Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase từ vỏ lụa sắn theo phương pháp bề mặt năng suất 18000kgngày

Với những ưu điểm vượt trội - tốc độ sinh trưởng nhanh, hệ enzymephong phú và có hoạt tính cao, môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm, vi sinh vật đãtrở thành nguồn nguyên liệu thu enzyme

MỞ ĐẦU

Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước vàtrong dung dịch muối loãng Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 1.000.000dalton nên không qua được màng bán thấm

Enzyme là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng hợphóa học Người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật hoặc

vi sinh vật Với những ưu điểm vượt trội - tốc độ sinh trưởng nhanh, hệ enzymephong phú và có hoạt tính cao, môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm, vi sinh vật đãtrở thành nguồn nguyên liệu thu enzyme chủ yếu thu hút được nhiều quan tâm củacác nhà nghiên cứu và sản xuất

Enzyme không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọisinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm,trong y học, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường Vì vậy mà nhữngnghiên cứu sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầuthế kỉ XX

Mặt khác, hiện nay các nhà máy chế biến tinh bột sắn thải ra hàng trăm ngàn tấn bãthải Theo ước tính, một nhà máy chế biến có công suất 30-100 tấn/ngày thì sẽ sảnxuất được 7,5 - 25 tấn tinh bột, kèm theo đó là khối lượng lớn vỏ lụa sắn Lượng vỏlụa này hiện nay vẫn chưa được xử lý riêng rẽ gây mùi hôi thối, ô nhiễm môi trườngcho cộng đồng dân cư sống quanh khu vực nhà máy chế biến tinh bột sắn Chính vìvậy cần có phương pháp xử lí để giảm thiểu độ ô nhiễm đồng thời tạo ra những sảnphẩm có giá trị, nâng cao hiệu quả sử dụng nguyên liệu

Xuất phát từ thực tế đó, ý tưởng sử dụng vỏ lụa sắn – thành phần chứa hàmlượng cellulose rất cao, làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất cellulase

Nó không chỉ góp phần tạo ra nguồn enzyme mang lại nhiều ứng dụng trong cuộcsống hằng ngày của con người mà còn góp phần giải quyết tình trạng ô nhiễm môitrường của các nhà máy tinh bột sắn

Trên cơ sở đó, tôi được thực hiện đề tài: “Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase từ vỏ lụa sắn theo phương pháp bề mặt năng suất 18000kg/ngày ”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về enzyme cellulase [1]

1.1.1 Định nghĩa enzyme cellulase

Cellulase là một phức hợp enzyme phân giải cellulose tạo thành β-glucose

Nó được sản xuất nhờ các vi khuẩn cộng sinh trong dạ cỏ của động vật nhai lại.Ngoài động vật nhai lại không còn động vật nào khác sản xuất được enzyme này

Cellulase là hệ enzyme có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose,chuyển hóa các hợp chất cellulose trong rác thải tạo nguồn năng lượng thông quacác sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác:

từ các chất thải nhà máy giấy như: các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu hồinăng lượng như ethanol

Trong cấu trúc của cellulose chủ yếu là liên kết β-(1-4) glucosit Để phá hủyhoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với nhữngtác động đặc trưng riêng biệt Sau khi enzyme cellulase (còn gọi là endoglucanaseD) và enzyme β-glucosidase (còn gọi là cellobiase) phá hủy không chọn lọc β-1,4gluccan thành các mảnh có khối lượng phân tử nhỏ oligocellulose Enzymecellobiosidase (còn gọi là cellobiohydrolase) phá hủy tiếp các mảnh nhỏ này cho tớiđơn vị nhỏ nhất là đường đơn

1.1.2 Tính chất và cơ chế hoạt động của cellulose [1]

1.1.2.1 Phân loại enzyme cellulase

Enzyme tham gia phân hủy cellulose được phân ra làm 3 nhóm chủ yếu:

- 1,4 β-D glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) Enzyme cắt đầu khôngkhử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này còn có một loạt cáctên khác như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase vàavicellase

Enzyme này có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thayđổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enyme endocellulase phân giải chúng

- 1,4 β-D glucan 4 glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) Enzyme này tham giaphân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose, lignin và β-D glucan Sản phẩmcủa quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose Chúng tham gia tácđộng mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh Enzymenày còn có các tên gọi khác như: endoglucanase, endo 1,4 glucanase và C-cellulase

Hình 1.1 Cấu trúc enzyme 1,4 β-D glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

Hình 1.2 Cấu trúc enzyme 1,4 β-D glucan 4 glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

- β-D glucoside glucohydrolase (EC 3.2.21) Enzyme này tham gia phân hủycellobiose tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân giải cellulose nguyênthủy.Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase

Hình 1.3 Cấu trúc enzyme β-D glucoside glucohydrolase (EC 3.2.21)

1.1.2.2 Tính chất của cellulose [25]

Cellobiohydrolase gồm hai loại Cbh I và Cbh II

Cbh I có trọng lượng phân tử khoảng 65 kD, điểm đẳng điện là 4,4 (PI =4,4) Loại enzyme này tác động lên cellulose vô định hình và kết tinh nhưng chúngkhông tác động đến cellulose biến tính như CMC

Cbh II có trọng lượng phân tử là 53 kD, PI = 5,0 Chúng cũng không tácđộng lên CMC, chúng có khả năng tác động lên cellulose hòa tan và không hòa tan

Endoglucanase chia thành hai loại Egl I và Egl II Egl I có trọng lượng phân

tử 48,212 kD và Egl II có trọng lượng phân tử 42,2 kD Các enzyme này có thể hoạtđộng ở nhiệt độ khá cao

β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động ở

pH rất rộng (pH = 4,4-8,4), trọng lượng phân tử 54-98 kD, PI = 8,4 và có thể hoạtđộng ở nhiệt độ cao

1.1.2.3 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase [25]

Hệ enzyme cellulase sẽ phân hủy thành hai phần tử glucose theo cơ chế:Cellobiohydrolase I (CBHI) sẽ tác động tại đầu khử, cellobiohydrolase II (CBHII)

sẽ tác động vào đầu không khử, endoglucanases (EG) thủy phân các liên kết bêntrong và β-glucosidase tách các cellobiose disaccharide thành glucose

Hình 1.4 Cơ chế tác động phân giải của tổ hợp enzyme

Theo nghiên cứu của Ogawa và Toyama còn có 1 enzyme C2 có tác dụngtrung gian giữa exoglucanase (C1) và endoglucanase (Cx) Enzyme này tác động vàocác phần tử cellulose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng thành những loạicellodextrin hòa tan Sau đó enzyme Cx sẽ tiếp tục thủy phân các loại cellodextrinnày thành cellobiose

Các chế phẩm enzyme cellulose có thể thủy phân các cellulose tự nhiên nhưgiấy lọc, hay dẫn xuất của cellulose như Carboxylmethyl cellulose (CMC) hoặcHydroxylethyl cellulose (HEC) bằng cách phá vỡ liên kết β-1,4-glucoside và β-,4-glucanase Vì vậy để xác định hoạt tính của C1 người ta sử dụng các loại cellulose

tự nhiên, để xác định hoạt tính của Cx người ta sử dụng môi trường thạch có bổ sungCMC hay HEC

1.1.3.Ứng dụng của enzyme cellulose[24]

1.1.3.1 Nguồn thu nhận enzyme cellulase[24]

Có thể nói nguồn phân giải cellulase bởi vi sinh vật là một trong những chutrình quan trọng của tự nhiên Người đầu tiên nghiên cứu khả năng phân giải củacellulose của các vi sinh vật kị khí là Popov vào năm 1875, tiếp đó là Omelianxki.Các môi trường nghiên cứu phân lập vi sinh vật loại này trở thành kinh điển Conngười đầu tiên phát hiện khả năng phân giải cellulose bởi vi khuẩn hiếu khí là G.Van Iterson vào năm 1903

Trước đó, hoạt động phân giải cellulaese bởi các vi sinh vật sống trong dạ cỏcủa các loài động vật nhai lại đã được chứng minh (1955) Đến năm 1971, người ta

đã phân lập được một số loài vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose trong dạ

cỏ Trong đó có hai giai đoạn nghiên cứu kĩ hơn cả là Ruminococus và R Flavefacicus.

Về sau này, rất nhiều vi sinh vật phân giải cellulose được tìm thấy trong đất,nước, phân bón hữu cơ Đáng chú ý hơn cả là việc ứng dụng vi khuẩn thuộc nhómCelludomonas vào việc lên men phân giải bã mía và rát thải thực vật Sưu tập giống

QM (QM collection) của Massachusetts cũng có khoảng 14000 chủng nấm có khả

năng phân giải cellulose trong đó có các chủng nổi tiếng như Trichoderma viride, Sporotrichum P Ruinosum, penicillium pusillum,

1.1.3.2 Ứng dụng [26]

Hiện nay, công nghiệp thủy phân nhờ enzyme đã và đang phát triển với tốc

độ nhanh chóng Cùng với các enzyme quan trọng khác, cellulase đã được ứng dụngrộng rãi vào các mục đích khác nhau như:

Trong công nghiệp:

Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăngia súc và tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó đểtăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thựcvật Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm đượctăng lên Một số nước đã sử dụng cellulase đẻ xử lý các loại rau quả như bắp cải,hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn xử lý cả chè, cácloại tảo biển

Cellulase còn được ứng dụng trong sản xuất glucose mật đường từ nguyênliệu giàu cellulase như rơm, rạ, mạt cưa, gỗ vụn, dăm bào thay thế dần cho phươngpháp thủy phân bằng axit Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức

hệ citase, trong đó có cellulase, thành tế bào của các hạt đại mạch bị phá hủy tạođiều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa

Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chấtlượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng axit để phá vỡ thành tế bào Đặc biệt

là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân,dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men

Những ứng dụng cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt.Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.

Trong lĩnh vực sản xuất nhiên liệu, enzyme cellulase ngày càng được quantâm do các enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóacác hợp chất kiểu linocellulose và cellulose trong các rác thải tạo nên nguồn nănglượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàunăng lượng khác Ví dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy

và giấy có thể thu nguồn năng lượng nhuwethanol Hiện nay vẫn có số lượng lớncác công trình đề xuất những phương pháp có thể thực hiện được trong việc sử dụngcác enzyme để thủy phân cellulose có trong các chất thải hữu cơ tại thành phố lớn

để thu hồi các sản phẩm đường có thể lên men và cuối cùng tạo ra ethanol vàbutanol

Ngoài ra cellulase còn được ứng dụng trong việc phá hủy vách tế bào, giúpcho việc trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc được dễ dàng hơn Trong côngnghiệp sản xuất vải sợi từ bột gỗ, sản xuất tơ nhân tạo, cellulase được bổ sung vàothành phần chất tẩy giặc để làm mềm vải

Trong nông nghiệp và xử lý môi trường:

Bên cạnh những ứng dụng trong công nghiệp, cellulase còn được ứng dụngtrong việc giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường và cải tạo đất Cellulase được dùng để

xử lý phân, rác thải tạo ra các sản phẩm cuối cùng là phân hữu cơ, gồm các thànhphần như: N, P, K, Ca, S các yếu tố vi lượng như: Fe , Mn, Cu, Zn, B, Mo,Na cùng với hàng tỉ tế bào sinh vật, trứng giun, ấu trùng, côn trùng có ích giúp đấttơi xốp, dễ canh tác, giảm đến mất thấp nhất bệnh cây trồng Các kháng sinh do visinh vật tiết ra trong đất hay có sự có mặt cua hoocmon trong phân hữu cơ sẽ kíchthích sinh trưởng của cây Phân hữu cơ lại có giá thành rẻ hơn các loại phân hóa họckhác

Ngoài ra cellulase còn phân hủy xác thực vật còn lại trên ruộng đồng để làmmàu mỡ cho đất, phân hủy các loại chất thải rắn hoặc nước có chứa cellulose để làmsạch môi trường Có thể nói cellulase là một trong những loại enzyme được ứngdụng rộng rãi cả trong công nghiệp, nông nghiệp cũng như trong sinh hoạt hằngngày

1.2 Tổng quan về hệ Vi sinh vật phân giải cellulase:

1.2.1 Vi khuẩn [18]

Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi

sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sửdụng gỗ làm nguồn thức ăn

Trong lòng đất người ta cũng phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+)

hiếu khí như Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus Đối với các

dòng ưa ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase củachúng hoạt động là 5,5 và 550C, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt

độ 750C

1.2.2 Xạ khuẩn [19]

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm.Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên ADN của xạ khuẩnrất giàu G+C chiếm 57-75 % Chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô Xạ khuẩncòn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại

kháng sinh như streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin.

Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản

sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu Một số loài đáng chú ý thuộc giống này

như Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans.

231.2.3 Nấm [2]

Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạonhững sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất tronglĩnh vực phân hủy cellulose Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao vàdường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi khuẩn

Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy

trình phân hủy cellulose ở nhiều môi trường khác nhau

Nguồn thu enzym cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật Trong đó, vi nấmTrichoderma là nguồn thu enzyme cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khácao.

Trong đồ án thiết kế của tôi, tôi sử dụng chủng Trichoderma reesei.

1.3 Tổng quan về Trichoderma reesei [23]

1.3.1 Lịch sử phát hiện

Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đóđược biết là Trichoderma viride Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượngcủa vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của cácngành khoa học khác Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội

Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ởNam Thái Bình Dương

Chương trình điều tra của quân đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã

số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này Sự nhầm lẫn này kéo dàisuốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tênlại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này làElwyn T Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác củaMary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủycellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này

và các thể đột biến trên chủng đó

Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu

và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của

Trichoderma vào cuối thập niên 60 Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma

Việc nuôi cấy dễ dàng và không tốn kém, các chủng Trichoderma đã lôi kéo

các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng

dụng về phân giải cellulose của chúng Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu

về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm

soát sinh học trong nông nghiệp Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên

cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới [Theo Christian P Kubicek và Gary E Harman].

1.3.2 Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei[24]

Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS ( CBS Course of

Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma nhưsau[24]:

Giới : Fungi Ngành: Ascomycota Lớp : Ascomycetes

Bộ : Hypocreales

Họ : Hypocreaceae Giống : Trichoderma Loài : Trichoderma reesei

Đặc điểm hình thái

Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên

trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng

vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thôngthường là 5-10 µm)

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ởcuối nhóm phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn,không màu, liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy

Bào tử của Trichoderma, có màu xanh đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu

trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử luôn đơn bào, bào tử hình cầu, hìnhelip hoặc hình thuôn

Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone).Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm Dưới phần nàythành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa Màng nguyên sinh chấtthường bám sát vào thành tế bào Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có

kết cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome)hay biên thể (lomasome)

Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân cónhiều lỗ thủng Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tếbào phía sau ngọn (1,2 nhân) Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển viquang học Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương

đối ít ( 6 ở T.reesei).

Tế bào nấm chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhânthực (Eukaryote) khác Ribosome của T.reesei thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ sốlắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit) :bán đơn vị lớn (large subunit ) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-

40 loại protein) Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24loại protein)

Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏnhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phíađỉnh ngọn sợi nấm

Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis)hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vậtkhác sinh ra Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợpvới thành tế bào tạo nên một màng dày hình thành những bào tử áo(chlamydospore) Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điềukiện môi trường khắc nghiệt Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh(endospore)

Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trênmột môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều-mycelia), sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc(colony)

Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng(anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo hệ thống liên thông thuận tiện choviệc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm

Hình 1.5: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử ( Nguồn bởi G.B.Sharples) 1.3.3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa[2]

1.3.3.1 Đặc điểm sinh thái

T.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm

sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 250C-300C, chậm ở

350C-370C Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thànhbào tử nhỏ và ở mép bất thường Trong khi ở 370C, bào tử không xuất hiện sau 7ngày nuôi cấy

Hình 1.6: Khuẩn lạc T.reesei sau 47 ngày nuôi cấy.

Môi trường sống

Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm Hầu hết chúng là vi sinh vật hoại sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác Trichoderma rất ít

tìm thấy thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật Chúng có mặt khắpmọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc Chúng phổ biến trong những khurừng nhiệt đới ẩm hoặc cận nhiệt đới là khu rừng ôn đới hay rừng phương Bắc.Nhu cầu nhiệt độ tối đa của môi trường sống đặc trưng cho từng loài

Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và chúng sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia.Trichoderma có

thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dứa

(6-pentyl-pynone đã bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng củaTrichoderma

1.3.3.3 Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh

Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh : glioviridin, sespuiterpenoids, trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid Trichoderma có khả năng sản xuất đa

dạng chất chuyển hóa thứ cấp: anthroquinon, emodin

1.3.3.4 Môi trường nhân sinh khối [22]

Trichoderma phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều

cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia…

1.3.4 Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma [22]

Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều "hoạt

động" khác nhau, chúng có thể sử dụng:

Kháng sinh được tạo ra chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng trưởng của tácnhân gây bệnh

Cạnh tranh: Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài nguyên (dinh dưỡng,

không gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma "xâm chiếm" môi

trường trước các vi sinh vật khác

Ký sinh: tức giết chết các loài gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên trongloài nấm gây hại và/hoặc tiết ra những chất (enzymee) để phân hủy chúng

Hình 1.7: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium

[(Nguồn: DienTrang Biolab)]

1.4 Các phương pháp lên men [2]

Dựa vào mức độ thông khí có hai phương pháp lên men sau

1.4.1 Phương pháp lên men chìm

Dùng cho cả VSV hiếu khí và kỵ khí, chỉ cần thay đổi chế độ sục khí

- Sử dụng môi trường dinh dưỡng lỏng (môi trường dịch thể) Phổ biến trongsản xuất men bánh mì, protein đơn bào từ VSV, chế phẩm vi sinh

Ưu điểm:

- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền

- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho 1 đơn vị sản phẩm thấp

- Dễ cơ khí hóa, tự động hóa cho toàn bộ quá trình

Nhược điểm:

- Trang bị kỹ thuật cao, chế tạo đặc biệt chịu áp lực cao, kín và làm việc trongđiều kiện vô trùng tuyệt đối Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

1.4.2 Phương pháp lên men bề mặt [2]

Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuấtenzyme thường dùng môi trường rắn, đôi khi dùng môi trường lỏng

Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngômảnh, bột đậu tương,… Môi trường lỏng thường là các dịch rỉ đường, dịch thủyphân từ thóc mầm, nước bã rượu… có thêm muối khoáng Môi trường lỏng ít dùng

để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này

- Ưu điểm của phương pháp này:

+ Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, qui trình công nghệ không phức tạp

+ Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rấtnhiều so với nuôi cấy chìm

+ Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản

+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việcvận hành công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém.

+ Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý

- Tuy nhiên phương pháp này có những nhược điểm:

+ Chỉ có thể nuôi cấy gián đoạn

+ Tốn nhiều diện tích cho quá trình nuôi cấy

Đây là phương pháp đang được sử dụng khá phổ biến hiện nay Và đồ án sản

xuất enzyme cellulase từ Trichoderma reesei của em sẽ sử dụng phương pháp lên

men bề mặt

1.5 Tổng quan về nguyên liệu vỏ lụa sắn:

1.5.1 Cấu tạo của củ sắn:[21]

Củ sắn có kích thước trung bình dài 25 – 38 cm, đường kính 3-6cm Tùy theogiống, điều kiện đất đai và thời gian thu hoạch mà củ sắn có kích thước trên dướikích thước trung bình Cấu tạo của củ sắn gồm 4 phần chính:

+ Vỏ gỗ (còn gọi là vỏ lụa) có màu nâu sẫm hoặc màu nâu vàng, bao bọcbên ngoài củ sắn, dày 0,2 ÷ 0,6 mm, chiếm khoảng 0,3 ÷ 0,5 trọng lượng toàn củ.Lớp vỏ gỗ cấu tạo chủ yếu là cellulose và hemicellulose, cho nên mặc dù rất mỏngnhưng cứng và bền Vỏ gỗ có nhiệm vụ bảo vệ củ sắn khỏi tác động của các yếu tốbên ngoài gây hư hỏng

Cấu tạo của củ sắn gồm 4 phần chính:

+ Vỏ thịt (còn gọi là vỏ cùi) nằm trong lớp vỏ gỗ, có màu trắng, vàng, hoặchồng tuỳ theo giống và thời gian thu hoạch, vỏ thịt dày 1,5 ÷ 6,0 mm, chiếm khoảng

5 ÷ 7% khối lượng củ sắn Trong vỏ thịt chứa khoảng 2,9 ÷ 3,2% protein, 5 ÷ 8%tinh bột, 2,7 ÷ 3,2 cellulose và là nơi tập trung nhiều nhất glucoxianogenic trong củsắn: 14,04 ÷ 21,60 mg HCN/100g, ngoài ra còn có các sắc tố và enzyme

+ Thịt sắn nằm trong lớp vỏ thịt và là phần quan trọng nhất của củ sắn,chiếm khoảng 90% khối lượng toàn củ Thịt sắn khi mới đào thì có màu trắng, mịn.Thành phần cấu tạo của thịt sắn chủ yếu là tinh bột, ngoài ra còn có một lượng nhỏ

là protein, lipit, các chất khoáng, vitamin, enzyme, khoảng 0,3% ÷ 0,5% nhựa sắn

và một lượng nhỏ glucoxianogenic Hàm lượng tinh bột trong lớp thịt sắn phân bốkhông đều, lớp thịt càng gần vỏ thịt thì hàm lượng tinh bột càng cao

+ Lõi sắn nằm dọc giữa củ sắn và chiếm khoảng 0,5% khối lượng toàn củ.Thành phần chủ yếu là cellulose, hemicellulose và một lượng glucoxianogenic:12,60 ÷ 15,80 mg% HCN

Bảng 1.1: Một số chỉ tiêu hoá học trong vỏ lụa sắn

lệ C/N tương đối cao cũng là điều kiện bất lợi cho sự phát triển của vi sinh vật

Bảng 1.2 Số lượng vi sinh vật phân giải cellulose trong mẫu vỏ sắn phân lập.

CFU/g nẫu khô (×106)

CHƯƠNG 2: CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN CÔNG NGHỆ 2.1 Chọn dây chuyền công nghệ:

Trong công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay có hai phương pháp: phươngpháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm

So sánh hai phương pháp ta thấy phương pháp nuôi cấy bề mặt có những ưuđiểm sau:

- Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, qui trình công nghệ không phức tạp

- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều

so với nuôi cấy chìm

- Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản

- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vậnhành công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém

- Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý

- Trong kĩ thuật nuôi cấy bề mặt có hai loại môi trường nuôi cấy, đó là môitrường bán rắn và môi trường lỏng Ở môi trường lỏng thì vi sinh vật sẽ phát triểntrên bề mặt dung dịch lỏng nơi phân cắt giữa pha lỏng và pha khí Khi đó các tế bào

vi sinh vật sẽ tạo thành những ván phủ kín bề mặt dung dịch lỏng Enzyme sẽ đượctổng hợp trong tế bào và thoát khỏi tế bào vào trong dung dịch nuôi cấy Do đó việcthu nhận enzyme thô trong dịch nuôi cấy cũng rất đơn giản Tuy nhiên phương phápnuôi cấy này tỏ ra không hiệu quả vì hoạt lực của enzyme thu nhận được củaphương pháp này không cao bằng nuôi cấy trên môi trường bán rắn.Một mặtphương pháp này vi sinh vật phát triển chủ yếu trên bề mặt nên hệ sử dụng môitrường nuôi cấy không cao, phương pháp này ít được dùng

Vì vậy tôi sẽ chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn vớidây chuyền công nghệ như sau:

Khoáng chất

Vỏ sắn khô

Trấu

Phối trộn W:60%

Khay

Thanh trùng khayPhân phối vào khay nuôi

Nuôi cấy 28 – 320C, 3660 giờ

Ngô

Nghiền, định lượng

Nước

Trích lyBã

Phân loại, làm sạch

Định lượng

Nghiền, định lượng

Làm sạch, định lượng

Bao góiNước

Nhân giống sản xuất

2.2 Thuyết minh dây chuyền công nghệ:

+ Cách tiến hành: Phân loại và làm sạch bằng thiết bị phân loại mảnh cókích thước khác nhau

Trong quá trình nghiền bột vỏ sắn được phân loại theo kích cỡ:

Loại 1: Đạt kích thước yêu cầu của công nghệ thì được gàu tải chuyển lênbunke định lượng và đựơc vít tải chuyển đến bộ phận phối trộn

Loại 2: Kích thước quá lớn thì được chuyển lại vào máy nghiền để tiếp tụcnghiền

2.2.1.2 Nguyên liệu trấu:

- Mục đích: Bổ sung trấu với mục đích tạo độ tơi xốp và tránh nguyên liệu bịkết dính

- Cách tiến hành: Trấu từ kho chứa được đưa đi làm sạch, sau đó được gàu tảichuyển lên bunke định lượng và từ bunke xả xuống thiết bị trộn

2.2.1.3 Nguyên liệu ngô:

Nghiền, định lượng:

- Mục đích: Ngô được nghiền và bổ sung vào nguyên liệu nhằm tạo đủ điềukiện dinh dưỡng cho mốc phát triển tốt

- Cách tiến hành: Ngô từ kho chứa được nghiền đạt kích thước cần thiết sau

đó được định lượng vào thiết bị phối trộn

2.2.2 Phối trộn:

- Mục đích: Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men sau này

- Cách tiến hành: Hỗn hợp bột sắn, trấu, nước, muối khoáng và các chất dinhduỡng cần thiết khác được định lượng và trộn đều theo tỉ lệ đã tính toán

Nước làm ẩm, phục vụ trực tiếp cho thanh trùng, đảm bảo chế độ làm ẩm choquá trình nuôi cấy, độ ẩm tối ưu là 58% ÷ 60%.

2.2.5 Nhân giống sản xuất:

T.reesei được nuôi cấy trong 4 loại môi trường khác nhau nhằm kiểm tra hìnhthái và kích thước bào tử cũng như sợi nấm đồng thời khảo sát khả năng sản xuấtcellulase

Kết quả cho thấy sinh khối khô trong môi trường A đạt đến nồng độ 14.7 g/lvào cuối giai đoạn và giảm dần sau khi thêm hỗn hợp lactose và acid lactobionicnhư là một tác nhân gây ức chế

Môi trường nuôi giống: [23]

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nhân giống

Nhân giống trên máy lắc

Môi trường trong giai đoạn này cũng là môi trường trên mốc giống được nuôitrong bình tam giác 1 lít và được đặt trên máy lắc

Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc, trích ra 10% chuyển quaphòng nhân giống để nhân giống sản xuất Quá trình nhân giống sản xuất cũng đượcthực hiện trên khay và được thực hiện trong phòng nhân giống

- Cách tiến hành:

Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được gàu tảichuyển lên bunke trung gian Từ bunke này canh trường qua cân định lượng vàđược đưa vào khay, khay chuyển vào phòng nuôi cấy được đặt trong phòng nuôi cấy

và tiến hành nuôi

Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH môi trường Đây là môitrường bán rắn nên sự thay đổi pH ở vị trí này không ảnh hưởng đến toàn bộ môitrường Độ ẩm 96% ÷ 98%

Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36 ÷ 60 giờ, trung bình thường là 42giờ.

Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặttrải qua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1:

Giai đoạn này thường kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.Trong giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng chậm

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

+ Khối môi trường còn rời rạc

+ Enzyme mới bắt đầu hình thành

Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không được

để nhiệt độ cao hơn 300C vì thời kỳ này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

+ Môi trường được kết lại khá chặt

+ Độ ẩm của môi trường giảm dần

+ Nhiệt độ của môi trường tăng nhanh có thể lên đến 400C ÷ 450C

+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá của nấm sợi + Các loại enzyme được hình thành, trong đó cellulase hình thành nhiềunhất

+ Lượng oxy trong môi trường giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giaiđoạn này cần thông khí mạnh và điều chỉnh nhiệt độ khoảng 290C ÷ 300C

Cần dừng quá trình nuôi cấy và thu nhận enzyme trong giai đoạn này Vìtrong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều và làm giảm hoạt lực của enzyme

2.2.8 Thu nhận chế phẩm:

- Mục đích: Tập trung lượng canh trường có thể thu nhận enzyme để thuậnlợi cho quá trình tiếp theo.

- Cách tiến hành: Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận chế phẩm enzymethô Tuỳ theo mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng chế phẩm ngay hoặc tiến hànhmột số bước nữa để bảo quản

2.2.9 Sấy băng tải:

- Mục đích: Sấy để làm giảm độ ẩm của chế phẩm nhờ đó có thể bảo quản và

sử dụng trong thời gian dài

- Cách tiến hành: Chế phẩm enzyme từ canh trường được chuyển lên bunkeđịnh lượng bằng gàu tải sau đó được băng tải chuyển đến máy sấy Độ ẩm cần đạtđược sau khi quá trình sấy kết thúc nhỏ hơn 10% Quá trình sấy được thực hiện bởitác nhân sấy là không khí có nhiệt độ là 400C

Mục đích của giai đoạn này là nâng cao nồng độ chất khô từ 4 6g/l tới 15

-20 g/l, cho thêm một số chất bảo quản để đưa dung dịch đạt nồng độ 35 – 40 g/l.Sau đó dịch cô đặc sẽ được đưa vào thiết bị sấy phun

CHƯƠNG 3: TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT

Số liệu ban đầu:

- Năng suất Enzyme thô đạt 18000 kg sản phẩm/ngày

- Tỷ lệ chế phẩm cho dây chuyền sản xuất sản phẩm enzyme thô là 40%

- Tỷ lệ chế phẩm cho dây chuyền sản xuất sản phẩm enzyme kỹ thuật là60%

Thành phần môi trường: CoCl2.6H2O : 0.004%

Vỏ lụa sắn: 60% , ; MgSO4.7H2O: 0,05% ; MnSO4.H2O: 0.001% Bột ngô: 20% ; KH2PO4 : 0,2% ; ZnSO4.7H2O: 0.001% Trấu: 19,6% ; CaCl2.2H2O : 0,15% ; FeSO4.7H2O: 0.006%Biểu đồ sản xuất của nhà máy

- Dây chuyền công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme Cellulase từ vỏ lụa sắntheo phương pháp bề mặt năng suất 18000kg/ngày

- Nhà máy làm việc 12 tháng/năm, 3 ca/ngày

- Các ngày nghỉ trong năm: Các ngày chủ nhật hàng tuần, các ngày lễ lớntrong năm và nghỉ 1 tuần vào tháng 8 để bảo trì máy móc, thiết bị định kỳ

Cụ thể:

+ Tết dương lịch : 1 ngày

+ Chiến thắng 30/4 : 1 ngày

+ Quốc tế lao động 1/5 : 1 ngày

+ Giỗ tổ Hùng Vương 10/3 : 1 ngày

+ Các ngày chủ nhật trong năm : 52 ngày (tương đương 365/7 = 52tuần)

Ta có được, tổng số ngày nghỉ trong năm: 74 ngày

Như vậy: Tổng số ngày làm việc là 365 – 74 = 291 ngày/năm

Tổng số ca làm việc là 291 × 3 = 873 ca/năm Mỗi ca làm việc 8 giờ

Bảng 3.1 Bảng tỉ lệ hao hụt qua các công đoạn

3.1 Cân bằng vật chất:

Công thức tính hao hụt ẩm:

Ký hiệu: Gt – Trọng lượng trước khi vào thiết bị (kg)

Gs – Trọng lượng khi ra khỏi thiết bị (kg)

Wt – Độ ẩm trước khi vào thiết bị (%)

Ws – Độ ẩm khi ra khỏi thiết bị (%)

Năng suất sản phẩm theo enzyme kĩ thuật đạt 18000kg/ngày

3.1.1.Bao gói:

G1

G

Tỉ lệ hao hụt: 0.1%

Lượng sản phẩm trước công đoạn này là:

(kg/ngày)Lượng sản phẩm hao hụt:

Độ ẩm ban đầu của chế phẩm : 60%

Độ ẩm của chế phẩm sau khi sấy : 10%

Lượng chế phẩm trước công đoạn sấy: [VII.18, tr 102, 7]

(kg/ngày)

Chọn tỷ trọng của enzyme cellulase khi sấy là 1200 (kg/m3)

Thể tích enzyme cellulase khi sấy là:

Lượng hao hụt là:

(kg/ngày) Hao hụt ẩm trong quá trình sấy:

Bao gói

Sấy

cô đặc 2 là:

41367,898 x =28957,529 (kg/ngày)Khối lượng chất khô trong sản phẩm sau cô đặc 2 là:

41367,898 – 28957,529 = 12410,369 (kg/ca)

Thể tích dung dịch đạt nồng độ 300g/ lít, hay:

C = => V = = = 41367,898 (lít/ngày )Thể tích dung dịch ở nồng độ 150g/ lít là:

V = = 82735,793 (lít/ngày)Quá trình cô đặc có thêm chất bảo quản để đưa nồng độ từ 100g/l đến 150g/l,

do thể tích không đổi nên ta có:

= = = = ( với x là khối lượng chất bảo quản)

 3x= m2  x= = 4136,789 (kg/ngày)Vậy khối lượng enzyme là : menzyme= 12410,369-4136,789= 8273,58(kg/ngày)

Dịch sau khi trích ly có C=25 g/ l đem đi cô đặc lần 1 để nồng độ lênC=100g/l Giả sử trong quá trình cô đặc lần 1 chỉ có nước bay hơi nên lượng ẩm bayhơi trong quá trình cô đặc lần 1 (thể tích dịch trước cô đặc ) được tính như sau:

Cô đặc 2: V150g/l đến V300g/l : V2 =82735,793 - 41367,898 = 41367,895 (lít/ngày)

Tổng lượng nước bay hơi là : 247545,521+41367,895 = 288913,416(lít/ngày) =288,913 (m3/ngày)

Với Dnước ở 20oC = 998kg/m3

Khối lượng nước bay hơi là: 998 x 288,913 = 288335,174 (kg/ngày)

Công đoạn này hao hụt 2% nên khối lượng sản phẩm trước cô đặc là: (288335,174 +41367,895 - 4136,789 ) x = 332210,489 (kg/ngày)Khối lượng hao hụt là:

Trích ly được 8% lượng chất khô với nồng độ là 10g/l

Khối lượng chất khô có trong dung dịch enzyme sau khi trích ly là :

mcks = 332210,489 x = 3322,105 (kg/ngày)Khối lượng chất khô trước trích ly là:

mckt =3322,105 x = 42373,788 (kg/ngày) Hao hụt chất khô: 3322,105 -3322,105 = 39051,683 (kg/ngày)

Sản phẩm trước trích ly đạt độ ẩm 60% có khối lượng là:

42373,788 x = 70622,98 (kg/ngày)Khối lượng dịch sau trích ly là 332210,489 (kg/ngày)

Nghiền mịn

Thu nhận canh trường

(kg/ngày)

3.1.9 Gieo giống

G9

Tỷ lệ hao hụt 0,1% G8

Giả thuyết lượng giống cấy bằng 10% lượng môi trường đưa vào nuôi cấy

Ta có: Ggiống = 10% Gmôi trường

Khối lượng môi trường trước khi cấy giống là:

Vậy:

Khối lượng giống theo yêu cầu:

Lượng giống cấp II bằng 10% giống sản xuất và tỷ lệ hao hụt khi cấy giốngcấp II để nuôi cấy lên giống sản xuất là 0,1% Vậy lượng giống cấp II cần có là:Lượng giống cấp I bằng 10% giống cấp II và tỷ lệ hao hụt khi cấy giống cấp I

để nuôi cấy lên giống cấp II là 0,1% Vậy lượng giống cấp I cần có là:

Vậy khối lượng môi trường và giống trong lên men bề mặt:

G9 + Ggiống sản xuất = + = 73229,359 (kg/ngày)Lượng hao hụt giống và môi trường: