Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT PCR phát hiện vi rút hanta trên chuột tại một số điểm ở hà nội, năm 2015 – 2016

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các giai đoạn điển hình, triệu chứng và biến chứng của bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận HFRS 11 Bảng 1.2 Sự phân bố địa lý của các vi rút Hanta gây bệnh cho n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Võ Thị Thương Lan

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

 TS BS Nguyễn Thị Kiều Anh, Phó Giám Đốc Trung tâm Y tế Dự phòng

Hà Nội Cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học, đã trực tiếp hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu Cô đã xây dựng

ý tưởng, cung cấp kinh phí và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

 PGS TS Võ Thị Thương Lan, Trưởng phòng thí nghiệm Sinh Y, trường

Đại học Khoa học Tự nhiên Cô đã tạo điều kiện cho tôi tiếp xúc với các kiến thức khoa học, hướng dẫn tôi từ những thí nghiệm khoa học đầu tiên

 Ths Nguyễn Tuyết Thu, Ths Nguyễn Vĩnh Đông - phòng thí nghiệm dại

và các lyssavirus, khoa Vi rút đã hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

 PGS TS Nguyễn Thị Lan Anh, Trưởng khoa Miễn dịch và Sinh học phân

tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, đã chỉ bảo tôi ngày càng trưởng thành hơn về cách sống, về tư duy khoa học ngay từ những ngày đầu bước chân vào Viện

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị đồng nghiệp phòng thí nghiệm Chẩn đoán phân tử - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã giúp đỡ, ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng tri ân tới Bố Mẹ – những người có công sinh

thành nuôi dưỡng, dạy dỗ, đã hết lòng ủng hộ để tôi có được thành quả hôm nay và

gửi lời cảm ơn đến Chồng tôi – người luôn bên tôi động viên, chia sẻ những khó khăn

và hạnh phúc trong cuộc sống hàng ngày

Hà Nội, tháng 09 năm 2017

Phan Hà Mỵ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 3

1.1 Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút Hanta 3

1.2 Vi rút Hanta 4

1.2.1 Phân loại 4

1.2.2 Hình thái 5

1.2.3 Cấu trúc 5

1.2.4 Quá trình nhân lên của vi rút Hanta 7

1.2.5 Phương thức và khả năng gây bệnh 9

1.3 Đặc điểm lâm sàng của bệnh do vi rút Hanta 10

1.3.1 Bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) 10

1.3.2 Hội chứng phổi do vi rút Hanta (HPS) 12

1.4 Dịch tễ học bệnh do vi rút Hanta 13

1.4.1 Tình hình dịch tễ bệnh do vi rút Hanta trên thế giới và Việt Nam 13

1.4.2 Ổ chứa và nguồn truyền bệnh 14

1.5 Chẩn đoán bệnh do vi rút Hanta trong phòng thí nghiệm 19

1.5.1 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học 20

1.5.2 Các phương pháp sinh học phân tử 22

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu nghiên cứu 25

2.2.1 Mẫu chứng 25

2.2.2 Sinh phẩm, hóa chất 26

2.2.3 Trang thiết bị, dụng cụ 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Tối ưu hóa quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta và xác định một

số thông số kỹ thuật cơ bản 27

2.3.2 Áp dụng quy trình RT-PCR đã được tối ưu hóa để phát hiện vi rút Hanta trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng 29

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 36

3.1 Kết quả tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đoán vi rút Hanta và xác nhận một số thông số kỹ thuật của phương pháp 36

3.1.1 Kết quả tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đoán vi rút Hanta 36

3.1.2 Một số đặc điểm của quy trình phát hiện vi rút Hanta sử dụng kỹ thuật

RT-PCR 38

3.2 Kết quả chẩn đoán vi rút Hanta trên chuột thu thâ ̣p ở mô ̣t số đi ̣a điểm ta ̣i Hà Nội, năm 2015 - 2017 41

3.2.1 Một số đă ̣c điểm về mẫu nghiên cứu 41

3.2.2 Kết quả chẩn đoán vi rút Hanta trên chuột 44

3.3.3 Kết quả phân tích đặc điểm di truyền đoạn gen M của 2 chủng phân lập năm 2015 và năm 2016 49

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 56

4.1 Tối ưu quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta 56

4.2 Sự lưu hành vi rút Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội, năm 2015 - 2016 59

4.3 Phân loài và đặc điểm phân tử đoạn gen M của một số chủng phân lập tại Hà Nội, năm 2015 - 2016 61

KẾT LUẬN 71

KIẾN NGHỊ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 80

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giai đoạn điển hình, triệu chứng và biến chứng của

bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) 11

Bảng 1.2 Sự phân bố địa lý của các vi rút Hanta gây bệnh cho

người và trên vật chủ tương ứng thuộc loài gặm nhấm 16 Bảng 2.1 Trình tự mồi của kỹ thuật RT-PCR phát hiện vi rút Hanta 26

Bảng 3.1 Phân loại chuột thu thập tại một số địa điểm nghiên cứu

Bảng 3.2 Phân bố chuột theo thời gian thu thập 44

Bảng 3.3 Kết quả chẩn đoán vi rút Hanta theo loài chuột, năm

53

Bảng 3.6

Trình tự axit amin (vị trí 629 – 769) của gen M 02 chủng phân lập trong nghiên cứu so sánh với các chủng tham chiếu phân lập tại Việt Nam và một số nước lân cận

55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét của vi rút Sin Nombre 5

Hình 1.5 Phân bố các trường hợp bệnh lâm sàng nhiễm vi rút Hanta trên

Hình 2.2 Sơ đồ cặp mồi SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353 trên đoạn trình

Hình 3.1 Hình ảnh xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu của phương pháp 36 Hình 3.2 Hình ảnh xác định số chu kỳ nhiệt tối ưu của phương pháp 37 Hình 3.3 Hình ảnh xác định thời gian kéo dài tối ưu của phương pháp 38 Hình 3.4 Hình ảnh xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 39 Hình 3.5 Hình ảnh xác định độ lặp lại của phương pháp 40 Hình 3.6 Hình ảnh xác định độ đặc hiệu của phương pháp 41

Hình 3.7 Bản đồ thu thâ ̣p mẫu chuô ̣t, năm 2015 -2017 42

Hình 3.8 Hình ảnh điê ̣n di sản phẩm PCR chẩn đoán vi rút Hanta từ mô

Hình 3.9 Bản đồ phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta tại các địa điểm nghiên

Hình 3.10 Cây gia hệ của các vi rú t Hanta lưu hành ở Việt Nam và một số

Hình 4.1 Cây gia hệ các vi rút Hanta lưu hành trên thế giới được xây dựng

Hình 4.2 Cây gia hệ của các vi rút hanta dựa trên trình tự nucleotide gen S 64

Hình 4.3 Cây gia hệ được xây dựng trên trình tự gen S các vi rút Hanta có

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Kết quả chẩn đoán chuột nhiễm vi rút Hanta theo địa

Biểu đồ 3.2 Phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta theo tháng, năm

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Axit Deoxyribonucleic

ARN : Axit Ribonucleic

ELISA : Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

(Phản ứng miễn dịch gắn enzyme) HFRS : Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome

(Sốt xuất huyết hội chứng thận) HPS : Hantavirus Pulmonary Syndrome

(Hội chứng phổi do vi rút Hanta) ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses

(Ủy ban Quốc tế về Phân loại Vi rút) IgG : Immunoglobin G

(Kháng thể miễn dịch lớp G)

(Kháng thể miễn dịch lớp M) RT-PCR : Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng khuếch đại chuỗi men sao chép ngược)

MỞ ĐẦU

Vi rút Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae có thể gây bệnh cho

người trên khắp thế giới, nhưng không gây bệnh cho các loài gặm nhấm Người bị nhiễm bệnh do hít phải những khí dung từ chất thải (phân, nước tiểu) hay do vết cắn của động vật gặm nhấm có chứa vi rút Vi rút Hanta gây ra hai thể bệnh với tỷ lệ tử

vong cao là Sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS - Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome) và Hội chứng phổi do vi rút Hanta (HPS - Hantavirus Pulmonary

Syndrome)

Thể bệnh do vi rút Hanta đã được ghi nhận ở tất cả các châu lục Tuy nhiên, mỗi loài vi rút Hanta truyền bệnh cho người thông qua một vật chủ nhất định và chúng được phân bố theo các vùng địa lý khác nhau, gây ra các bệnh cảnh lâm sàng chủ yếu khác nhau, chính vì vậy sự phân bố của HFRS và HPS cũng bị giới hạn theo sự phân

bố địa lý của các loài động vật gặm nhấm Vi rút thuộc các phân họ Neotominae và Sigmodontinae là nguyên nhân gây ra HPS nặng với tỷ lệ tử vong cao lưu hành ở các loài gặm nhấm khác nhau được phân bố khắp Bắc và Nam Mỹ Do vậy, tại các vùng này các ca bệnh nhiễm vi rút Hanta chủ yếu được báo cáo là HPS Tại Mỹ có vi rút

Araraquara lưu hành ở vật chủ là loài Necromys lasiurus, chúng là nguyên nhân gây

ra các ca HPS ở nước này Trong khi đó vi rút Dobrava-Belgrade truyền bệnh cho

người qua loài chuột rừng Apodemus ponticus, bệnh chủ yếu biểu hiện là HFRS với

tỉ lệ cao tại châu Âu Điển hình loài Rattus norvegicus (chuô ̣t cống) là vật chủ của vi

rút Seoul có phân bố địa lý trên toàn thế giới, gây nên bệnh cảnh chủ yếu là HFRS

Châu Á là châu lục có lịch sử lâu đời nhất về nhiễm vi rút Hanta Một số ý kiến cho rằng HFRS đã tồn tại rất lâu khoảng 1.000 năm trước tại Trung Quốc và tại Anh Quốc thời kỳ Trung Cổ, nhưng trên thực tế, HFRS lần đầu tiên được phát hiện trong khoảng thời gian chiến tranh Triều Tiên khiến hơn 3.000 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện Tại châu Á, vi rút Haantan và vi rút Seoul là những tác nhân chính gây ra HFRS

Ở Việt Nam, tỷ lệ chuột có kháng thể dương tính với vi rút từ 14-34% Cụ thể, tại khu vực phía Bắc, huyết thanh dương tính với vi rút Hanta mà chủ yếu là vi rút

Seoul đã được báo cáo tại Hải Phòng, Hà Nam và Thanh Hóa trên cả mẫu chuột và mẫu huyết thanh người, 5,4% cư dân tại thủ đô Hà Nội có kháng thể dương tính với

vi rút Hanta [57] Tại khu vực phía nam, tỷ lệ lưu hành huyết thanh kháng vi rút Hanta trên bệnh nhân nghi nhiễm là khá cao, chiếm 11,5% song song với đó là tỷ lệ lưu hành huyết thanh trên chuô ̣t tương đối lớn 21,4% [7, 24] Tại Thành phố Hồ chí Minh

và Hà Nội đã có những ghi nhận ca bệnh mắc HFRS Do đó, việc nghiên cứu áp du ̣ng

kỹ thuâ ̣t phát hiện nhanh, chính xác để giám sát vi rút Hanta trên chuô ̣t là quan trọng giú p đưa ra các biện pháp phòng bệnh chủ động, hiệu quả Chính vì vâ ̣y, chúng tôi thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện vi rút Hanta

trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội, năm 2015 – 2016” với 2 mục tiêu:

1 Tối ưu hóa được kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi rút Hanta trên chuột

2 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi rút Hanta trong mẫu phổi chuột thu thập tại một số địa điểm ở Hà Nội, năm 2015-2016

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút Hanta

Vi rút Hanta nằm trong họ Bunyaviridae, lịch sử phát hiện ra chúng gắn liền

với hai bệnh điển hình mà chúng gây nên là HPS và HFRS Trong đó, HFRS được nhắc đến trong các tạp chí Y học tại châu Âu và châu Á dưới rất nhiều tên gọi khác nhau như sốt xuất huyết Nam Triều Tiên hay bệnh dịch sốt xuất huyết [54] Một số ý kiến cho rằng, HFRS đã tồn tại rất lâu khoảng 1.000 năm trước tại Trung Quốc [40]

và tại Anh Quốc thời kỳ Trung Cổ [43] Một số đợt dịch được cho là mắc HFRS xuất hiện lẻ tẻ trong các báo cáo tại Nga vào năm 1913 và 1932, tại Mãn Châu năm 1932, tại Thụy Điển năm 1934 [54] Trên thực tế, HFRS lần đầu tiên thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu cũng như giới y học là trong khoảng thời gian chiến tranh Triều Tiên (1951 – 1954) khiến khoảng 3.200 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện và 7% bệnh nhân tử vong [37, 54] Tiếp đó, vào đầu những năm 1940, các nhà nghiên cứu người Nga và Nhật Bản đưa ra những giả thuyết đầu tiên về tác nhân gây

bệnh cũng như vật chủ tự nhiên của chúng [13] Năm 1978, dựa trên kết quả thí

nghiệm dương tính trong phản ứng huyết thanh người bệnh với kháng nguyên tách từ

phổi của chuột đồng sọc vàng giống Apodemus agrarius và kết quả của các thí nghiệm

chứng minh sự lây truyền vi rút giữa các động vật gặm nhấm, các nhà nghiên cứu đã khẳng định vật chủ tự nhiên của vi rút Hanta là động vật gặm nhấm Dựa trên tiền đề

đó, vi rút gây ra HFRS được phân lập từ loài Apodemus agrarius và đặt tên là

Hantaanvirus theo tên con sông Haanta, nơi thu thập mẫu chuột [38, 42] Năm 1993,

sự gia tăng đột biến các ca bệnh suy hô hấp bất thường sau này gọi là HPS - Hội chứng phổi do vi rút Hanta ở vùng Tây Nam nước Mỹ với tỉ lệ tử vong cao [40] Các thí nghiệm nhanh chóng tiến hành và đưa ra kết quả dương tính giữa huyết thanh người bệnh với kháng nguyên của tác nhân gây bê ̣nh Kháng nguyên này được tách chiết trong mô của người bệnh cũng như trong các mẫu mô của động vật gặm nhấm thu thập quanh nhà các bệnh nhân Trong khoảng thời gian rất ngắn, các nhà nghiên cứu đã phân lập được loại vi rút Hanta mới từ chuột hươu Peromyscus maniculatus

và đặt tên là vi rút Sin Nombre [42] Tính đến thời điểm hiện tại có hơn 21 vi rút Hanta có khả năng gây bệnh cho người đã được phát hiện trên toàn thế giới [18]

1.2 Vi rút Hanta

1.2.1 Phân loại

Vi rút Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae - một họ lớn bao gồm

hơn 300 loài vi rút có khả năng gây nhiễm cho động vật, thực vật, con người và các

loài chân đốt [27, 66] Hantavirus bao gồm nhiều loài vi rút khác nhau được phân

thành các genotype (kiểu gen) và serotype – týp huyết thanh khác nhau [66] Mặc dù

có rất nhiều vi rút Hanta được phát hiện nhưng tính tới thời điểm hiện tại, chỉ có 24

vi rút Hanta được Ủy ban Quốc tế về Phân loại Vi rút (ICTV) chính thức phân loại, trong đó bao gồm cả những vi rút không gây bệnh cho người Theo ICTV, có bốn tiêu chuẩn để xác định các týp vi rút Hanta: (1) thuộc về ổ sinh thái duy nhất, ví dụ như tác động đến một loài hoặc phân loài gặm nhấm nhất định như là vật chủ chính; (2) khác biệt ít nhất 7% ở trình tự amino acid của glycoprotein bề mặt thuộc nucleoprotein của vi rút; (3) khác biệt ít nhất bốn lần về mức độ kháng thể trung hòa; (4) không hình thành sự tái sắp xếp tự nhiên với các vi rút Hanta khác [18] Tuy nhiên các tiêu chuẩn về phân loại còn gặp khá nhiều tranh cãi, thậm chí một số nhà nghiên cứu đưa ra đề nghị nên phân loại các vi rút Hanta không được liệt kê trong danh sách phân loại chính thức của ICTV thành các genotype và đặt tên viết tắt kết thúc bằng các con số [19] Bên cạnh đó, vi rút Hanta cũng được đề cập đến trong các tài liệu thống kê, dịch tễ và nghiên cứu với 2 nhóm chính: vi rút Hanta trong Cựu Thế Giới (Old World) và vi rút Hanta trong Tân thế giới (New World) [27, 37, 43] Sự phân chia này tương ứng với thời gian phát hiện ra các vi rút Hanta tương ứng gây bệnh HFRS và HPS [27] Ví dụ, các vi rút Hanta thuộc nhóm Cựu Thế Giới gây ra bệnh HFRS cho người có thể kể đến vi rút Amur, vi rút Seoul phân bố phổ biến tại Châu

Á cũng như vi rút Dobrava, vi rút Tula và vi rút Puumala phân bố chủ yếu tại Châu

Âu Nhóm vi rút Hanta Tân Thế Giới bao gồm các vi rút là tác nhân của gần 300 ca bệnh HPS mỗi năm tại các vùng Bắc và Nam Mỹ [43] Đặc điểm đặc trưng của vi rút Hanta là mỗi vi rút Hanta gây nhiễm đặc hiệu cho một loài vật chủ chứa nhất định,

vật chủ chứa đó phần lớn là các loài động vật gặm nhấm Trường hợp điển hình của

vi rút Hanta phân lập ở loài ăn sâu bọ là vi rút Thottapalayam (TPMV) phân lập được

ở chuột chù Suncus murinus [37, 40, 54, 57] Chính vì mối quan hệ gần gũi giữa vi

rút và vật chủ chứa, vi rút Hanta thường được nhắc đến trong các nghiên cứu theo vật chủ củ a chúng Bảng 1.2 trình bày các chủng vi rút Hanta phân loại theo động vật chủ

1.2.2 Hình thái

Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, hạt vi rút có hình cầu hoặc hình bầu dục với đường kính từ 80 – 120 nm [27, 34, 37, 66] Tuy nhiên, vi rút Hanta cũng có thể có hình dạng thon dài (170nm), hình thái này ít thấy ở các vi rút khác trong họ

Bunyaviridae [66]

Hình 1.1 Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét của vi rút Sin Nombre

(Vi ru ́ t phân lập được từ bê ̣nh nhận tại vụ dịch bệnh HPS năm 1993

ở vùng Tây Nam nước Mỹ)

1.2.3 Cấu trúc

Cấu trúc của vi rút Hanta bao gồm các ribonucleoprotein đóng gói bởi vỏ ngoài bao gồm 2 lớp lipid gắn với glycoprotein bề mặt [22, 27, 42, 44]

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo của hạt vi rút Hanta [37]

(L; M; S kí hiệu cho genome sợi đơn tương ứng với đoạn lớn,

đoạn trung bình và đoạn nhỏ; G: Glycoprotein)

1.2.3.1 Các protein cấu trúc của vi rút Hanta

Vi rút Hanta có 3 protein cấu trúc [42]

 Glycoprotein

Glycoprotein tiền thân (GPC) của vi rút Hanta được tổng hợp ở ribosome liên kết với màng lưới nội chất (ER) [42] Sau đó trong quá trình chuyển tới ER, GPC được protease nội bào phân chia thành glycoprotein trưởng thành G1 và G2 [42], [44] Các glycoprotein G1 và G2 tạo điều kiện cho vi rút có thể gắn lên các thụ thể màng trên bề mặt tế bào vật chủ [27, 42, 44] Cũng có nghiên cứu cho rằng G1 ứ c chế

tế bào vâ ̣t chủ sản xuất IFN-β – yếu tố quan trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch

củ a tế bào vâ ̣t chủ chống lại sự xâm nhập của vi rút [44]

 Protein nucleocapsid (Protein N)

Protein N bao gồm khoảng 433 amino acid (kích thước khoảng 50kDa) [44] Protein N tồn tại với mật độ cao trong tế bào chất của tế bào nhiễm vi rút Có thể phát hiện được protein N khoảng 6 tiếng sau khi tế bào bị nhiễm [42] Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các đáp ứng miễn dịch sớm phần lớn tác động đích đến Protein N Chức năng của Protein N là đóng gói vật liệu di truyền của vi rút vì vậy chúng đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ nhân lên của vi rút [42, 44]

 ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút (RdRp)

RdRp là protein lớn với trọng lượng phân tử trong khoảng 250 – 280 KD Do trọng lượng lớn nên RdRp rất khó để biểu hiện protein này bằng các phương pháp tái tổ hợp trên hệ thống tế bào vi khuẩn dùng để biểu hiê ̣n protein của gen Vì vậy có thể nói chúng là protein có nhiều đặc điểm chưa được làm rõ nhất ở vi rút Hanta RdRp thực hiện khá nhiều vai trò: phiên mã, nhân bản, endonuclease, tháo xoắn helix ARN Trong quá trình phiên mã RdRp tổng hợp mARN từ khuôn là sợi đơn âm ARN và nhân bản vật liệu di truyền của vi rút qua cARN (ARN bổ sung) [42]

1.2.3.2 Cấu trúc hệ gen vi rút Hanta

Vi rút Hanta mang vật liệu di truyền là sợi ARN đơn âm, chia thành 3 đoạn dựa trên trọng lượng phân tử [22, 27, 40, 43] Đoạn lớn L mã hóa cho ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút (RdRp); đoạn trung bình M mã hóa cho glycoprotein vỏ tiền thân (GPC) cho vi rút mà sau đó tạo nên 2 glycoprotein là G1 và G2 hay còn gọi là Gn và Gc; đoạn nhỏ S mã hóa cho protein nucleocapsid (N) [37,

40, 42, 44] Trình tự nucleotide tại đầu 5’ và 3’ của mỗi đoạn đều bắt cặp bổ sung theo cặp ba zơ tạo nên cấu trúc cán xoong “panhandle” [42]

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc hệ gen của vi rút Hanta

1.2.4 Quá trình nhân lên của vi rút Hanta

Các tế bào đích của vi rút Hanta trên cơ thể vâ ̣t chủ bao gồm: các tế bào nội

mô, tế bào biểu mô, đại thực bào, các tế bào gai nang và các tế bào bạch cầu Vi rú t xâm nhập vào các tế bào đích thông qua liên kết giữa glycoprotein của vi rút và các thụ thể trên bề mặt tế bào của vật chủ Vi rút Hanta có thể xâm nhập vào tế bào đích

thông qua màng tế bào Có thể mô tả quá trình này bằng 7 bước cơ bản như sau (1)

vi rút gắn glycoprotein của mình vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ; (2) vi rút xâm nhập vào tế bào đích bằng con đường nhập bào qua thụ thể trung gian sau đó giải phóng genome của chúng vào tương bào; (3) phiên mã thành ARN bổ sung (cRNA)

từ hệ gen ARN vi rút, tiếp đó là các mARN; (4) sử dụng bộ máy dịch mã của vật chủ dịch mã tạo các protein từ các đoạn mARN mã hóa cho các protein L, M và S; (5) nhân bản ARN củ a vi rút, kết hợp với protein N và vận chuyển đến mạng bộ máy Golgi; (6) tạo thành cấu trúc cơ bản củ a vi rút từ các thành phần tại bộ máy Golgi Riêng các vi rút Hanta thuộc loại Tân Thế Giới sự lắp ráp có thể xảy ra ở màng sinh chất; (7) giải phóng các hạt vi rút trưởng thành thông qua sự dung hợp giữa các bóng bào Golgi và màng sinh chất [27]

Hình 1.4 Chu ky ̀ nhân lên của vi rút Hanta [27]

1.2.5 Phương thức và khả năng gây bệnh

1.2.5.1 Phương thức gây bệnh

Loài gặm nhấm hoặc loài ăn sâu bọ được xác định là vật chủ của vi rút Hanta khi chúng có khả năng nhiễm vi rút trong thời gian dài, duy trì lượng vi rút trong cơ thể ở mức có thể truyền bệnh, nhưng vi rút lại không gây bê ̣nh cho các loa ̣i sinh vâ ̣t

này [28, 33] Vi rút Hanta được phát tán vào môi trường thông qua các hạt khí dung tạo nên bở i chất thải của vật chủ như phân, nước tiểu và nước bọt [28, 35] Các hạt khí dung chứa vi rút có khả năng tồn tại vài tuần và đây cũng là nguyên nhân lây nhiễm vi rút Hanta trong quần thể vật chủ [35] Phương thức truyền bệnh chủ yếu của

vi rút Hanta sang người là do hít phải các hạt khí dung bi ̣ nhiễm vi rút Hanta [25, 35,

54, 62] Ngoài ra còn có mô ̣t số đường truyền khác, nhưng hiếm xảy ra như: (1) qua vết cắn của động vâ ̣t nhiễm vi rút Hanta được báo cáo với vi rút Puumala [20, 54, 62]; (2) qua đường tiêu hóa như thức ăn hoặc nước uống; (3) lây truyền giữa người

và người do tiếp xúc gần gũi như quan hệ tình dục và/ hoặc hít phải các hạt khí dung chứa vi rút từ người nhiễm bệnh vô cùng hiếm và hầu như chỉ được báo cáo với vi rút Andes Tuy nhiên, qua nghiên cứu các bệnh nhân nhiễm HPS tại Chile năm 2007 cũng chỉ có thể đưa ra bằng chứng gián tiếp về phương thức lây truyền này [62]; (4)

qua các vật chủ phụ (spillover hosts) dựa trên một số lượng lớn nghiên cứu chỉ ra tỉ

lệ lớn động vật (chó, mèo, lợn) là động vật nuôi/ loài dại có kháng thể kháng vi rút Hanta Các kết quả này cho thấy nguy cơ nhiễm vi rút Hanta có thể tăng lên đối với các trường hợp nuôi thú cưng hoặc phải tiếp xúc với lợn như giết, mổ [62, 68]

1.2.5.2 Khả năng gây bệnh

Khả năng tồn tại của vi rút Hanta trong vật chủ có quan hê ̣ mật thiết với khả năng sống sót của chúng tại môi trường [68] Chính vì mối quan hệ gần gũi này, sự bùng phát dịch bệnh của vi rút Hanta liên quan tới (1) các yếu tố môi trường, bao gồm nhiệt độ, lượng mưa, độ ẩm, độ cao so với mặt nước biển, mức độ sử dụng đất đai Các yếu tố này ảnh hưởng đến mật độ của quần thể vật chủ và khả năng con người có thể tiếp xúc với vi rút lây nhiễm; (2) sự tiếp xúc thường xuyên giữa người

và vật chủ của vi rút Hanta liên quan tới các hoạt động, môi trường sinh sống hay

điều kiện làm việc ví dụ như nhóm đối tượng có nguy cơ lây nhiễm cao bao gồm: nhân viên diệt chuột, diệt sâu bọ côn trùng, nhân viên dọn vệ sinh phải tiếp xúc với các khu vực không có người ở thường xuyên, nhân viên làm việc với phòng thí nghiệm động vật, nhân viên làm việc trong kho hàng, người thích đi cắm trại trong rừng, cư dân sống ở ngoại thành gần đồng ruộng…; (3) miễn dịch cộng đồng liên quan tới tỉ lệ dân số bị nhiễm vi rút Hanta [62, 68] Một số yếu tố liên quan đến khả năng nhiễm vi rút Hanta đã được xác nhâ ̣n đó là nhóm đối tượng hút thuốc có nguy

cơ nhiễm vi rút Hanta cao hơn nhóm không hút thuốc khi hít phải hạt khí dung có chứa vi rút, điều này có thể giải thích do biểu mô khí quản phổi của người hút thuốc

ít có khả năng chống lại sự lây nhiễm của vi rút do bị suy giảm chức năng [62]

1.3 Đặc điểm lâm sàng của bệnh do vi rút Hanta

Tùy thuộc vào thể bệnh nặng hay nhẹ mà bệnh nhân có những biểu hiện lâm sàng khác nhau Nếu ở dạng thể nhẹ, bệnh nhân có các triệu chứng như cảm cúm bao gồm sốt, nhức đầu, đau cơ bắp, thường ở đùi, lưng và hông Ở thể nặng, bệnh nhân

có biểu hiện giảm tiểu cầu, xuất huyết, khó thở, suy hô hấp và suy thận, nếu không được điều trị kịp thời, người nhiễm bệnh có thể tử vong Thể nă ̣ng thường biểu hiê ̣n dưới hai hô ̣i chứng đó là sốt xuất huyết hô ̣i chứng thâ ̣n (HFRS) và hô ̣i chứng phổi do

vi rút Hanta (HPS), các thể này có tỷ lê ̣ tử vong cao, từ 35 - 50% [35]

1.3.1 Bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS)

Các ca bệnh lâm sàng HFRS được miêu tả với các triệu chứng sốt, suy yếu hệ

tuần hoàn kèm hạ huyết áp, xuất huyết và tổn thương thận cấp (acute kidney injury -

AKI) Bệnh này trải qua 05 giai đoạn điển hình: sốt, sốc hạ huyết áp, tiểu ít, tiểu nhiều

và cuối cùng là hồi phục [25, 54] Tuy nhiên, một hoặc hai giai đoạn thường gối lên giai đoạn khác hoặc một số giai đoạn của bệnh không xuất hiện đối với các ca mắc nhẹ Bên cạnh đó, một số ca bệnh còn để lại các di chứng có thể kể đến như: đau đầu, mất ngủ, xuất huyết và tăng bài niệu Các đặc điểm cụ thể của các giai đoạn mắc bệnh cũng như di chứng của bệnh được trình bày tại Bảng 1.1

Bảng 1.1 Các giai đoạn điển hình, triệu chứng và biến chứng của bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) [25] Giai đoạn Sốt Giảm huyết áp Tiểu ít Tiểu nhiều Hồi phục

Các đặc điểm chủ

Lượng nước tiểu giảm

Lượng nước tiểu tăng

- Rò rỉ mao mạch

- Có các triệu chứng liên quan đến đau phổi

- Lượng nước tiểu dưới 100ml/ ngày

1.3.2 Hội chứng phổi do vi rút Hanta (HPS)

HPS được nhắc đến là một bệnh cấp tính nghiêm trọng liên quan đến các triệu chứng khởi phát nhanh chóng của suy hô hấp và sốc tim với tỉ lệ tử vong khoảng 40% [27, 37] Nói chung, HPS mang một số đặc điểm tương đồng với HFRS bao gồm các triệu chứng về sốt, giảm tiểu cầu và bạch cầu, trừ đích tác động là phổi gây ra rò rỉ mao mạch thay vì thận như HFRS mặc dù cũng có một số vấn đề liên quan tới thận nhận thấy ở một số ca mắc HPS [27, 54].Về cơ bản, các giai đoạn mắc HPS được chia thành ba giai đoa ̣n, bao gồm: (1) giai đoạn sốt, (2) giai đoạn liên quan đến giảm chức năng phổi, tim và cuối cùng là (3) giai đoạn hồi phục Tại mỗi giai đoạn, biểu hiện bệnh sẽ xuất hiện khác nhau tùy thuộc vào loại vi rút mắc phải [27, 37] Giai đoạn sốt thường kéo dài từ 3 đến 5 ngày với một số triệu chứng liên quan đến đường

hô hấp tuy nhiên không bao gồm ho và viêm mũi Sau đó, bệnh nhân thường phát triển đến giai đoạn có những triệu chứng liên quan đến đường tiêu hóa như đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn và nôn [27, 37, 47] Các dấu hiệu đánh dấu sự bắt đầu của giai đoạn liên quan đến phổi bao gồm sự xuất hiện của các cơn ho, thở nhanh, nhịp tim tăng Ở giai đoạn này, có thể thấy giảm số lượng tiểu cầu, giảm mức protein, tăng dung tích hồng cầu và phát hiện sự hoạt động của các tế bào lympho [47] Diễn biến của HPS thường rất nguy cấp, từ 1 đến 3 ngày sau khi xuất hiện những triệu chứng liên quan đến đường hô hấp, bệnh sẽ phát triển những hội chứng rò rỉ trong mao mạch phổi, từ đó dẫn đến suy hô hấp kéo theo sốc tim [27] Bên cạnh đó, các triệu chứng của HPS rất đa dạng và phụ thuộc vào loại vi rút Hanta, chính vì các triệu chứng không đặc hiệu, các ca bệnh mắc HPS có khả năng không được phát hiê ̣n và chữa trị

kịp thời [37, 47] Thông thường các bệnh nhân HPS nhâ ̣p viê ̣n khi đã có triệu chứng khó thở, mất bù cấp hô hấp và xuất hiện phù phổi, giai đoạn này thường kéo dài khoảng 3 – 4 ngày nhưng cũng có một số bệnh nhân tử vong ngay sau khi nhập viện vài giờ [47] Tuy nhiên, đối với các bệnh nhân ở thể HPS sau khi hồi phục, thường không gây ra các di chứng lớn [46]

1.4 Dịch tễ học bệnh do vi rút Hanta

1.4.1 Tình hình di ̣ch tễ bệnh do vi rút Hanta trên thế giới và Việt Nam

Tại Châu Âu, hàng năm có 9.000 ca bệnh do nhiễm vi rút Hanta được báo cáo với xu hướng tăng dần về số lượng [66] Hầu hết các ca bệnh tập trung ở nước Nga, vùng lãnh thổ thuộc châu Âu với số ca bệnh trung bình là 7.476 ca từ năm 1999 đến

2008 [62] Các vi rút Hanta lưu hành chủ yếu tại đây bao gồm: vi rút Puumala gây ra dạng nhẹ của HFRS được mô tả rộng rãi khắp châu Âu; vi rút Dabrava là vi rút nguy hiểm nhất với tỉ lệ tử vong các ca bệnh lên tới 12% và là nguyên nhân của hầu hết các ca tử vong do HFRS trên toàn châu Âu; ngoài ra còn có vi rút Saaremaa và vi rút Seoul chiếm tỉ lệ nhỏ nguyên nhân của các ca bệnh [28, 35]

Ở Mỹ bệnh HPS do vi rút Hanta là vấn đề về sức khỏe cộng đồng, đặc biệt tại Nam Mỹ với số lượng các ca bệnh tăng theo mỗi năm [66] Từ năm 1993 tới 2014 đã

có khoảng 4.000 ca HPS gây ra bởi 30 chủng vi rút Hanta Các vi rút chủ yếu lưu hành tại đây là Sin Nombre, vi rút Andes, vi rút Choclo [62]

Châu Phi, mặc dù là khu vực mới phát hiện ra vi rút Hanta lưu hành khoảng

10 năm gần đây nhưng lại là nơi có nhiều vi rút Hanta phân lập từ các loài đô ̣ng vâ ̣t

ăn sâu bọ như dơi và chuột chù [35]

Châu Á là châu lục có lịch sử về bệnh nhiễm vi rút Hanta lâu đời nhất với các

ca bệnh HFRS là chủ yếu [62] Tỉ lệ 90% các ca mắc bệnh ở khu vực Đông Á [29]

Số lượng lớn các trường hợp mắc HFRS được báo cáo tại Trung Quốc với tổng số ca bệnh trên 1.400.000 ca trong đó khoảng 45.000 ca tử vong trong khoảng thời gian từ

1950 đến 2001 Tại Hàn Quốc, tổng số bệnh nhân mắc HFRS phải nhập viện từ năm

1951 đến 1986 là 14.309 và mỗi năm có 100 đến 300 ca mắc mới [27, 66, 67] Tại

Đông Nam Á, các vi rút Hanta gây bệnh qua loài Rattus đã được báo cáo, điển hình

là chủ ng vi rút Thái Lan (Thailandvirus – THAIV) tại Thái Lan, vi rút Seoul tại Indonesia, vi rút Haantan và vi rút Sin Nombre tại Malaysia [29, 35]

Tại Việt Nam, tỉ lệ chuột có kháng thể dương tính với vi rút Hanta là 14 – 34% [35] Cụ thể trong báo cáo của Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ năm 2010 đã có

những bằng chứng chứng minh sự lưu hành của vi rút Hanta tại Hà Nam, Thanh Hóa

và Hải Phòng [24] Điểm đáng chú ý là tỉ lệ mẫu huyết thanh dương tính với vi rút Hanta tại các nước Đông Nam Á vượt quá 5% [66] nhưng các trường hợp bệnh lâm sàng tại các nước này trong đó có Việt Nam lại chỉ được báo cáo lẻ tẻ (Hình 1.5) Điều này có thể do các biện pháp giám sát phát hiện ca bệnh chưa tốt cũng như chưa

áp dụng các phương pháp chẩn đoán thích hợp để xác định tỉ lệ mắc thực sự của bệnh hoặc kiểm soát các vấn đề, yếu tố về dịch tễ bao gồm cả ổ chứa

Hình 1.5 Phân bố các trường hợp bệnh lâm sàng nhiễm vi rút Hanta

trên thế giơ ́ i, năm 2000 [62]

1.4.2 Ổ chứa và nguồn truyền bệnh

Vật chủ tự nhiên của vi rút Hanta hầu hết là các loài động vật gặm nhấm và số ít là loài ăn sâu bọ [51, 54, 62] Các loài vật chủ này có đặc điểm chung là bị nhiễm

vi rút trong thời gian dài với các biểu hiện ở giai đoạn cấp tính lượng vi rút đạt đỉnh,

vi rút được đào thải với số lượng lớn ra ngoài cùng chất tiết như phân, nước tiểu, nước bo ̣t và tiếp theo giai đoa ̣n cấp là giai đoạn nhiễm dai dẳng [28] Điều đặc biệt là mỗi vi rút Hanta có động vật là ổ chứa nhất định [21, 27] Vì đặc thù này nên sự phân

bố địa lý và dịch tễ học của các bệnh do vi rút Hanta gây ra cho con người gắn liền

vớ i sự phân bố của vật chủ chứa chúng [27]

1.4.2.1 Loài gặm nhấm

Loài gặm nhấm có khoảng 2.200 loài trên toàn thế giới, chiếm 42% tổng số loài động vật có vú Các loài gặm nhấm có các đặc điểm sinh thái và sinh lý đa dạng

để có thể thích ứng với hầu hết các môi trường sống trên cạn [51] Các loài động vật

gặm nhấm là vật chủ của vi rút Hanta có thể được chia làm 2 họ: (1) họ Muridae, phân họ Murinae (chuột cống và chuột nhà); (2) họ Cricetidae được chia làm 3 phân

họ: Arvicolinae - phân bố chủ yếu ở vùng Âu Á và vùng Bắc Mỹ, Neotominae và Sigmodontinae phân bố rải rác ở châu Mỹ Cụ thể, Neotominae tập trung ở miền Nam Mỹ; Sigmodontinae tập trung ở miền Trung và miền Bắc Mỹ [27, 51] Các vi rút

Hanta cùng một phân họ vật chủ sẽ có phân bố địa lý giống nhau và theo sự phân bố của phân họ vật chủ đó [27]

Vi rút Hanta gây nhiễm cho các loài thuộc phân họ Murinae (thuộc họ

Muridae) và phân họ Arvicolinae (thuộc họ Cricetidae) thuộc nhóm vi rút Hanta Cựu

Thế Giới gây ra HFRS, phân bố chủ yếu ở Châu Á và Châu Âu Các loài điển hình là

vật chủ cho nhóm vi rút Hanta Cựu Thế Giới có thể kể đến là (1) giống Apodemus là

vật chủ của vi rút Hantaan, trong đó vi rút Amur phân bố tại Châu Á, còn vi rút

Dobrava và vi rút Saaremaa phân bố tại Châu Âu; (2) giống Rattus là vật chủ của vi rút Seoul phân bố tại châu Á; (3) giống Bandicota là vật chủ của vi rút Thái Lan phân

bố tại Châu Á; (4) giống Myodes là vật chủ của vi rút Puumala phân bố tại châu Âu; (5) giống Microtus là vật chủ của vi rút Tula phân bố tại châu Âu Trong số đó nổi bật là chuột cống Na-uy R novegicus có mật độ và địa bàn phân bố dày, rộng ở cả

khu vực thành thị, nông thôn Loài chuột này là vật chủ cho vi rút Seoul (SEOV) tìm thấy ở châu Âu, châu Mỹ và châu Á bao gồm cả Việt Nam [27, 51]

Tất cả các vi rút Hanta gây ra HPS thuộc nhóm vi rút Hanta Tân Thế Giới đều

liên quan tới các động vật gặm nhấm thuộc phân họ Sigmodontinae và Neotominae,

cũng là 2 phân họ có phân bố địa lý tại châu Mỹ Trong các vi rút Hanta thuộc nhóm Tân Thế Giới đã có hơn 30 vi rút Hanta được phân lập và mô tả tuy nhiên chỉ có 11 loại vi rút Hanta được ICTV chính thức phân loại như loài Một số vật chủ chính liên quan đến các vi rút điển hình có thể nhắc đến như:

- Giống Peromyscus phân bố địa lý tại Mỹ, Canada liên quan đến các vi rút Sin

Nombre, vi rút New York;

- Giống Oligoryzomys liên quan tới các vi rút Andes tại Argentina, Chile;

- Giống Holochilus là vật chủ của vi rút Rio Mearim tại Brazil [51]

Bảng 1.2 Sự phân bố địa lý của các vi rút Hanta gây bệnh cho người và trên

vật chủ tương ứng thuộc loài gặm nhấm [27, 51, 62, 66]

(bao gồm cả các vi rút Hanta chưa được ICTV phân loại chính thức)

cu ̉ a vi

ru ́ t

Phân bố địa lý

Biểu hiê ̣n

bê ̣nh

Vi rút Hanta trong Cựu Thế Giới (Old World)

Murinae

Apodemus agrarius Vi rút Hantaan HTNV

Trung Quốc, Nam Triều Tiên, Nga

HFRS

Apodemus flavicollis

Vi rút Belgrade DOBV Balkan HFRS

Dobrava-Apodemus agrarius

Vi rút Dobrava/

Belgrade (Kurkino)

Vi rút Dobrava/

Belgrade (Sochi)

DOBV

Khu vực phía Nam châu Âu thuộc lãnh thổ Nga

HFRS

Rattus norvegicus Vi rút Seoul SEOV

Toàn thế giới HFRS

cu ̉ a vi

ru ́ t

Phân bố địa lý

Biểu hiê ̣n

bê ̣nh

Apodemus agrarius

Vi rút Saaremaa SAAV Châu Âu HFRS

Bandicota indica Vi rút Thái Lan THAIV

Đông Nam

Apodemus peninsulae Vi rút Amur AMRV

HFRS/NE

Vi rút Hanta trong Tân Thế Giới (New World)

Sigmodontinae

và Neotominae

Peromyscus maniculatus

Vi rút Sin

Peromyscus maniculatus nubiterrae

Vi rút Monongahela MGLV Bắc Mỹ HPS

Peromyscus leucopus

Vi rút New

Sigmodon hispidus

Vi rút Black Creek Canal BCCV Bắc Mỹ HPS

Oryzomys palustris Vi rút Bayou BAYV Bắc Mỹ HPS

Oligoryzomys fulvescens Vi rút Choclo - Panama HPS

cu ̉ a vi

ru ́ t

Phân bố địa lý

Biểu hiê ̣n

bê ̣nh

Oligoryzomys longicaudatus Vi rút Andes ANDV

Argentina, Chile HPS

Oligoryzomys chocoensis Vi rút Bermejo BMJV Argentina HPS Oligoryzomys

flavescens

Vi rút Lechiguanas LECV Argentina HPS

Bolomys obscurus Vi rút Maciel MCLV Argentina HPS Oligoryzomys

longicaudatus Vi rút Orán ORNV Argentina HPS Calomys

laucha

Vi rút Laguna

Paraguay, Bolivia, Argentina

HPS

Bolomys lasiurus

Vi rút

Oligoryzomys nigripes Vi rút Juquitiba - Brazil HPS

* Chú thích trong bảng 1.3:

HFRS: Sốt xuất huyết hội chứng thận

HPS: Hội chứng phổi do vi rút Hanta

NE: Bệnh lý thận có yếu tố dịch tễ học

1.4.2.2 Loài ăn sâu bọ và một số loài mới

Vi rút Thottapalayam có vật chủ là chuột chù nhà Suncus murinus là vi rút

Hanta điển hình có liên quan tới vâ ̣t chủ là các loài đô ̣ng vâ ̣t ăn sâu bọ Đến nay có

21 vi rút Hanta được miêu tả có vật chủ thuộc các nhánh phân loại khác nhau của

chuột chù họ Soricidae, tuy nhiên chưa có mối quan hệ nào giữa các vi rút này và

bệnh HPS cũng như HFRS [51] Có thể nói các vi rút Hanta gây bệnh cho người chủ yếu có ổ chứa là các loài chuột mặc dù đã có những báo cáo về sự có mặt của vi rút Hanta ở dơi, mèo hoang thậm chí là chim [21, 27] Tới nay chưa có bằng chứng rõ ràng chứng minh các vật chủ chứa này là ổ chứa vi rút bền vững và gây nhiễm bệnh cho người [21] Một số nghiên cứu đưa ra giả thuyết có thể đây là kết quả của lây truyền tác nhân giữa các loài hay nói cách khác các vật chủ chứa này chỉ là vật chủ

phụ“spillover hosts” [51] Môi trường tự nhiên đang ngày càng biến đổi dẫn đến sự

chồng chéo các môi trường sống của các loài sinh vật, tạo điều kiện lây truyền tác nhân giữa các loài khác nhau dẫn đến nguy cơ bùng nổ dịch và sự xuất hiện của những loài vật chủ mới Điều đặc biệt là vi rút Hanta không gây bệnh cho vật chủ là ổ chứa của chúng nhưng được đào thải liên tu ̣c trong nước tiểu và nước bọt trong thời gian dài Phổi của vật chủ là ta ̣ng chứa lượng vi rút lớn hơn các bộ phận khác [35] Đây cũng chính là những nguyên nhân cho thấy tầm quan trọng của việc kiểm soát các ổ chứa mang vi rút là động vật

1.5 Chẩn đoán bệnh do vi rút Hanta trong phòng thí nghiệm

Chẩn đoán các ca bệnh nhiễm vi rút Hanta ở người cần dựa trên các thông tin

về lâm sàng, dịch tễ cũng như chẩn đoán phòng thí nghiệm Chẩn đoán cuối cùng không thể chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng đặc biệt ở các ca bệnh nhẹ, không có các triệu chứng cấp tính [53] Các ca bệnh cần chỉ định làm xét nghiệm bao gồm các bệnh nhân có kết quả thay đổi các chỉ số máu như giảm tiểu cầu, tăng bạch cầu và tăng lượng creatinine trong huyết thanh; sốt không rõ nguyên nhân, suy thận hoặc suy

hô hấp; bệnh nhân sống ở vùng có vi rút Hanta lưu hành hoặc bệnh nhân có những hoạt động ngoài trời có thể tiếp xúc với động vật gặm nhấm hay chất thải của chúng trong khoảng thời gian gần thời điểm phát bệnh [35, 53] Đối với chẩn đoán bệnh do

vi rút Hanta, phương pháp phân lập vi rút trên tế bào không phải là phương pháp thường quy có thể áp dụng đại trà Nguyên nhân do vi rút Hanta lây truyền qua đường

hô hấp và phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, tốn thời gian, khó khăn trong quá trình thực hiện, yêu cầu về cơ sở hạ tầng, chỉ có thể thực hiện đối với cán bộ được

đào tạo và phải tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp III và an toàn sinh học cấp IV [21, 27, 35, 59] Bên cạnh đó, một vấn đề cần lưu ý đó là tiến triển của HFRS cũng như HPS rất nhanh và thường gây nhầm lẫn với bệnh nhiễm trùng huyết hoặc bệnh nhiễm trùng xoắn móc câu Trong 12 – 24 tiếng, tiến triển bệnh có thể từ sốt chuyển sang giai đoạn viêm phổi nặng dẫn đến suy hô hấp và sốc tim [27, 58] Chính vì vậy, các thí nghiệm chẩn đoán được phát triển dựa trên phát hiện kháng thể đặc hiệu hoặc phát hiện hệ gen của vi rút Hanta sử dụng các kỹ thuật huyết thanh học và sinh học phân tử với độ chính xác cao và tiết kiệm thời gian Tương tự như vậy đối với phát hiện vi rút Hanta trên chuột do chúng gây nhiễm cho vật chủ nên trong cơ thể vật chủ có cả vi rút gây nhiễm và kháng thể đặc hiệu [58]

1.5.1 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học

Trong giai đoạn đầu phát triển các triệu chứng, các protein cấu trúc của vi rút Hanta bao gồm protein Gn, Gc, N kích thích vâ ̣t chủ ta ̣o kháng thể IgM/ IgG cao trong hầu hết các trường hợp mắc HFRS và HPS [27, 35, 53] Sau giai đoạn nhiễm cấp tính, kháng thể IgM có thể biến mất sau vài tháng mắc bệnh trong khi kháng thể IgG vẫn duy trì với mức cao trong cơ thể sau vài năm [35] Chính vì vậy, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học xây dựng dựa trên phát hiện kháng thể IgM/ IgG đặc hiệu đối với vi rút Hanta được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán các bệnh gây ra do nhiễm vi rút này [27] Độ nhạy và độ chính xác của các kỹ thuật phụ thuộc vào kháng nguyên được sử dụng [53] Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học bao gồm:

 Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA)

 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)

 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (ICT)

 Kỹ thuật thẩm thấu miễn dịch (Immunoblot)

 Kỹ thuật trung hòa (Neutralization)

Mặc dù IFA là kỹ thuật huyết thanh học được sử dụng vào những năm đầu tiên để chẩn đoán nhiễm vi rút Hanta trên người nhưng tới nay, ELISA là kỹ thuật phổ biến nhất [27, 53, 58] Kỹ thuật ELISA thường sử dụng các protein tái tổ hợp, điều này nhằm giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm cho kỹ thuật viên khi phải xử lý với lượng

lớn kháng nguyên vi rút Protein N là kháng nguyên được sử dụng nhiều nhất bên cạnh protein Gn và protein Gc [53] Kháng thể IgM kháng đặc hiệu với vi rút Hanta

là chỉ thị phân biệt các trường hợp bị mắc trong quá khứ và các trường hợp hiện mắc [25] hoặc sự khác biệt tăng 4 lần kháng thể IgG kháng đặc hiệu với vi rút Hanta Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA phụ thuộc vào kháng thể kháng vi rút cần phát hiện (loại vi rút Hanta cần chẩn đoán) Ví dụ đối với kháng thể IgM kháng vi rút Sin Nombre, Seoul, Hantaan, Dobrava và Puumala độ nhạy của phương pháp là 95,1% và độ đặc hiệu là 94,1% trong khi đó đối với vi rút Araraquara độ nhạy lên tới 97,2% và độ đặc hiệu là 100% [53] Chính vì vậy mặc dù với điểm yếu là có thể xảy

ra các phản ứng nhiễm chéo giữa các loại vi rút [35], phương pháp ELISA vẫn được

sử dụng phổ biến trong chẩn đoán cũng như các nghiên cứu sàng lọc và dịch tễ về loại vi rút này

Kỹ thuật thẩm thấu miễn dịch có độ đặc hiệu cũng như độ nhạy cao hơn kỹ thuật ELISA và được sử dụng là kỹ thuật khẳng định trong các trường hợp kết quả ELISA không rõ ràng tuy nhiên chúng cũng có nhược điểm là tốn thời gian và có chi phí cao hơn [35] Các kỹ thuật ELISA, IFA, immunoblot thường cho kết quả từ 4 đến

6 tiếng với kỹ thuật viên có kinh nghiệm, tay nghề thành thục [27] Một đặc điểm cần lưu ý là các kỹ thuật này có phản ứng chéo kháng nguyên giữa các vi rút Hanta khác nhau (bao gồm cả kỹ thuật hóa mô miễn dịch) Mặc dù điều này là lợi thế trong các nghiên cứu về vi rút Hanta vì có thể phát hiện ra loài mới nhưng sẽ gây khó khăn khi cần xác định loại vi rút Hanta cụ thể gây nhiễm cho ca bệnh [27, 35, 53]

Kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT) sử dụng vi rút Hanta sống và

các chủng khác nhau để xác đi ̣nh và đi ̣nh lượng kháng thể trung hòa đă ̣c hiê ̣u Do

vậy, kỹ thuâ ̣t này có đô ̣ đă ̣c hiê ̣u cao nhất trong các kỹ thuâ ̣t huyết thanh ho ̣c [25, 27] Tuy nhiên, kỹ thuật trung hòa giảm đám hoa ̣i tử là kỹ thuật rất phức tạp, đòi hỏi cơ

sở hạ tầng tối thiểu là an toàn sinh học cấp III, kỹ thuật viên có tay nghề và không thể phát hiện ra vi rút Hanta mới [27, 35]

1.5.2 Ca ́ c phương pháp sinh học phân tử

Các kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử với đặc điểm nổi trội là cho kết quả nhanh, độ đặc hiệu cao và có thể sử dụng các loại mẫu lâm sàng khác nhau như mẫu máu, mẫu mô, mẫu nước bọt, mẫu sinh thiết và có thể chẩn đoán ngay từ những ngày đầu khi bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng bệnh (từ 7 – 10 ngày), đặc biệt có thể thực hiện trên mẫu tử thi [20, 27, 35, 53] Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử bao gồm các kỹ thuật sau:

 Kỹ thuật PCR truyền thống; Nested PCR và kỹ thuật Real-time PCR xác định gen đặc hiệu đối với vi rút Hanta (thường sử dụng các mồi phát hiện gen đích trên đoạn S và M)

RT- Kỹ thuật Microarray và kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) là kỹ thuật

mở cho phép phát hiện hàng ngàn gen của vi rút

Các kỹ thuật sinh học phân tử rất hữu hiệu trong việc giám sát sự lưu hành của

vi rút hay nghiên cứu những biến đổi, tiến hóa của chúng Kỹ thuật Microarray và kỹ thuật NGS có ưu điểm lớn là phát hiện ra hàng ngàn gen của vi rút, thậm chí là toàn

bộ hệ gen tuy nhiên nhược điểm là quá tốn kém, yêu cầu không những về trang thiết

bị hiện đa ̣i, vật tư sinh phẩm tốn kém mà cần kỹ thuật viên có trình độ tin sinh ho ̣c cao, hơn nữa kỹ thuật quá phức tạp không thể áp dụng thường quy để phát hiện vi rút Hanta mà chỉ có thể áp du ̣ng trong nghiên cứu [35] Trong khi đó, kỹ thuật RT-PCR truyền thống được coi là “tiêu chuẩn vàng” cho việc phát hiện sớm các vi rút gây bệnh trong đó có vi rút Hanta [21] do có độ nha ̣y, đă ̣c hiê ̣u cao, có thể thực hiện kỹ thuật trên các loại mẫu lâm sàng khác nhau và trả kết quả trong ngày [27, 53] Bên cạnh đó kỹ thuật RT-PCR có thể thu được axit nucleic của vi rút và từ đó sử dụng trong các nghiên cứu về định loại, tiến hóa, phát sinh chủng loại của vi rút Hanta [35,

58, 66] Từ kỹ thuật RT-PCR truyền thống phát triển lên 2 kỹ thuật Nested RT-PCR

áp dụng đối với các mẫu có tải lượng vi rút trong mẫu ít [27] và kỹ thuật Realtime RT-PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian thực hiện ngắn [53] Mặc dù vậy 2

kỹ thuật này vẫn tồn tại các nhược điểm là thực hiện tốn thời gian (kỹ thuật Nested RT-PCR phải thực hiện 2 vòng, tăng nguy cơ nhiễm chéo dẫn đến dương tính giả),

phức tạp và chi phí cao (kỹ thuật Realtime RT-PCR cần thiết kế đầu dò có gắn huỳnh quang), không thu được axit nucleic để nghiên cứu sâu hơn (đối với kỹ thuật Realtime RT-PCR) [27, 35, 53] Chính vì vậy, kỹ thuật RT-PCR truyền thống nổi trội hơn cả với các đặc điểm nhanh, độ nhạy tốt, có thể thu được các đoạn trình tự cho các nghiên cứu sâu hơn, giá thành cũng chấp nhâ ̣n được

Phát hiện vi rút Hanta trên ổ chứa và động vật chủ

Vi rút Hanta và các thể bệnh do chúng gây nên là vấn đề y tế công cộng toàn cầu nhưng vẫn đưa được quan tâm đầy đủ ở một số khu vực thuộc châu Âu, Nam Mỹ

và châu Á trong đó có Việt Nam [58] Hơn nữa, động vật trung gian truyền bệnh phần lớn là các động vật gặm nhấm với khả năng sinh sản lớn đặc biệt là các loài chuột, có thể lây truyền bệnh do vi rút Hanta cho người qua cả con đường gián tiếp (khí dung

từ chất thải như phân, nước tiểu) hay con đường trực tiếp (cắn) [35] Với tình trạng gia tăng các ca nhiễm vi rút Hanta ở người cũng như sự lưu hành vi rút Hanta trên chuột được báo cáo ở châu Á, đặc biệt là các báo cáo về tính đa dạng của các chủng

vi rút Hanta lưu hành tại khu vực Đông Nam Á [26, 37] Việc nghiên cứu, áp dụng

kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vật liệu di truyền của vi rút Hanta trên các mẫu

mô của vật chủ (chuột) và mẫu bệnh phẩm lâm sàng của người là vô cùng cần thiết

để nghiên cứu về dịch tễ, dịch tễ học phân tử, tính đa dạng di truyền của vi rút Hanta giúp cho dự báo nguy cơ bùng phát dịch và thực hiện các biện pháp can thiệp hiệu quả phòng chống lây truyền bệnh từ động vật sang người

Các phương pháp phát hiện vi rút Hanta trên động vật chủ cũng tương tự như các phương pháp chẩn đoán bệnh do vi rút này trên người [58] Với các ưu điểm về giá thành, thời gian thực hiện nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp RT-PCR thường được sử dụng trong phát hiện vi rút Hanta trên động vật chủ [6, 9, 35] Ngoài các yếu tố về giai đoạn nhiễm vi rút, sự thành công của kỹ thuật RT-PCR phụ thuộc nhiều vào việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu [37] Hiện tại, các cặp mồi đặc hiệu

sử dụng trong kỹ thuật RT-PCR phát hiện vi rút Hanta được thiết kế dựa trên trình tự các đoạn S và M Nguyên nhân do 2 đoạn S và M mã hóa cho protein N và protein G tương ứng có trình tự bảo thủ cao giữa các loại vi rút Hanta [53] Đây cũng là 2 đoạn

gen được sử dụng cho các phân tích phát sinh chủng loại của vi rút này [29, 56, 60] Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới gen đích nằm trên đoạn gen M từ vị trí

1936 đến vị trí 2353 sử dụng cặp mồi trong nghiên cứu của Wang và cộng sự năm

2000 [60] Tuy nhiên khi ứng dụng cặp mồi này trong chẩn đoán và phát hiện vi rút Hanta tại mỗi phòng thí nghiệm, cần thiết phải tối ưu hóa điều kiện phản ứng phù hợp với trang thiết bị và các sinh phẩm sử dụng cũng như loại mẫu bệnh phẩm chẩn đoán

để phản ứng có hiệu suất, hiệu quả cao và đạt độ tin cậy tốt nhất

Đoạn gen M mã hóa cho glycoprotein tiền thân có mô típ WAASA (từ vị trí axit amin 644 – 648) được bảo tồn cao nhất giữa các chủng Hanta [22] Bên cạnh đó, nghiên cứu của Xiao và cộng sự năm 1994 đã chứng minh dữ liệu trình tự tốt nhất cho các nghiên cứu đa dạng của vi rút Hanta là vùng gen khoảng 330 nucleotide thuộc đoạn gen M (từ nucleotide 1987 – 2315) Đoạn trình tự ngắn này được chuẩn hóa tạo cây gia hệ giống như dữ liệu sử dụng trình tự cả đoạn gen M [63] Do hiệu quả của đoạn gen này trong phân tích đặc điểm di truyền, xác định kiểu gen, nhóm gen, dưới nhóm gen hoặc cluster của các chủng vi rút Hanta mà hầu hết các kỹ thuật chẩn đoán, giải trình tự để phân tích di truyền đều sử dụng đoạn gen này

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chuột được thu thập ở một số địa điểm giám sát thường quy trên địa bàn Hà Nội từ tháng 7/2015 đến tháng 7/2017

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: các địa điểm giám sát thường quy được chọn lựa bao gồm các chợ dân sinh, bến xe vâ ̣n tải, nhà ga, một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội

Có 7 địa điểm được lựa chọn thuộc 04 quận:

Quận Hoàng Mai: bến xe vận tải Nam Hà Nội, ga Giáp Bát

Quận Đống Đa: chợ Thái Hà, bệnh viện Đống Đa

Quận Ba Đình: chợ Thành Công, nhà máy Bia Hà Nội

Quận Hà Đông: bệnh viện Hà Đông

- Địa điểm thực hiện phân loại chuột và lấy mẫu phổi chuô ̣t: Khoa Sốt rét kí sinh trùng và Côn trùng – Trung tâm Y Tế Dự Phòng Hà Nội

- Địa điểm thực hiện xét nghiệm RT-PCR: Khoa xét nghiệm - Trung tâm Y Tế

- Thang chuẩnADN (GelPilot MidRange 100bp Ladder – QIAGENE, Đức);

- Cặp mồi khuếch đại gen M mã hóa cho protein G2 của vi rút Hanta, SEO-MF (mồi xuôi) và SEO-MR (mồi ngược) đã được tác giả Hua Wang và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền của vi rút Hanta tại Trung Quốc năm 2000 [60],

có trình tự nucleotide và sơ đồ mồi như sau:

Bảng 2.1 Trình tự mồi của kỹ thuật RT-PCR phát hiện vi rút Hanta

Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ – 3’) T m

Vị trí gắn trên genome

Kích thước sản phẩm đích

(mồi ngược) TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG 60.6

oC 2331 -

2353

Hình 2.2 Sơ đồ cặp mồi SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353

trên đoạn trình tự gen M

- Các sinh phẩm, hóa chất cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật RT-PCR

2.2.3 Trang thiết bị, dụng cụ

- Máy nghiền Mini-Beadbeater (Mỹ);

- Hạt nghiền thủy tinh, đường kính 0,1 mm;

- Máy PCR (Applied Biosystems; Mỹ);

- Máy chụp kết quả điện di Gel.doc;

- Máy định lượng ADN (Nano Drop, Mỹ);

- Máy giải trình tự gen ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (Applied Biosystems; Mỹ) với gel POP-6;

- Các trang thiết bị và dụng cụ cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tối ưu hóa quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta và xác định một số

thông số kỹ thuật cơ bản

2.3.1.1 Tối ưu hóa quy trình phát hiện vi rút Hanta sử dụng kỹ thuật RT-PCR

Thực nghiệm kỹ thuật RT-PCR sử dụng bộ mồi SEO-MF 1936 và SEO-MR

2353 với các điều kiện về (1) nhiệt độ bắt cặp, (2) số chu kỳ nhiệt chính, (3) thời gian kéo dài chuỗi để lựa chọn những điều kiện cho hiệu quả cao nhất Thử nghiệm được thực hiện trên mẫu chứng dương

 Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của bộ mồi

Thử nghiệm các nhiệt độ gắn mồi ở các nhiệt độ 50oC; 52oC; 55oC và 58oC để tìm ra nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp mồi sử dụng Thử nghiệm được thực hiện trên ARN chứng dương Mỗi thử nghiệm lặp lại 3 lần Chọn nhiệt độ bắt cặp có kết quả dương tính ở mẫu ARN chứng dương với băng sáng đậm nhất và tại mẫu ARN chứng

âm không xuất hiện băng ADN tạp

 Tối ưu hóa số chu kỳ của chu trình nhiệt chính

Các chu kỳ nhiệt được áp dụng thử nghiệm là 30, 35 và 40 chu kỳ ở nhiệt độ bắt cặp tối ưu Mỗi chu kỳ gồm có 940C/1phút, nhiệt độ bắt cặp tối ưu trong 1 phút,

720C/1phút, cuối cùng 720C/10 phút

 Tối ưu hóa thời gian kéo dài chuỗi

Phản ứng RT-PCR đã được tối ưu điều kiện nhiệt độ bắt cặp và số chu kỳ cho chu trình nhiệt chính sẽ tiếp tục thử nghiệm với 3 mức thời gian kéo dài là 72oC trong

1 phút; 1,5 phút và 2 phút nhằm tìm ra được một chu trình RT-PCR thích hợp nhất

2.3.1.2 Xác định một số thông số cơ bản của quy trình

 Giới hạn phát hiện của quy trình

Để xác định giới ha ̣n phát hiê ̣n, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu ARN chuẩn bậc 10 ở các nồng độ từ 100 đến 10-7 sau đó tiến hành phản ứng với các điều kiện đã được tối ưu Mỗi nồng độ chạy lặp lại 3 lần Giới ha ̣n phát hiê ̣n được xác đi ̣nh là nồng

đô ̣ ARN chuẩn pha loãng nhất mà ở đó còn cho kết quả dương tính ở tất cả các lần thử nghiê ̣m lă ̣p la ̣i

 Độ đặc hiệu

Để đánh giá độ đặc hiệu của quy trình, chúng tôi tiến hành áp dụng quy trình

đã tối ưu với một số tác nhân khác có cấu trúc hê ̣ gen tương đồng với vi rút Hanta là nhó m các vi rút arbo lưu hành chủ yếu ta ̣i Viê ̣t Nam như: 4 týp vi rút Dengue gây sốt xuất huyết, vi rú t viêm não Nhâ ̣t Bản Thử nghiệm áp dụng quy trình sử dụng các vật liệu di truyền của các tác nhân, mẫu chứng âm (vật liệu di truyền của chuột nhắt trắng swiss khỏe mạnh), mẫu chứng dương (mẫu ARN chuẩn) Vật liệu di truyền của các tác nhân sử dụng làm khuôn cho quy trình đã được xác nhận mang tác nhân đích

 Độ chụm của quy trình thông qua độ lặp lại

Độ lặp lại của quy trình được đánh giá dựa trên phân tích kết quả khi thử nghiệm với 2 nồng độ pha loãng của mẫu ARN chuẩn (100; 10-5)

Thử nghiệm 1: mỗi độ pha loãng lặp lại 03 lần (triplicate) trong cùng một phản ứng để đánh giá tính lặp lại của cùng một phản ứng Tiêu chuẩn chấp thuâ ̣n: các mẫu dương cho kết quả dương tính ở cả 3 lần lă ̣p la ̣i; độ đồng đều của các băng điện di ở cùng nồng độ tương ứng

Thử nghiệm 2: lặp lại 03 lần phản ứng khác nhau cho mỗi độ pha loãng trên

để đánh giá tính lặp lại giữa các lần phản ứng Tiêu chuẩn chấp thuâ ̣n: các mẫu dương cho kết quả dương tính ở cả 3 lần thử nghiê ̣m; độ đồng đều của các băng điện di ở cùng nồng độ tương ứng

2.3.2 Áp dụng quy trình RT-PCR đã được tối ưu hóa để phát hiện vi rút Hanta

trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng

2.3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu

Chuột được thu thâ ̣p bằng phương pháp đặt bẫy lồng tại các địa điểm giám sát, mỗi điểm giám sát đặt 50 bẫy lồng trong 3 đêm liên tục Thời gian đặt bẫy vào buổi chiều tối và thu bẫy vào sáng sớm hôm sau trước lúc mặt trời mọc [1]

Chuột sau khi thu thâ ̣p được vận chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành đi ̣nh loại theo phương pháp hình thái ho ̣c [5] dựa vào khóa xác đi ̣nh loài sau:

- Kích thước cơ thể;

- Màu lông của thân, đuôi, bu ̣ng, chi;

- Đă ̣c điểm củ a lông: Đô ̣ mềm, có gai hay không có gai, đô ̣ dài của lông;

- Chiều dài: chiều dài thân, chiều dài đuôi, chiều dài của đuôi so với thân;

- Kích thước so ̣: Chiều dài chung, chiều dài xương mũi, chiều dài bầu nhĩ, chiều

dài dãy răng hàm, đă ̣c điểm cung gò má;

- Hình da ̣ng của tai, mõm, lỗ khẩu cái;

- Hình thái, chiều dài răng cửa, đă ̣c điểm răng cửa, các núm mă ̣t nhai của răng… Chuột sau khi xác định loại cụ thể được gây mê bằng ether và phẫu thuật, mở lồng ngực lấy mẫu phổi Mẫu phổi được bảo quản trong tủ -80oC cho tới khi sử dụng

2.3.2.2 Kỹ thuật tách chiết và tinh sạch ARN tổng số từ mẫu phổi chuột

Được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp II

Nguyên lý: Tế bào trong mẫu phổi chuột khi cho vào dung dịch TRIzol sẽ bị

ly giải giúp ARN vi rút được gắn vào chất mang ARN Sau đó dung dịch được tách chiết theo bộ kít RNeasy Lipid Tissue Mini Kit của hãng QIAgen ARN tổng số sau tách chiết được bảo quản ở tủ -80oC cho đến khi sử dụng

Quy trình tách chiết và tinh sạch ARN tổng số được thư ̣c hiê ̣n trên máy Mini Beadbeater va ̀ bô ̣ sinh phẩm tách chiết ARN từ mô của Qiagen, quy trình tóm tắt như sau:

1) Cho 0,5 mL hạt nghiền thủy tinh kích thước 0.1mm vào ống tube chuyên dụng cho máy nghiền

2) Dùng pince lấy mảnh phổi có kích thước khoảng 3mm3 và chứng âm (phổi chuột lành, không mang tác nhân gây bệnh) cho vào tube nghiền chuyên dụng

đã ghi mã hoá mẫu

3) Thêm 1ml dung dịch tách triết TRIzolsau đó cho ống tube vào máy Beadbeater

để nghiền mô phổi, thời gian 03 phút

4) Ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 5 phút Thêm 0,2ml chloroform, trộn đều 5) Ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 3 phút

6) Ly tâm tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC.Sau khi ly tâm, hỗn dịch thu được sẽ có 3 pha: pha trên cùng không màu chứa RNA; pha ở giữa màu trắng và pha cuối cùng màu đỏ chứa các thành phần hữu cơ

7) Lấy pha trong ở phía trên (khoảng 600 µl), thêm 1 lượng tương đương ethanol 70%, vortex

8) Đặt cột lọc vào trong tube 2ml, cho 630 µl hỗn dịch mẫu trên vào cột, đậy nắp,

ly tâm tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút Sau đó chuyển cột sang một tube 2ml mới, loại bỏ tube cũ

9) Tiếp tục nhỏ mẫu còn lại vào cột và làm tiếp như bước trên cho đến khi hết dung dịch mẫu

10) Mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 700 µl dung dịch đệm RW1 Đóng nắp cột,

ly tâm tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 30 giây Chuyển cột sang tube 2ml mới Loại bỏ tube cũ

11) Mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 500 µl dung dịch đệm RPE Đóng nắp cột,

ly tâm tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 30 giây Chuyển cột sang tube 2ml mới Loại bỏ tube cũ

12) Tiếp tục cho vào cột 500 µl dung dịch đệm RPE Đóng nắp cột, ly tâm tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 30 giây Chuyển cột sang tube 2ml mới Loại bỏ tube

cũ

13) Ly tâm khô tốc độ 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

14) Chuyển cột vào tube sạch 1,5ml, mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 50µl nước cất không chứa ARNase, để ở nhiệt độ phòng 1 phút Ly tâm tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 1 phút Loại bỏ cột Thu tube chứa mẫu ARN

15) ARN được bảo quản trong hộp đựng mẫu ARN ở -80oC

Xác định độ tinh sạch và nồng độ của RNA sau tách chiết bằng phương pháp đo độ hấp thụ ARN trên máy Nanodrop:

- Tỉ lệ hấp thụ đo được tại bước sóng 260 và 280 nm nằm trong khoảng 1.9 – 2.1 thì ARN được coi là tinh sạch Nồng độ ARN được xác định dựa trên độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm

- Tất cả các mẫu ARN tách chiết đều được đo hàm lượng ARN 03 lần tại bước sóng 260nm để đảm bảo tính ổn định của quy trình tách chiết

Mồi xuôi SEO-MF 1936 (10 pmol/µl) 3 l

Mồi ngược SEO-MR 2353 (10 pmol/µl) 3 l

- Chu kỳ nhiệt: lựa chọn chu kỳ nhiệt đã tối ưu tại mục 2.3.1

Độ dài đoạn ADN khuếch đại: Đoạn ADN đặc hiệu được khuếch đại bằng RT – PCR,

sử dụng cặp mồi SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353 có độ dài là 418bp

2.3.2.4 Chạy điện di trên thạch agarose 1,5% va ̀ đọc kết quả phản ứng RT – PCR

- Viết sơ đồ điện di gồm thang ADN chuẩn, các mẫu bệnh phẩm, chứng dương, chứng âm