Nhân nhanh và lai tạo giống động vật

Sau đó khối blacktocyst này có thể được: + Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm nhằm để lấy tế bào gốc, qua đó có thể tạo ra các bản tế bào gốc phôi mang gen giống với cơ thể cho tế bào thân

BÀI 1: NHÂN NHANH VÀ LAI TẠO GIỐNG ĐỘNG VẬT

1 Nhân bản vô tính bằng kỹ thuật chuyển nhân

1.1 Nhân bản vô tính là gì?

Nhân bản vô tính động vật hay tạo dòng vô tính là thực hiện các kỹ thuật

để tạo một hay một số cá thể động vật giống nhau về cấu trúc di truyền, không qua quá trình thụ tinh

1.2 Cơ sở khoa học

Tế bào động vật có tính toàn năng từ đó từ tế bào soma cũng có thể tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh đồng thời tế bào động vật có thể nuôi cấy trên các loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào

1.3 Kỹ thuật trong nhân bản vô tính

Động vật (cloning) hiện nay dùng một trong 3 kỹ thuật sau:

- Phân tách các tế bào blastomere (blastomere separation)

- Chia cắt phôi túi (blastocyst division)

- Kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân (somatic cell nuclear transfer)

1.4 Nhân bản phôi bằng phân tách các tế bào blastomere

(blastomere separation)

 Tóm tắt quy trình:

 Tạo phôi: chọn phôi ở giai đoạn sớm 2-4 hay 8 tế bào

 Tách rời các tế bào: giai đoạn này các tế bào lien kết yếu nên dung

enzyme tripsin hoặc lắc nhẹ trong môi trường ổn nhiệt và không có ion Ca2+, Mg2+

 Đóng gói tế bào: mỗi tế bào phôi được bọc trong màng zona

 Nuôi cấy phôi in vitro đến giai đoạn plastocyst và cấy truyền vào mẹ nhận phôi đã gây đồng pha

1.5 Nhân bản phôi bằng chia cắt phôi túi (blastocyst division)

Đầu tiên trứng và tinh trùng cũng được thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành phôi Nhưng khác với kỹ thuật phân tách blastomere, phôi này được nuôi cấy

cho phân chia tới khi tạo thành blastocyst Lúc này người chia cắt blastocyst

cũng mang bộ gen lưỡng bội có nguồn gốc từ hai bố- mẹ

1.6 Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào thân (Nuclear Transplanation):

 Tóm tắt quy trình nhân bản bằng phương pháp chuyển nhân:

 Lấy tế bào trứng( nhân đơn bội) của cơ thể “mẹ”, hút bỏ nhân đơn bội

 Lấy tế bào thân trưởng thành (máu, da…) của các cá thể nhân bản, hút lấy nhân( 2n) tế bào soma được lựa chon để lấy nhân, thường là các tế bào ở giai đoạn tĩnh (G0) trong chu kỳ tế bào

 Đưa nhân đơn bội vào trong trứng đã hút bỏ nhân nói trên ( bằng tiêm trực tiếp hoặc bằng kích thích xung điện)

 Dung hợp tế bào: thực hiện các kỹ thuật xung điện hoặc hóa chất để dung hợp tế bào Kích thích để hợp tử tiếp tục phát triển và phân chia tạo nên khối blastocyst

Sau đó khối blacktocyst này có thể được:

+ Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm nhằm để lấy tế bào gốc, qua

đó có thể tạo ra các bản tế bào gốc phôi mang gen giống với cơ thể cho tế bào thân

+ Hoặc đem cấy vào tử cung của một “mẹ nuôi” để cho phát triển hai, qua đó có thể tạo nên một “ bản sao” giống hệt cơ thể cho nhân tế bào thân( mục đích nhân bản vô tính động vật/ người)

o Những thành tựu đạt được:

 Ở thế giới:

2004: nhân bản bò bằng kỹ thuật chuyển nhân chuỗi: các nhà khoa học Oxtraylia đã nhân bản một con bò bằng kỹ thuật chuyển nhân chuỗi tên là Brandy, con bò giống Holstein- Fresian vào tháng 12/2004

Ngày 12/7/2017, Giám đốc viện Nghiên cứu Hoàng gia Iran (RRI), Tiến sĩ Mohammed Hossein Nasr e Isfahani cho biết con bò đực được nhân bản vô tính có tên Bonyana, chào đời ngày 11/7 tại thành phố Isfahan ở miền Trung Iran

Các nhà khoa học Nhật Bản đã cho ra đời 26 thế hệ nhân bản vô tính của một con chuột duy nhất và việc này có thể mở đường cho việc vô tính hàng loạt các loại gia cầm có giá trị Theo nhà nghiên cứu Teruhiko

Wakayama ở Trung tâm phát triển sinh học Riken, nhóm hiện đã cho ra đời

598 con chuột với bản sao giống hệt con chuột "mẫu" trong thí nghiệm đã kéo dài tới 7 năm

 Ở Việt Nam:

27/6/2005: Việt Nam nhân bản được phôi nang sao la Tuy các phôi nang này dừng phân chia sau 10-12 ngày tuổi vì chưa có tử cung phù hợp để nuôi cấy tiếp nhưng kết quả đã chứng tỏ thành công ban đầu trong công nghệ nhân bản nước ta

Viện Công nghệ sinh học cho biết đã nhân bản được giống lợn mini hoang dã và còn nhân bản vô tính trên các loài khỉ đuôi dài và khỉ vàng

2 Công nghệ cấy truyền phôi

2.1 Khái niệm

"Cấy truyền phôi" (CTP) là "một quá trình đưa phôi tạo ra từ cá thể cái này (cái cho phôi) vào cá thể cái khác (cái nhận phôi) phôi vẫn sống, phát triển bình thường trên cơ sở trạng thái sinh lý sinh dục của cái nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh

lý sinh dục của cái cho phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi ( gọi sự phù hợp này là đồng pha)"

2.2 Nguồn gốc cấy truyền phôi

Lần đầu tiên thành công của CTP đã diễn ra tại Anh vào những năm 1890 bởi một đồng nghiệp tên là Walter Heap, các đối tượng của ông là thỏ Mặc dù đó là một thành công,nhưng phôi chuyển đã không được sử dụng thương mại cho đến khi FSH hooc môn, đó là viết tắt của Follicle Stimulating Hormone, xảy ra vào những năm 1950 Lúc đầu, kỹ thuật duy nhất là phẫu thuật để cả hai nhú ra và cấy ghép phôi

2.3 Lợi ích của cấy truyền phôi

Phổ biến và nhân nhanh các giống tốt, quí, hiếm ra thực tế sản

Nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh công tác giông trên cơ sở tăng nhanh tiến

bộ di truyền hàng năm

Nâng cao khả năng sinh sản, các sản phẩm thịt, sữa trong chăn nuôi

Giúp cho con người dễ dàng, thuận lợi trong việc xuất nhập, vận chuyển, trao đổi

con giống giữa các nước, các vùng, các địa phương đã được thương mại hóa

Bảo tồn con giống dưới dạng trứng, phôi, tinh trùng nhằm giữ gìn vật liệu di

truyền ( phương pháp ex - situation)

Hạn chế một số dịch bệnh và nâng cao khả năng chống chịu bệnh, khả năng thích

nghi cho con vật ở môi trường mới, cụ thể:

Nếu phôi được đem đến môi trường mới để cấy truyền, mẹ nhận phôi trong thời gian mang thai đã tạo cho con kháng thể chống lại một số bệnh, và khi ra

đời ngay từ đầu con vật dễ dàng thích ứng với môi trường xung quanh

Làm cơ sở để thúc đẩy nhanh việc nghiên cứu và phát triển một số ngành khoa

Hiện nay con người đã chế tạo thành công một số hormon sinh dục như: FSL,

estrogen progesterone, Do đó có thể điều hòa chu kỳ sinh dục nhân tạo, các quá

trình sinh lý, sinh sản của gia súc Nghiên cứu sản xuất những dụng cụ thu phôi và

xây dựng được những quy trình thu định giá và phân loại phôi

Tạo ra được môi trường nuôi cấy trứng và hợp tử ở ngoài cơ thể gia súc và phương

pháp bảo tồn phôi đông lạnh

2.5 Qui trình công nghệ cấy truyền phôi:

Bước 1: Chọn vật cho phôi

Bước 2: Chọn vật nhận phôi

Bước 3: Tạo động dục đồng pha giữa động vật cho phôi và động vật nhận phôi

bằng cách sử dụng horemone sinh dục cùng 1 lúc cho cả 2 đối tượng

Bước 4: Gây siêu bài noãn ở động vật cho phôi

Bước 5: Gây động dục cho động vật nhận phôi

Bước 6: Thu hoạch phôi

Bước 7: Cấy truyền phôi

2.6 Bảo quản phôi

2.6.1 Thế nào là đông lạnh phôi?

Đông lạnh phôi là phương pháp trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cực thấp -196 độ C trong Nitơ lỏng để làm ngưng hoàn toàn các phản ứng Enzym nội bào, hô hấp tế bào chuyển hóa và phát triển lưu giữ phôi trong thời gian rất dài mà khi rã đông những phôi này vẫn có thể phát triển bình thường

2.6.2 Các bước tiến hành bảo quản và đông lạnh phôi

Chọn phôi

Phôi được chọn để giữ lại là những phôi có chất lượng cao nhất để có thể sống sót

và phát triển tốt nhất sau khi giải đông

Chất bảo quản

Glixerol, etilenglicol, polyvinyl pirolydine(PVP), DMSO và sacrose là các chất thường được sử dụng bổ sung các chất bảo vệ chống lại sự đông lạnh phôi

Dụng cụ chứa phôi đông lạnh

Phôi có thể được đựng trong các ống nhựa nhỏ ống thuốc tiêm hoặc các cong Rạ dùng riêng cho việc đông lạnh tinh trùng 0.25 ml hay 20.5 ml

Tốc độ làm lạnh

Sau tất cả các bước, dựa vào những nguyên tắc trình bày trong phần trên những phác đồ nhằm trữ phôi sẽ được đưa ra và hoàn chỉnh bằng hai loại phác đồ được sử dụng rộng rãi hiện nay là áp dụng cho phôi giai đoạn sớm (trước phôi Nang)và cho giai đoạn muộn (phôi Nang)

2.6.3 Những điều cần lưu ý trong kỹ thuật đông lạnh phôi

Tạo mầm tinh thể: đây là bướcquyết định thành công của kỹ thuật làm lạnh chậm Mặc dù hiện nay, các máy làm lạnh đều đã có tùy chọn tạo mầm tinh thể tự động nhưng độ tin cậy vẫn không thể bằng thao tác bằng tay có kiểm soát Vì thế bạn nên lưu ý điểm này khi có ý định đi trữ lạnh phôi

Thao tác thực hiện và thời gian lưu trữ: theo các nghiên cứu cho thấy chỉ 40s ở nhiệt độ phòng đã có thể ảnh hưởng đến chất lượng của phôi đang được trữ lạnh

2.7 Thành tựu của công nghệ phôi

● Trên thế giới:

Một số mốc lịch sử về quá trình phát triển của công nghệ cấy truyền phôi:

- 1890 : thí nghiệm đầu tiên về CTP thành công trên thỏ bởi Walter Heap Sau đó thành công cho dê (1932), cho chuột cống (1933), cho cừu (1934), cho lợn (1951), cho bê (1951)

- 1959: Từ một phôi thỏ Seidel đã nhân lên thành 4 phôi

- 1970: Thành công trong bảo quản phôi đông lạnh, làm cơ sở cho CTP đông lạnh trên bò ( 1972)

- 1978: Em bé đầu tiên ra đời từ thụ tinh trong ống nghiệm và CTP

- 1983: Nghé đầu tiên ra đời bằng CTP tại Mỹ

- 1984: Cấy phôi sau khi chia hai thành công trên bò

- 1986: ở cừu đã thành công khi chia phôi thành 4 ở giai đoạn 8 phôi bào( sinh 4 đơn hợp tử qua tách phôi bào) Ở bò sinh 3 và ở ngựa, lợn, dê sinh 2

- 1987: Cô bé sinh ra do cấy ghép gen tăng trưởng nhanh

- 1991: Nghé đầu tiên trên thế giới ra đời bằng CTP phôi trâu đông lạnh

- 1992: Bằng kỹ thuật Cloning từ một phôi bò đã cho ra 5 phôi

- 1997: Một con cừu ra đời và trưởng thành từ nhân tế bào tuyến vú của một cừu cái 6 năm tuổi

- 1999: Hội nghị quốc tế lần thứ nhất về CTP được tổ chức tại Mỹ Vào 1974tổ chức cấy phôi quốc tế được thành lập Năm 1975 hội nghị lần thứ nhất của

26-5-tổ chức này được tiến hành, từ đó tới nay hội nghị diễn ra hàng năm ( gắn liền với các vấn đề sinh sản, giới tính, chuyển gen, …ở vật nuôi) Khi thành lập ( 1974) hội nghị cấy truyền phôi chỉ có 24 thành viên, sau 10 năm đã có 800 thành viên của 35 nước Trang thiết bị, hoá chất, dụng cụ chuyên dùng và kỹ thuật của CTP đã được thương mại hoá Cơ sở thương mại đầu tiên trên thế giới về CTP được thành lập tại Alberta ( Canada), sau đó đã có thêm 20 công ty khác ra đời

sự tham gia.của Trường đại học nông nghiệp I, Viện quân y 103, Viện chăn nuôi và một số cơ quan khác

Những con thỏ đầu tiên ra đời bằng công nghệ cấy truyền phôi vào năm 1979 Năm 1986, con bê đầu tiên ở nước ta cũng được ra đời từ công nghệ này

Năm 1994, bò sinh đôi trong đó có một bê do trứng rụng tự nhiên trong chu kỳ động dục và một bê do cấy truyền phôi Đây là trường hợp đầu tiên sinh ra ở nước

ta do cán bộ Viện chăn nuôi thực hiện cấy phôi

Năm 1996-1997, 150 phôi đông lạnh cùng với 2 chuyên gia Newzealand đã đến Việt Nam để tiến hành thí nghiệm cấy truyền phôi bò sữa trên đàn bò miền nam và

Hà nội Kết quả rất khả quan, 40-45% bò cấy phôi đông lạnh đã có chửa Đến nay, những bê được sinh ra từ công nghệ cấy truyển phôi sinh trưởng, phát triển rất tốt, sinh sản bình thường và cho sữa vượt hơn toàn đàn 20-30%

2.8 Tương lai của công nghệ cấy truyền phôi

Phạm vi của sự phát triển trong lĩnh vực chuyển phôi rất lớn và thú vị Việc thực hiện thương mại của kỹ thuật rất có thể sẽ có tác động lớn hơn đến nghiên cứu Công nghệ hiện nay cho thấy một xu hướng cải tiến và sàng lọc

3 Lai giống vật nuôi

3.1 Khái niệm

Trong sinh học, lai giống (hybrid) là sự kết hợp các phẩm chất của hai sinh vật thuộc hai giống, hoặc loài, chi thực vật hoặc động vật khác nhau, thông qua sinh sản hữu tính Con lai của hai giống, loài khác nhau không phải lúc nào tính trạng cũng mang sự hòa hợp về di truyền (Blending inheritance) giữa bố mẹ của chúng, nhưng cho thấy ưu thế lai, chẳng hạn như có sức sống cao hơn, sinh trưởng nhanh,

phát triển mạnh, chống chịu bệnh tật tốt, năng suất cao, thích nghi tốt

3.2 Động lực lai chéo

Từ thời xa xưa con người đã thực hiện pháp lai xa giữa hai loài ngựa và lừa tạo ra con lai là la, không có khả năng sinh sản Điều đó chứng tỏ sự quan tâm đến việc tìm hiểu và vận dụng các quy luật về di truyền, lại tạo, giao phối nhầm tạo ra giống vật nuôi có ưu thế về năng suất, khả năng chịu đựng hay đáp ứng các yêu cầu trong sản xuất

Ưu thế lai là một trong những lý do để áp dụng lai giống của giống hoặc dây

chuyền Những ảnh hưởng của sự thống trị được quan sát thấy ở tất cả các loài và giữa các loài có thể kết luận rằng ước tính cho ưu thế lai cao hơn đối với các đặc điểm có tỷ lệ di truyền thấp và thấp hơn đối với những đặc điểm có tính di truyền cao Ưu thế lai thường rất quan trọng đối với khả năng sinh sản và đặc điểm sức

khoẻ mà không thể cải thiện một cách dễ dàng nhờ chọn lọc giống do tính di truyền thấp Do đó, việc cải thiện sức khoẻ và các đặc điểm sinh sản thường là một động lực quan trọng để áp dụng lai giống Lý do thứ hai để lai tạo là để khai thác sự bổ sung của giống hoặc đường: sự kết hợp của các đặc tính của hai giống hoặc dây chuyền là thuận lợi Lý do thứ ba là lai giống kết hợp các đặc tính không thể dễ dàng được cải thiện đồng thời trong một giống chó Lý do cuối cùng để lai tạo giống là việc bảo vệ sự cải tiến di truyền trong các dòng lựa chọn của các công ty thương mại

3.3 Phương pháp lai tạo giống

Phương pháp lai là phương pháp cho giao phối những cá thể thuộc các dòng khác nhau trong cùng một giống hoặc các giống khác nhau nhằm phát huy ưu thế lai cho đời sau (đời con) là cơ sở để nâng cao năng suất và sức sống của vật nuôi Thông qua phương pháp lai sẽ tạo ra tổ hợp của các yếu tố di truyền khác nhau

3.3.1 Lai kinh tế

Lai kinh tế (Commercial crossing), còn gọi là lai công nghiệp, là phương

pháp lai giữa hai cơ thể (đực và cái) thuộc hai, ba, bốn dòng, hoặc giống, hoặc loài khác nhau để tạo con lai thương phẩm; con lai này không sử dụng làm giống mà chỉ

để nuôi lấy sản phẩm thịt, trứng, sữa… Lai kinh tế được gọi là lai công nghiệp vì chỉ dùng con lai F1 làm sản phẩm, sản phẩm có thể sản xuất nhanh, hàng loạt, có chất lượng trong một thời gian tương đối ngắn

Trong công tác giống, các giống mới thường được hình thành bằng con đường lai tạo vì những giống gốc ban đầu ít nhiều có pha máu giữa nhiều giống Việc lai tạo

đã có ảnh hưởng tốt đến sản lượng và chất lượng của sản phẩm (Trần Đình Miên và Nguyễn Văn Thiện, 1995)

Bên cạnh đó, mục đích của lai tạo còn nhằm sử dụng hiện tượng sinh học quan trọng đó là ưu thế lai (Heteorosis) làm cho sức sống của con vật, sức miễn kháng đối với bệnh tật và các tính trạng kinh tế được nâng cao, đồng thời thông qua các chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật của tổ hợp lai, ưu thế lai làm căn cứ cho việc chọn lọc giống gia súc (Lê Đình Lương và Phan Cự Nhân, 1994)

Trong chăn nuôi gia cầm, lai kinh tế có hai phương pháp lai là lai đơn và lai kép

3.3.2 Lai luân chuyển

Lai luân chuyển (Rotation crossing) là phương pháp lai sử dụng nhiều đực giống thuộc các giống khác nhau để cho giao phối lần lượt với những con cái lai qua các thế hệ cho tới khi tạo được con lai mang những tính trạng mong muốn

3.3.3 Lai cải tạo

Lai cải tạo (Grading up) là phương pháp sử dụng một giống cao sản, tốt hơn nhiều mặt, cho giao phối với một giống kém hơn để cải tạo giống sau

Ở nước ta thường dùng những con đực tốt nhất của giống ngoại cho phối với những con cái tốt nhất của giống địa phương Con đực giống cao sản được sử dụng liên tiếp qua nhiều đời lai Sau 4 – 5 thế hệ, giống địa phương đã cải tạo sẽ được gần như giống ngoại thuần chủng, chẳng hạn lợn được tăng tầm vóc, tăng tỉ lệ nạc trong thịt Về mặt di truyền học, phương pháp lai cải tiến giống ban đầu làm tăng tỉ

lệ thể dị hợp, sau đó tăng dần tỉ lệ thể đồng hợp

3.3.4 Lai gây thành

Lai gây thành (Crossing for creating new breeds) là một phương pháp lai sử dụng nhiều giống tốt phối hợp lại để tạo nên giống mới có các tính trạng tốt hơn các giống gốc tham gia

Khi cần tạo ra giống mới người ta thường áp dụng phương pháp này, thường dùng nhiều giống, mỗi giống có những đặc điểm riêng

3.3.5 Lai cải tiến

Lai cải tiến dùng trong trường hợp một dòng, một giống vịt về cơ bản đã đạt được những tiêu chuẩn chính nhưng còn một vài đặc điểm cần khắc phục

Ví dụ: Vịt Khaki Campbell có sản lượng trứng khá cao nhưng lại có lông màu Khaki, nhưng người tiêu dùng có mặc cảm khi dùng trứng vịt lộn Do vậy, có thể dùng vịt CV2000 Layer để cải tiến đặc điểm này

3.3.6 Hồi giao

Hồi giao, còn gọi là phản giao, lai ngược, lai trở lại (Back crossing, criss crossing)

là một phương pháp lai giống bằng cách cho con lai giao phối trở lại với một trong các dạng của giống gốc

Ví dụ: lấy con lai của hai giống A và B cho giao phối với đực của giống A hoặc đực của giống B

Hồi giao lặp lại (Repeated backcross) là sự hồi giao thực hiện lại sau một số thế

hệ nhất định

3.3.7 Lai đơn và lai kép

Lai đơn là một phương pháp lai sử dụng trong phạm vi hai giống, cùng cặp tính trạng

Lai kép là phương pháp lai được sử dụng trong phạm vi nhiều giống, nhiều cặp tính trạng (từ 2 giống với 2 cặp tính trạng trở lên)

Tổ hợp lai tối ưu là khả năng do lai giữa những cá thể, những dòng, những giống nhất định để có được kết quả cao hơn so với những cặp lai khác

3.3.8 Giao dòng

Giao dòng (Cross - crossing), còn gọi là lai dòng, là cho giao phối hai dòng với nhau để tạo nên dòng mới, có các tính trạng bổ sung, phối hợp từ hai dòng gốc Các phương pháp giao dòng gồm có:

Dùng hai dòng đồng huyết rất gần khác nhau trong cùng giống giao phối với nhau (Inbreeding-crossing)

Dùng đực đồng huyết rất gần giao phối với cái không đồng huyết cùng giống (Top

Những khó khăn trong lai xa :

Ở động vật : + Do chu kì sinh sản khác nhau không phù hợp giữa các loài

+ Bộ máy sinh dục không phù hợp, tinh trùng khác loài chết trong đường sinh dục cái

*Khó khăn chủ yếu : con lai bất thụ

Ứng dụng của phương pháp lai xa :

- Lai xa có ý nghĩa quan trọng trong chọn giống ở cây trồng sinh sản sinh dưỡng vì không cần giải quyết vấn đề bất thụ

- Trong chọn giống vật nuôi, lai xa bị hạn chế vì đa số những động vật có hệ thần

kinh phát triển, kiễm soát tập tính giao phối và dễ bị rối loạn NST giới tính

thường Dùng các hoocmon phù hợp để kích thích tế bào lai phát triển , tạo thành

cơ thể lai Người ta còn dùng keo hữu cơ pilieylen glycol hoặc luồng xung điện cao

áp để tăng tỉ lệ kết dính thành tế bào lai

KẾT LUẬN

Kỹ thuật nhân nhanh và lai tạo giống động vật được ra đời từ sớm nhưng hoàn thiện muộn hơn những lĩnh vực khác của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học động vật nói riêng Điều này bắt nguồn từ lý do cơ bản là tính toàn năng của tế bào động vật và là do vấn đề hiện nay khoa học vẫn chưa tìm ra những phương thức hiệu quả để kiểm soát quá trình biệt hóa của tế bào gốc phôi nuôi trong ống nghiệm để thành tế bào tốt chứ không phải tế bào ác

Tuy nhiên không thể phũ nhận kỹ thuật nhân nhanh và lai tạo giống động vật đã mở

ra nhiều hướng ứng dụng quan trọng trong đời sống của con người: Nhân bản các nguồn gen quý hiếm, tạo các thế hệ lai mang phẩm chất vượt trội hơn so với bố mẹ,

là tiền đề cho việc tạo ra các dòng mới hữu thụ tăng đa dạng sinh học hay các vấn

đề điều trị các bệnh nan y, thay thế các cơ quan, bộ phận của cơ thể bị tổn thương hoặc thậm chí đã có thể tạo được cơ thể hoàn chỉnh bằng phương pháp nhân bản vô tính Tuy nhiên, ngoài các vấn đề về khoa học kỹ thuật thì các phương pháp nhân nhanh và lai tạo vẫn còn gặp những khác về đạo đức sinh học Xong nếu hoàn thiện những bước đi chính xác cho các kỹ thuật nêu trên thì ắt hẳn đó sẽ là bước tiến vĩ đại của nhanh loại

BÀI 2: THỤ TINH NHÂN TẠO

khái niệm: Thụ tinh nhân tạo (Intrauterine insemination - IUI), còn gọi là phối

giống nhân tạo, là một phương pháp hỗ trợ sinh sản, thông qua một số biện pháp kỹ thuật, con người lấy tinh trùng từ con đực để pha chế, bảo quản và bơm vào đường sinh dục (tử cung) của con cái

Mục đích:

-Đối với động vật, nhằm nâng cao khả năng sinh sản của gia súc và tăng tốc độ cải thiện tiềm năng di truyền của gia súc, do đó góp phần đáng kể gia tăng sản phẩm chăn nuôi

-Đối với con người,góp phần tăng khả năng mang thai trong quá trình điều trị ở những cặp vợ chồng vô sinh,hiếm muộn

Lịch sử:

Từ thế kỷ thứ 17, thụ tinh nhân tạo mới được nghiên cứu và thực nghiệm rộng rãi trên nhiều đối tượng: I.I Ivanov (Nga), L Spallanzani (Italia), Bibbiena là những người đầu tiên thí nghiệm thụ tinh nhân tạo trên tằm.Năm 1898 Heape, nhà bác học người Anh đã phát hiện ra chu kỳ sinh dục ở gia súc, đây là nền tảng khoa học cho

kỹ thuật thụ tinh nhân tạo

Ở Việt Nam,kỹ thuật thụ tinh nhân tạo trên vật nuôi được ứng dụng đầu tiên vào năm 1957 tại Học viện Nông - Lâm, nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam Năm

1958, thử nghiệm lần đầu trên lợn tại trại An Khánh (Hà Tây), đầu những năn1960

áp dụng thụ tinh nhân tạo trên bò

So sánh thụ tinh nhân tạo (IUI) và thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

Giống nhau:

Thụ tinh nhân tạo và thu tinh trong ống nghiệm đều là các phương pháp hỗ trợ sinh sản an toàn, tốt nhất, đem lại cơ hội thụ thai cao hơn cho những cặp vợ chồng vô sinh hiếm muộn đường con cái.Tuy nhiên, thông thường trong quá trình điều trị vô sinh hiếm muộn các bác sỹ căn cứ vào điều kiện sức khỏe, hoàn cảnh của bệnh nhân để áp dụng các phương pháp phù hợp

Khác nhau:

Thụ tinh nhân tạo (IUI) Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

Tinh trùng được lọc rửa, lựa chọn

Quá trình thụ tinh nhân tạo thành phôi

thai diễn ra trong cơ thể nữ giới, phôi

được tạo thành sẽ di chuyển xuống

buồng tử cung để làm tổ

Quá trình thụ tinh xảy ra hoàn toàn trong ống nghiệm Bên ngoài cơ thể con người, sau khi tạo thành phôi mới cấy vào buồng tử cung

Điều kiện để có thể áp dụng phương

pháp này đó là tinh trùng của nam giới

vẫn trong giới hạn có thể thực hiện

được, nữ giới có buồng tử cung,

buồng trứng và ít nhất một vòi trứng

hoạt động bình thường,

Phương pháp này được áp dụng cho mọi đối tượng vô sinh khi tinh trùng đáp ứng yêu cầu giới hạn cho phép, nữ giới có buồng trứng và tử cung hoạt động bình thường Những trường hợp vô sinh do tắt nghẽn buồng trứng vẫn có thể áp dụng

ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH NHÂN TẠO

Ưu:Giúp giảm thiểu các yếu tố cản trở quá trình thụ tinh tự nhiên như: Cổ tử cung

bất thường, rối loạn phóng noãn, lạc nội mạc tử cung, kháng thể tinh trùng nhẹ,xuất tinh ngược dòng, tinh trùng yếu,xuất tinh ngược dòng, tinh trùng yếu Đơn giản, dễ thực hiện Chi phí thấp Tỉ lệ thành công cao Tránh được những bệnh lây lan qua đường tình dục Chất lượng tinh dịch được kiểm tra kĩ càng trước khi thụ tinh

Nhược:Nguy cơ nhiễm trùng cổ tử cung, Nguy cơ đa thai, Nguy cơ mang thai

ngoài tử cung, Nguy cơ phát triển buồng trứng quá kích, Tỉ lệ thành công tỉ lệ

nghịch với độ tuổi, những ca thụ tinh nhân tạo dễ bị sinh non và sảy thai hơn so với những người mang thai đơn

.THỤ TINH NHÂN TẠO TRONG CHĂN NUÔI

Khái quát:

Trong kỹ thuật này,người ta đưa tinh trùng của con đực vào thân tử cung con cái với dụng cụ thích hợp, trong thời gian thích hợp với kỹ thuật thích hợp, tinh trùng chắc chắn sẽ nhanh chóng đến thụ tinh với trứng

Lợi ích và hạn chế

-lợi ích: Tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền giống, lai tạo giống.Giảm số lượng

đực giống cần nuôi từ đó tiết kiệm thức ăn, chuồng trại, công lao động, tăng năng suất lao động, hạ giá thành sản phẩm.Việc dùng dụng cụ chuyên dụng được kiểm tra chặt chẽ nên tránh được sự lây lan của bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng thông qua đường sinh dục

-Hạn chế: Trang thiết bị và vốn ban đầu đòi hỏi cao hơn, tốn kém hơn Thụ tinh nhân tạo sẽ là con dao 2 lưỡi nếu như công tác thú y kém.Do làm giảm số lượng đục giống từ đó làm đơn điệu hóa sự biến dị di truyền của đời sau

Quy trình chung của kỹ thuật lấy tinh gia súc

Các phương pháp khai thác tinh dịch : Phương pháp hải miên, Phương pháp âm đạo , Phương pháp dùng túi , Phương pháp cơ giới (Massage), Phương pháp dùng điện, Phương pháp dùng âm đạo giả (AĐG)

-Phương pháp lấy tinh bằng AĐG

Khi dùng đổ nước nóng có nhiệt độ 50 – 600C tùy theo mùa vào van trên vỏ AĐG sao cho nhiệt độ trong lòng AĐG thích hợp với từng loài đực giống

Lượng nước nóng đổ đủ vào xoang vỏ - ruột AĐG khác nhau tùy từng loài gia súc, tuy nhiên yêu cầu chung là lượng nước chiếm 2/3 thể tích xoang ADG

- Bơm hơi vào xoang AĐG với áp lực thích hợp

- Bôi trơn lòng AĐG bằng vaselin đã tiêu độc hoặc dùng dung dịch bôi trơn Chiều dài bôi trơn trong lòng AĐG từ 1/3 – 1/2

Giá nhảy: Với trâu, bò, ngựa, dê, cừu, phải có giá nhảy thích hợp để cố định con

vật làm giá Giá nhảy có thể làm bằng sắt hoặc gỗ hoặc những con cái dơn thuần

Huấn luyện đực giống nhảy giá: Thành lập cho gia súc đực một phản xạ có điều kiện về nhảy giá và thường xuyên củng cố phản xạ này

Chế độ lấy tinh:Để thu được số lượng và chất lượng tinh dịch cao nhất, kinh tế nhất

cần có chế độ lấy tinh thích hợp Nếu lấy tinh mau quá sẽ thu được tinh dịch với số lượng và chất lượng thấp Kéo dài chế độ này có thể dẫn tới hiện tượng bệnh lý sinh dục, thậm chí bị liệt.Nếu lấy tinh quá thưa, không những giảm hiệu suất sinh sản của đực tốt, giảm hiệu quả kinh tế mà tinh trùng thu được có tỷ lệ kỳ hình cao

Pha loãng, bảo tồn, vận chuyển tinh dịch

-Pha loãng tinh dịch: Tăng thể tích tinh dịch Kéo dài thời gian sống của tinh trùng

ở ngoài cơ thể gia súc

-Bảo tồn tinh dịch: Bảo tồn ở nhiệt độ không khí, Bảo quản ở nhiệt độ lạnh

THỤ TINH NHÂN TẠO TRÊN NGƯỜI

Tổng quan:

Trên người, thụ tinh nhân tạo chủ yếu nhằm mục đích hỗ trợ sinh sản cho những cặp vợ chồng hiếm muộn, vô sinh, vì lý do nào đó mà tinh trùng không thể thụ tinh cho trứng bằng phương pháp tự nhiên như: tinh trùng người chồng yếu, rối loạn phóng noãn, lạc nội mạc tử cung, yếu tố cổ tử cung, Để thực hiện được thụ tinh nhân tạo, người phụ nữ phải có ít nhất một vòi dẫn trứng không bị tắt

Quy trình thụ tinh nhân tạo:

Thủ thuật thực hiện bằng cách đưa một catheter rất nhỏ, mềm, mảnh đi qua cổ tử cung và bơm tinh trùng đã lọc rửa vào buồng tử cung- Qui trình nhanh, đặt mỏ vịt

và đưa catheter mất 1-1,5 phút Nếu khó đặt phải dùng cặp cổ tử cung để đặt Catheter và khoảng 5-6 phút sau mới rút catheter

-Đối với nam giới:

Lấy mẫu tinh dịch:Người chồng kiêng quan hệ tình dục trong thời gian từ 02 đến 07

ngày;Cần chuẩn bị trước các dụng cụ dùng để xử lý mẫu tinh trùng, mỗi người một

bộ dụng cụ riêng có ghi tên vợ và chồng hoặc đánh mã số; Lấy tinh dịch bằng phương pháp thủ dâm, rửa tay và bộ phận sinh dục sạch trước khi lấy mẫu

Lọc rửa tinh trùng:Để tinh dịch ly giải hoàn toàn trong tủ ấm 37°C hoặc nhiệt độ

phòng, trung bình 30 phút; Đánh giá các chỉ số tinh dịch đồ: thể tích, thời gian ly giải, pH, đếm mật độ tinh trùng

-Đối với nữ giới:thực hiện kỹ thuật bơm tinh trùng vào buồng tử cung

a) Thời điểm bơm: một lần vào 36 giờ hoặc hai lần vào 24 giờ và 48 giờ sau mũi tiêm hCG:

b) Người phụ nữ nằm tư thế phụ khoa, trải săng vô trùng vùng bụng và hai đùi; c) Lau âm hộ bằng nước muối sinh lý;

d) Đặt mỏ vịt, bộc lộ cổ tử cung;

đ) Lau sạch âm đạo và cổ tử cung bằng nước muối sinh lý, lau lại bằng gạc khô; e) Hút mẫu tinh trùng đã lọc rửa vào bơm tiêm đã được gắn catheter;

g) Luồn nhẹ catheter khi vừa qua lỗ trong cổ tử cung thì dừng lại;

h) Bơm từ từ tinh trùng vào buồng tử cung;

i) Rút nhẹ nhàng catheter ra khỏi buồng tử cung;

k) Tháo mỏ vịt và cho bệnh nhân nằm nghỉ 30 phút;

l) Hỗ trợ hoàng thể: sau bơm tinh trùng vào buồng tử cung dùng progesteron hỗ trợ pha hoàng thể;

m) Đánh giá có thai: xét nghiệm thai nghén 14 ngày sau bơm tinh trùng vào buồng

tử cung

Trong khoảng phóng noãn 6h, nếu là yếu tố Nam giới, một số bác sĩ tin rằng sau phóng noãn là tốt nhất, mặt khác cơ hội để thành công cao là tinh trùng phải chờ noãn Khi thời điểm trên cơ sở tiêm hCG, IUI thường được tiến hành trong khoảng 24-48h sau Nếu làm 1 lần thì sau 36h, nếu bơm 2 lần thì 24 và 48h Một số báo cáo nêu lên, bơm 2 lần tỷ lệ cao hơn 6% Trên thực tế chỉ bơm 01 lần do lượng mẫu khó khăn Do vậy để tăng hiệu suất thì cần có chất lượng tinh trùng tốt, bệnh nhân đều được kích thích nang noãn, lại được bơm 02 lần vào thời điểm 24 và 48h sau tiêm thuốc rụng trứng

Tỷ lệ thành công phụ thuộc vào chất lượng tinh trùng và noãn Nếu tinh trùng đảm bảo chất lượng, chu kỳ tự nhiên (không sử dụng thuốc kích thích nang noãn – theo các tác giả trên thế giới) tỷ lệ thành công chỉ 6% Nếu sử dụng thuốc kích thích nang noãn (để có nhiều nang trong 1 chu kỳ), tỷ lệ thành công có thể đạt 26% Nhìn chung, tỷ lệ thành công IUI cho 1 chu kỳ là 15 – 20% Tỷ lệ đa thai 23 – 30%

Nhiều nghiên cứu hiện nay chỉ ra rằng tinh trùng lọc rửa có thể sống được 24 – 72h, tuy thế nhưng sau 24h chất lượng giảm đáng kể Tinh trùng có khả năng cao nhất xuyên qua màng noãn để thụ thai là 6 -12h sau phóng noãn Có nghiên cứu phát hiện tinh trùng có thể sống 05 ngày trong dịch nhầy đường sinh dục

BÀI 3: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÔNG LẠNH

1 KHÁI NIỆM

Sinh học đông lạnh là một ngành khoa học ứng dụng những kỹ thuật trữ tế bào sống ở nhiệt độ thấp trong một thời gian rất dài Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196), hầu hết mọi phản ứng hóa học đều không xảy ra, tất cả các hoạt động bên trong tế bào đều ngừng lại Các phân tử nước lúc này tồn tại ở dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự tổn hại nào cho tế bào được trữ Theo cách này, tế bào và mô có thể hồi phục tới lúc nào con người cần sử dụng

2 MỤC ĐÍCH

- Giảm thiểu biến đổi kiểu gen, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định di truyền

- Ngăn ngừa sự lão hóa của tế bào

- Ngăn cản quá trình biệt hóa của tế bào

- Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào

- Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong invitro

- Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái

- Giảm chi phí nuôi cấy

- Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng

- Thuận lợi cho việc bảo tồn gen

- Thuận lợi cho việc vận chuyển

- Thuận lợi cho việc thương mại hóa

- Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào cùng một lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian, công sức

3 CÁC BƯỚC BẢO QUẢN TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH

- Quá trình thu nhận và thao tác tế bào

- Quá trình làm lạnh

- Quá trình trữ lạnh

- Quá trình giải đông

- Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi nuôi cấy

4 CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH

4.1 Sự hình thành tinh thể nước đá

Khi nhiệt độ hạ thấp, sự xuất hiện những tinh thể nước đá đầu tiên là dấu hiệu bắt đầu của sự biến đổi giai đoạn Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ bên trong tế bào bằng với độ hạ băng điểm của dung dịch mà băng điểm của dung dịch này lại phụ thuộc vào nồng độ của chất hòa tan Tuy nhiên, nồng độ bên trong tế bào đậm đặc hơn bên ngoài tế bào nên sự biến đổi giai đoạn ở bên trong tế bào được xảy ra ở một nhiệt độ thấp hơn ở bên ngoài tế bào Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường ngoài tế bào, vì vậy nồng độ chất hòa tan tăng và áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển động ra ngoài tế bào và dung tích tế bào giảm Tốc độ mất nước của tế bào lại phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh Ở trên tốc độ giới hạn (tốc độ thích hợp tối ưu) khả năng tạo băng đá nội bào tăng; những tinh thể nước đá tăng kích thước và do đó, sự tổn hại tế bào cũng nhiều hơn Ngược lại, ở dưới tốc độ giới hạn, sự sống của tế bào giảm do nồng độ của chất hòa tan nội bào tăng lên Người ta nhận thấy trong môi trường huyền phù, nước biến đổi chậm hơn và sự mất nước nội bào được duy trì sao cho có sự cân bằng thẩm thấu với môi trường bên ngoài, do đó sẽ gây tổn hại tế bào ít hơn Sự có mặt của băng đá nội bào và “hiệu ứng của dung dịch” là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh, quyết định khả năng sống của tế bào

Sự hoạt động phối hợp của 4 yếu tố sau đây quyết định hình dạng tinh thể nước đá được tạo thành trong quá trình đông lạnh:

 Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn

 Thành phần các chất hòa tan trong dung dịch

Hình 1: Sự hình thành tinh thể đá

Ở môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300mOsm/kg), tinh thể đá thường hình thành ở nhiệt độ -5 đến -150C Tuy nhiên, đá chỉ tạo thành tự nhiên ở nhiệt độ -100C Ở nhiệt độ -5 đến -100 C cần có điều kiện kết hợp Đó là sự tham gia của một phần nhỏ chất rắn (ví dụ như hạt bụi hoặc tinh thể đá nhân tạo) Sự tạo

đá càng tăng khi nhiệt độ càng giảm Ở nhiệt độ khoảng -1300C, tất cả chất liệu không còn ở dạng lỏng mà đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh.Đây là hiện tượng kết tinh hóa hay còn được gọi là thủy tinh hóa Hiện tượng này xảy ra do môi trường có pha chất hòa tan cũng như chất bảo quản đông lạnh có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan

Hình 2: Sự biến đổi vật lý của tế bào khi đông lạnh

Sự tăng thêm nồng độ của các chất hòa tan trong môi trường đông lạnh ảnh hưởng đến việc hình thành những tinh thể đá Khi nước chuyển sang dạng tinh thể, lượng nước ở thể lỏng giảm đi Do đó, nồng độ các chất hòa tan tăng lên gây mất cân bằng về áp suất thẩm thấu, kéo nước bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương màng tế bào

Việc tăng nhiệt độ tiềm năng cũng là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá Phân tử nước khi chuyển từ thẻ lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra 1 nhiệt lượng Nếu nhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0⁰ C Thay đổi này ảnh hưởng đến chức năng của tế bào sau khi giải đông

4.2 Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh

Nhiệt độ chính xác để kết tinh và thủy tinh hóa hoàn toàn phụ thuộc vào phức hợp

có trong nước Trong dung dịch NaCl có cùng một áp suất, hiện tượng thủy tinh hóa xảy ra ở nhiệt độ -20⁰ C đến -30⁰ C Nhiệt độ này gọi là điểm Eutecti Vì vậy, trước khi đạt đến điểm này NaCl vẫn ở dạng dung dịch Số lượng phân tử nước có

ở dạng dung dịch giảm xuống cùng với nhiệt độ, kết quả trực tiếp là giảm độ thẩm thấu của môi trường, môi trường trở nên ưu trương

Hình 3: Khi nhiệt độ của dung dịch NaCl đẳng trương hạ thấp liên tục đến điểm

đông hiện tượng kết tinh đá và nồng độ NaCl tăng lên

Làm lạnh ở nhiệt độ xấp xỉ 00C làm giảm sự khuếch tán một chiều của protein màng Ở những nhiệt độ thấp hơn, màng tế bào hướng về nồng độ muối cao, nhất là trong quá trình đông lạnh chậm Màng tế bào bị sốc thẩm thấu cùng với sự co thể tích trong quá trình mất nước Sau đó, màng tế bào giãn ra, nồng độ các ion tăng lên, vì vậy, tế bào trở nên rất nhạy cảm với các stress trong quá trình đông lạnh khi nhiệt độ giảm hoặc khi pha loãng môi trường trong quá trình giải đông

4.3 Tốc độ khử nước

Tốc độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố Các yếu tố này thay đổi khác nhau tùy theo từng loài tế bào và vì vậy đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình bảo quản đông lạnh ở điều kiện tốt nhất Các yếu tố liên quan là tính thẩm thấu nước của màng tế bào (Lp), năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước này (dH*) và tỉ lệ diện tích bề mặt/ thể tích của tế bào (SA/V)

Bằng cách đo tỷ lệ thay đổi về diện tích bề mặt tế bào và thể tích tế bào ở các độ thẩm thấu khác nhau, có thể xác định được tính thấm của màng tế bào (Lp) Diện tích bề mặt càng lớn, tỉ lệ SA/V càng cao thì tính thấm của màng tế bào (Lp) càng lớn Đối với hầu hết các tế bào của động vật có vú, tính thấm của màng tế bào (Lp)

có giá trị khoảng 0.43 m3/m2.phút.atmosphere Tuy nhiên đối với hồng cầu và tinh trùng thì tính thấm của màng tế bào (Lp) lớn hơn nhiều Điều này có nghĩa là hồng

cầu và tinh trùng mất nước nhanh hơn trong dung dịch ưu trương; do đó, tốc độ bảo quản đông lạnh tốt nhất đối với loại tế bào này là rất quan trọng

Yếu tố quan trọng thứ hai trong quá trình khử nước là năng lượng hoạt hóa cho tính thấm nước (dH*) Năng lượng (ở dạng nhiệt) làm cho tế bào có khả năng thấm nước Trước đây, bằng cách đo tính thấu của màng tế bào (Lp) ở các nhiệt độ khác nhau để xác định được dH* đối với trứng Về thực hành, đây là khoảng nhiệt độ trên điểm đông lạnh Kết quả đo được là 14.5 Kcal/mol Giá trị này tương đối cao

và nói chung, nhiệt độ cứ hạ 10% thì tốc độ khử nước sẽ giảm một nửa

Cuối cùng, tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích cũng góp phần quan trọng đối với tốc độ khử nước của tế bào Nếu tỉ lệ này cao thì tế bào sẽ khử nước nhanh hơn

Hình 4: Tốc độ mất nước của tế bào trong môi trường ưu trương phụ thuộc vào

nhiệt độ

4.4 Thể tích của tế bào

Sự thay đổi thể tích tế bào có thể đo được để biểu thị quá trình khử nước Quá trình khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) và năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) của tế bào Các giá trị này phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh Dựa trên cơ sở tính toán, phạm vi thể tích giảm có thể xác định được ở các tốc độ làm lạnh khác nhau Ở tốc độ làm lạnh cao, tế bào không bị mất nước nhiều, và thể tích tế bào không bị giảm nhiều như ở tốc độ làm lạnh thấp Tốc độ làm lạnh thấp

sẽ làm cho tế bào mất nước Tuy nhiên, thể tích giảm thực sự ít hơn so với tính toán, điều này có thể là do sai lầm trong phép ngoại suy đối với năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) (được xác định ở nhiệt độ ở trên điểm đông lạnh)

4.5 Hoạt động của Enzyme

Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 370C xuống còn 70C, hoạt động của Enzyme giảm 8 lần Tốc độ phản ứng Enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phẩn ứng Từ 200C, tốc độ phản ứng Enzyme giảm theo nhiệt độ

một cách ổn định theo trình tự 2-3 lần với mỗi khoảng giảm 100C (Q10) Tuy nhiên, trong một số trường hợp, khi hạ nhiệt độ thì sự thay đổi tốc độ phản ứng Enzyme (ở nhiệt độ tương ứng) không còn rõ rệt, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein Các chất bảo quản đông lạnh có thể đề phòng sự biến đổi này

4.6 Sự tủa muối và pH của dung dịch

Trong quá trình đông lạnh, độ pH của dung dịch tăng theo sự giảm nhiệt độ, sự cân bằng acid-base của môi trường biển đổi như sau: lực ion tăng lên, sự kết tủa của các hợp chất như các protein hòa tan trong môi trường trở nên dễ dàng (salting out) Các chất bảo quản đông lạnh có thể biến đổi cân bằng acid-base của dung dịch, chẳng hạn như glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, ester hoạt động như base mạnh (DMSO chẳng hạn) Sự biến đổi độ pH của dung dịch theo nhiệt độ sẽ khác nhau theo loại chất bảo quản được sử dụng: với nồng độ DMSO hay glycerol tăng thêm 50%, độ pH của dung dịch PBS tăng nhanh, nhưng lại ổn định hơn với propanediol hay methanol; với nồng độ giảm (10-20%) độ pH của dung dịch PBS và glycerol ổn định, trong khi đó, pH dung dịch đệm Tris có sự thay đổi nổi bật Tuy nhiên, pH thích hợp để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ Người ta nhận thấy rằng tế bào có thể sống sau bảo quản ở nhiệt độ xấp xỉ 0⁰ C với pH trên 9

4.7 Sự hình thành bọt khí

Tế bào có thể chết theo nhiều cách khác nhau do sự hình thành đá Hơn nữa, tinh thể nước đá tạo ra các lỗ gây rò rỉ và thể tích nước bị đông lạnh tăng lên (tỉ trọng của đá thấp hơn tỉ trọng của nước) Do đó, bọt khí có thể được hình thành khi giải đông tế bào Năm 1988, Ashwood-Smith mô tả sự hình thành bọt khí dưới tác động của sự hình thành đá Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25 đến 100µm và tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh Số lượng bọt khí tương ứng với tốc độ làm lạnh

Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dung

CO2 làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng hòa tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây hại

tế bào Trong quá trình giải đông, trong vài phút, bọt khí phát triển thành không bào lớn bên trong tế bào, làm tế bào phình to Trong thực tế, bọt khí hình thành rất nhanh, dẫn đến vỡ tế bào

Sự hình thành khí xảy ra nhiều khi sử dụng môi trường đông lạnh có chứa bicarbonate Vì vậy, PBS thường được sử dụng hơn

5 Thuyết hai yếu tố

Căn cứ vào những quan sát thực nghiệm về mối quan hệ giữa sự sống sót của tế bào với nhiệt độ làm lạnh chúng, Mazur đã đưa ra giả thuyết hai yếu tố về những tổn thương khi đông lạnh tế bào Hai yếu tố này đã đặt nên tảng cơ sở cho hai cơ chế khác nhau, và có thể chúng là các nguyên nhân trực tiếp, gây ra những tổn hại cho tế bào, trong suốt quá trình tiến hành đông lạnh và lưu giữ

BẢNG 1: Khả năng phản ứng của tế bào khi gặp phải các tác nhân gây stress trong

tiến trình đông lạnh

- Giải trùng hợp bộ xương tế bào

Tăng nồng độ chất hòa tan - Co thẩm thấu

Tăng nồng độ ion - Tác động trực tiếp lên màng tế bào,

làm hòa tan protein màng

Kết tủa muối - Làm thay đổi pH dung dịch, ảnh

hưởng đến hoạt động của các protein

Sự hình thành bọt khí - Tổn thương cơ học đối với màng và bộ

xương tế bào

Dung dịch trở nên quá nhớt - Làm hạn chế quá trình khuếch tán và

thẩm thấu

(1) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh chậm, sự tổn thương xảy ra

do những tác động dung dịch (ví dụ như nồng độ chất tan/chất điện li, sự mất nước của tế bào nhanh đột ngột, và sự giảm phần không bị đóng đá trong khoảng không ngoại bào)

(2) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh nhanh, sự tổn thương do hình thành đá nội bào gây chết Nhiệt độ làm lạnh tối ưu cho sự sống sót của

tế bào phải đủ thấp để tránh sự hình thành đá nội bào, nhưng cũng phải đủ cao để giảm đến mức tối thiểu những tác động của dung dịch

Hình 5: Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh lên sức sống tế bào

Hình 5 mô tả nhiệt độ làm lạnh tối ưu, ở đó hai yếu tố gây thiệt hại được giữ một cách cân bằng, và xác suất sống của tế bào đạt đến một giá trị cực đại Những giá

trị tốt nhất cho tất cả các quá trình làm lạnh hữu dụng có thể được giải thích trong giới hạn của sự cân bằng giữa tác động dung dịch và sự hình thành đá nội bào Mặc dù, từ những bằng chứng thực nghiệm đều thấy rằng, thuyết hai yếu tố nói trên như là một lời giải thích hiển nhiên, hợp lí về sự tổn thương của tế bào trong suốt quá trình làm lạnh, nhưng phương pháp bảo quản bằng đông lạnh tốt nhất sẽ khác nhau tuỳ vào từng loại tế bào Bổ sung thêm cho hai cơ chế tổn thương này, còn có những cơ chế khác đáng quan tâm, chẳng hạn sự làm lạnh cũng có thể gây nên tổn thương hệ miễn dịch và kích hoạt tế bào chết theo chương trình (apoptosis), có thể những vấn đề nêu trên cũng là nguyên nhân gây ra sự tổn thương tế bào Tế bào ít khi tiếp xúc trực tiếp với các tinh thể nước đá, và đúng hơn là chúng tập hợp vào những nơi không có sự đóng băng, đồng thời cũng chính tại các vị trí này, tế bào được cô lập bởi các tác nhân vật lý, và điều này đã tạo nên các stress cho tế bào Đó

là sự phản ứng tự nhiên của tế bào đối với các tác nhân này để chúng có thể sống sót và tồn tại Tế bào phải chịu tác động của những tác nhân nói trên và luôn luôn thay đổi trong suốt quá trình đông lạnh Tuy nhiên, các phản ứng thẩm thấu qua màng sinh chất là yếu tố có tính quyết định đầu tiên cho sự tồn tại của tế bào Trong những môi trường ưu trương, tế bào sẽ gặp phải sự mất tính thấm với nước, giới hạn tổn thương này phụ thuộc vào nhiệt độ đông lạnh Sức chịu đựng của tế bào khi đông lạnh tại những thang nhiệt độ chậm sẽ phụ thuộc vào khả năng của tế bào, nhằm chống lại sự thâm nhập của các tác nhân stress Sức chống chịu của tế bào trước áp lực của sự tăng khuếch tán nước, khi nhiệt độ làm lạnh tăng và những thành phần của tế bào có thể chậm đông hơn, trước khi tất cả những phần nước đóng băng bị loại thải Dưới những điều kiện này, tế bào co lại và sự tổn thương màng sẽ giảm đến mức tối thiểu Những hiện tượng này xảy ra khi tốc độ làm lạnh được cho là tốt nhất

6 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH

6.1 Đông lạnh chậm chương trình (Programmed slow freezing method)

 Đặc điểm:

- Sử dụng chất bảo quản với nồng độ thấp (1-2M)

- Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 5oC/phút trong giai đoạn giảm nhiệt xuống -80C)

- Hạ nhiệt tự động

- Sự khử nước diễn ra suốt quá trình làm lạnh

- Cân bằng giữa tốc độ nước rời khỏi tế bào và nước chuyển sang dạng đá

- Chi phí cao (máy tự động), tổn thương tế bào do tác động của nồng độ chất tan

 Ưu, nhược điểm của phương pháp:

- Nhược điểm:

Tỷ lệ phôi sống không cao, mất nhiều thời gian, cần sử dụng máy khi trữ lạnh, sử dụng nhiều nitơ, chương trình không ổn định Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trình mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá Do đó, thời gian cần thiết để hoàn tất một quy trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt

độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh Để có thể đảm bảo được tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng Chi phí đầu tư cho một hệ thống này rất cao, chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa hằng năm Khó khăn cơ bản là phải có được phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi đến được giai đoạn phôi nang (blastocyst)

- Ưu điểm: Do sử dụng chất bảo quản ở nồng độ thấp nên ít gây tổn thương về cấu trúc tế bào

6.2 Đông lạnh nhanh ba bước (Stepwise freezing method)

- Khử nước không hoàn toàn, hình thành đá nội bào

- Cải tiến - Đông lạnh in situ (đông lạnh trong bình nuôi)

 Ưu, nhược điểm của phương pháp:

+ Cải tiến thêm phương pháp đông lạnh in situ mang nhiều ưu điểm như: Không

sử dụng cryotube-lọ lưu trữ sinh phẩm, giảm thao tác thu nhận tế bào nên giảm nguy cơ nhiễm, tiến hành nhanh, chi phí thấp

6.3 Đông lạnh cực nhanh (Thuỷ tinh hoá)

 Khái niệm

Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh.Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình đông lạnh Sau khi được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao (4 -8M), mẫu trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, không qua quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong đông lạnh chậm Tốc độ làm lạnh của phương pháp này rất lớn, khoảng 2000 - 25000 C /phút

- Có thể ảnh hưởng đến tế bào do nồng độ chất bảo quản

- Quy trình thực hiện dễ dàng, nhanh chóng, chi phí thấp

 Ưu, nhược điểm của phương pháp:

- Ưu điểm:

+ Ưu điểm vượt trội của nó là thời gian trữ lạnh nhanh, tỷ lệ phôi sống và nguyên vẹn đạt đến 99% Tỷ lệ thụ thai từ kỹ thuật này đạt tỷ lệ 50%, gấp đôi phương pháp cũ Do đó, đông lạnh phôi cực nhanh với kỹ thuật thủy tinh hóa sẽ khắc phục được rất nhiều nhược điểm của phương pháp cũ, đồng thời giảm thiểu chi phí điều trị, giảm nguy cơ biến chứng, gia tăng tỷ lệ thành công cho những người hiếm muộn

+ Chi phí đầu tư cho trang thiết bị thì không cần nhiều

+ Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa cao gấp 4-5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp đông lạnh chậm trước đây Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn Kết quả là không có sự hình thành thể đá bên trong tế bào, nhờ đó mà tế bào có thể tránh được những tổn thương màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra Phương pháp thủy tinh hóa cho tỉ lệ sống sau rã đông của phôi và trứng cao hơn rất nhiều so với phương pháp đông lạnh chậm

- Nhượu điểm:

+ Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, đòi hỏi người thực hiện phải thuần thục và chính xác trong kỹ thuật cao Sự thay đổi nhiệt độ do ngẫu nhiên hay “tai nạn” trong quá trình lưu trữ và di chuyển mẫu đã đông lạnh là rủi ro thường gặp nhất Do thể tích môi trường xung quanh trứng/phôi rất nhỏ, chỉ một vài thay đổi nhiệt độ nhỏ cũng làm ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông

+ Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây Điều này có thể gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức sống của trứng hoặc phôi Đặc biệt là ảnh hưởng lớn đến hệ thoi

vô sắc của trứng sua khi rã đông Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao, những tế bào nhạy cảm như trứng/ phôi có thể bị tổn thương vật liệu

di truyền Nhưng cho đến nay chưa có một bằng chứng nào cho thấy em bé được sinh ra rừ kỹ thuật đông lạnh trứng/ phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao hơn phương pháp đông lạnh chậm trước đây

7 CÁC KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

- Quan sát bên ngoài và kiểm tra nhiễm:

+ Nuôi trong môi trường không kháng sinh vài lần trước khi kiểm tra

+ Quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi

Thay đổi môi trường nuôi 24 tiếng trước khi đông lạnh

7.2 Môi trường đông lạnh

- Đệm Hepes:

Vì quá trình đông lạnh và làm tan đông được thực hiện ngoài tủ ấm CO2 nên môi trường có đệm HEPES thường được sử dụng Môi trường này có thể làm môi trường nuôi cấy

- Huyết thanh:

Mặc dù vai trò của huyết thanh trong trữ lạnh tế bào chưa được làm rõ Một số nghiên cứu chứng tỏ rằng khi sử dụng môi trường có bổ sung huyết thanh, sau giả đông, khả năng sống của tế bào tăng; đối với tế bào phôi, ngoài sức sống tế bào tăng, tỉ lệ có thai cũng như tỉ lệ thai làm tổ sau khi chuyển phôi cũng gia tăng Tuy nhiên, việc dùng huyết thanh trong trữ lạnh làm gia tăng nguy cơ các bệnh truyền nhiễm cũng như phải chấp nhận tính không ổn định của huyết thanh với rất nhiều thành phần không thể xác định được

- Kháng sinh: Việc sử dụng kháng sinh nhằm mục đích hạn chế sự nhiễm khuẩn trong quá trình đông lạnh và giải đông

- Muối: Đóng vai trò làm đệm sinh lí cho tế bào

- Đường:

Đường là nguồn cung cấp năng lượng chính và cũng được xem như một tác nhân bảo quản đông lạnh do có sự tương tác trực tiếp với màng tế bào Đường sẽ ngăn cản sự khử nước quá mức của màng và làm giảm sự chuyển phase của phospholipid khi hạ nhiệt độ Sucrose là một trong những loại đường được sử dụng với mục đích này

- Chất bảo quản lạnh:

+ Là những chất tan được trong nước, có khả năng tạo liên kết hydro với các phân tử nước và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào

+ Tác dụng:

 Thâm nhập và thay chỗ cho nước bên trong tế bào

 Giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào

 Giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước đá

 Hạn chế sự gia tăng nồng độ của các chất hòa tan

 Kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế bào

+ Đặc tính của chất bảo quản đông lạnh:

 Có thể thấm qua màng tế bào một cách bị động

 Có khả năng hoạt động thay thế nước

 Chỉ độc với tế bào ở nồng độ cao

+ Phân loại chất bảo quản đông lạnh:

 Chất bảo quản ngoại bào: BSA, saccharide, disaccharide (trehalose,…), trisaccharide (raffinose,…), polymer (PVP, polyethylenglycol,…)

 Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylenglycol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO)

+ Nguyên tắc hoạt động của chất bảo quản đông lạnh:

Hoạt động của chất bảo quản đông lạnh thể hiện qua 2 hiện tượng “khử nước” trong quá trình đông lạnh và “bù nước “ trong quá trình giải đông

Theo nguyên tắc, phôi ở môi trường nuôi cấy có sử dụng chất bảo quản đông lạnh phải trải qua phản ứng thẩm thấu, vì vậy sẽ mất nước Sau một thời gian (thời gian này nhanh hơn khi ở nhiệt độ cao so với ở nhiệt độ thấp), tế bào hấp thụ chất bảo quản đông lạnh và trở lại thể tích ban đầu Khi tế bào trở lại thể tích bình thường thì quá trình đông lạnh bắt đầu Do có sự bổ sung chất bảo quản đông lạnh nên nước trong tế bào có ít hơn và do đó, ít hình thành tinh thể đá hơn

Sau khi tan đông, trong quá trình bù lại nước, phản ứng của phôi hoàn toàn ngược lại Quá trình này diễn ra chậm Nếu có quá ít chất bảo quản đông lạnh trong môi trường bù nước, tế bào sẽ phồng lên và vỡ do áp suất thẩm thấu trong tế bào cao Vì vậy, quá trình bù nước xảy ra từng bước một, tế bào được nuôi trong môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh giảm dần Mỗi lần như vậy, thể tích của phôi tăng lên do hấp thu nước, rồi trở lại bình thường do chất bảo quản đông lạnh thoát ra

Hình 6: Quá trình đông lạnh không chất bảo quản

+ Chất phụ trợ đông lạnh:

 Không có khả năng thấm vào tế bào

 Bảo vệ tế bào trong quá trình bù nước

 Thường là mono-, di- hoặc tri-saccharide Sucrose và dextran được sử dụng phổ biến

8 QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

- Đông lạnh tế bào động vật là sử dụng môi trường đông lạnh, nhiệt độ thấp (- 80oC, -196oC) để lưu trữ các tế bào động vật phục

vụ cho nghiên cứu và ứng dụng

- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông lạnh như: tốc độ đông lạnh, kỹ thuật đông lạnh, chất bảo quản lạnh, môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ bảo quản, đặc trưng của tế bào đông lạnh…

- Quy trình đông lạnh có sự khác biệt giữa các phương pháp đông lạnh khác nhau (nhanh, chậm hay cực nhanh) Tuy nhiên, nhìn chung quy trình đông lạnh tế bào gồm các bước sau:

8.1 Kiểm tra tình trạng tế bào

Đầu tiên, tế bào được đông lạnh phải đang trong tình trạng tăng trưởng mạnh để đảm bảo chất lượng và khả năng phục hồi sau giải đông tốt nhất Tế bào đang trong pha log của chu kì tăng trưởng là tốt nhất (2 - 4 ngày sau cấy chuyền, tuỳ loại tế bào) 24 giờ trước khi tiến hành đông lạnh, môi trường nuôi cấy được thu mới và tình trạng tế bào được dấu hiệu nhiễm khuẩn được ghi nhận qua việc quan sát dưới kính hiển vi Đồng thời các khuẩn lạc nấm có thể xuất hiện ở mặt phân cách giữa pha lỏng và pha khí và phát hiện bằng cách quan sát bằng mắt thường (quan sát bằng kính hiển vi không thể phát hiện được) Bằng cách khác, môi trường không bổ sung kháng sinh được sử dụng để nuôi tế bào ít nhất một tuần trước khi đông lạnh nhằm dễ dàng phát hiện nhiễm và giảm thiểu khả năng phục hồi của các vi khuẩn tiềm ẩn

8.2 Bảo dưỡng và thu nhận tế bào

8.3 Sử dụng chất bảo quản lạnh phù hợp

- Dung dịch bảo quản lạnh: thành phần chính của dung dịch này là chất bảo quản lạnh được pha loãng trong dung môi thích hợp Dung môi này có thể là môi trường nuối cấy tế bào hoặc dung dịch muối sinh lí có thể bổ sung thêm một số thành phần như huyết thanh, kháng sinh…Trong một số trường hợp, đối với các tế bào khó, dung dịch bảo quản chỉ gồm huyết thanh (90 - 95%) và

các chất bảo quản đông lạnh Việc lựa chọn các chất bảo quản đông lạnh phù hợp với từng loại tế bào và nồng độ thích hợp rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả đông lạnh DMSO và glycerol được sử dụng phổ biến nhất vì có khả năng áp dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau Nồng độ chất bảo quản đông lạnh thường từ 5 - 10%

- Trypsin hay tác nhân tách tế bào

- Thuốc nhuộm như trypan blue để xác định tỉ lệ tế bào sống, chết trước và sau khi đông lạnh

8.4 Sử dụng dụng cụ trữ phù hợp với điều kiện đông lạnh

- Việc sử dụng các thiết bị và dụng cụ trữ phải phù hợp với điều kiện đông lạnh

- Đông lạnh in situ được tiến hành trực tiếp trên dụng cụ đang nuôi tế bào trong

tủ đông -80oC

- Đông lạnh trong nitơ lỏng cần có các dụng cụ chuyên biệt, bề và chịu nhiệt như ống đông lạnh (cryotube), cọng rạ (straw) và nhiều thiết bị như tủ lạnh (4oC), tủ đông (-20oC, -80oC), bình trữ nitơ

8.5 Đánh dấu

8.6 Điều chỉnh tốc độ làm lạnh

Tuỳ vào phương pháp đông lạnh mà tuỳ chỉnh tốc độ làm lạnh, ví dụ như:

- Phương Đông lạnh chậm chương trình thì tốc độ làm lạnh chậm (0,1 –

5oC/phút trong giai đoạn giảm nhiệt xuống -80C)

- Phương pháp đông lạnh nhanh 3 bước thì tốc độ làm lạnh nhanh (4oC trong 30 phút, -20 oC trong 45 phút, -80oC và bảo quản qua đêm)

- Phương pháp Thuỷ tinh hoá thì tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000 – 2500oC/ phút)

8.7 Trữ tế bào ở nhiệt độ dưới -130 o C

8.8 Kiểm tra mức nitơ lỏng

8.9 Ghi nhận định kì

9 QUÁ TRÌNH THU NHẬN TẾ BÀO SAU ĐÔNG LẠNH

Quy trình thu nhận tế bào sẽ khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau Thông thường, được chia ra 2 loại: tế bào bám dính và tế bào không bám dính (tế bào huyền phù) Và quy trình thu nhận 2 loại tế bào như sau:

Quy trình thu nhận tế bào bám dính Quy trình thu nhận tế bào huyền phù

Loại môi trường cũ bằng cách hút bỏ Ly tâm thu cặn tế bào và loại bỏ môi

trường cũ

Rửa đĩa tế bào bằng PBS vài lần Rửa đĩa tế bào bằng PBS vài lần

Tách toàn bộ tế bào khỏi đĩa nuôi bằng

dung dịch trypsin Sau đó, bổ sung chất

ức chế protease để làm ngừng hoạt

động của trypsin

Ly tâm thu cặn tế bào và loại bỏ

trypsin, chất ức chế protease

Rửa tế bào bằng PBS vài lần

Xác định số lượng tế bào sống Xác định số lượng tế bào sống

Huyền phù cặn tế bào vào môi trường

Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị

làm lạnh (tuỳ theo phương pháp đông

lạnh)

Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị làm lạnh (tuỳ theo phương pháp đông lạnh)

BẢNG 2: Quy trình thu nhận 2 loại tế bào

Tách tế bào

Ly tâm thu cặn tế bào

Huyền phù vào môi trường đông

lạnh

Bổ sung vào dụng cụ đông lạnh

Đưa vào nhiệt độ đông lạnh phù hợp

Giải đông ở 37oC

Loại môi trường bảo quản

Tái nuôi cấy trong môi trường mới

Đếm mật độ tế bào

Đếm mật độ tế bào Loại môi trường cũ

10 GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

 Bổ sung huyết thanh tế bào thai FBS

 Ly tâm trong 5 phút với tốc độ 1000 vòng/phút

 Bổ sung 5 - 6ml môi trường dung dịch đã làm ấm

 Chuyển sang bình nuôi ủ ở 370C trong điều kiện nồng độ CO2 5%

 Sau 24h thì kiểm tra kết quả nuôi cấy, bỏ môi trường cũ và bổ sung 5 - 6ml môi trường mới đã được làm ấm và nuôi cấy

10.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trong quá trình giải đông

 Nếu quá trình giả đông chậm, các tế bào bị tổn thương hoặc bị chết nhiều, ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy

 Nếu quá trình giải đông nhanh, đúng kỹ thuật chất lượng tế bào tốt

- Nâng cao khả năng sinh sản, các sản phẩm thịt sữa trong chăn nuôi

- Hạn chế mức tối thiểu số lượng gia súc làm giống, từ đó giảm các chi phí khác đi kèm

- Bảo tồn thành lập ngân hàng tinh trùng động vật

- Vào ngày 6/1/2016 giới chức Trung Quốc thông báo con gấu trúc đầu tiên trên thế giới được tạo ra từ tinh trùng đông lạnh đã chào đời ở nước này

b) Đối với người

- Đông tinh mẫu hiến tự do nhằm góp mẫu vào ngân hàng tinh trùng, theo dõi

và điều trị cho những trường hợp không có tinh trùng, tinh trùng quá ít, di dạng

vô sinh do hóa trị rất cao

nữ chưa chịu lấy chồng sớm hoặc tiền mãn kinh vẫn có thể mang thai

- Bảo toàn cơ hội làm mẹ cho bệnh nhân nữ bị ung thư, chuẩn bị được điều trị bằng hóa trị, xạ trị, bởi hóa trị và xạ trị rất độc hại đối với buồng trứng và nang noãn Khi việc điều trị ung thư kết thúc, trứng sẽ được rã đông và họ vẫn có thể có con như phụ nữ bình thường.

11.3 Ứng dụng kĩ thuật đông lạnh phôi

- Lưu trữ phôi đông lạnh là một kỹ thuật được hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới áp dụng bởi nó giúp giảm chi phí rất nhiều do không phải sử dụng thuốc kích thích buồng trứng để tạo phôi tươi

- Đông lạnh phôi đã trở thành một trong những kĩ thuật không thể thiếu ở bất

kỳ trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên thế giới, mở ra một hướng mới trong công nghệ hỗ trợ sinh sản

- Đông lạnh phôi là trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cực thấp (-1960C) trong nitơ lỏng

sẽ làm ngưng hoàn toàn các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển Giúp lưu giữ chúng trong thời gian rất dài mà sau khi rã đông các phôi này vẫn phát triển bình thường

a) Đối với động vật

- Khai thác triệt để tiềm năng di truyền ở những các thể cái cao sản thông qua việc lấy phôi của chúng

- Nâng cao hiệu quả chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống

- Bảo quản phôi gọn nhẹ, vận chuyển dễ dàng, đồng thời cũng là kho bảo tồn quỹ gen

- Hạn chế được bệnh tật thú y

- Mang lại hiệu quả kinh tế cao

b) Đối với con người

- Bảo quản và đông lạnh phôi là phương pháp hàng đầu trong việc giúp tăng

cơ hội thụ thai cho bệnh nhân đang điều trị các bệnh như vô sinh, cho phép người bệnh chủ động hơn trong điều trị vô sinh Bên cạnh đó, đông lạnh phôi còn cho

phép người bệnh được chuyển phôi với số lượng giới hạn để giảm tỷ lệ đa thai, hoặc là hoãn chuyển phôi nếu có nguy cơ quá kích buồng trứng nặng

- Chuyển phôi đông lạnh giúp tăng tỉ lệ có thai, tăng tỉ lệ sinh sống, giảm sảy thai, tăng trọng lượng bé sơ sinh, người mẹ và em bé khỏe hơn

11.4 Ứng dụng kĩ thuật đông lạnh tế bào gốc

a) Đối với động vật

- Tế bào gốc đông lạnh giúp phục hồi đa dạng sinh học của các loài có nguy

cơ tuyệt chủng như tê giác trắng và khỉ đầu chó

- Sử dụng tế bào gốc để làm cho tinh trùng và trứng từ các tế bào da của động vật đã chết trong sở thú đông lạnh, họ có thể giúp đa dạng di truyền và tăng dân số các loài động vật

b) Đối với con người

- Sử dụng tế bào gốc vào mục đích nghiên cứu các cơ chế sinh lí và bệnh lí của cơ thể, nghiên cứu phát triển thuốc và các biện pháp điều trị mới

tiểu đường type 1, bệnh tim, đột quỵ, ung thư, chấn thương cột sống, viêm khớp xương mãn tính và viêm khớp dạng thấp

- Nghiên cứu tế bào gốc cũng mở ra hướng đi khả quan trong tái tạo và cấy ghép mô, cơ quan nội tạng

- Ứng dụng để điều trị các tổn thương da, các bệnh lí da liễu và chăm sóc da thẩm mĩ

BÀI 4: ĐIỀU TRỊ VÔ SINH Ở NGƯỜI

1 Khái niệm vô sinh

- Theo Tổ chức Y tế thế giới, vô sinh được định nghĩa là tình trạng vợ chồng sau một năm chung sống, quan hệ tình dục 2-3 lần/tuần, không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào mà người vợ vẫn chưa có thai Có thể hiểu vô sinh là hiện tượng mất hay thiếu khả năng sinh sản xảy ra trong khoảng 10-15% các cặp nam

nữ muốn có con

- Định nghĩa mới của WHO, những người nam hoặc nữ độc thân, không gặp vấn đề

về sức khỏe, muốn trở thành bố mẹ nhưng không có con sẽ bị xếp vào nhóm " vô sinh"

 Phân loại vô sinh:

 Vô sinh 1(vô sinh nguyên phát): Hai vợ chồng chưa bao giờ có thai, mặc dù đã sống với nhau trên một năm và không dùng biện pháp tránh thai nào

 Vô sinh 2 (vô sinh thứ phát): Hai vợ chồng trước kia đã có con hoặc đã có thai, nhưng sau đó không thể có thai lại mặc dù đang sống với nhau trên một năm và không

sử dụng biện pháp tránh thai

2 Nguyên nhân vô sinh

2.1 Nguyên nhân do nam giới

 Bất thường tinh dịch:

 Bất thường giải phẩu:

 Rối loạn chức năng:

 Ảnh hưởng của các tia phóng xạ, nghiện rượu, thuốc lá, cũng có thể gây ra những đột biến tinh trùng

 Những nam giới đang mắc bệnh tiểu đường, huyết áp cao hoặc tuổi đã cao, mắc bệnh liệt dương, suy giảm ham muốn tình dục, căng thẳng kéo dài hay vợ chồng đang có những mâu thuẩn dồn nén không thể nói ra