Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học sinh sản và thử nghiệm sinh sản nhân tạo cá sọc ngựa danio rerio (f hamilton, 1822) nuôi tại khánh hòa

LỜI CAM ĐOAN Tôi là Lê Thị Thu Hà, là học viên lớp cao học CHNTTS2012-3, chuyên ngành Nuôi trồng Thủy sản, tôi xin cam đoan: Đề tài “Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học sinh sản và thử

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT VÀI ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC SINH SẢN

VÀ THỦ NGHIỆM SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ sọc NGỤA

Danio rerìo (F.HAMILTON, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN VÃN THẠC s ĩ

Khánh Hòa - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU MỘT VÀI ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC SINH SẢN

VÀ THỬ NGHIỆM SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ sọc NGỤ A

Danio rerio (F.HAMILTON, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC s ĩ

C huyên ngành: Nuôi trồ n g T hủy sản

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Quốc Hùng

Khánh H òa-2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Lê Thị Thu Hà, là học viên lớp cao học CHNTTS2012-3, chuyên ngành

Nuôi trồng Thủy sản, tôi xin cam đoan: Đề tài “Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh

học sinh sản và thử nghiệm sinh sản nhân tạo cá sọc ngựa Danio rerio

(F.Hamilton, 1822) nuôi tại Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu cùa riêng tôi, các

nội dung trong luận văn là do tự bản thân tôi tiến hành bố trí thí nghiệm, thu thập và phân tích kết quả Các tài liệu tham khảo và kết quả nghiên cứu của các tác giá khác được sử dụng trong luận văn này với mục đích phân tích và so sánh đã được trích dẫn đầy đủ, minh bạch và đúng các nguồn công bố Toàn bộ nội dung và kết quả nghiên cứu trong luận văn đều đảm bảo tính trung thực, có đủ độ tin cậy và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Lê Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nồ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều người Nhân đây tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Trước tiên, tôi xin bày tò lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Quốc Hùng và TS

Lê Minh Hoàng, những người đã định hướng và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cám ơn các thầy giáo, cô giáo trong Viện Nuôi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang, những người đã dạy dỗ, chỉ báo và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quãng thời gian qua

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến bạn bè, những người luôn bên cạnh giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn to lớn đến gia đỉnh và người thân đã luôn bên tôi, động viên giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong cuộc sống cũng như trong học tập.Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 5 năm 2014

Học viên

Lê Thị Thu Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM Ơ N ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẢT V DANH MỤC CÁC B Ả N G vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN 3

1.1 Môt sổ đặc điểm sinh học của cá sọc ngựa Danio rerio (F.Hamilton, 1822) 3

1.1.1 Đặc điếm phân loại, hình th ái 3

1.1.2 Phân bố và môi trường sống 4

1.1.2.1 Phân bố 4

1.1.2.2 Môi trường sống 5

1.1.3 Dinh dưỡng 6

1.1.4 Sinh sản 7

1.1.5 Các giai đoạn phát triến phôi 8

1.1.5.1 Giai đoạn phôi nang Blastula 9

1.1.5.2 Giai đoạn phôi vị _Gastrula 11

1.1.5.3 Quá trình hình thành cơ quan 11

1.1.5.4 Giai đoạn ấu trùng sớ m 13

1.2 Những nghiên cứu về cá sọc ngựa tại Việt Nam và trên thế giới 13

1.2.1 Trên thế giới 13

1.2.2 Ở Việt N am 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17

2.1 Địa điểm, thời g ian 17

2.2 Đối tượng nghicn cứ u 17

2.3 Vật liệu nghicn cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên c ứ u 17

2.4.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên c ứ u 17

2.4.2 Bố trí thí nghiệm 18

iii

2.4.2.1 Chăm sóc cá bố m ẹ 18

2.4.2.2 Phương pháp cá bố mẹ sinh sản 19

2.5 Thu thập số liệu 20

2.5.1 Nghiên círu một vài đặc điếm sinh học sinh sản 20

2.5.2 Thừ nghiệm sinh sản nhân tạo 21

2.5.2.1 Tỷ lệ thụ tinh (FR) .21

2.5.2.2 Tỷ lệ nở (H R ) 21

2.5.2.3 Quan sát sự phát triển của phôi .21

2.5.2.4 Đánh giá chất lượng ấu trùng 21

2.6 Xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Một vài đặc điểm sinh học sinh sản 23

3.1.1 Phân biệt cá đực, cá c á i 23

3.1.2 Các giai đoạn phát triển của buồng trứng 23

3.1.3 Anh hường của thức ăn lên hệ sô thành thục (GSI) 25

3.1.4 Ánh hướng của thức ăn lên sức sinh sản tương đối và sức sinh sán tuyệt đối 26

3.2 Thử nghiệm sinh sản nhân tạo 27

3.2.1 Chăm sóc cá bố mẹ 27

3.2.2 Tuyển chọn cá bố mẹ cho sinh sản 28

3.2.3 Bố trí thí nghiệm cho cá đé 28

3.2.4 Các giai đoạn phát triển của phôi 29

3.2.5 Ảnh hường của thức ăn lên tỷ lệ thụ tinh và tý lệ nớ 32

3.2.6 Ánh hưởng của thức ăn lên khá năng vận động của ấu trùng 33

3.2.7 Ảnh hưởng của thức ăn lcn tỷ lệ sống của ấu trùng cá sọc ngựa 33

3.2.8 Ảnh hưởng cùa thức ăn lên tốc độ sinh trướng đặc trưng về chiều d à i 34

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH MỤC CÁC T Ừ VIẾT TẮT

GSI : Gonado somatic Index (hệ số thành thục)

AF : Sức sinh sản tuyệt đối

RF : Sức sinh sản tương đối

FR : Tỷ lệ thụ tinh

HR : Tỷ lệ nở

ppt : Part per thousand

BW : Khối lượng toàn bộ cơ thể

GW : Khối lượng tuyến sinh dục

SGR l : Tốc độ sinh trưởng đặc trưng về chiều dài

SGRw : Tốc độ sinh trường đặc trưng về khối lượng TLS : Tỷ lệ sống

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điếm thủy lý, thủy h ó a 6

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng thức ăn tổng hợp sử dụng trong thí nghiệm 19

Bảng 3.1 Sức sinh sản của cá sọc ngựa khi cho ăn 3 loại thức ăn khác n h au 26

Bảng 3.2 Quá trình phát triển phôi cá sọc ngựa 30

Bảng 3.3 Kết quá tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ n ở 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá sọc n g ự a 4

Hình 1.2 Phân bố của cá sọc ngựa trong tự n h iê n 5

Hình 1.3 (A) Phôi sau vài phút được thụ tinh (B) Phôi giai đoạn 1 tế bào 8

Hình 1.4 Phôi cá sọc ngựa dưới kính hiển vi đảo n g ư ợ c 9

Hình 1.5 Mô hình phôi cá sọc ngựa giai đoạn phôi nang với 3 lớp tế b à o 10

Hình 1.6 Phôi cá sọc ngựa giai đoạn phôi n a n g 10

Hình 1.7 Mô hình phôi cá sọc ngựa giai đoạn phôi vị: 9 giờ và 10 giờ sau khi thụ tinh .11

Hình 1.8 Các cơ quan trong cơ thể cá sọc n g ự a 12

Hình 1.9 Miệng phát triển và bắt đầu hình thành s ắ c 13

Hình 1.10 Các công trình công bố liên quan đến cá sọc ngựa từ những năm 1970 - 2008 Số lượng các công trình bắt đầu gia tăng mạnh từ những năm 1990 và vẫn có khuynh hướng tăng cho đến nay .15

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứ u 18

Hình 2.2 Be nuôi cá sọc ngựa bố mẹ thí nghiệm 19

Hình 2.3 Bể cho cá đ ẻ 20

Hình 3.1 Hình dạng cá đực 23

Hình 3.2 Hình dạng cá cái 23

Hình 3.3 Biến động hệ số thành thục của cá sọc ngựa 25

Hình 3.4 Hình ảnh một số giai đoạn phát triển của phôi 31

Hình 3.5 Số lần xoay thân của cá trong 1 p h ú t 33

Hình 3.6 Ánh hưởng của thức ăn đến tỷ lệ sống của c á 34

Hình 3.7 Ảnh hường của thức ăn lên SGR l (% /ngày) 34 Hình 3.8 Ánh hưởng của thức ăn lên chiều dài của ấu trùng cá sọc n g ự a.35

vii

Cá sọc ngựa Danio rerio (F.Hamilton, 1822), là đối tượng cá cánh phổ biến thuộc

họ cá Chép Cyprinidae Cá có các đặc điểm hình thái và màu sắc độc đáo, có thể nuôi riêng hoặc nuôi kết hợp với các loài cá cánh khác trong bế cá cánh Với nhu cầu tiêu thụ cá cảnh ngày càng tăng như hiện nay, trong khi nguồn cung cấp cá cảnh chủ yếu dựa vào khai thác từ tự nhiên, đã đặt ra nhiều mối quan tâm đổi với các nhà khoa học, quản lý và bảo tồn Nuôi trồng thủy sản được xem là giải pháp hữu hiệu nhất đổ giảm thiểu các ảnh hưởng tiêu cực lên nguồn lợi tự nhiên và phát triển bền vừng ngành công nghiệp này

Ngoài ra, cá sọc ngựa Danio rerio còn là đối tượng thí nghiệm quan trọng trong

các nghiên cứu về di truyền học, thần kinh học và y học [42], Cá sọc ngựa trở thành

mô hình chính trong các nghiên cứu về độc chất học, sinh học thần kinh, sinh học phát triển và sinh học phân từ [55] Mỗi con cái có thể đẽ 50 - 200 trứng/ ngày, cá thụ tinh ngoài giúp dễ dàng quan sát và thao tác trên phôi ngay sau khi được thụ tinh, phôi phát triển nhanh chóng, đạt độ trong suốt hoàn hảo cho phép ghi lại hình ảnh thực trong quá trình phát triên cơ quan [9], Nhờ vào những ưu diêm trên nên cá sọc ngựa được coi là

sự lựa chọn hàng đầu cho các nghiên cứu về ảnh hưởng của độc tố lên sưu phát triển phôi [14]

Tuy nhiên, các nghiên cứu sinh học sinh sản trên cá sọc ngựa Danio rerio ở Việt

Nam còn rất hạn chế đã gây cản trở trong việc mở rộng phát triển đối tượng này tương ứng với tiềm năng

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học

sinh sản và thử nghiệm sinh sản nhân tạo cá sọc ngựa Danio rerío (F.Hamilton,

1822) nuôi tại Khánh Hòa” được thực hiện nhàm góp phần xây dựng quy trinh sản

xuất giống nhân tạo cá Danio rerio.

• Mục ticu của đề tài:

- Xác định được một số đặc điếm sinh học sinh sàn cá sọc ngựa Danio rerio nuôi

tại Khánh Hòa

- Nắm được quy trình sinh sản nhân tạo cá sọc ngựa Danio rerỉo nuôi tại Khánh

Hòa

• Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sàn chủ yếu của cá sọc ngựa Danio rerio

nuôi tại Khánh Hòa: Phân biệt đực cái, các giai đoạn phát triển của buồng trứng, hệ số thành thục, sức sinh sán tuyệt đối, sức sinh sản tương đối

- Thư nghiệm sinh sản nhân tạo cá sọc ngựa: chăm sóc cá bố mẹ, sự phát triển của phôi, tý lệ thụ tinh, tỷ lệ nở, khả năng vận động cùa ấu trùng, tốc độ sinh trướng đặc trưng về chiều dài, tỷ lệ sống của ấu trùng cá

• Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần cung cấp những dẫn liệu khoa học về đặc điềm sinh học sinh sản, thử nghiệm sinh sản, làm cơ sở cho

các công trình nghiên cứu khác về cá sọc ngựa Danio rerio.

- Ý nghĩa thực tiền: Xác định một số đặc điềm sinh học sinh sản và thử nghiệm

sinh sản nhân tạo cá sọc ngựa Dơnio rerio.

CHƯƠNG 1: TÓNG QUAN

1.1 Môt số đặc điểm sinh học của cá sọc ngựa Danio rerío (F.Hamilton, 1822)

1.1.1 Đặc điểm phân loại, hình thái:

Cá sọc ngựa Danio rerío là loài cá nước ngọt nhiệt đới, thuộc họ cá Chép

Cyprinidae [37] Loài cá này được mô tả lần đầu tiên ờ thế kỷ 19 bởi bác sĩ phẫu thuật Francis Hamilton Ông đã cho xuất bán một báo cáo về các loài cá này, theo đó nó được tìm thấy ở sông Hằng và các nhánh của sông Hằng vào năm 1822 Trong nghiên cứu của mình, Francis Hamilton đã phát hiện được 10 loài cá thuộc giống Danio

Trong đó, loài cá sọc ngựa Danio rerio đã được phân vào chi Brachydanio [54], Đốn

năm 1991, Barman lại phân Danio và Barachydanio thành 2 giống khác nhau tuy nhiên ông không chỉ ra được đặc điểm ricng biệt của từng giống [6]

Các nghiên cứu đầu tiên dựa trên việc nghiên cứu sinh học phân tứ để phân loại được tiến hành năm 1993 bời Meyer và các cộng sự Trong nghiên cứu cùa mình, ông

đã tiến hành phân tích DNA 16S và 12S của 9 loài cá khác nhau thuộc giống Danio Từ kết quả phân tích của mình, Meyer và các cộng sự đã kết luận Danio là một giống riêng

biệt, và gồm 2 loài có đặc điềm thân dầy (Danio rerio) và thân mỏng (Barachydanio

rerio) [36, 57] Kết quá này cũng trùng với kết quá trong các nghiên cứu sinh học phân

tử sau này được thực hiện bới Mc Clure (năm 1999), Parichy và Johnson (năm 2011) [34, 40] Tuy nhiên,vào năm 2002, Sanger và McCune kết hợp nghiên cứu sinh học phân tứ và nghiên cứu hình thái học nhằm đã đưa ra một kết quả hoàn toàn trái ngược,

theo đó tồn tai hai loài Danio rerio và Barachydanio rerio khác nhau [43],

Be mặt hai bên của cá Danìo rerìo có những sọc vằn chạy dọc phần thân và vây nên

được gọi với tên là cá sọc vằn hay cá sọc ngựa Không giống như nhiều loài của họ cá chép Cyprinidae, kích thước của cá sọc vằn nhỏ hơn nhiều, cá trưởng thành có chiều dài

từ 3-5 cm Cá sọc ngựa được thuần từ tự nhiên có thế sống từ 3 - 5 năm, trong nghiên cứu năm 1991 của Talwar, ông đã tìm thấy cá thể có tuổi thọ lên đến 5,5 tuổi [52]

Loài: Danio rerio (F.Hamilton, 1822) [39]

Hình 1.1 Hình dạng ngoài cua cá sọc ngựa [611

Tên tiếng Anh: Zebrafish

Tên tiếng Việt: Cá sọc ngựa, cá ngựa vằn

1.1.2 Phân bố và môi trường sống

1.1.2.1 Phân bố

Trong tự nhiên, cá sọc ngựa phân bố ở Ấn Độ và Nam Á, chú yếu tại lưu vực sông Hằng và sông Brahmaputra ở phía đông bắc Án Độ, Bangladesh và Nepal Những nghiên cứu hóa thạch của loài cá này cũng cho thấy sự hiện diện của loài cá này ở Indus, Cauvery, Pennar, Godavari và lưu vực sông Mahanadi Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của Streisinger năm 1981 đã chi ra sự phân bổ của loài cá này cũng có trên lưu

vực sông Krishnavà ở các bang Rajasthan, Gujarat và Andra Pradesh (lưu vực sông đố

ra biền Á Rập) cũng như phía Bắc Myanmar và Sri Lanka [6],

Hình 1.2 Phân bố của cá sọc ngựa trong tự nhiên [4]

1.1.2.2 Môi trường sống

Trong nghiên cứu của Engeszer và các cộng sự tiến hành năm 2007, ông cho rằng ngoài môi trường tự nhiên, cá sọc ngựa sinh trướng và phát triển trong những môi trường nước nhiệt có độ khoảng từ 24,6-38,6°C [21] Hwang và các cộng sự (năm 1995) cho rằng 28,5°c là nhiệt độ tối ưu cho sự sinh và phát triển của cá sọc ngựa [27],

Đây là loài sống đáy, thường được tìm thấy ờ nhũng nơi có dòng nước tĩnh hoặc nước chảy chậm, đặc biệt là các con mương gần ruộng lúa [28, 49, 51] Tuy nhiên, vẫn thấy loài cá này ở các con suối mà chủ yếu ở phần hạ lưu hay phổ biến trong các khe suối nhỏ [13], nơi có tốc độ dòng chảy chậm [35] Cá sọc ngựa sống ờ vùng nước nông, độ sâu khoảng 30 cm, nơi ít tán cây, thực vật thùy sinh, nền đáy thường là bùn hoăc là bùn sói, do đó phần lớn cá tập trung ỡ vùng bãi bồi hơn là ven các con sông.

Bảng 1.1 Một số đặc điểm thủy lý, thủy hóa

Địa điểm Độ trong

(cm)

pH Độ mặn (ppt)

Độ sâu (cm) Nhiệt độ (°C)

Nguồn tham khảo

India, Uttar Pradesh >35 8.2 Không

thu được Không thu được

27 [34]

India, Uttar Pradesh >35 8 Nt Nt 32 [34] India, West Bengal >35 7.9 Nt Nt 34 [34] Bangladesh

những loài sinh sản ấu trùng trong nước, đặc biệt là ruồi và muỗi, do đó cá sọc ngựa được xem là cỏ vai trò trong việc kiêm soát muỗi [18] Cá sọc ngựa ăn thức ăn ở cả 3 tầng nước: tầng mặt, tầng giừa và tầng đáy Bên cạnh đó, có sự biến động về thành phần thức ăn trong tự nhiên theo các mùa trong năm ở loài cá này Trong một nghiên cứu của Spence và các cộng sự, dựa trên việc lấy mẫu trong 12 tháng, thành phần chế

độ ăn của cá sọc ngựa có sự khác biệt rõ ràng giữa các mùa [46].

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, sau 3 ngày tuổi, cá tiêu hóa hết noãn hoàng

Từ 4 - 8 ngày tuổi, thức ăn ưa thích của cá sọc ngựa là rotifera, ngoài ra có thể thay thế thức ăn rotifer bàng lòng đỏ trứng gà vẫn cho tỉ lệ sống cao (90 - 94%) nhưng dề làm đục nước, khó chăm sóc Từ 8 - 15 ngày tuổi, ngoài rotifera cỡ lớn cá còn

ăn moina cỡ nhò, kết hợp cả 2 sẽ cho kết quả cao nhất với tỉ lệ sống (86 - 90%) Từ 15

- 30 ngày tuổi cho ăn moi na và trùn chỉ [1].

1.1.4 Sinh sản

Trong thời gian đầu phát triên, tuyến sinh dục của cá đực và cá cái đều giống nhau, chưa phân biệt được con đực, con cái Chi có thế phân biệt được con đực, con cái khi cá đạt chiều dài cơ thê 10 - 15mm, tương đương với 5 - 7 tuần sau khi cá nở Tuyến sinh dục của con đực phát triển hoàn chinh vào khoảng tháng thứ 3 (lúc này cơ thê cá đạt chiều dài 12 - 17mm), tùy thuộc vào điều kiện môi trường và điều kiện chăm sóc [15, 32].

Chu kỳ sinh sản của cá ngắn, một cá thổ đạt đến độ tuổi trưởng thành và tham gia sinh sản lần đầu khi đạt 3 tháng tuỏi Sinh sản của cá xảy ra khi có nhừng biến đối của nhiệt độ Trong tự nhiên, mùa vụ sinh sản hằng năm của cá bắt đầu vào mùa mưa.

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, giống cá sọc ngựa thuần chủng được nuôi quanh năm, và khà năng sinh sản của nỏ phụ thuộc nhiều vào thức ăn [4] Ngoài ra, sự thành thục sinh dục có liên quan mật thiết tới kích thước cơ thê cá hơn là tuổi của cá

Cá sọc ngựa hoang dã và cá thuần có kích thước thành thục tương tự nhau mặc dù tốc

độ tăng trưởng khác nhau [20] Eaton and Farley đã chỉ ra rằng: cá sọc ngựa thuần chủng được nuôi ở 25°c sẽ thành thục sau 75 ngày, khi con cái đạt chiều dài 24,9mm

và con đực dài 23,lmm Và cá sọc ngựa hoang dã được nuôi trong phòng thí nghiệm cũng thành thục sinh dục khi chiều dài cơ thể đạt 23,lmm [45].

8Trong suốt thời gian đẻ, con đực luôn bơi theo con cái [20] và một con cái có thể đẻ vài trăm trứng 1 đợt đẻ Một số nghiên cứu đã chí ra rằng: chu kỳ sinh sản của con cái kéo dài 4 - 5 ngày [3, 53] Và con cái chỉ đẽ trứng khi có sự xuất hiện và tiếp xúc với con đực.

Cá sọc ngựa đẻ trứng rời, có đường kính khoảng 0.7mm Trứng cá màu trong suốt, phần noãn hoàng được cô lập thành phần riêng biệt Trứng cùa loài cá này được thụ tinh và phát triến bên ngoài môi trường, sau khi đẻ ra thì lắng xuống đáy và không cần sự chăm sóc của cá bố mẹ Những trứng không được thụ tinh thì không trải qua các giai đoạn phân chia tế bào [31] Theo nghiên cứu của Lee và các cộng sự năm

1999, ông cho ràng trong khoảng 48 - 72 giờ sau khi thụ tinh ở nhiệt độ 28.5°c thì cá

nở, thời gian nở dài hay ngắn là tùy thuộc vào độ dày của màng tế bào trứng và sự vận động của phôi thai Một cơ thể cá cái có thể cho khoáng 100 - 200 trứng cho một lần sinh sản, thời gian cá thành thục trong thời gian 3 tháng [23],

1.1.5 Các giai đoạn phát triển phôi

Quá trình phát triển phôi được kích thích bời ánh sáng và chu kỳ sáng tối tự nhiên của cá là 14 giờ sáng: 10 giờ tối Trứng cá sọc ngựa nhỏ (đường kính khoảng 0,5

- 0,6 mm trước khi được thụ tinh), có noãn hoàng lớn Bao xung quanh trứng là một lớp ngoại tế bào gọi là vỏ noãn hoàng, và bên ngoài lớp vỏ này là một màng đệm cứng [11]

Hình 1.3 (A) Phôi sau vài phút được thụ tinh (B) Phôi giai đoạn 1 tế bào [62]

Cá sọc ngựa thụ tinh ngoài Sau giai đoạn bắt cặp ngắn, cá cái đẻ trứng và cá đực tưới tinh trùng lên trứng Tinh trùng cá được giải phóng ra môi trường nước và xâm nhập vào trứng qua lồ khổng trên màng đệm Tinh trùng đầu tiên gặp bề mặt

trứng sẽ bám vào các vi nhung mao trên bề mặt trứng Các vi nhung mao kéo dài đế tạo nón thụ tinh trong khi tinh trùng dung hòa với màng trứng, lỗ khổng sau đó sẽ đóng lại ngăn chặn hiện tượng nhiều tinh trùng xâm nhập Khoảng 12 phút sau thụ tinh, màng đệm ngấm nước căng hoàn toàn, lúc này đường kính cùa trứng có thể tăng lên tới lmm Phôi phát triên toàn diện trong 96 giờ ở 28,5°c (Hình 1.4) Các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi là công cụ cung cấp chính xác cho việc nghicn cứu sự phát triên Bởi vì những phôi khác nhau sẽ phát triển theo những tỷ lệ khác nhau [11],

Hình 1.4 Phôi cá sọc ngựa dưói kính hiến vi đảo ngược [63]

1.1.5.1 Giai đoạn phôi nang_ Blastula

Giai đoạn phôi nang bắt đầu từ khoảng 2 giờ 15 phút đến 5 giờ 30 phút sau khi trứng được thụ tinh (hoặc được tính từ lần phân cắt thứ 7) ở 28,5°c Trong giai đoạn phôi nang sớm, đTa phôi có dạng quả bóng, các tế bào tiếp tục phân chia đạt trên 128 tế bào, và trở nên đồng bộ, tạo nhiều lớp tế bào phôi (blastomere) Khi bước vào lần phân cắt thứ 9, phôi đi vào giai đoạn chuyển giao phôi nang giữa (mid-blastula transition), chu kỳ tế bào kéo dài, các tế bào trong phôi bì tạo thành 3 lớp phân biệt Lớp đầu tiên (hình thành trong lần phân cắt thứ 9 và 10) được gọi là lóp họp bào noãn hoàng (yolk syncytial layer - YSL) Lớp này được tạo ra khi các tế bào xung quanh rìa phôi bi (blastoderm) dung họp với noãn hoàng bên dưới, tạo thành vòng nhân Vòng nhân dịch chuyến họp nhất với các nhân từ vùng rìa phôi bì cuối cùng tạo thành một lớp nhân hoàn chinh nằm dưới phôi bì Sau đó, các tế bào ngoài cùng của phôi bì thiết lập tạo lớp vó dày là EVL (enveloping layer) Lớp thứ ba là lớp tế bào ờ giữa EVL và YSL (lóp dcep cells) Lớp tế bào ở giữa sẽ tạo thành thề phôi Lóp EVL sau đó hình thành chu bì (periderm) đê báo vệ phôi phát triên Lớp YSL sẽ kéo các tê bào bao phủ

10noãn hoàng, quá trình bao phù bắt đầu xảy ra vào giai đoạn phôi nang muộn và diễn ra trong suốt giai đoạn phôi vị [11] (Hình 1.5).

Hình 1.5 Mô hình phôi cá sọc ngựa giai đoạn phôi nang vói 3 lóp tế bào |60|

Blastoderm: phôi bì, Enveloping:, Internal yolk suncytial layer: thể phôi, Yolk syncvtial nuclci: tế bào ờ giữa, External yolk syncytial layer: họp bào noãn hoàng,

Microtubules: ống dẫn nhò

Giai đoạn phôi nang là giai đoạn các gene của phôi được kích hoạt (trước đó các gene bị kiếm soát thông qua các tín hiệu được tích trừ trong trứng trong suốt giai đoạn hình thành trứng) (mRNA từ mẹ) Sự kích hoạt bộ gene của phôi được gọi là sự chuyển giao sang giai đoạn phôi nang giữa và được bắt đầu tại lần phân chia tế bào thứ mười [14],

Hình 1.6 Phôi cá sọc ngựa giai đoạn phôi nang [59]

(A) Phôi nang sớm

(B) Phôi nang giữa

(C) Phôi nang muộn

1.1.5.2 Giai đoạn phôi vị Gastrula

Ó 28,5°c, giai đoạn phôi vị bắt đầu từ khoáng 5 giờ 30 phút tới 10 giờ sau khi trứng được thụ tinh, phôi bì trải rộng được khoảng một nửa noãn hoàng (bao phủ 50%) Các tế bào ở rìa phôi bì bắt đầu hướng vào trong và trãi rộng trên đỉnh YSL Ket quả tạo ra hai lớp bên trong các tế bào, lớp ngoại phôi bì ở trcn (cpiblast) và lớp nội bì

ờ dưới (hypoblast) Lớp ngoại phôi bì tạo thành ngoại bì (lớp mầm tạo biểu bì của da

và hệ thần kinh); lớp nội bì tạo thành trung phôi bì (lóp mầm tạo cơ, xương, và hệ tuần hoàn, thận, hệ sinh sản và tuyến sinh dục) và nội bì (lớp mầm tạo hệ tiêu hóa và ruột).Khi phôi bì hoàn tất quá trình bao phù noãn hoàng, đầu và chồi đuôi được hình thành Phôi bước vào giai đoạn hình thành các cơ quan [11]

Hình 1.7 Mô hình phôi cá sọc ngựa giai đoạn phôi vị: 9 giờ và 10 giờ

sau khi thụ tinh [9]

1.1.5.3 Quá trình hình thành CO' quan

Sự hình thành cơ quan diễn ra nhanh, hầu hết những kết cấu cơ quan thô sơ được hình thành trong 24 giờ phát triển Đối với phôi gà, ở 38°c, sau 24 giờ mới chỉ hình thành được hệ thần kinh và 4 cặp đốt sống, nhưng đối với phôi cá sọc ngựa, ở nhiệt độ 28,5°c đã hình thành được đầy đủ 30 cặp đốt sống, tim đập và tạo sắc tố ở mắt và da [11],

Hình 1.8 Các cơ quan trong cơ thể cá sọc ngựa [62j

Giai đoạn phân đốt song (Segmentation): Cặp đốt sống đầu tiên tạo thành sau

10 giờ phát triển, và từ đó sau mỗi nửa giờ sẽ hỉnh thành thêm một cặp mới Điều này

có nghĩa là trong vòng vài giờ, ta có thề quan sát một vài cặp đốt sống

Ống thần kinh: Giống như đốt sống, hệ thần kinh cũng được tạo thành Đĩa thần kinh xuất hiện trong 10 giờ cũng giống như cặp đốt sống đầu tiên (giai đoạn chồi) Sau

đó đĩa thần kinh gấp lại vào trong tạo thành ống thần kinh (13 giờ), và sau đó là đường thần kinh (16 giờ) Đường thần kinh tạo lồ hình thành nên ống thần kinh lõm (bắt đầu lúc 18 giờ, khi phôi đạt 18 đốt sống) Vùng não vào lúc này có thể bắt đầu được xác định là những chỗ sưng phồng phân biệt gọi là đốt thần kinh (neuromere) Khi đạt 18 giờ, có 10 đốt thần kinh theo thứ tự từ trước tới sau, 3 đốt đầu tiên tương ứng với não cùng, não trung gian, não giữa và 7 đốt cuối cùng tương ứng với não sau

Hỉnh thành vòm hầu họng (Pharyngeal): Sau 24 giờ, phôi bắt đầu phản ứng với

sự đụng chạm và sự tạo thành sắc tố trờ nên rõ rệt Trong vùng hầu họng, hàm và nắp mang được tạo thành từ hai vòm hầu họng đầu tiên và các vòm họng sau đó cũng được hình thành rõ rệt (cũng được gọi là vòm mang tạo thành mang)

Đường viền bên: Hệ thống đường viền bên gồm một loạt các đường ống chứa cấu trúc cám ứng gọi là khối thần kinh giác quan (neuromast), đề phát hiện những chuyến động chậm trong nước và do đó sẽ thông tin cho cá về đổi thủ trong phạm vi

gần Khi đạt giai đoạn 18 đốt sống, nó bắt đầu di chuyển trong biếu bì, di chuyến giữa hai đốt sống sau mỗi giờ và tới đuôi khi được 40 giờ.

Nở: Phôi thoát nang trong vòng 48 - 72 giờ Trong suốt quá trình thoát nang, phôi tiếp tục tăng trưởng theo cùng tý lệ với các giai đoạn trước Quá trình hình thành hình thái của nhiều co quan đã khá hoàn thiện và chậm hơn đáng kề ngoại trừ ruột và các cơ quan có liên quan Có thể dỗ dàng quan sát sự phát triển nhanh của vây ngực, hàm và mang [14]

1.1.5.4 Giai đoạn ấu trùng só'm

Vào ngày thứ 3 sau khi nớ, ấu trùng cá sọc ngựa hoàn thiện hầu hết quá trình phát sinh hình thái và tiếp tục tăng trưởng nhanh Có nhiều thay đổi xảy ra trong suốt những ngày kế tiếp như bong bóng căng phồng, miệng tiếp tục phát triển, các dải sắc

tố sáng dần và kco dài, noãn hoàng ờ bụng cũng kco dài ra Các ống ruột tập trung nhiều ở bụng và có thể quan sát được dễ dàng Khác với giai đoạn phôi, ấu trùng ở giai đoạn sớm bắt đầu bơi một cách linh hoạt và cử động hàm, vây ngực và mắt Những phát triển này giúp cá đáp ứng trốn thoát kẻ thù, hô hấp và tìm thức ăn [11]

Hình 1.9 Miệng phát triển và bắt đầu hình thành sắc [ 11Ị

1.2 Những nghiên cứu về cá sọc ngụa tại Việt Nam và trên thế giói.

1.2.1 Trên thế giới

Từ lâu cá sọc ngựa (Danio rerio) được sử dụng đe nghiên cứu sự đa dạng trong

nhiều lĩnh vực sinh học thủy sản Trong hai mươi năm trờ lại đây, cá sọc ngựa được coi là một mô hình động vật xương sống nôi bật dùng cho những nghiên cứu về di truyền, phát triển Qua nhiều nãm, các nhà nghiên cứu đà rút được những ưu điểm mang tính thực tiễn như khả năng sinh sản cao, kích thước cơ thề nhỏ, chu kỳ sinh sản ngắn, phôi trong suốt có thế quan sát dễ dàng, tập tính theo đàn, đo độc tố trong môi trường thủy sinh, sự điều hòa áp suất thẩm thấu, tính tương đồng trong di truyền với con người [30], Chúng đã góp phần không nhỏ trong việc nghiên cứu về bệnh và sự

14phát triển trên người Ngoài ra chúng còn được đánh giá cao như là những mô hình dùng cho nghiên cứu hành vi tập tính, sinh lý cá và đo độc tố trong môi trường thủy sinh.

Cá sọc ngựa là loài cá cánh phô biến, nó được sử dụng làm mô hình trong nghiên cứu sinh học phát triển từ nhiều năm nay [11] Nổi bật phải kế đến nghiên cứu của Streisinger vào năm 1981, ông là người tiên phong trong việc áp dụng di truyền sinh học phân tử trcn cá sọc ngựa để nghicn cứu về quá trình phát triển phôi của động vật

có xương sống [50]

Cá sọc ngựa là loài có xương sống đầu tiên được sử dụng để nghiên cứu về đột biến gen [25], Những nghiên cứu này tiến hành năm 1996 tại Boston [17] và Tübingen [26], đã tạo ra được hơn 4000 đột biến và do đó dẫn đến việc xác định được hơn 400 kiểu gen khác nhau kiểm soát sự phát triển của động vật có xương sống.Cá sọc ngựa ngày càng trở thành đối tượng quan trọng trong các nghiên cứu sinh học của lĩnh vực y học [16, 44],

Các thí nghiệm được tiến hành trên bộ gcn của cá sọc ngựa thay vì thực hiện trực tiếp trên con người đã cho ra những kết quả tích cực, nhằm hiếu rõ thêm về tác nhân và nhùng biểu hiện cùa một số loại bệnh nguy hiểm trcn người do những thay đổi trên bộ gen gây ra Các phương pháp tiếp cận di truyền theo chiều thuận và di truyền ngược đã được sử dụng trong cá sọc ngựa nhằm giải thích những mô hình đột biến do gen gây ra trên cơ thể người Nghiên cứu như vậy có thể xác định các gen tương tác để tạo ra mô hình đa gcn ở bệnh cho người giúp xác định các loại thuốc đổ điều trị

Sử dụng cá sọc ngựa trong mô hình phát triên: Phương pháp tiếp cận di truyền

đã được sử dụng trong cá sọc ngựa đế xác định vai trò của gen liên quan đến sự phát triển của vật có xương sống cơ quan, mô và tế bào Một số ví dụ bao gồm phát triển hệ thống tim mạch [41] các nội bì, tế bào thần kinh vận động và các cấu trúc sọ mặt [22, 56] có liên quan đến cấu trúc của cá

Ngoài ra, cá sọc ngựa còn được sử dụng làm sinh vật chi thị cho chất lượng môi trường nước MG Akande, L Noưgren và o Stefan (năm 2010) đã sử dụng cá sọc ngựa làm vật chỉ thị đánh giá chất lượng nước của một nhà máy xử lý nước thải ở Thụy Điển Cá đưc, cá cái trưởng thành được bố trí tiếp xúc với nguồn nước thải trong 22 ngày Và sau đó tiến hành theo dõi khả năng sinh sán, khả năng thụ tinh của cá Ket

quà nghiên cứu: Khi cá tiếp xúc với nguồn nước đã được loại bo trầm tích thì cho kết quả sinh sản và thụ tinh cao hơn so với các đối chứng (cá tiếp xúc với nước thải chưa được loại bò trầm tích) Cá tiếp xúc với nguồn nước được xử lý bằng phương pháp lọc sinh học và lọc ozone thì khả năng sinh sản giảm [5].

Ngày nay, cá sọc ngựa được sử dụng chủ yếu trong sinh học phân tử, sinh học thần kinh và các nghicn cứu di truyền Gần đây nó đã được đưa vào nghicn cứu bệnh ung thư, thử nghiệm các loại thuốc Một trong những lý do cá sọc ngựa được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm là chi phí thấp chì bằng 1/1000 lần so với việc sử dụng chuột bạch [24],

Trong các nghiên cửu gần đây, số lượng các nghiên cứu ứng dụng cá sọc ngựa ngày càng tăng Hiện nay ước tính có khoảng 5.000 nhà nghiên cứu làm trong 450 phòng thí nghiệm trên toàn thế giới làm việc với cá sọc ngựa [55],

Gần đây, nhiều nhóm nghiên cứu đã công bố những nghiên cứu về lịch sừ tự nhiên, dinh dưỡng, tập tính sinh sản của cá sọc ngựa, số công trình nghiên cứu trên cásọc ngựa ngày càng tăng

Hình 1.10 Các công trình công bố liên quan đến cá sọc ngựa từ những năm 1970 -

2008 Số lượng các công trình bắt đầu gia tăng mạnh từ những năm 1990 và vẫn có

khuynh hướng tăng cho đến nay [49]

1.2.2 Ở Việt Nam

Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Thạc Sĩ Phan Kim Ngọc, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh công bố đã chuyển genc phát sáng gfp từ sứa

16sang cá sọc ngựa thành công bằng kỹ thuật bắn gene với khoáng cách 6, 9, 12 cm (Lê Thành Long, 2009).

Năm 2011, Nguyền Thị Hạnh Tiên và cộng sự thuộc trường đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và đại học Ghent — Bi, đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng cua nhiệt độ đến quá trình kết nối các đốt sống và tạo dị tật xương sống ở cá sọc ngựa

Năm 1994, Nguyền Hoàng Kiến Giang, sinh viên ngành nuôi trồng thủy sản trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã khảo sát một số đặc điềm sinh học và

sinh sản cúa cá sọc ngựa (Brachvdanio rerio).

Năm 2009, Nguyễn Thị Thu Giang, sinh viên trường Đại học Nông Lâm Tp

Hồ Chí Minh đã nghiên cứu việc sứ dụng cá sọc ngựa làm mô hình động vật thủy sinh dùne đề “Đánh giá tác động của Cadmium lên quá trình phát triển của cá sọc ngựa

(Danio rerio) ở giai đoạn phôi, ấu trùng và cá trưởng thành”.

Ớ Việt Nam, ngoài các công trình công bố đã nêu ỡ trên thì không có công trình nào công bố về loài cá này Vì thế, nghicn cửu đặc điếm sinh học sinh sản và thử

nghiệm sinh sản nhân tạo cá sọc ngựa Dcmio rerio nhằm cung cấp thông tin và cơ sỡ

dữ liệu về loài cá này ở Việt Nam Ngoài ra nghiên cứu còn góp phần vào việc xây

dựng quy trình sán xuất giống nhân tạo cá Danio rerio.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Địa điểm, thòi gian:

- Địa điểm bố trí thí nghiệm: Phòng thí nghiệm sinh học nghề cá - Viện nuôi trồng thủy sản, Trường Đại Học Nha Trang.

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2013 đến tháng 6/2014.

2.2 Đối tương nghiên cứu:

Cá sọc ngựa Danio rerio (F.Hamilton, 1822)

Cá sọc ngựa được thu mua tại các cửa hàng cá cảnh trên địa bàn Nha Trang - Khánh Hòa.

Cá sọc ngựa bố mẹ được thu mua tại các tiệm cá cảnh trên địa bàn Nha Trang

có độ tuổi từ 2 tháng tới 2 tháng rưỡi Được cho ăn bằng 3 loại thức ăn: tổng hợp, tổng hợp + trùn chỉ, trùn chỉ Sau 2-3 tuần tiến hành kiểm tra Khi thấy phần lớn trứng đạt đến giai đoạn rv thì bố trí thí nghiệm sinh sản.

2.3 Vật liệu nghiên cứu:

Vật liệu chính nghiên cứu bao gồm: cá sọc ngựa bố mẹ, thức ăn công nghiệp, trùn chỉ, bộ đồ giải phẫu, cân điện tử, máy sục khí, kính hiển vi.

2.4 Phưong pháp nghiên cứu

2.4.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.4.2 B6 tri thi nghiem

2.4.2.1 Chsim s6c c£ bo me

Ca bo me dugc bo tri rieng biet vao sau 6 trong be kinh C) moi 6, co 30 ca the,

va sue khi 24/24 gia, cac yeu to moi truang dugc kiem soat nhu nhau.

Co 3 nghiem thuc:

Nghiem thuc 1: Cho ca bo me an thuc an tong hgp.

Nghiem thuc 2: Cho ca bo me an ket hgp thuc an tong hgp va trim chi.

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng thức ăn tổng họp sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn giành cho cá kiếng nhỏ của hãng Kao Kui, sản xuất theo công nghệ Đài Loan

- Chuấn bị bê cho đẻ: Cá được bố trí đé trong các bê kính (22cm X 12 c m X

15cm, dài X rộng X cao) Be đẻ bọc kín bằng túi nilon đen để tránh ánh sáng chiếu vào xếp 2 lớp bi ve tròn cao 3cm xuống đáy, đế tránh trường hợp cá bố mẹ sẽ ăn trứng sau khi đẻ ra

Ớ mỗi lô thí nghiệm, tiến hành chọn ra 5 cặp cá bố mẹ: Chọn những con cá cái

có bụng to, bơi khỏe; cá đực chọn con to, bơi khỏe

Hình 2.3 Bể cho cá đẻ 2.5 Thu thập số liệu

2.5.1 Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học sinh sản

❖ Xác định giói tính cá bố mẹ: Bằng cách quan sát hình dạng, màu sắc cơ thể cá

Khi cá thành thục, bụng cá cái to, mềm hơn cá đực Nếu vuốt dọc theo lườn bụng cá cái có trứng cháy ra ngoài

❖ Quan sát sự phát triển của buồng trứng

Bằng cách giải phẫu và quan sát trên kính hiền vi Các giai đoạn phát triển của buồng trứng và tinh sào cá sọc ngựa được xác định dựa vào hình thái bcn ngoài, và mô

tà theo thang 6 bậc theo phương pháp của G v Nickolski (1963) [38] và OF Sakun &

NA Butskaia (1968) [2] làm tiêu chuẩn đổ xác định độ chín của tuyến sinh dục cá cái

❖ Xác định GSI, AF, RF

- Hệ số thành thục (GSI): Là tỷ lộ phần trăm giữa khối lượng tuyến sinh dục và

khối lượng toàn bộ cơ thể cá hay khối lượng cơ thề cá đà bỏ qua nội quan, được tính bằng công thức:

Trong đó: GW là khối lượng tuyến sinh dục (g)

BW là khối lượng cơ thể cá (g)

- Sức sinh sản tuvệt đối (AF): Là toàn bộ số trứng trong buồng trứng ở giai

đoạn IV Được xác định theo phương pháp thế tích và được tính trên cơ sở đếm số lượng tế bào trứng ở giai đoạn IV Bằng cách lấy toàn bộ tuyến sinh dục ngâm trong formol 10% Sau đó tách rời trứng khỏi màng của phần tuyến sinh dục Rửa nhẹ và hút

đi các tạp chất lơ lửng Sau đó cho vào ống chia độ, tính thể tích theo phương pháp pha loãng và đếm trứng bằng buồng đếm động vật.

- Sức sinh sản tương đối (RF): Là tỷ số giữa sức sinh sản tuyệt đối của một cá

thề với khối lượng (tính bàng gam) toàn thân

2.5.2.2 Tỷ lệ nỏ’ (HR): Tỷ lệ nó là tỷ lệ phần trăm giữa số lượng cá bột nở ra trên

tống số trứng đã được thụ tinh Đế xác định tỷ lệ nở, trứng sau khi được thụ tinh được chuyền vào cốc 250ml và được sục khí nhẹ Sau khi cá nở hoàn toàn, đếm số cá trong các cốc thí nghiệm, tính tỷ lệ nở (HR) theo công thức:

Số cá nở raHR(%) =

Tống số trứng được thụ tinh X 100

2.5.2.3 Quan sát sự phát triến của phôi: Việc thu trứng được tiến hành ngay sau khi

cá đẻ 1 5 -2 0 phút (đảm báo quá trình thụ tinh xảy ra)

Dụng cụ thí nghiệm:

— Lọ nhựa thề tích 3-5 L

- 2 dây và đá sục khí

-P ipet hoặc dụng cụ lấy trứng để quan sát, lam kính, hộp lồng

-K ính hiển vi, máy ảnh

-N ướ c ngọt

Lấy mẫu trứng cá đã thụ tinh: Cứ sau 30 phút thu mẫu trứng 1 lần để xác định các giai đoạn phát triển của phôi bàng kính hiển vi, ghi hình bàng máy ảnh kỹ thuật số.Thời gian phát triển phôi được tính từ lúc trứng thụ tinh cho tới khi trứng nở

2.5.2.4 Đánh giá chất lượng ấu trùng