(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ THÔNG TIN VÀ TRUYỀN THÔNG

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ THÔNG TIN VÀ TRUYỀN THÔNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC MÁY TÍNH

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Việt Vũ

THÁI NGUYÊN - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn “ Nghiên cứu về nhận dạng tiếng nói ứng dụng vào điều khiển xe lăn ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kì học vị nào Trong phần kiến thức chung, nghiên cứu giải thuật áp dụng tôi có tham khảo ở một số tài liệu và đã có trích dẫn đúng và đầy đủ Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng khoa học và trước pháp luật

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017

Tác giả luận văn

Hà Thị Thu Giang

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy Vũ Việt Vũ, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này

Em cũng xin cảm ơn sự dạy dỗ và giúp đỡ nhiệt tình của tất cả các quý thầy cô tại trường đại học Công Nghệ Thông Tin và Truyền Thông Thái Nguyên Tất cả các kiến thức mà em được truyền đạt sẽ là hành trang quí giá trên con đường học tập, làm việc và nghiên cứu sau này

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Hà Thị Thu Giang

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN VỀ NHẬN DẠNG TIẾNG NÓI 3

1.1 Tổng quan về lĩnh vực xử lý tiếng nói 3

1.1.1 Tiếng nói là gì? 3

1.1.2 Biểu diễn tín hiệu tiếng nói 3

1.1.3 Các bài toán trong lĩnh vực xử lý tiếng nói 6

1.2 Nhận dạng tiếng nói 7

1.2.1 Khái niệm nhận dạng tiếng nói 7

1.2.2 Tổng quan về bài toán nhận dạng 9

1.2.3 Các bước xử lý trong bài toán nhận dạng tiếng nói 11

1.3 Các khó khăn gặp phải trong nghiên cứu về nhận dạng tiếng nói 14

1.4 Nghiên cứu về nhận dạng tiếng nói ở Việt Nam 15

1.5 Ứng dụng 16

1.6 Kết luận 16

Chương 2 17

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHẬN DẠNG TIẾNG NÓI 17

2.1 Mô hình Markov ẩn (Hidden Markov Model - HMM) 17

2.1.1 Chuỗi Markov 17

2.1.2 Mô hình Markov ẩn 18

2.1.3 Tính Likelihood: thuật toán Forward 21

2.1.4 Thuật toán Viterbi cho bài toán giải mã 25

iv

2.2 Mạng Nơ ron nhân tạo 28

2.2.1 Cấu trúc mạng Nơron 28

2.2.2 Mạng Nơ ron lan truyền thẳng một lớp 30

2.2.3 Mạng Nơ ron lan truyền thẳng nhiều lớp 31

2.2.4 Học trong mạng Nơ ron nhiều lớp 32

2.2.5 Học xây dựng cấu trúc mạng nơ ron 33

2.3 Mô hình âm học 34

2.3.1 Mô hình toán học của hệ thống nhận dạng 34

2.3.2 Đơn vị huấn luyện cho Tiếng Việt 34

2.4 Mô hình ngôn ngữ 35

2.5 Kết luận 36

Chương 3 37

MÔ PHỎNG HỆ THỐNG ĐIỀU KHIỂN XE LĂN BẰNG TIẾNG NÓI 37

3.1 Giới thiệu 37

3.2 Giới thiệu về hệ thống xe lăn và quy trình điều khiển 39

3.2.1 Giới thiệu về các thành phần chính của xe lăn 39

3.2.2 Quy trình điều khiển hoạt động của xe lăn 39

3.3 Nhiệm vụ và chức năng của hệ thống 40

3.3.1 Nhiệm vụ của hệ thống 40

3.3.2 Chức năng của hệ thống 40

3.4 Thiết kế hệ thống điều khiển xe lăn 40

3.4.1 Phần mềm, thư viện và CSDL nhận dạng 40

3.4.2 Các bước của giải thuật điều khiển xe lăn 41

3.4.3 Thiết kế phần mềm 43

3.5 Chạy thử 51

KẾT LUẬN 52

Những kết quả đã đạt được 52

Hướng phát triển tiếp theo của đề tài 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

FFT - Fast Fourier Transform

DFT - Digital Fourier Transform

ADC - Analog Digital Converter

MFCC - Mel Frequency Cepstrum Coeffient LPC - Linear Prediction Coding

PCA - Principle Components Analysis HMM - Hidden Markov Model

NNs - Neural Networks

BP - Back Propagation

ICA - Independent Component Analysis

DC motor - Dirrect Current

DCT - Discrete Cosine Transform

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chi Brugmansia

Chi Brugmansia là chi trong họ Cà (Solananceae) Chi Brugmansia trên thế giới có tám loài là B arborea , B aurea , B candida , B dolichocarpa, B

này chỉ có một loài là B suaveolens [1, 2]

1.2 Nghiên cứu hóa học chi Brugmansia

Tinh dầu lá và hoa loài B candida được các tác giả Geoffrey C Kite và

Christine Leon nghiên cứu Kết quả cho thấy, các hợp chất benzaldehyde, methyl benzoate, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, methyl salicylate,

benzyl benzoate, benzyl salicylate, α-thujene, α-pinene, β-pinene, limonene, 1,8-cineole, trans-ocimene, trans-sabinene hydrate, terpinolene, α-terpineol,

β-elemene, β-cedrene, [z]-α-trans-bergamotene, α-farnesene, trans-nerolidol,

cis,trans-farnesol, trans,trans-farnesol, trans,cis-farnesol, indole được tìm thấy

trong tinh dầu hoa; các hợp chất ethyl benzoate, methyl salicylate, α-pinene, trans-ocimene, perillene, α-elemene, [z]-α-trans-bergamotene, α-santalene, β- caryophyllene, [z]-α-cis-bergamotene, α-guaiene, cis,β-farnesol, γ-gurjunene,

β-selinene, β-bisabolene, β-sesquiphellandrene, trans-nerolidol, dendrolasin

và santalol acetat được tìm thấy trong tinh dầu lá [3]

Từ tinh dầu hoa loài B suaveolens các hợp chất heptanal, octanal, cineole, (E)-β-ocimene, γ-terpinene, linalool, nonanal, phenethyl alcohol,

1,8-terpinen-4-ol, 2-isobutyl-3-methoxypyrazine, α-terpineol, theaspirane A, theaspirane B, megastigmatrienone I, (E)-nerolidol, megastigmatrienone II, megastigmatrienone III, megastigmatrienone IV, pentacosane, heptacosane, nonacosane và hentriacontane đã được tác giả Samuel J Anthony và cộng sự thông báo [4]

Từ cặn nước của hoa loài B suaveolens được Alexander Garcia

Parker và cộng sự nghiên cứu tác dụng giảm đau trên chuột Nghiên cứu này đã được tiến hành để kiểm tra khả năng giảm đau của nó bằng cách sử dụng acetic axit gây đau bụng và đĩa nóng gây bỏng chân Cặn nước từ

hoa loài B suaveolens dùng với mức liều 100 và 300 mg/kg thể trọng

lượng ức chế đáng kể cảm giác đau do axit gây ra Tăng nhiệt độ tấm đĩa kim loại, các tác giả nhận thấy ở cả mức hai liều 100 và 300 mg/kg đều có khả năng làm giảm cảm giác đau [5]

Một số alkaloid tropane như hyoscine (scopolamine) (1) [6], atropine

(2) và scopolamine (1) [7] cũng đã được thông báo có mặt trong loài B

arborea Cặn metanol của loài này có tác dụng chống viêm, giảm đau, làm

lành vết thương, thông mũi, chống co thắt và đặc biệt là có tác dụng trong

điều trị bệnh thấp khớp [8] Cặn metanol và nước của B arborea có tác dụng

ức chế tái hấp thụ serotonin (5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C, D1, D2, 𝛼1 và 𝛼2) - hoạt tính chống trầm cảm [9]

B candida chứa các alkaloid tropane trong số đó có hyoscyamine (3) và

scopolamine (1) là chất có hoạt tính kháng cholinergic đã được sử dụng rộng rãi

làm thuốc giảm đau, an thần, chống co thắt và giãn đồng tử [10, 11, 12]

1.3 Giới thiệu cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Brugmansia suaveolens

Tên tiếng Việt: đại cà dược, cà độc dược cảnh

Chi: Brugmansia suaveolens)

có khi không cân; đầu nhọn; cuống dài 2-3 cm Hoa mọc thòng xuống, to, đơn độc hay xếp từng đôi, màu trắng, tràng hình hoa loa kèn

Hình 1.1 Hình ảnh cây đại cà dược

(Brugmansia suaveolens)

1.3.2 Công dụng theo kinh nghiệm dân gian

Trong y học cổ truyền Trung Hoa, nó là một trong 50 vị thuốc cơ bản, với tên gọi dương kim hoa

Theo Đông y, hoa cà độc dược có vị cay, tính ôn, có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau nhức Lá là vị thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe Ngoài ra còn điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng Người ta thường dùng lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn), dùng

lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn

Vì cây có độc tính cao nên chỉ dùng theo sự hướng dẫn của thầy thuốc Khi bị ngộ độc, có hiện tượng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô, khô cổ đến mức không nuốt và không nói được Chất độc tác động vào hệ thần kinh trung ương, có thể gây tử vong do hôn mê

Trong dân gian có rất nhiều bài thuốc dùng cây đại cà dược, tuy nhiên thành phần hóa học và giải thích những tác dụng trong dân gian chưa được các nhà khoa học trong nước nghiên cứu

1.3.3 Hợp chất scopolamine

Hợp chất scopolamine là một alkaloid có khung tropan, là este của scopinol và axit tropic Scopolamin (hyoscin) có tác dụng an thần mạnh gây ngủ, gây mê Trước đây scopolamine được dùng để điều trị đau do co thắt cơ trơn theo đường tiêm hoặc uống (đau dạ dày, đau đường ruột ) nhưng vì có nhiều tác dụng phụ nên hiện nay chỉ dùng trong sản xuất miếng dán chống say tàu xe [13] Liều cao của scopolamine có thể gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm, thậm chí là tử vong Theo các chuyên gia, scopolamine là một loại thuốc nhưng không giống bất kỳ thứ thuốc nào khác Một người có thể đang

đi và bỗng nhiên thành người khác một cách nhanh chóng sau khi bị thổi bột scopolamine vào mặt, chỉ một phút sau là người này bị kiểm soát

Các nghiên cứu về dược lý của scopolamine cũng chỉ ra rằng hợp chất này có tác dụng dược lý liên quan tới hệ thần kinh trung ương (gây kích thích hoặc trầm cảm), có ảnh hưởng tới hệ tuần hoàn, hệ tiêu hóa và trong một số trường hợp có thể sử dụng như là những chất giải độc Tuy vậy, với những liều lượng nhất định, scopolamine lại có thể gây tác dụng phụ như làm tăng nhịp tim, gây giãn đồng tử, mờ mắt [14, 15, 16]

Với các tác dụng phụ trên, giới tội phạm đã mệnh danh scopolamine như là “hơi thở của quỷ” Tại Columbia, giới tội phạm vẫn thường sử dụng scopolamine để kiểm soát tâm trí của những người khác để phạm tội Thực tế

đã có rất nhiều trường hợp báo cáo bị hại vì scopolamine, do đó, nhiều chính phủ đã khuyến cáo công dân của mình phải cảnh giác với tội phạm sử dụng

dược được bào chế từ cây Borrachero ở Colombia và có tác dụng gây mê, đồng thời có khả năng làm mất đi thần trí của con người và đưa con người vào trạng thái bị thôi miên Loại này được coi là loại thuốc đáng sợ nhất thế giới mà tội phạm thường dùng để xóa trí nhớ và làm mất ý thức tạm thời của nạn nhân, loại này cũng được giới tội phạm ở Việt Nam sử dụng trong thời gian gần đây

Scopolamine tồn tại ở dạng tự nhiên khá phổ biến trong một số loài

thực vật họ cà, trong đó có loài B suaveolens [17] Tuy vậy hàm lượng

scopolamine trong loài này đến nay vẫn chưa được thông báo Do đó cần thiết

có các phân tích định lượng hàm lượng của scopolamine trong loài B

suaveolens để có những cảnh báo hợp lý trong việc sử dụng hay tiếp xúc với

loài thực vật này, tránh các tác dụng phụ không mong muốn của scopolamine

1.4 Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.4.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung

môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng

với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất

để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong

khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlrofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình

[di-(2-etylhexyl)-chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…

Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng

có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn

chlorofrom

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu

được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính

tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết Ví dụ trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense

được chiết trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà

thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit

dễ nổ Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành

những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình

tạo thành chất không mong muốn

Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt

độ cao hơn

1.4.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khóa ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể

Ví dụ:

- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendorff và tác nhân Maye

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra

và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

- Các lacton của sesquitecpene và các glicosid trợ tim, phản ứng Kedde

có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.5 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến

và hữu hiệu nhất hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc

phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.5.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…)

Phương pháp sắc ký dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh Nguyên nhân của

sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ của các chất khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh

Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua

hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.5.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng

nhiệt Langmuir:

n =

n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b : Hằng số

C : Nồng độ của chất bị hấp phụ

1.5.3 Phân loại phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký:

- Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng

- Pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

 Theo bản chất của hai pha sử dụng

- Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silicagel đã được xử lý,

- Sắc ký phân bố (partition chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)

+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn

- Sắc ký hấp phụ (Adsorption chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin

- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học

là polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học

ở dạng ion Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation

- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng

- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)

+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở

+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao

+ Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp

 Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)

- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin - layer chromatography) Trong sắc ký giấy:

+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulose

+ Pha động: là chất lỏng

Trong sắc ký lớp mỏng:

+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực

+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng

- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)

+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh

+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột

 Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí

 Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký thành các nhóm nhỏ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

1.5.3.1 Sắc ký cột (CC)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ

là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể

Trong sắc ký, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau

Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5-1/10), tách

tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô

Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.5.3.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột TLC được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, TLC còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản TLC điều chế (bản được tráng sẵn silica gel

dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.6 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người

ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp

sắc ký so sánh,…

1.6.1 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân

mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV

- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là

phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử

và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

1.6.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng

độ dịch chuyển hoá học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm

1.6.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại carbon khác nhau Trên phổ DEPT, tín hiệu của các carbon bậc bốn biến mất Tín hiệu của CH và CH3

nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350 Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH

1.6.3.4 Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương

tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ

biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định

về cấu trúc

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây đại cà độc dược còn gọi là cà độc dược quả nhẵn, cà độc dược

cảnh (Brugmansia suaveolens) Phần trên mặt đất của cây cà độc dược (B

suaveolens) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai

Mẫu thực vật được TS Bùi Văn Thanh Viện Sinh thái, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Phần trên mặt đất cây đại cà dược được phơi khô, nghiền thành bột (5,0 kg), và chiết với metanol (3 lần x 10 lít) trên thiết bị chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1 giờ) Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 700 g cặn chiết metanol Phân bố cặn chiết metanol vào 2 lít nước cất sau đó chiết với dung môi diclometan (2 lần x 3 lít)

và thu được cặn diclometan (30 g) và lớp nước

2.2.2 Phương pháp phân lập các chất

Để phân lập các chất từ các phần chiết của cây, các phương pháp sắc ký

đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo

Sắc ký lớp mỏng (TLC): sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp của một số trong số các dung môi thường dùng như hexan, chlororfom, etyl acetat, aceton, methanol và nước Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường, silica gel pha đảo Silica gel pha thường có kích cỡ hạt là 0,040-0,063nm (240-430 mesh) Silica gel đảo YMC (30-50μm, Fujisilisa Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 (Misubishi Chem.Ind.Co.,Ltd)

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các chất là sự kết hợp xác định giữa các chỉ số hóa lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

• Phổ khối lượng (ESI-MS): Phổ khối lượng được ghi trên máy Agilent

1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

• Phổ khối phân giải cao (HR TOF-MS) được đo trên máy Varian 910 FT-ICR mass spectrOMeter của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500MHz) và 13NMR (125MHz), HMQC, HMBC được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR SpectrOMeter của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl Silan)

C-• Điểm nóng chảy (Mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler hotstage Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

micro-2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Xử lý mẫu dược liệu, chiết tách và phân lập các hợp chất

Xử lý mẫu dược liệu, chiết tách và phân lập các hợp chất đối với phần trên mặt đất cây đại cà dược được tiến hành theo cách thông thường với các loại cây dược liệu

Phần trên mặt đất cây đại cà dược được phơi khô, nghiền thành bột (5,0 kg) và chiết với metanol (3 lần x 10 lít) trên thiết bị chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1 giờ) Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi

dưới áp suất giảm thu được 700 g cặn chiết metanol Phân bố cặn chiết metanol vào 2 lít nước cất sau đó chiết với dung môi diclometan (2 lần x 3 lít) thu được cặn diclometan (30 g) và lớp nước

Từ cặn diclometan ký hiệu BSD, phân tách trên cột sắc ký pha đảo

RP-18 với hệ dung môi axeton/nước (1;1) thu được BS1 (30 mg)

Phân tách sơ bộ lớp nước qua cột trao đổi ion (Diaion HP-20) và giải hấp phụ với hệ dung môi tăng dần nồng độ metanol trong nước (50, 75, và

100 %) thu được 3 phân đoạn W1 (22 g), W2 (30 g) và W3 (10 g) Phân đoạn W2 (30 g) sau khi phân tách trên cột sắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi axeton/nước (1/3) và tinh chế lại bằng sắc ký cột silica gel sử dụng hệ dung

môi rửa giải etyl axetat/metanol/nước (3/1/0,1) thu được hợp chất BS2 (20 mg) và BS3 (25 mg) Trong quá trình tách, phân lập các chất dùng phương

pháp sắc ký bản mỏng (TLC) để lựa chọn dung môi chạy cột, gom các chất, kiểm tra chất sạch, …

Chi tiết quá trình phân lập các hợp chất từ că ̣n chiết MeOH của cây B

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các chất từ loài Brumansia suaveolens

H-13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δC: 58,6 (C-1), 56,4 (C-2), 56,1 (C-4), 58,7 (C-5), 29,4 (C-6), 67,1 (C-7), 29,6 (C-8), 39,1 (C-10), 172,8 (C-1’), 55,9

Chiết với MeOH (3 lần) Cất loại dung môi bằng áp suất giảm

Bổ sung nước

Bố sung diclometan

Lớp nước

Cột Dianion MeOH:H 2 O (50:50→ 100:0) Lớp diclometan

Phần trên mặt đất cây đại

W1 (22 g)

W2 (30 g)

MeOH:H 2 O(

(50:50)

MeOH:H 2 () (75:25)

MeOH:H 2 O (100:0)

BS1

(30 mg)

YMC Axeton:H 2 O (1:3→ 3:3)

(C-2’), 64,4 (C-3’), 137,5 (C-1’’’), 129,9 (C-2’’’, C-6’’’), 128,8 (C-4’’’), 129,2 (C-3’’’, C-5’’’)

2.3.2.2 Hợp chất BS2

Kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside 7-O- α -L-rhamnopyranoside

Bột vô định hình màu vàng ESI-MS: m/z 587 [M+Na]+ Công thức phân tử

C26H28O14 (M = 564)

1H -NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 6,44 (1H, d, 2,0 Hz, H-6), 6,81 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 8,10 (2H, d, 9,0 Hz, H-2’, H-6’), 6,9 (2H, d, 9,0 Hz, H-

3’, H-5’), 5,32 (1H, d, 5,5 Hz, H-1’’), 3,75 (1H, dd, 5,5, 7,0 Hz, H-2’’), 3,52 (1H, dd, 3,0, 7,0 Hz, H-3’’), 3,66 (1H, m, H-4’’), 3,21 (1H, dd, 5,5, 11,0 Hz, H-5’’), 3,57 (1H, dd, 5,5, 11,0 Hz, H-5’’), 5,55 (1H, s, H-1’’’), 3,41 (1H, s, H-

2’’’), 3,64 (1H, dd, 3,5, 9,0 Hz, H-3’’’), 3,0 (1H, t, 9,0 Hz, H-4’’’), 3,84 (1H, m, H-5’’’), 1,11 (1H, d, 6,0 Hz, H-6’’’),

13C -NMR (125 MHz, DMSO-d6): δC: 156,99 (C-2), 133,95 (C-3), 177,84 (C-4), 160,97 (C-5), 99,55 (C-6), 161,76 (C-7), 94,74 (C-8), 156,06 (C-9), 105,74 (C-10), 120,49 (C-1’), 131,23 (C-2’, C-6’), 115,53 (C-3’, C-5’), 160,58 (C-4’), 101,38 (C-1’’), 70,92 (C-2’’), 71,76 (C-3’’), 66,22 (C-4’’), 64,50 (C-5’’), 98,48 (C-1’’’), 70,19 (C-2’’’), 70,39 (C-3’’’), 71,76 (C-4’’’), 69,91 (C-

5’’’), 18,02 (C-6’’’)

2.3.2.3 Hợp chất BS3

Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside 7-O- α -L-rhamnopyranoside

Bột vô định hình màu vàng ESI-MS: m/z 617 [M+Na]+ Công thức phân tử

C27H30O15 (M = 594)

1H -NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 6,44 (1H, d, 2,0 Hz, H-6), 6,81 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 8,07 (2H, d, 9,0 Hz, H-2’, H-6’), 6,9 (2H, d, 9,0 Hz, H-

3’, H-5’), 5,46 (1H, d, 7,5 Hz, H-1’’), 3,19 (1H, m, 5,5, H-2’’), 3,21 (1H, m,

H-3’’), 3,08 (1H, m, H-4’’), 3,08 (1H, m, H-5’’), 3,32 (1H, m, H-5’’), 3,54 (1H, m,

H-6’’), 5,55 (1H, s, H-1’’’), 3,42 (1H, s, H-2’’’), 3,62 (2H, dd, 3,0, 9,0 Hz,

H-3’’’), 3,30 (1H, H-4’’’), 3,84 (1H, m, H-5’’’), 1,11 (1H, d, 6,0 Hz, H-6’’’),

13C -NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 156,84 (C-2), 133,52 (C-3), 177,68 (C-4), 160,91 (C-5), 99,42 (C-6), 161,63 (C-7), 94,54 (C-8), 156,03 (C-9), 105,71 (C-10), 120,75 (C-1’), 131,03 (C-2’, C-6’), 115,21 (C-3’, C-5’), 160,23 (C-4’), 101,82 (C-1’’), 74,24 (C-2’’), 76,46 (C-3’’), 69,94 (C-4’’), 77,57 (C-5’’), 60,87 (C-6’’), 98,42 (C-1’’’), 70,09 (C-2’’’), 70,30 (C-3’’’), 71,66 (C-

4’’’), 69,84 (C-5’’’), 17,94 (C-6’’’)

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng của hợp chất phân lập được

Máy móc thiết bị:

- Sử dụng hệ thống HPLC Alliance 2695, của hãng Waters- My ̃

- Cân phân tích Adam AAA 160L (d = 0,0001)

Chuẩn bị mẫu:

Xây dựng đường chuẩn:

Cân chính xác một lượng mẫu BS1 (9,5 mg) cho vào bình định mức (10 ml) sau đó định mức đến vạch bằng MeOH ta được dung dịch gốc (0,95 mg/ml) Pha loãng dung dịch gốc với MeOH để được các các dung dịch có nồng độ 0,19; 0,38; 0,475; 0,79 và 0,95 mg/ml, sau đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống HPLC với cột phân tích: Sunfire -C18 RP (4,6 x 150 mm), 5µm

Detector PDA : bước sóng 346 nm Thể tích mẫu bơm vào máy 10µl Các nồng độ BS1 chuẩn ở trên đã được đo lặp lại 3 lần, kết quả thu được có sự ổn định rất cao về giá trị tích phân (diê ̣n tích pic) và thời gian lưu (RT) Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp mà chúng tôi đã lựa chọn cho hệ thống HPLC là phù hợp cho việc phân tích định lượng BS1

Định lượng hợp chất BS1 trong dịch chiết B suaveolens:

Cân chính xác một lượng dịch chiết mẫu B suaveolens (0,85 g) cho

vào bình định mức 10 mL rồi hòa tan và thêm MeOH đến vạch định mức thu được dung dịch chiết tổng có nồng độ 85 mg/mL Đem phân tích nồng

độ BS1 trong dung dịch nhận được với điều kiện tương tự đường chuẩn, từ điện tích pic BS1 nhận được sẽ cho phép xác định hàm lượng mẫu BS1 có trong dịch chiết tổng

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Bằng các phương pháp sắc ký, từ cặn chiết trong methanol của cây đại

cà dược đã phân lập được 03 hợp chất sạch được ký hiệu là BS1, BS2 và BS3

δH 3.17 (m, H-1) và 3.28 (m, H-5) và tín hiệu của một nhóm metyl có nitơ ở

δH 2,52 (3H-10)

Hình 3.2 Phổ 1 H -NMR của hợp chất BS1

Phổ 13C NMR và HSQC chỉ ra sự hiện diện của một carbon cacbonyl

ở δC 172.8 (C-1), năm nhóm metin thơm ở δC 137,5 (C-1), 129,9 (C-2 và

6), 128,8 (C-4) và 129,2 (C-3 và 5), nhóm epoxy ở δC 56.4 (C-2) và 56.1 (C-4), một oxymetin ở δC 67,1 (C-7), một oxymethylene ở δC 64,4 (C-

3), hai methin liên kết với nitơ ở δC 58,6 (C-1) và 58.7 (C-5), hai nhóm methylen và một nhóm methyl

Dữ liệu 1H -NMR và 13C NMR của hợp chất BS1 (trong CD3OD) cho thấy sự tương đồng với các kết quả của scopolamine (trong CDCl3), cho thấy cấu trúc của cả hai hợp chất giống nhau (Bảng 3.1) [18]

Hình 3.3 Phổ 13 C -NMR của hợp chất BS1

Bảng 3.1 Dữ kiện phổ NMR của hợp chất BS1 và chất tham khảo

C * δ C δ C a,b δ H a,c (mult., J = Hz) HMBC (H  C)

Hình 3.4 Phổ HMBC của hợp chất BS1

Theo các mối tương quan HMBC được quan sát từ giữa δH 2,52 10) đến δC 58,6 (C-1) và giữa δH 3,57 (H-2) và δH 3,03 (H-4) đến và δC 58,7 (C-5) Các vị trí của các nhóm methyl và epoxy được chỉ định tương ứng với C-10 và C-4/C-5

(3H-Hình 3.5 Một số tương tác chính HMBC của hợp chất BS1

Cấu trúc tổng thể của BS1 sau đó được phân chia theo các tương quan HMBC giữa δH 3,79 (H-2’) đến δC 137,5 (C-1’’), 129,9 (C-2’’ và C-6’’), giữa δ 3,77 và 4,15 (H2-3’) đến và δC 172,8 (C-1’), 55,9 (C-2’), và 137,5 (C-1’’), và giữa δH 4,99 (H-7) đến δC 172,8 (C-1’) Dựa trên phân tích trên, hợp chất BS1 được xác định là scopolamine

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất BS1 (Scopolamine)

3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất BS2

Kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside 7-O- α -L-rhamnopyranoside

Hợp chất BS2 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng Trên phổ 1H -NMR của BS2 xuất hiện 2 tín hiệu thuộc hệ tương tác spin-spin AA’BB’ tại δH 6,90 (2H, d, J = 9,0 Hz) và 8,10 (2H, d, J = 9,0 Hz) gợi ý cho

sự có mặt của một vòng thơm thế para Bên cạnh đó, hai tín hiệu xuất hiện tại

δH lần lượt đặc trưng cho tín hiệu của hai proton H-6 và H-8 ở vòng A của một hợp chất flavone Ngoài ra, trên phổ 1H -NMR của BS2 còn quan sát thấy

tín hiệu của hai proton anome tại δH 5,32 (1H, d, J = 5,5 Hz), 5,55 (1H, br s),

và một nhóm metyl tại δH 1,11 (3H, d, J = 6,0 Hz)