Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho việc tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Acetobacter xylimun BHN2

LỜI CẢMƠNEmxingửilờicảmơnchânthànhtớiTS.DươngMinhLamvàPGS.TS.ĐinhThịKimNhung.Emcũngxingửilờicảmơn tớiThS.NguyễnKhắcThanhđãh ướngdẫn,chỉbảotậntình,giúpđỡvàtạođiềukiệnch

HOASINH–KTNN

LỜI CẢMƠN

EmxingửilờicảmơnchânthànhtớiTS.DươngMinhLamvàPGS.TS.ĐinhThịKimNhung.Emcũngxingửilờicảmơn

tớiThS.NguyễnKhắcThanhđãh ướngdẫn,chỉbảotậntình,giúpđỡvàtạođiềukiệnchođểemthựchiệnvàh o ànthànhtốtkhóaluậnnày

KTNN,phòng thínghiệmvi sinhvật,cùngcác thầycôtrongtổbộmônvisinh,ban bảo vệđ ãt ạo điều kiện giú p đỡem

EmxinchânthànhcảmơnBanGiámHiệutrườngĐHSPHàNội2,khoaSinh-Emxincảmơn sựgiúpđỡq u an tâmđộngviêncủabạnbè,giađìnhtrong suố t quát rình hoàn thành khó aluận

Emxinchân thà nhcả mơn!

HàNội,tháng05năm2012

Sinhviên

ĐỗThịNga

LỜI CAMĐOAN

Đểđ ảmbảotínhtrungthựccủađềtài,tôixin camđoan:

1 Đềt àicủatôi khôngsaochépbấtcứtàiliệusẵncón ào

2 Đềt àicủ atôi không trù ng lặp vớ imộ t đềt ài nào khác

3 Kếtquảt h u đượctrongđềt àilàd o tựb ảnthântôinghiêncứuthựctiễnđảmbảotínhchínhxácvàt rungthực

HàNội,tháng05năm2012

Tácgiả

ĐỗThịNga

LờicảmơnLời

camđoan

Danhmụccác

từviếttắtDanhmụchìnhvàbản

gbiểu

MỞĐẦU 2

1 Lýdochọnđềtài 2

2 Nộidungcủađềtài 3

3 Ýnghĩacủađềtài 3

4 Mụctiêucủađềtài 3

CHƯƠNG1.TỔNGQUANTÀILIỆU 4

1.1 VịtrívàđặcđiểmphânloạicủaA.xylinumtrongsinhgiới 4

1.1.1 VịtríphânloạicủaA.xylinum 4

1.1.2 ĐặcđiểmphânloạicủaA.xylinum 5

1.2 NhucầudinhdưỡngcủavikhuẩnA.xylinum 7

1.2.1 Ảnhhưởngcủanguồncacbon 7

1.2.2 Nhucầunitơcủavisinhvật 8

1.2.3 Nguồndinhdưỡngkhoáng 8

1.2.4 Cácchấtkíchthíchsinhtrưởng 9

1.3 Đặcđiểmvà cơchếhìnhthànhmàngBacterialcellulose 10

1.3.1 ĐặcđiểmcấutrúccủaBacterialcellulose 10

1.3.2 CơchếtổnghợpBacterialcellulose 11

1.3.3 ChứcnăngcủacelluloseđốivớivikhuẩnA.xylinum 12

1.4 TìnhhìnhnghiêncứuvàsảnxuấtmàngBChiệnnay 12

1.4.1 Trênthếgiới 12

1.4.2 TạiViệtNam 13

CHƯƠNG2.PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU 14

2.1 Đốitượngnghiêncứuvàhóachất 14

2.1.1 Đốitượngnghiêncứu 14

2.1.2 Hóachất 14

2.1.3 Dụngcụ, thiếtbị 14

2.1.4 Môitrườngnghiêncứu 15

2.2 Phươngphápnghiêncứu 15

2.2.1 Phươngphápvisinh 15

2.2.1.1 Phươngphápbảoquảnchủnggiốngtrênthạchnghiêng 15

2.2.1.2 Phươngpháphoạthoágiống 16

2.2.1.3 Phươngpháplênmentạomàng 16

2.2.2 Phươngpháphoá sinh 16

2.2.2.1 Pháthiệnhoạttínhcatalase 16

2.2.2.2 Pháthiệnkhảnăngoxyhoárượuêtylicthành acidacetic 17

2.2.2.3 Pháthiệnkhảnăngoxyhoáacidacetic 17

2.2.2.4 Pháthiệnkhảnăngchuyểnhoáglucosethànhacid 18

2.2.2.5 Pháthiệnkhảnăngchuyểnhoáglycerolthànhdihydroxyaceton 18

2.2.2.6 .6.Sinhtrưởng trênmôitrườngHoyer 18

2.2.2.7 Pháthiệnkhảnăngtổnghợpcellulose 19

2.2.3 PhươngphápnghiêncứukhảnăngtạomàngBCcủamôitrường tuyểnchọn 19

2.2.4 PhươngphápxácđịnhtrọnglượngtươicủamàngBC 19

2.2.5 Phươngphápquyhoạchhóatoánhọcthựcnghiệm(phươngpháp Box–Wilson) 19

2.2.5.1 Thiếtlậpmôhìnhtoánhọc 19

2.2.5.2 Tốiưuhóa 23

2.2.6 Phươngphápxửlýsốliệuthốngkê 24

CHƯƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨUVÀTHẢOLUẬN 25

3.1 NghiêncứukhảnăngtạomàngcủachủngA.xylinumBHN2trên cácmôitrườngkhácnhau 25

3.2 Nghiêncứuđộngtháisinhtrưởngpháttriểncủachủngvikhuẩn A.xylinumBHN2 26

3.3 TốiưuhóamôitrườngdinhdưỡngchochủngvikhuẩnA.xylinum BHN2 29

3.3.1 Thiếtlậpmôhìnhtoánhọctốiưu môitrườngnuôicấy 30

3.3.2 Tốiưu 39

3.4.Xâydựngquytrìnhđónggóiv à bảoquảnmàngB C ở q u y mô phòngthínghiệm 40

KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ 43

1 Kếtluận 43

2 Kiếnnghị 43

TÀILIỆUTHAMKHẢO 44

DANHMỤCBẢNG BIỂU

Bảng1.1.Đặcđ i ể m sinhhoác ủ a chủngvikhuẩnA.xylinumtheoFrateur(1950)

Bảng1.2.Ảnhhưởng

củanguồncacbonđếnnăngsuấtsảnxuấtmàngBCBảng1.3.Thànhphầnhóahọccủanướcdừa

MàngBCsaukhixửlýđemsấykhô

NhờnhữngthuộctínhđặcbiệttrênmàmàngBCđượcsửdụngởrấtnhiềucác nướcpháttriển,ứngdụngrộngrãitrongcác lĩnhvực:côngnghệthựcphẩmsảnxuấtthạchdừa,côngnghiệpgiấysảnxuấtgiấychấtlượngcao,lĩnhvựcmỹphẩmdùng làmmặtnạ dưỡngda.Tronglĩnhvựcyhọc,màngBCbướcđầuđượcnghiêncứulàmmàngtrịbỏng,danhântạothayt h ế da tạmthời,mạchmáunhân

tạo.MộttrongcácứngdụngđãvàđangđượcquantâmhiệnnaylàsảnxuấtmàngBCđiềutrịbỏngvàtổnthươngda[6].Đặcbiệt,hiệnn a y n h u cầuv ề màngtrịbỏngrấtcaonhưngđềuphảinhậpngoạivớigiáthànhrấtlớnvàchấtlượngkhôngnhưmongmuốn

1 Lýdochọnđềtài

Ngàynaycôngnghệsinhhọcđangtrởthànhmộtngànhkĩthuậtchủđạocủanhiềuquốcgiatrênthếgiới.Gắnliềnvớinólàcôngnghệvisinhvớinhữngthànhtựulớncóýnghĩatrongđờisống,trongcácngànhcôngnghiệp,yhọc Khócóthểtìmramộtlĩnhvựcnàocủacôngnghệsinhhọcmàlại khôngliênquantớivisinhvật

VikhuẩnA.xylinumthuộcnhómvikhuẩnGramâmhiếukhíbắtbuộc,hoádưỡ ngthuộcchiAcetobacter,họAcetobacteraceae.VikhuẩnA.xylinumt ì m thấytrong

giấm,dịchrượu,nướcéphoaquả.Khinuôicấyvikhuẩnnàytrênmôitrườngdịchlỏng,chúngs ẽ hìnhthànhtrênbềmặtmộtl ớ p màngBacterialcellulose(màngBC).Đólàtậphợpcáctếbàovikhuẩnliênkếtvớiphântửcellulose.MàngBCcấutạobởinhữngchuỗipolimer--

Vớimongmuốntìmra môitrườngdinhdưỡngtốiưuchochủngvikhuẩnA.xyl

inumvànhữngứngdụnghữuíchcủamàngBCtrêncơsởkếthừanhữngkếtquảthuđượ

ccủa cáctác giảđãnghiêncứutrướctôiquyếtđịnhchọnđề tài:“Tốiưu hóamôitrườ

ngdinhdưỡngchoviệctạomàngBCtừchủngvikhuẩnAcetobacterxylinum BHN2”.

CHƯƠNG1TỔNG QUAN TÀILIỆU

Năm1950, FrateurđãxếpA.xylinumvàonhómMeroxydans.

Năm1957,theo“Bergey‟smanualofdeterminativebacteriology”ôngđ ã xế pA.xylinumvàochiAcetobacter,thuộchọPseudomonadaceae,bộPseudomonadale

trongsuốt,khuẩnlạcbằngphẳnghoặclồilênd ễ táchkhỏimôit r ư ờ n g VikhuẩnA.xy

linumkhinuôicấytrongmôitrườnglỏngởđiềukiệntĩnh,chúngsẽhình

thànhtrênbềmặtmôitrườngmộtlớpmàngBC.Ngượclạitrongđiềukiệnnuôilắc,cellulosehìnhthànhdạnghạtnhỏvớikíchthướckhôngđềunhauvàphântántrongmôitrườngdinhdưỡngtạoranhữngđặctínhhìnhtháikháchẳncellulosetrongđiều

Cacboncótrongt ế bàochất,thànht ế bào,trongtấtc ả c á c phânt ử enzim,axitnucleicvàcác sảnphẩmtraođổichất.Chínhvì vậy,nhữnghợpchấthữucơcóchứacacboncóýnghĩahàngđầutrongđờisốngcủavisinhv ậ t Ảnhhưởngcủanguồncacbonđếnnăng suấtsảnxuấtmàngBC:

Bảng1.2.ẢnhhưởngcủanguồncacbonđếnnăngsuấtsảnxuấtmàngBC

Nguồncacbon

Monosaccharide

Năng suất tổnghợpc ellulose

Nguồncacbon Disaccharide

Năng suất tổnghợpc ellulose

1.2.2 Nhucầunitơcủavisinhvật

Ýnghĩachủyếucủanguồnnitơlàcungcấpchocơthểsinhvậtnguyênliệuđểhìnhthànhcácnhómamin(-NH2v à-

NH-)trongcácphântửaminoacid,nucleotit,cácbazơdịvòngvàcáchợpchấthóahọctrongnguyênsinhchất[4].NguồnnitơdễhấpthụnhấtđốivớivisinhvậtlàNH3v àNH4 +

.Visinhvậtcókhảnăngđồnghóarấttốtnitơchứatrongcácthứcănhữucơ.Dođókhin

uôicấyvikhuẩnA.xylinumngườitathườngsửdụngnguồnnitơv ôc ơ l à (NH4)2SO4 ,NH4NO3;nguồnnitơhữuc ơ l à peptone,c a o thịt,caonấmmen[4].MôitrườngcơbảnchocácnghiêncứuvềBClàmôitrườngdoHestrinvàScharammthiếtlập[29]

1.2.3 Nguồndinhdưỡngkhoáng

Phosphobaogiờcũngchiếmt ỷ l ệ c a o nhấttrongsốc á c nguyêntốkhoángcủatếbàovisinhvật.Phosphocómặtởtronghầuhếtcácthànhphầncủa tếbào.Đểđảmbảonguồndinhdưỡngphospho,ngườitasửdụngcácloạiphosphovôcơnhưKH2PO4,

1.2.4 Cácchấtkíchthíchsinhtrưởng

Cácvitaminpyridoxine,acidnicotinic,p–

aminobenzoicacid(pABA),biotinđượcx á c địnhl à cầnthiếtchosựtăngtrưởngt ếbàov à tổnghợpcellulose,trongkhipantothenatevàriboflavinchokếtquảngượclại[23]

NướcdừagiàlànguồnnguyênliệuchủyếuđượcsửdụngđểnuôicấyA.xylinu

mthumàngBC.Tùytheogiốngdừa,tuổicủaquảdừamàcác thànhphầnhoáhọctrong

nướcdừacókhácnhau.Lượngđườngkhửtổngvàproteintrongnướcdừatănglênkhidừacàngchín(caonhấtlàvàothángthứ9,sauđ ó giảmdần).Đườngởđâycóthểlàglucose,fructose,sucrosehaysorbitol.Ngoàira,nướcdừacónhiềukhoángchất,vitamin,acidamin…

Acidglutamic 14.5 Tyrosine 2.83 Arginine 12.75 Alamine 2.41 Leucine 4.18 Histidine 2.05 Lysine 4.51 Phenylalanin 1.23 Proline 4.12 Senine 0.91 Aspartic 3.6 Cystein 1.17

1.3 Đặcđiểmvàcơchếhình thànhmàngBacterialcellulose

1.3.1 Đặcđiểmcấu trúccủaBacterialcellulose

Celluloseđượccấutạobởichuỗipolymeβ

-1,4glucopyranosemạchthẳng.Nócóthànhphầnhoáhọcđồngnhấtvớicellulosethựcvật,nhưngcấutrúcvàđặctínhcủanólạikhácxanhau

Chuỗipolymeβ-1,4glucopyranosemớihìnhthànhliênkếtvớinhautạo thànhsợinhỏ(subfibril)cókí

chthước1,5nm.Nhữngsợinhỏkếttinhtạos ợ i

lớnhơn-sợivĩmô,nhữngsợinàykếthợpvớinhautạothànhbóvàcuốicùngtạodảilớn.Nhữngdảilớntừtếbàonàykhiđẩyrangoàisẽliênkếtvớinhữngdảilớncủatếbàokhácbằngliênkếthidrohoặcvandesvantạothànhdạngsệt (gel)haymộtlớpmàngmỏng.Kích

lênkhiquầnthểv i khuẩnsinhtrưởng.Nhữngđiểmtạo màngB C mớicóthểxuấthiện,chínhvìthếmàmàngBCđượcmởrộng

Hình1.3.SợicellulosecủamàngBC Hình1.4.Sợicellulosecủathựcvật

1.3.2 CơchếtổnghợpBacterialcellulose

Quátrình sinh tổnghợpBClàmộttiến trìnhbao gồmnhiềubướcđượcđiềuhoàmộtcáchchuyênbiệtvàchínhxác bằngmộthệthốngchứanhiềuloạienzyme,phứchợpxúctácvàcácproteinđiềuhoà[11],[12]

TheotácgiảAlinaKrystynowicsvàcộngsựcó

4enzymethamgiaxúctác tổnghợpcelluloseở v i khuẩnA.xylinum:Glucokinase(G

K),Phosphoglucomutase(PGM),Glucose-1-phosphateuridylyltransferase(UDPGpyrophosphorylaseh a y UGP),Cellulosesynthase(CS).TrongđóUGPlàenzymecóvaitròquantrọngnhất[13]

Hình1.5.ConđườngsinhtổnghợpcelluloseởA.xylinum

Ngoàira,màngBCcònlàgiáthểchốngđỡchocáctếbàovikhuẩnđồngthờicũnggiúpchúnglấychấtdinhdưỡngtừmôitrườngmộtcách dễdànghơnsovớikhiởtrongmôitrườnglỏngkhôngcómạnglướicellulose[21].

[31].C á c nghiêncứuhiệnnayvề màngBCtrênthếgiớiđãtậptrungvàovấnđề sảnxuấttrênquymôcôngnghiệpvàứngdụngcácsảnphẩmtừmàngBC

WanvàMillonđãđượcđăngkýbảnquyềnvềlàmmàngBCtừA.xylinumdùngtrịbỏng

[27]

1.4.2 TạiViệtNam

ỞViệtNam,đ ã c ó mộtsố nghiêncứuvàứngdụngv ề A.xylinumvàmàngBC.

C á c côngtrìnhnghiêncứumớichỉquant â m tớiquátrìnhtạomàng,đặctínhvàcấutrúccủamàng.Vềứngdụngthựctiễn,mớichỉ đượcứngdụngtrongchếtạomàngsinhhọ

cdùngtrongtrịbỏngvàđượcứngdụngtrongsảnxuấtthạchdừa[7],[11], [15],[16].

TheotácgiảNguyễnVănThanh,TrưởngbộVisinh–

Kýsinh,ĐạihọcYDược,ThànhphốHồChíMinhchobiếtnhómnghiêncứucủaôngchếtạothànhcôngmàngtrịbỏngsinhhọccótẩmdầumùubằngphươngpháplênmen.Nócókhảnăngthấmnướccao,kếtdínhchặtvàtrơvềmặthóahọcnênnócóvaitrònhưmàngsinhhọccóthểthaythếdatạmthời[29]

Nghiêncứuvề màngtrị bỏngcủatácgiảnhư H uỳ nh ThịNgọcLan,nghiênc

ứuchếtạomàngtrịbỏngtừBacterialcellulosecủaA.xylinumvàhoạtchấttáisinhmôcủ

adầumùu.Ngoàira,cónghiêncứuvềhiệuứnglàmlànhv ế t thươngcủahỗnhợpChistosantantrongnước–Bacterialcellulose–

Nanob ạ c củanhómtácgiảNguyễnThịMỹLan,HuỳnhThịPhươngLinh,LêThịMỹPhướcvàNguyễnQuốcHiển[10]

TạiphòngVisinhvật,khoaSinh-KTNN,trườngĐạihọcSưphạmHàNội2 , nhómnghiêncứucủatácg i ả ĐinhThịKimNhungvàc s đangtiếnhànhnghiêncứuquytrìnhsảnxuấtmàngBCvớichấtlượngtốtvàứngdụngvàotrịbỏngbướcđầuđãđạtđượcthànhcông[14]

Hiệnnaymớichỉcómộtsốcôngtrìnhnghiêncứuảnhhưởngcủamôitrườngdi

nhdưỡngđếnkhảnăngtạomàngBCcủachủngAcetobacter.

CHƯƠNG2PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU

2.1 Đốitượngnghiêncứuvàhóachất

2.1.1 Đốitượngnghiêncứu

ChủngvikhuẩnA.xylinumBHN2đượcphânlậpt ừ màngc ủ a cácnguồnngu

yênliệukhácnhaunhờquátrìnhlênmengiấmtừb i a , giấmlênmentheophươngphápcổtruyền,chủnggiốngnhậntừphòngVisinh,KhoaSinh-

Mộtsốloạithuốcnhuộm:tímgentian, dungdịchfushsin,dung

dịchlugolNướcdừa,agar…

2.1.3 Dụngcụ,thiếtbị

Trongquátrìnhtiếnhànhthínghiệmtôiđ ã s ử dụngnhữngdụngcụthiếtbịnhư:nồihấpkhửtrùng,tủs ấ y (Haraeus,Đức),boxc ấ y v ô trùng(Haraeus,Đức),cânđiệntử(PrecicaXT320M,ThụySỹ),micropipep(Gilson,Pháp),tủlạnh(Tawasi,Nhật),kínhhiểnviquanghọc(olympusCX41

,Nhật),hộplồng,ốngnghiệm,pipet,bàntrangthủytinh,bìnhtamgiác,lam

kính,lamen,đèncồn…vànhiềudụngcụhóasinhthôngdụngkhác

2.1.4 Môitrườngnghiêncứu

1 Glucozo 20 g 20 g 20 g 20 g 20 g 20 g 2.Agar 20 g 0 0 0 0 0 3.(NH 4 ) 2 SO 4 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g

4 KH 2 PO 4 2 g 2 g 2 g 2 g 2 g 2 g 5.MgSO 4 7 H 2 O 2 g 2 g 2 g 2 g 0 2 g

6 Axitaxetic 2 % 2 % 2 % 2 % 5 ml 2,5 ml 7.Rượuetylic 2 % 2 % 2 % 2 % 0 2% 8.Pepton 0 5 g 0 5 g 0 5 g 9.Nướcmíaép 0 0 0 200 ml 0 0 10.Nướcdừa 0 0 0 0 0 1000 ml 11.Nướcmáy 1000 ml 1000 ml 1000 ml 800 ml 1000 ml 0

2.2.1.2 Phươngpháphoạthoágiống

Giốngtừốngnghiệmđượcbảoquảntrongtủlạnh,trướckhiđemsửdụngphảihoạthoágiống,nhângiốngđảmbảođủsốlượngtếbàovisinhvậtchoquátrìnhlênmen.Phươngpháphoạthoágiốngsửdụngmôitrườngtiêuchuẩnkhôngcóthạchagar,đemhấpthanhtrùngở1210trong20phút.Sauđóđemxửlýtrongđèntím15phút,cấychuyểngiốngtừốngthạchnghiêngvàovànuôilắc135vòng/phúttrong24giờ[4], [5]

2.2.1.3 Phươngpháplênmentạomàng

Sửdụngmôitrườnglênmentạo màngđemhấpthanhtrùngở1100Ctrong20phútđểtránhphânrãđường.Sauđókhửkhuẩnởđèncựctímtrong1 5 phút.Bổsungvàomôitrường5%giốnghoạthoá.Nuôicấyởđiềukiệntĩnhtrong4- 8ngày

2.2.2 Phươngpháphoásinh

2.2.2.1 Pháthiệnhoạttínhcatalase

NhỏmộtgiọtH2O23%lênbề mặtkhuẩnlạc, nếuthấyhiệntượngsủibọtkhíthìchủngvikhuẩnđóđượccoilàcóhoạttínhcatalase(catalase+).Ngượclại,chủngvikhuẩnđókhôngcóhoạttínhcatalase(catalase-).Ngoàir a cóthểnhỏtrựctiếpH2O23 %lênsinhkhốitếbàocủachủngnghiêncứuđãđượctáchtừdịchnuôicấybằngcáchđemlitâm5000vòng/10phút,quansáthiệntượngnhưtrên[3]

Thànhphần:Caonấm men: 10g Canxiacetat:10g

BlueBromophenol(BPB)0,04%: 20ml

Phânmôitrườngvàocácốngnghiệm( 4

-5ml),khửtrùngở 1210Ctrong20phút,đểnguộikhoảng30oCcấyvikhuẩnnghiêncứumớihoạthoá,nuôi7ngàytrongđiềukiệnthíchhợp.Quansátthấymôitrườngchuyểnsangmàuvànglàdươngtính,khôngđổimàulàâmtính

PhadungdịchBPB0,04%:cân0,1gBPBnghiềnnhỏtrongcốcsứ,sauđ ó bổsung14,9mlNaOH0,001Nhoàtanchođều.Đổtấtcảvàobìnhđịnhmứcthêmnướcchođếnkhithểtíchđạt250ml[4]

tượng:nếuxungquanhkhuẩnlạc

cóvòngphângiảicanxilàphảnứngdươngtính,ngượclạilàâmtính

2.2.2.4 Pháthiệnkhảnăngchuyểnhoáglucosethànhacid

Đểxác địnhkhảnănghìnhthànhacidcủachủngvikhuẩntuyểnchọntôicấyvikhuẩntrênmôitrườngthạchGCP.Nếuxungquanhchuẩnlạctạovòngphângiảicanxi

,chứngtỏchủngtuyểnchọncókhảnănghìnhthànhacidt ừ glucose[14].

2.2.2.5 Pháthiệnkhảnăngchuyểnhoáglycerolthànhdihydroxyaceton

Đểthửkhảnănghìnhthànhdihydroxyacetontừglycerol.Tôitiếnhànhnuôivikhuẩntrongmôitrườngbaogồmthànhphầnsau:

s ự tạothànhdihydroxyaceton(cósựxuấthiệnkếttủaCu2Omàuđỏgạch)

CáchphadungdịchFehling[3],[6]

Fehling1: CuSO4.5H2O:34,6g Nướccất:500ml

Fehling2: Na.K.Tartrat:173g NaOH:70g Nướccất:500ml

TrộnFehling1v à Fehling2 theot ỷ lệ1:1tađượcdungdịchFehlingmàuxanhthẫm

2.2.2.6 SinhtrưởngtrênmôitrườngHoyer

Thànhphầnmôitrường:(g/l)

(NH4)2SO4:1g KH2PO4:0,9g FeCl3.6H2O:0,02g

MgSO4.7H2O:0,25g K2HPO4:0,1g Rượuêtylic99,5%:20ml

Hấpthanhtrùng1 2 1oCtrong1 5 phút.Đểmôitrườngnguộib ổ sunggiốngnghiêncứunuôiởnhiệtđộkhoảng30oCtrong0,12,24,48giờsauđó

hút1mmldịchnuôicấychovàoeppendorflytâmở5000vòngtrong10phútv à xácđịnhgiátrịODởλ = 610nm[10].

2.2.2.7 Pháthiệnkhảnăngtổnghợpcellulose

Nuôicấyvikhuẩntrênmôitrườngdịchthểởnhiệtđộ28-30o4ngày,quansátsựhìnhthànhmàng.Kiểmtrakhảnăngbắtmàucủamàngbằngcáchnhỏl ên đódungdịchlugolv à H2SO460%nóchuyểnhoáthànhmàuxanhlam

Ctrongvòng3-2.2.3 PhươngphápnghiêncứukhảnăngtạomàngBCcủamôitrườngtuyển

chọn

Saukhitiếnhànhnghiêncứuảnhhưởngcủacácnguồndinhdưỡngđếnkhảnăngtạo

màngBCvàchọnrađượccácnguồndinhdưỡngvàhàmlượngthíchhợpcủachúngchoquátrìnhtạomàngBC.Tôitiếnhànhxâydựngcôngthứcmôitrườngtuyểnchọnchoq

uátrìnhtạomàngBCcủavikhuẩnA.xylinumBHN2.Sau5ngàynuôicấytrênmôitrườ

ngtuyểnchọntiếnhànhthumàngvàđánhgiáchấtlượngmàngthuđược,sosánhvớikếtquảmàngthuđượcởmôitrườngcơbản(MT3)

2.2.4 PhươngphápxácđịnhtrọnglượngtươicủamàngBC

Saukhinuôicấy,màngđượclấyra,để

màngráonướckhoảng4-5giờ,trênkhaynhựacủanhiệtđộphòngthínghiệm.Tiếnhànhcânmàngtrênc â n điệntử.Trọnglượngtươicủ a màngđượctínhbằnghiệusốcủatrọnglượngkhaynhựalúccóvàchưacómàng

Mặtđồngmứcđượcbiểudiễntheophươngtrìnhhồiquy:

y=b0+b1x1̃ +b2x

2̃

+ …+bnxñ (1)

Wilsonchỉhiệuquảkhimôhìnhtuyếntính,cáchệs ố phươngtrìnhđềucónghĩa(nếuc

óhệsốnàokhôngcónghĩathìcầnloạib ỏ khỏimôhình).

Cónhiềuphươngphápđ ể thiếtlậpphươngtrìnhtoánhọc,nhưngphươngphápphổbiếnnhấtlàphươngphápquyhoạchthựcnghiệm.Phươngphápnàytiếnhànhnhưsau:

hailàsốmức