o tạo, m số 2015-17-78

Trong giới hạn khu n khổ của một luận v n, chắc chắn sẽ kh ng th bao quát tr n vẹn được hết các vấn đề xoay quanh nội dung của luận v n nghiên cứu Vì vậy em xin ch n th nh cảm ơn v mong nhận được nhiều kiến từ các thầy, c giáo g p bổ sung cho luận v n n y

Qua các kiến đ ng g p, giúp em c th ho n thi n hơn vốn kiến thức của mình trong quá trình vận dụng v o th c tế cuộc sống

Xin trân trọng cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN vi

1 Mở đầu vi

2 Mục tiêu nghiên cứu vi

3 Nội dung nghiên cứu vii

4 Kết quả nghiên cứu đạt được vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

1.1 Tổng quan về Trichoderma 4

1.1.1 Đặc đi m sinh trưởng của Trichoderma 5

1.1.2 Các sản phẩm trao đổi của Trichoderma 5

1.1.3 Nghiên cứu chuy n hóa sinh khối th c vật của Trichoderma 8

1.1.4 Ứng dụng th c ti n của Trichoderma 9

1.1.5 Ảnh hưởng của một số nhân tố m i trường đến s sinh trưởng và phát tri n của Trichoderma 10

1.1.6 Nghiên cứu ứng dụng Trichoderma ở Vi t Nam v thế giới 11

1.2 Cellulase 12

1.2.1 Cellulase 12

1.2.2 Cơ chế tác động của cellulase 14

1.2.3 Ứng dụng cellulase 15

1.2.4 Ngô và phụ phẩm từ sản xuất ngô 15

1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma ở Vi t Nam 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Đ a đi m nghiên cứu 24

2.3 Bố trí thí nghi m 24

2.3.1 Hóa chất 24

2.3.2 Dụng cụ thiết b 24

2.3.3 M i trường nuôi cấy Trichoderma 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Phương pháp đ nh tính enzyme 25

2.4.2 Phương pháp xác đ nh đ nh lượng cellulase 26

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu các điều ki n m i trường ảnh hưởng đến khả n ng sinh trưởng, phát tri n và sinh enzyme của chủng 28

2.4.4 Xác đ nh h m lượng kim loại trong cơ chất sau lên men 30

2.4.5 Xác đ nh h m lượng Protein trong cơ chất sau khi lên men 33

2.4.6 Phương pháp xác đ nh một số th nh phần của cơ chất 34

2.4.7 Th nghi m trên gia cầm th c tế 37

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả đ nh tính enzyme của các chủng nghiên cứu 40

3.2 Kết quả đ nh lượng enzyme 41

3.3 Kết quả theo dõi s sinh trưởng và phát tri n của Trichoderma trên 3 loại môi trường: PDA, Sabouraud, Czapek-dox 42

3.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ cơ chất CMC và BG 44

3.5 Kết quả ảnh hưởng của điều ki n ngoại cảnh lên s sinh trưởng và sinh enzyme của chủng Trichoderma 46

3.5.1 Kết quả về ảnh hưởng của thời gian 46

3.5.2 Kết quả về ảnh hưởng của nhi t độ 47

3.5.3 Kết quả về ảnh hưởng của pH 48

3.5.4 Kết quả về ảnh hưởng của nồng độ cơ chất thân ngô 49

3.6 Kết quả đo h m lượng kim loại của cơ chất sau khi lên men 49

3.7 Kết quả đo Protein 50

3.8 Động thái chuy n hóa của nấm Trichoderma 1432 trên cơ chất thân cây ngô 51

3.9 Th nh phần cơ chất th n ng trước v sau lên men 52

3.10 Kết quả xác đ nh độc tính của cơ chất sau khi lên men 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

1 Kết luận 56

2 Kiến ngh 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 65

T M TẮT LUẬN VĂN

H v tên h c viên: Nguy n Th Thu Hương

Cán bộ hướng dẫn: GVHD 1: TS Lê Thanh Huyền

GVHD 2: PGS TS Dương Minh Lam

Tên đề t i: Nghiên cứu s dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuy n

h a phế phẩm của ng l m thức n ch n nu i gia cầm

1 Mở đầu

Ng l c y lương th c chủ đạo ở nước ta sau c y lúa Lượng phế phẩm

từ sản xuất trồng ng sau mỗi m a vụ l rất lớn Nhưng ch một phần nh lượng phế phẩm n y được s dụng l m thức n th d tr nghèo n n dinh dưỡng cho động vật v o m a đ ng Phần c n lại được s dụng l m chất đốt cho sinh hoạt hoặc đốt lấy tro g y ra nhiều bụi kh i nh kính g y nhi m m i trường Phụ phẩm từ sản xuất ng l một nguồn t i nguyên c giá tr m ta cần tận dụng đ t ng hi u quả kinh tế g p phần bảo v m i trường

Trichoderma được biết l loai nấm c nhiều ứng dụng trong sinh h c

như đối kháng nấm bênh, ủ ph n b n sinh h c, sản xuất enzyme thủy ph n đặc bi t l cellulase giúp biến đổi cellulose th nh thức n d tiêu h a v hấp thụ hơn đồng thời bổ sung vi sinh vật giúp quá trình ph n giải chất thải của động vật di n ra nhanh ch ng g p phần bảo v m i trường

Đ tận dụng nguồn phế phẩm từ sản xuất ng c hi u quả, t ng giá tr kinh tế v bảo v m i trường, t i đ th c hi n đề t i nghiên cứu n y

2 Mục tiêu nghiên cứu

S dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuy n h a phế phẩm của ng

l m thức n ch n nu i gia cầm, biến nguồn phụ phẩm từ sản xuất trồng ngô

thành nguồn tài nguyên mang lại giá tr kinh tế đồng thời góp phần bảo v

m i trường

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng th nh phần m i trường v một số yếu tố ngoại

cảnh lên khả n ng sinh cellulase của chủng nấm Trichoderma 1432

- Nghiên cứu điều ki n thu sinh khối trên th n ng nhờ tác động của nấm

Trichoderma 1432

- ước đầu th nghi m sản phẩm thu được ứng dụng v o thức n ch n

nu i gia cầm

4 Kết quả nghiên cứu đạt được

- Xác đ nh được ảnh hưởng của điều ki n m i trường v một số yếu tố

ngoại cảnh lên s sinh trưởng v phát tri n của nấm Trichoderma

- Xác đ nh được điều ki n thu sinh khối trên th n ng nhờ tác động của

nấm Trichoderma 1432

- ước đầu th nghi m sản phẩm ứng dụng trong thức n ch n nu i gia cầm

D NH MỤC BẢNG

ảng 1.1 H m lượng cellulose trong một số cơ chất t nhiên khô 18

ảng 3.1: Kết quả đ nh tính enzyme cellulase của các chủng nghiên cứu 40

ảng 3.2: Kết quả hoạt tính enzyme của các chủng nghiên cứu 41

ảng 3.3: S sinh trưởng của chủng Trichoderma 1432 42

trên các m i trường khác nhau 42

ảng 3.4: Kết quả đo h m lượng kim loại trong cơ chất 50

ảng 3.5: Kết quả đo protein 51

ảng 3.6: Th nh phần cơ chất th n ng trước v sau lên men 52

Bảng 3.7: H m lượng độc tố trong cơ chất sau lên men 53

Bảng 3.8: Tr ng lượng gà gi a đ n đối chứng v đ n thì nghi m 54

Bảng 3.9: Lượng thức n điều ch nh 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: o t v cuống sinh b o t nấm Trichoderma 5

Hình 1.2: Ki u cắt Endo v Exo 14

Hình 1.3: M hình thủy ph n enzyme cellulose 14

Hình 1.4: Cấu trúc lập th của ph n t cellulose 17

Hình 1.5: Cấu trúc cellulose 18

Hình 1.6: Các v ng cấu trúc của cellulose 19

Hình 1.7: Cấu trúc của Lignin 20

Hình 1.8: M hình ch n nu i g 21

Hình 1.9: Ủ chua thức n ch n nu i 22

Hình 2.1: Đồ th đường chuẩn Glucose 27

Hình 2.2: Đồ th đường chuẩn Mg 2+ 30

Hình 2.3: Đồ th đường chuẩn Ca 2+ 31

Hình 2.4: Đồ th đường chuẩn Fe 3+ 31

Hình 2.5: Đồ th đường chuẩn Zn 2+ 32

Hình 2.6: Đồ th đường chuẩn 33

Hình 2.7: Đồ th đường chuẩn xác đ nh h m lượng glucose b ng sắc kí l ng 37

Hình 2.8: Đồ th đường chuẩn xác đ nh h m lượng xylose b ng sắc kí l ng 37

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ CMC tới s sinh enzyme cellulase của chủng Trichoderma 1432 44

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ G tới s sinh enzyme cellulase của chủng Trichoderma 1432 45

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian tới s sinh enzyme cellulase của chủng Trichoderma 1432 46

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhi t độ tới s sinh enzyme cellulase 47

Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH tới s sinh enzyme cellulase của chủng 1432 48

Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ cơ chất th n ng tới s sinh enzyme cellulase của chủng Trichoderma 1432 49

Hình 3.7: Sợi cellulose khi chưa lên men 51

Hình 3.8: S đứt g y các sợi cellulose sau khi lên men 52Hình 3.9: o t bám trên bề mặt sợi cellulose 52 Hình 3.10: Trộn cơ chất đ lên men v o thức n với t l cơ chất: thức n l 1: 4 55 Hình 3.11: Đ n g thí nghi m 55 Hình 3.12: Đ n g đối chứng 55

D NH MỤC TỪ VI T TẮT

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ở nước ta, ng l c y lương th c chủ đạo quan tr ng thứ 2 đứng sau c y lúa Điều ki n khí hậu ở nước ta rất ph hợp đ phát tri n c y ng Theo Tổng cục Thống kê n m 2016, di n tích trồng ng l 1300 nghìn ha, sản lượng ng hạt l 5980 nghìn tấn Trong quá trình sản xuất n ng nghi p, bên cạnh sản phẩm chính m chúng ta cần c n c nh ng sản phẩm phụ khác, ví dụ l th n,

lá ng Sau khi thu hoạch, lượng phế phẩm từ ng l rất lớn Nhưng ch một phần nh lượng phế phẩm n y được s dụng l m thức n th d tr nghèo

n n dinh dưỡng m a đ ng Phần c n lại s dụng l m chất đốt cho sinh hoạt hoặc đốt lấy tro Đốt sẽ tạo ra nhiều kh i bụi khí nh kính g y nhi m m i trường Nếu lượng phụ phẩm n y kh ng được x l thì c ng sẽ l nơi l tưởng đế nấm mốc phát tri n, l nơi trú ngụ của động vật g y hại l m ảnh hưởng đến sản xuất n ng nghi p Phụ phẩm từ trồng ng cồng kềnh v c giá

tr dinh dưỡng nghèo n n, nhiều xơ Phụ phẩm sản xuất n ng nghi p n i chung, phụ phẩm sản xuất trồng ng n i riêng l một nguồn t i nguyên c giá

tr m chúng ta cần tận dụng

V giải pháp giải quyết các vấn về dư thừa phụ phẩm n ng nghi p g y ảnh hưởng tới m i trường, giảm giá th nh thức n ch n nu i, hỗ trợ gia cầm tiêu h a thức n tốt hơn v ph n hủy chất thải ch n nu i gia cầm nhanh hơn, chúng ta sẽ biến nguồn phế phẩm trên th nh nguồn thức n c giá tr đ giải quyết b ng con đường sinh h c tạo protein sinh khối l m thức n ch n nu i Giải pháp n y l quá trình chuy n h a t nhiên, th n thi n với m i trường, đáp ứng được các yêu cầu của Luật ảo v m i trường v các tiêu chí trong Ngh quyết số 41-NQ/TW ng y 15/11/20014 về ảo v m i trường trong thời

kỳ đẩy mạnh c ng nghi p h a, hi n đại h a đất nước

Trichoderma l loại nấm đ được phát hi n v ứng dụng nhiều trong

lĩnh v c sinh h c như đối kháng nấm b nh, ph n b n sinh h c trong nhiều lĩnh v c sinh h c v sản xuất enzyme thủy ph n, đặc bi t cellulase S dụng phương pháp dùng cellulase đ biến đổi cellulose th nh thức n d tiêu h a, giúp hấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn cho vật nu i đồng thời bổ sung thêm vi sinh vật giúp ph n giải chất thải vật nu i nhanh ch ng hơn, giảm thi u khả

n ng g y m i ảnh hướng tới m i trường [25]. Đ c nhiều c ng trình nghiên

cứu về ứng dụng của cellulase của Trichoderma trong chuy n h a sinh khối

th c vật l m thức n ch n nu i trên thế giới Tuy nhiên, hướng nghiên cứu

n y vẫn chưa được quan t m tại nước ta

Vì vậy, đ tận dụng tri t đ các phế phụ phẩm từ c y ng th n, lá , s

dụng hi u quả đặc tính sinh h c của Trichoderma, t i đ tiến h nh nghiên cứu

đề t i: N hi n cứu sử dụn chủn nấ Trichoderma 1432 chu n h a

phế phẩ của n à thức n ch n nu i ia cầ ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

S dụng chủng nấm Trichoderma 1432 chuy n h a phế phẩm của ng

ứng dụng l m thức n ch n nu i gia cầm, biến nguồn phụ phẩm từ sản xuất trồng ng th nh nguồn t i nguyên mang lại giá tr kinh tế đồng thời g p phần bảo v m i trường

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dun 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của th nh phần m i trường v một

số yếu tố ngoại cảnh lên khả n ng sinh cellulase của chủng nấm Trichoderma

Nội dun 2 Nghiên cứu điều ki n thu sinh khối trên th n ng nhờ tác

động của nấm Trichoderma 1432

Nghiên cứu th nh phần th n c y ng trước v sau lên men với nấm

Trichoderma 1432 h m lượng tro,lignin

Nghiên cứu động thái chuy n h a nấm Trichoderma trên cơ chất th n

ng v l a ch n thời đi m thích hợp thu chế phẩm

Nội dun 3: ước đầu th nghi m sản phẩm thu được ứng dụng v o

thức n ch n nu i gia cầm

Chươn 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

ra nhánh đối xứng nhau g i l th bình Đ i khi th bình m c tr c tiếp từ phần

nh trên h sợi Các nhánh m c vu ng g c với h sợi gốc Cuống sinh b o t chứa một hay v i th bình Một số lo i c nh ng nhánh chính d i hơn, đơn hay nhánh được m c nối thẳng hay khúc khuỷu, c vách m ng nh n nheo hay nhẵn kéo d i ra tận c ng

Th bình hình chai, hình trụ, hình cầu, phình rộng chính gi a Nh ng th bình c th m c th nh v ng xoắn d c cuống sinh b o t hoặc thẳng g c 900

, đơn lẻ hoặc tạo th nh chum o t trần l loại b o t chủ yếu của chi

Trichoderma, thường c m u xanh lục, trắng hoặc v ng nhạt, đơn b o Đa số

b o t c hình dạng elip, hình cầu, tr n hoặc oval t y theo từng lo i ề mặt

b o t thường nhẵn, c mấu như hạt cơm [18] o t áo c th được sinh ra

ở bất cứ đi m n o trên h sợi sinh dưỡng sau khoảng 10 ng y nu i cấy ở

200C o t c th nh d y, đơn b o hoặc đa b o, dạng cầu hoặc gần cầu

C ng c th chúng hình th nh ở tận c ng sợi nấm hoặc bên trong sợi nấm Bào t áo c khả n ng chống ch u tốt với điều ki n m i trường Quá trình sinh sản h u tính l m t ng khả n ng thích nghi v tiến h a nhanh của

Trichoderma

Hình 1.1: o t v cuống sinh b o t nấm Trichoderma

1.1.1 Đặc đi sinh trưởng của Trichoderma

Đa số các lo i Trichoderma đều d nảy mầm ở m i trường t nhiên hay

nh n tạo, dưới điều ki n ánh sáng tối xen kẽ hay trong điều ki n ho n to n sáng hoặc tối Nguồn carbon v n ng lượng chúng s dụng l hydratcarbon, axit amin, aldehydes v axit h u cơ Một số yếu tố dinh dưỡng cần cho

Trichoderma là axit béo, methanol, methylamine, formate, NH3 Các hỗn hợp azaguanine, 5- fluorouacil, actiomycin D, cyclohexemide, phenethyl alcohol

v ethidium bromide ng n cản s hình th nh b o t áo của cơ th Muối NaCl

l m giảm s sinh trưởng v phát tri n của nấm Trichoderma [40]

Chi Trichoderma ph n bố rộng r i, thường xuất hi n trên loại đất gi u

dinh dưỡng v thường sống trong m i trường đất phèn [11]

1.1.2 Các sản phẩ trao đổi của Trichoderma

Các sản phẩm trao đổi của Trichoderma gồm sản phẩm sơ cấp như

enzyme Chitinases, β-1,3 glucanaese, cellululase), sản phẩm thứ cấp như kháng sinh gliotoxin, gliovirin, viridian, valintricin hay các độc tố khác

(isonitrin D, pyrindine) [47] Nh ng enzyme do Trichoderma tiết ra, đặc bi t

là cellulase c vai tr ph n hủy th nh phần tạo nên tính rắn của tế b o th c vật Enzymes n y được s dụng rộng r i trong thương mại c ng nghi p d t may, th c phẩm v chế biến thức n ch n nu i tạo chế phẩm sinh h c l m

gi u cho đất, kích thích t ng trưởng của c y v ph ng trừ b nh nấm b nh cho

cây, sản xuất enzyme từ Trichoderma [31], bột giấy v ng nh c ng nghi p

sản xuất giấy N được chia l m 3 nh m nh endocellulase Carboxylmethyl

cellulose - CMCase , exocellulase v β-glucoside [31] Trichoderma reesei là

lo i được nghiên cứu nhiều với khả n ng tiết khá mạnh enzyme CMCase v exocellulase ph n hủy hoàn toàn cellulose Các điều ki n về nhi t độ, độ ẩm,

độ thoáng khí, pH, nồng độ ion kim loại ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát

tri n c ng như khả n ng ph n hủy cellulose của Trichoderma

Chitinase l một loại enzyme thủy ph n liên kết glucosidic trong chitin,

l một hydrolases glycosyl với kích thước khác nhau từ 20kD đến 90kDa Chitinase sinh ra trong m i trường chứa chitin, b kìm h m bởi glucose v N- acetylglucosamine Enzyme n y được sinh ra tốt nhất ở điều ki n nu i cấy

280C, pH 6 v c nồng độ chitin l 58 Chitinanse đ c chia th nh 2 nh m chính l Endochitinase EC 3.2.1.14 v EXO- chitinase Endochitinase cắt chitin tại các đi m ngẫu nhiên đ tạo th nh cetylchitiniose v các multimers

ph n t khối nh d d ng h a tan của GlcNAc ví dụ như chitriose, chitotetraose Các EXOchitinase được chia th nh 2 loại l chitobiosidases EC 3.2 1.29 v 1-4-β- glucosaminidase EC 3.2.1.30 Chitobiosidases xúc tác giải ph ng acetylchitobioses ở đầu m kh ng l m giảm sợi chitin 1-4-β- glucosaminidase kh các sản phẩm oligomeric của endochitinases v chitobiosidase tạo ra các monomer của GlcNAc [35] Chitinase b ng n cản bởi 8 hydroxy quiolin v cycloheximde, chất tổng hợp protein, chất ức chế

RNA [35] Chitinase g p phần tạo ra carbon v nitơ cho h sinh thái Trong

n ng nghi p, chitinase được ứng dụng v o ki m soát mầm b nh, các nấm, c n

tr ng g y b nh Chitinase c n được ứng dụng rộng trong vi c chuẩn b chitooligosaccharides v N- acetyl D glucosamine, tách bi t b o t trần của nấm men.β-1,3 glucanaese l một enzyme phá vỡ β-1,3-glucans, giải ph ng glucose Chúng c vai tr quan tr ng giúp ph n chia tế b o, tham gia v o quá trình kết hoa quả th c vật, bảo v th c vật kh i nấm b nh do chúng c th

ph n hủy sợi nấm của Fusarium v Pythium giúp ki m soát sinh h c cụ th

Cellulase l nh ng enzyme thủy ph n liên kết β -1,4 trong chuỗi xích cellulose Chất xúc tác cho quá trình thủy ph n của cellulase được chia th nh nhiều nh m d a theo trình t axit amin v cấu trúc tinh th Enzyme cellulase bao gồm 3 th nh phần chính: endo-β-glucanase EC 3.2.1.4 , exo-β-glucanese EC 3.2.1.91 v β-glucosidase EC3.2.1.21 Gliotoxin l một chất độc c chứa lưu huỳnh Gliotoxin c tính chất ức chế mi n d ch, l m chết tế

b o mi n d ch trong h mi n d ch bao gồm neutrophils , eosinophils,

granulocytes , macrophages và thymocytes Gliotoxin th hi n hoạt động chống viêm, n được biết đến như l một kháng sinh, thuốc chống nấm, chống vi rút N c n l m bất hoạt một số enzyme như l NADPH oxidase ,

và glutaredoxin Gliotoxin được tổng hợp b ng cách ngưng tụ Lphenylalanie

v Lserrine m kh ng c ribosomal peptide synthetase g i l G v theo sau một loạt l các phản ứng xúc tác bởi enzyme được m h a bởi 11 gen khác nhau Gliotoxin độc khi nuốt hay hít phải, g y kích ứng da v mắt Liều lượng

g y chết của gliotoxin l LD50 = 67mg/kg [47]

Gliovirin l hoạt chất ki m soát sinh h c các mầm b nh th c vật c

nguồn gốc Pythium ultimum hay c n g i l kháng sinh chống lại pythium

Ngo i ra, gliovirin c n l một chất chống ung thư do chúng ức chế tổng hợp alpha TNF b ng cách ức chế s kích hoạt kinase một loại enzyme chuy n

h a gốc phosphate từ ph n t gi u n ng lượng sang ph n t đích cụ th ,

chống oomycete mạnh N l tác nh n ức chế mi n d ch, tác nh n kháng

khuẩn mạnh

1.1.3 N hi n cứu chu n h a sinh khối thực vật của Trichoderma

a Nghiên cứu chuy n h a sinh khối th c vật nhờ Trichoderma ngo i nước

Trong nh ng n m gần đ y, đ c nhiều c ng trình nghiên cứu mới về

c ng dụng của enzyme cellulase trong x l phế phẩm n ng nghi p th nh sản

phẩm c giá tr dinh dưỡng cao V Trichoderma reesei được biết đến l lo i

sản xuất enzyme cellualase nhiều nhất giúp ph n hủy sinh khối th c vật

th nh đường đơn [41,38]

Theo tác giả Krause v cs 1998 vi c bổ sung enzyme trong chế biến thức

n ch n nu i giúp ph n hủy một lượng cellulose trong nguyên li u, đồng thời giảm tính bền v ng của thức n, giúp sinh trưởng của động vật tốt hơn [36]

Theo tác giả Osama v cs 2013 , s dụng chủng nấm Trichoderma viride ,

T harzianumand và T reesei b ng phương pháp lên men bề mặt giúp n ng

cao h m lượng protein c ng như giá tr dinh dưỡng trong chất thải n ng nghi p như rơm rạ, lá c chua, b mía…[46]

Tác giả Adrio v cs 2014 đ s dụng Trichoderma viride đ x l v lạc

l m thức n ch n nu i c giá tr dinh dưỡng cho động vật thuộc bộ m ng guốc Sản phẩm của c ng trình n y được th nghi m trên cừu Ossimi cho thấy hi u quả rõ r t so với phương pháp ủ chua phổ biến đang được áp dụng

hi n tại Cụ th l , h m lượng protein tổng số đ t ng từ 1,07 lên 2,49g/100gam kh Ngo i ra, khi s dụng sản phẩm thức n được lên men với nấm c n giúp động vật t ng s chuy n h a axetic th nh propionic, giảm lượng vi khuẩn c hại với vật nu i [13]

Hi n nay, các c ng trình nghiên cứu chủ yếu s dụng enzyme trong chế biến thức n m ít nghiên cứu s dụng enzyme lên men tr c tiếp l m thức n cho vật nu i đ tiết ki m chi phí sản xuất

b Nghiên cứu chuy n h a sinh khối th c vật nhờ Trichoderma trong nước

Đ c một số nh khoa h c Vi t Nam đ nghiên cứu tạo ra các sản phẩm

s dụng đặc tính tốt của Trichoderma Tuy nhiên, các nghiên cứu n y đều tập trung v o s dụng Trichoderma s dụng trong ph n hủy sinh khối th c vật

l m ph n h u cơ b n cho c y trồng Tuy đ tận dụng được nguồn phế phụ phẩm từ sản xuất n ng nghi p nhưng chưa mang lại h u quả cao trong s

dụng, chưa thấy được nguồn lợi ích từ s kết hợp Trichoderma với sinh khối

th c vật đ mang lại hi u quả kinh tế v bảo v m i trường

1.1.4 Ứn dụn thực tiễn của Trichoderma

a Ứng dụng của nấm Trichoderma trong chế biến lương th c v ng nh

d t

Trichoderma c khả n ng tiết ra m i trường các enzyme ph n hủy

polysaccharide phức tạp như chitin, protei, pectin, amynopectin Nhờ vậy, chúng thường được s dụng trong th c phẩm v ng nh d t cho các mục đích tương t

Trichoderma được d ng đ tẩy trắng trong sản xuất vải sợi c ng như

c ng nghi p d t may

b Nấm Trichoderma l tác nh n ki m soát sinh h c

Nấm Trichoderma được s dụng như l chất ki m soát sinh h c một

cách c hi u quả như l khống chế, cạnh tranh hay tiêu di t một số b nh như

thối r , chết rạp c y con, xì mủ… trên c y trồng do nấm Pythium,

Rihizoctonia, Fusarium, Sclerotium… g y nên nhờ chúng tiết ra enzyme l m

tan vách tế b o của các loại nấm g y hại l m chúng chết đi

Hình thức s dụng dưới dạng chế phẩm riêng bi t hoặc được phối trộn

v o ph n h u cơ đ b n cho c y trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho c y vừa

t ng khả n ng kháng b nh của c y a lo i nấm Trichoderma được d ng phổ biến trong ki m soát sinh h c l lo i T harzianum , T viride và T hamatum

c Nguồn gen đ s dụng trong chuy n gen

Nhiều gen c nguồn gốc từ Trichoderma đ được tạo d ng v c tiềm

n ng ứng dụng rất lớn trong chuy n gen đ tạo ra c y c khả n ng kháng được nhiều b nh Chưa c gen n o được thương mại h a, tuy nhiên c một số gen hi n đang được nghiên cứu v phát tri n

Ví dụ: Sản xuất protein tái tổ hợp đ được c ng bố như l : enzyme

chitinase của Trichoderma asperellum trong nấm men Saccharomyces

cerevisiae Một số nghiên cứu khác đang được tiến h nh tạo d ng v bi u

hi n enzyme β-glucanase của Trichoderma asperellum, pectinase của

Asperillus niger v lumbrokinase của giun quế Perionyx excavatus)

1.1.5 Ảnh hưởng của một số nhân tố i trườn đến sự sinh trưởng

và phát tri n của Trichoderma

- Ảnh hưởng của nhi t độ: Trichoderma l lo i ưa ấm, sinh trưởng tối

ưu trong điều ki n nhi t độ 25-300

C [37] Ví dụ T erinaceum tiết nhiều

enzyme CMCase nhất ở 280C, T.harzianum tiết nhiều enzyme nhất ở 300C [32] Nhi t độ thấp trong m a đ ng c th ảnh hưởng đến khả n ng sinh trưởng và phát tri n của chúng c ng như khả n ng ph n hủy cellulose

- Ảnh hưởng của nước: Nước ảnh hưởng đến s sinh trưởng v phát tri n của h sợi, s nảy mầm của b o t Thêm n a, nước c n ảnh hưởng tới s sinh tiết, hoạt động của enzyme, ảnh hưởng đến s ph n giải [43 Độ ẩm thích hợp trên cơ chất xác b th c vật cho s sinh trưởng v phát tri n của

Trichoderma l 50- 60% [ 1]

- Ảnh hưởng của pH: Delgado- Jarana v cs, 2000 đ nghiên cứu ra

r ng pH c ảnh hưởng lên s sinh trưởng v phát tri n của h sợi, hoạt động

của enzyme ngoại b o của Trichoderma [24] Dải pH sinh trưởng của

Trichoderma n m trong khoảng từ 2-6 nhưng thường tối ưu trong giá tr pH

b ng 4 [37 Giá tr pH ph hợp đối với s hoạt động của các enzymes do

Trichoderma tiết ra: β-glucosidase, cellobiohydrolase là 5, β-xylosidase là 3,

với hoạt động protease kiềm l 6

- Ảnh hưởng của ion kim loại: S hình th nh sợi nấm c ng cần một số ion kim loại nặng như Cu, Zn, Fe, Ni…nhưng nếu ở nồng độ cao chúng lại

g y độc nghiêm tr ng, ức chế sinh trưởng, s phát tri n của h sợi c ng như

s sinh tiết enzyme của nấm [16]

1.1.6 N hi n cứu ứn dụn Trichoderma ở Việt Nam và thế iới

a Nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma ở Vi t Nam

- Trichoderma được biết đến v s dụng nh m ki m soát, tiêu di t một

số nấm bênh như l Rhizoctonia solani, Pythium g y b nh thối th n r , nh n thân; Fusarium, Phytophthora g y b nh v ng, héo lá do chúng tiết enzyme

l m thủng hoặc tan vách tế b o của nấm b nh khiến nấm b nh b tiêu di t hoặc ki m soát s phát tri n

- Trichoderma được nghiên cứu v s dụng nh m mục đích t ng khả

n ng phát tri n của bộ r , giúp bộ r phát tri n nhanh v mạnh hơn, m c

b Nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma trên thế giới

Đ c nhiều c ng trình nghiên cứu trên thế giới về đặc tính tuy t vời của

Trichoderma Ví dụ, N m 1997, Carle-Urioste JC v cs đ nghiên cứu S

kích thích sản sinh cellulase ở Trichoderma reesei yêu cầu điều ki n cơ bản

b ng cellulose [19]

N m 1988, Teeri TT v cs đ nghiên cứu về s hi u quả hoạt động của

Trichoderma reesei trên xenlozo tinh th [55]

N m 1988, I Yedidia v cs đ nghiên cứu Phản ứng t v của c y dưa

chuột nhờ tác nh n ki m soát sinh h c Trichoderma harzianum [30]

N m 2014, Netta-Li Lamdan v cs đ nghiên cứu Bí mật của

Trichoderma tương tác với gốc r ng : Vai tr trong đối kháng h thống[45

Trong nghiên cứu n y, tác giả đ ch ra r ng, ngo i khả n ng ki m soát sinh

h c các nấm b nh g y ra cho c y ng trong đất, T virens c n tương tác với r ,

giúp c y giảm thi u các b nh trên các bộ phận khác trên mặt đất của c y tạo

ra một h thống ki m soát mầm b nh

N m 2013, Osama v cs đ nghiên cứu s dụng các chủng nấm

Trichoderma viride , T harzianumand và T reesei đ lên men bề mặt các

chất thải n ng nghi p l m thức n ch n nu i [46]

N m 2014, arbara Reithner v cs nghiên cứu Trichoderma atroviride

nh m điều ch nh phiên m Xyr1 giúp hỗ trợ hoạt động của kháng th trong

th c vật Nghiên cứu n y đ g p phần tạo ra các sản phẩm mang lại hi u quả đối kháng nấm b nh trên c y trồng, giúp mang lại hi u quả cao [17]

1.2 Cellulase

1.2.1 Cellulase

Cellulase l một enzyme thủy ph n, xúc tác cho quá trình ph n cắt các liên kết gluoside trong ph n t cellulose cho ra sản phẩm cuối c ng l gluco se Cấu trúc của cellulase c ng khá phức tạp, chia nhiều v ng khác nhau g i

l cấu trúc v ng domain V ng cấu trúc bao gồm một v ng trung t m hoạt

động catalylic domain liên kết với một số v ng gi chức n ng liên kết với

ph n t cenlulozo cellulose binding domain C Ds Các nghiên cứu c ng cho thấy C Ds rất cần thiết đ ph n giải cenlulose dạng kết tinh nhưng kh ng

c khả n ng ph n giải các cellulose dạng h a tan

Cellulase l một phức h enzyme đ ơc chia th nh 3 loại chính: glucanase, exo-glucanase, - glucosidase

Endo-Endo-glucanases (EG-endo-1,4-β-D-4-glucanase, glucanohydrolase, EC

3.2.1.4 hay c n g i l CMC chúng tấn c ng v o nhiều đi m trên chuỗi cellulose, thủy ph n liên kết β-1,4- glycosid ngẫu nhiên, cellulose trương phồng,  - glucan đại mạch, các cello- oligosaccharide l m suy giảm mức độ

tr ng lặp của cellobiose Sản phẩm cuối c ng l cellodextrin, cellobiose nhưng các sản phẩm chứa từ 3 - 6C được coi l các sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối c ng t y từng trường hợp Các liên kết đơn sau khi b cắt đứt vẫn c n liên kết với phần kết tinh Vì thế, sau một thời gian d i mới giải

kh ng c khả n ng thủy ph n cellulose kết tinh, chúng ch l m thay đổi tính chất h a lí giúp endoglucanase hoạt động tốt nhất [15]

-glucosidases kh ng c khả n ng thủy ph n cellulose dạng nguyên

thủy, chúng thủy ph n cellobiose v một v i cello-oligosaccharide khác thành glucozo Hoạt tính của chúng giảm dần trên chiều d i chuỗi [15]

1.2.2 Cơ chế tác động của cellulase

Enzyme ph n giải cellulose c ái l c h a h c đặc hi u với liên kết - 1,4glucozit có trong cellulose Các cơ chế tác động của cellulase lên cellulose thường được chia l m 2 ki u Endo v Exo Hình 1.2

Hình 1.2: Ki u cắt Endo v Exo

Hình 1.3: M hình thủy ph n enzyme cellulose

Ki u cắt Endo l đặc trưng của Endo- glucanases (Cx) Cx cắt đứt các liên kết

- 1,4 glucozit d c theo chiều dài của sợi cellulose một cách ngẫu nhiên, tùy ý, nhất là tại các v ng v đ nh hình Chúng làm giảm chiều dài của chuỗi polysaccharit đi một cách nhanh chóng, tạo ra lượng ít đường kh Quá trình phân giải cellulose của endo-glucanese được xem như l c ng cụ giảm s bền v ng các

sợi Endo- glucanases hoạt động mạnh ở v ng v đ nh hình, nhưng yếu ở vùng

kết tinh và không phân giải được cellobiose [34]

1.2.3 Ứng dụng cellulase

Cellulase giúp vi c ph n hủy xác th c vật di n ra nhanh ch ng, v ng tuần

ho n cacbon được đảm bảo th ng suốt Một số ứng dụng của cellulase đ ơc s dụng hi n nay như l :

- Cellulase ph n giải phế phẩm sản xuất th c phẩm, bổ sung thức n ch n nuôi

- Cellulase s dụng trong c ng nghi p sản xuất giấy, hỗ trợ l m giảm h a chất tiêu thụ đ tẩy trắng, tạo sản phẩm giấy d ph n hủy sinh h c

- Trong c ng nghi p sản xuất d t may, cellulase giúp l m mềm sợi vải, giúp sợi vải được trắng v bền hơn

- Chế biến th c phẩm giúp thức n được tiêu h a d d ng T ng hi u quả trích li protein, axit amin, vitamin từ th c vật như l đậu tương, chất h a tan khi sản xuất chè xanh, cải thi n cấu trúc, t ng chất l ng protein, tinh bột, t ng hung v sản phẩm

- Giúp quá trình lên men sinh khối th c vật di n ra nhanh ch ng đ sản xuất cồn, rượu, axit h u cơ

- Dược phẩm: sản xuất các hoạt chất t tiêu

1.2.4 Ngô và phụ phẩm từ sản xuất ngô

a Ngô

Ng l c y lương th c chủ đạo của n ng nghi p nước ta sau lúa gạo Ngô

c ng một trong số loại c y trồng khác như khoai mì v gạo được s dụng trong

ng nh c ng nghi p sản xuất thức n ch n nu i đang phát tri n nhanh ch ng Theo Tổng cục Thống kê, n m 2016 di n tích trồng ng l 1300 nghìn ha, sản lượng

ng hạt l 5980 nghìn tấn Tương ứng với lượng ng hạt thu được thì c ng c một lượng lớn phế phẩm n ng nghi p từ ng Cứ 1kg ng hạt thu được sẽ c 2,5-3,0 kg phế phẩm từ ng gồm th n, lá v áo bắp Vì vậy, mỗi n m c khoảng 14.950 – 17.940 nghìn tấn phế phẩm từ sản xuất trồng ng

C y ng được trồng ph n bố rộng r i trên cả nước v được trồng nhiều

vụ trong n m t y v o v trí đ a l Ở các v ng đ a l c điều ki n khắc nghi t như v ng núi phía ắc, thời gian sinh trưởng d i hơn khoảng 134-140 ng y

so với 110- 120 ng y ở c ng đồng b ng , n ng suất ng thấp hơn do canh tác

ho n to n phụ thuộc v o thời tiết thì vi c c sẵn nguồn cơ chất ng hay nguồn thức n l kh ng c Với m hình trồng tr t nh lẻ ở các hộ d n cư, vi c sẵn

c nguồn cơ chất l cần thiết đ đảm bảo lu n đủ lượng thức n cho gia cầm Với các quy m trồng tr t trên di n tích lớn, s sẵn c nguồn cơ chất lu n đ c đảm bảo song cần c bi n pháp bảo quản hợp l tránh b hư h ng

b Thành phần chính của thân n

Th nh phần th n ng bao gồm cellulose 37,4%, Xylan 21,1%; lignin

18 ; protein 3,1 ; tổng tro 5,2 ; acetate 2.9 ; mannan 1,6 ; galactan 2,0 [48]

Cellulose

Cellulose l chất m u trắng, kh ng m i, kh ng v Cellulose không tan trong nước ngay cả khi đun n ng v các dung m i h u cơ th ng thường Tan trong một số dung d ch acid v cơ mạnh như: HCl, HNO3,.một số dung

d ch muối: ZnCl2, PbCl2,

Cellulose l th nh phần cấu tạo chính của tế b o th c vật Do đ , n l polymer sinh h c phong phú nhất trên trái đất, giúp cho các mô th c vật c độ bền cơ h c v tính đ n hồi Cellulose t nhiên là phân t homopolysaccharide

chƣa ph n chia gồm có các phân t D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết

- 1,4 glycosidic, tạo th nh một chuỗi các polymer Đơn v nh nhất lặp đi lặp lại trong cellulose l cellobiose, bao gồm 2 ph n t glucozo

Trong th c tế, chuỗi cellulose c mức độ tr ng lặp khoảng 10000 đơn v glucozo trong th n gỗ v 15000 đơn v glucozo trong sợi b ng Tinh th cellulose l chuỗi tu n theo bởi các liên kết hydro v l c Waal đến cấu trúc

kh ng h a tan Trong v ng tinh th , cellulose t nhiên chứa cấu trúc v đ nh hình hoặc paracrystalline region 6 dạng đa hình của cellulose (I,II,III1, III11,

IV1, IV11 đ đƣợc ghi nhận review in O’Sullivan, 1997 Cellulose I hoặc cellulose t nhiên đƣợc tìm thấy trong t nhiên, tồn tại thêm 2 tinh th g i l cellulose Iα, và Iβ Cellulose II thu đƣợc từ s tái tạo cellulose I hoặc meration Cellulose III1 và III11 hình th nh từ cellulose I v II bởi ammoniac l ng đặc

tr Cấu trúc đa hình IV1 và IV11 c th điều chế b ng cách l m n ng cellulose III1 và III11

Hình 1.4: Cấu trúc lập th của ph n t cellulose

Hình 1.5: Cấu trúc cellulose

H m lượng cellulose có trong các nguyên li u khác nhau thì khác nhau

H m lượng cellulose trong một số cơ chất được th hi n dưới bảng 1.1 sau [35]

Bản 1.1 Hà ượng cellulose trong một số cơ chất tự nhiên khô Loại cơ chất Cellulose (%) tron tổn chất kh

28

44

36

91

Cấu trúc của cellulose kh ng đồng nhất, n bao gồm v ng kết tinh cao,

v ng v đ nh hình v v ng cận kết tinh [33]

Hình 1.6: Các v ng cấu trúc của cellulose

V ng kết tinh cao c mật độ các sợi đậm đặc chiếm ¾ cấu trúc cellulose Các liên kết hydro d y đặc ng n cản s tiếp xúc với nước, kh b h a chất tác động c ng như cellulase

V ng v đ nh hình c cấu trúc kém chặt chẽ hơn so với v ng kết tinh,

v ng n y c th hấp thụ nước, d trương lên tạo điều ki n cho các phản ứng

ph n giải xảy ra Xylan l các loại polisaccarit bao h m các đơn ph n l xyloza một loại đường pentoza , cụ th l các loại β-D-xylose nối với nhau [57] Xylan l m t ng độ nhớt của thức n, cản trở quá trình tiêu h a các th nh phần khác v l m giảm mức độ hấp thu dinh dưỡng

Lignin l th nh phần cấu tạo dồi d o thứ 3 của m th c vật [58] Lignin

b tấn c ng hầu hết bởi nấm đặc bi t l do thối r a trắng

Hình 1.7: Cấu trúc của Lignin

Hi n nay, ngo i lõi ng được s dụng đ trồng nấm thì nh ng phần c n lại được s dụng l m chất đốt hay l m thức n d tr cho gia súc m a kh Nhưng nguồn thức n d tr n y kh ng đảm bảo do kh ng được bảo quản đúng cách, cách chế biến chưa mang lại hi u quả dinh dưỡng

Theo báo cáo trong chương trình Hội thảo tạo giống ng l m thức n gia súc trong vi c n ng cao chất lượng thức n th v th n lá tại trường Đại h c Minnesota, Mỹ n m 2009 c khoảng 6,6 di n tích ng nước Mỹ được trồng

v thu hoạch l m thúc n ủ chua cho gia súc

c Tình hình ch n nu i ia cầ ở nước ta hiện na

Theo báo cáo 6 tháng đầu n m 2015 của ộ N ng nghi p v PTNT, trong lĩnh v c n ng nghi p c mức t ng trưởng cao nhất l 4,0 , d ch vụ 2,5 v trồng tr t l 1,1 Theo Tổng cục Thống kê, tháng 10/2016 cả nước

có 2,6 tri u con tr u, 5,3 tri u con b , 2.7 tri u con gia cầm Vì thế, ng nh

gầy, phát tri n kh ng đều Thêm n a, nếu trong khẩu phần thức n kh ng c n

b ng lượng chất th xơ, dẫn đến kh tiêu h a, x t ruột cho vật nu i v dẫn đến tình trạng đánh nhau trong đ n gia cầm

Hi n nay, đ bổ sung thức n th xanh cho gia cầm, b con n ng d n thường s dụng các loại rau xanh b m nh hoặc đ cả c y cho gia cầm n Tuy nhiên, thức n xanh thì hạn chế ở mặt bảo quản, c ng như kh ng đảm bảo được lượng cung cấp v c tính m a vụ nên kh ng chủ động được

Chất thải ch n nu i gia cầm c m i rất kh ch u, nếu kh ng x l thì còn

l một nguồn d nhi m b nh tật cho người c ng như chính bản th n vật nu i

Hi n nay, b con n ng d n c ng như một số quy m c ng nghi p đ s dụng phương pháp d ng chất đ m sinh h c đ giảm thi u phát tán m i trong

ch n nu i gia cầm V chất thải gia cầm sẽ được thu gom lại sau 3-4 tuần thay

Nguyên l : ủ chua l quá trình lên men yếm khí trong th ng kín c nhi t

độ, độ ẩm thích hợp Ủ chua tạo ra acid lactic, l m giảm độ pH xuống ngƣỡng

ức chế vi khuẩn c hại g y thối r a

Thức n sau ủ c m u v ng nhạt, mềm, m i giống dƣa muối Thức n sau khi ủ c th d ng tr c tiếp cho gia súc n Gia súc đƣợc bổ sung thêm thức n ủ chua chúng sẽ lớn nhanh hơn, t ng cừơng sức đề kháng, phát tri n tốt hơn

Hình 1.9: Ủ chua thức n ch n nu i

1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma ở Việt Na

Trichoderma đƣợc biết l lo i nấm ph n hủy cenlulose mạnh mẽ nhất Trichoderma đ đƣợc ứng dụng trong chế phẩm sinh h c giúp c y trồng đối

kháng nấm b nh khác hay l ứng dụng trong vi c ủ ph n sinh h c Chế phẩm

vi sinh từ Trichoderma đƣợc phun v o đất nh m mục đích ph n hủy hết t n

dƣ th c vật, t ng độ m n tơi xốp cho đất v o m a vụ tiếp theo

Ph n giải h u cơ: Trichoderma spp đƣợc xem nhƣ nh máy sản xuất

enzymes cellulase v nhiều enzyme khác nhƣ chitinase, protease, pectinase, amylase… giúp ph n giải chất xơ cellulose v các chất polysacharides khác

như : chitin, lignin, pectin… do đ , Trichoderma thường được trộn chung với

chất thải h u cơ như v đậu, v c phê, dư thừa th c vật sau thu hoạch đ đẩy nhanh quá trình ph n huỷ các chất h u cơ th nh các đơn chất dinh dưỡng giúp

c y hấp thu d d ng hơn C ng nhờ đặc tính n y, Trichoderma c n được d ng

trong c ng ngh th c phẩm v ngh nh d t giúp vải mềm hơn , c ng ngh chế biến thức n gia súc thức n d tiêu hoá hơn , kh m i h i ở các b i rác, chuồng trại, x l đáy ao nu i t m, cá…

Ph n h u cơ sinh h c: Nhờ các đặc tính trên, Trichoderma thường được

trộn với ph n h u cơ v các chế phẩm sinh h c… b n v o đất, đ ngo i vi c hạn chế b nh hại c n giúp cải tạo l hoá tính giúp đất tơi, xốp hơn, nhiều chất

m n hơn, t ng độ phì, giúp vi sinh vật c ích v vi sinh vật đối kháng c điều

ki n phát tri n Hạn chế ph n b n hoá h c v thuốc VTV Giúp t ng cường khả n ng phát tri n h r r nhiều hơn, m c s u hơn…

Chươn 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm Trichoderma được lưu tr tại bộ m n CNSH-VS, trường Đại h c Sư phạm H Nội v các chủng nấm Trichoderma được lưu tr tại ảo

t ng Giống chuẩn Vi sinh vật Vi t Nam VTCC thuộc Vi n Vi sinh vật v

C ng ngh sinh h c ĐHQGHN v các chủng nấm Trichoderma được lưu tr

tại bộ m n CNSH-VS trường Đại h c Sư phạm H Nội

Th n ng được thu tại Vi n Nghiên cứu Ng

Đối tượng th nghi m th c tế: g nu i lấy th t

2.2 Địa đi m nghiên cứu

Đ a đi m:

- Ph ng thí nghi m của bộ m n sinh h c vi sinh, nh K1, ph ng 108, Đại

h c Sư phạm H Nội

- Đại H c T i nguyên v M i trường H Nội

- X Song Phượng, huy n Đan Phượng th nh phố H Nội

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2017 đến tháng 11/2017

2.3 Bố trí thí nghiệm

2.3.1 Hóa chất

Dầu soi kính Đức , nước cất, giấy thấm, cồn, propanol, glucose, peptone, agar, KH2PO4, FeSO4.7H2O, KNO3, NaCl, MgSO4.H2O, KCl, NaNO3, H2SO4, CMC, BG, NaNO3, NaOH

Các h a chất đều đạt tiêu chuẩn ph n tích

Sĩ , c n ph n tích kĩ thuật số (Precisa XT 320M-Thụy Sĩ , kính hi n vi quang h c hi u Carl Zeiss Đức : Axioskop 40, máy ảnh kĩ thuật số, tủ lạnh, bếp ga, kẹp số 5, lam kính, lamelle, kim m i mác, hộp Petri 10, pipet các loại, tủ sấy, tủ ấm inder Đức , nồi hấp cao áp Hyrayama Nhật , buồng cấy Holten safe 2001 Đan Mạch , máy chưng cất nước 1 lần Hamilton-Anh , các loại bình tam giác dung tích 100, 250, 500 ml, hộp lồng, ống nghi m, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh, ống đong, ph u thuỷ tinh Vi t Nam , giá nu i cấy

2.3.3 M i trường nuôi cấy Trichoderma

Cellulasee được nấm Trichoderma tiết ra m i trường sẽ ph n hủy cơ chất

CMC và BG l m độ đục của m i trường b giảm v trở nên trong suốt khi b

nhuộm b ng congo Độ lớn của v ng ph n giải phản ánh hoạt tính của

enzyme

Cách tiến hành

+ Đặt thí nghiệm

Chủng Trichoderma tuy n ch n được nu i lắc trong m i trường sinh

enzyme ở 30 trong 3 ngày

D ng khoan nút chai khoan lấy khối thạch trong đĩa Petri m i trường cơ

chất ph hợp đ tạo lỗ 100µl d ch Trichoderma đ nu i lắc được bổ sung v o

lỗ thạch vừa khoan Đĩa thạch được ủ 6h trong tủ lạnh 40

C đ enzyme khuếch tán Sau đ , đĩa thạch được ủ 12 h ở 30 rồi nhuộm b ng dung d ch 1 congo đ trong 3-5 phút v r a lại b ng 0,9 NaCl một v i lần

+ Kiểm tra khả năng tạo th nh các enzyme

Mức độ sinh cellulase phụ thuộc v o đường kính v cường độ m u sắc

v ng ph n giải: Ki m tra khả n ng sinh enzyme cellulase b ng cách xác đ nh

hi u số gi a đường kính v ng ph n giải (D): vòng trong, sáng xung quanh khuẩn lạc v đường kính khuẩn lạc d Hi u số D – d c ng lớn chứng t chủng nghiên cứu sinh enzyme cellulase c ng mạnh

2.4.2 Phươn pháp xác định định ượng cellulase

Nguyên tắc: phương pháp d a trên cơ sở phản ứng tạo m u gi a đường

kh với thuốc th Dinitro salysilic acid DNS Cường độ m u của hỗn hợp phản ứng tỷ l thuận với nồng độ đường kh trong một phạm vi nhất đ nh + Mẫu trắng: 450 µl dung d ch cơ chất CMC, gi ở nhi t độ 500