Nghiên cứu biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào thuốc lá By-2 (Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN HOÀI NAM NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2 Nicotiana tabacum L.cv Bright

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG

TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2

(Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG

TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2

(Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã ngành : 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS LÂM ĐẠI NHÂN

HÀ NỘI, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và không sao chép trong bất kỳ công trình nào khác Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả

Nguyễn Hoài Nam

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, em Ÿã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy, cô, các anh chị công tác trong Viện Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lâm Đại Nhân và TS Phạm Bích Ngọc đã dành nhiều thời gian, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập thí nghiệm

Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, NCS La Việt Hồng, Th.s Nguyễn Thu Giang, các cán bộ, anh, chị công tác tại Viện Công nghệ Sinh học cũng như thầy giáo, cô giáo và các cán bộ bộ môn Sinh học, phòng Sau đại học - Trường đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn ở bên em, động viên em và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này Em xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2014

Học viên

Nguyễn Hoài Nam

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

PHẦN II NỘI DUNG 4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cây Thần kỳ 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái của cây Thần kỳ 4

1.2 Miraculin 6

1.2.1 Tính chất của miraculin 6

1.2.2 Cấu tạo của miraculin 7

1.2.3 Cơ chế tác dụng của miraculin 9

1.2.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen trên thế giới 10

1.2.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen ở Việt Nam 12

1.2.6 Tính an toàn và ứng dụng sản xuất của protein miraculin 12

1.3 Những ưu điểm của dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 14

1.4 Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens 15

1.4.1 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 16

1.4.2 Cấu trúc của Ti-plasmid và T-DNA 17

1.4.3 Cơ chế quá trình chuyển gen ngoài tự nhiên của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens 19

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 22

2.1.1 Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm 22

2.1.2 Vật liệu thực vật 22

2.1.3 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121/35S/Mir và cấu trúc vector………

pBI121/HSP/Mir mang gen miraculin……… 22

2.1.4 Hóa chất 23

2.1.5 Môi trường nuôi cấy 24

2.1.6 Máy móc và thiết bị nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

2.2.2 Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc lá BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển gen pBI121/35S/Mir và pBI121/HSP/Mir 26

2.2.3 Đánh giá các dòng tế bào BY-2 chuyển gen miraculin bằng kỹ thuật PCR 29

2.2.4 Phương pháp đánh giá sinh trưởng của dòng tế bào BY-2 đã được chuyển gen 33

2.2.5 Đánh giá sự biểu hiện protein trong dòng tế bào BY-2 bằng kỹ thuật Dot Blot 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả chuyển gen mã hóa miraculin vào tế bào BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 39

3.1.1 Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc mang gen mã hoá protein miraculin trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 39

3.1.2 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 40

3.1.3 Tỷ lệ các dòng tế bào sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần chọn lọc 42

3.2 Đánh giá các dòng tế bào BY-2 chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 44

3.3 Đánh giá sinh trưởng của một số dòng tế bào BY-2 chuyển gen 48

3.4 Đánh giá biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp bằng kỹ thuật Dot Blot 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

1 Kết luận 57

2 Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

Thermus aquaticus

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) Base pair

Kilo base Kilo Dalton Optical density Tumor inducing plasmid Ethylene diamine tetra- acetate acid Glycine betaine

Miraculin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các chỉ tiêu sinh trưởng 4

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh học cây Thần kỳ 5

Bảng 1.3 Chuỗi phân tử đường của miraculin 7

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 23

Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 24

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy tế bào BY-2 24

Bảng 2.4 Thiết bị thí nghiệm 25

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 31

Bảng 2.6 Chu kì nhiệt 31

Bảng 2.7 Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE 36

Bảng 3.1 Thống kê các dòng tế bào mô sẹo thuốc lá BY-2 chuyển gen 44

Bảng 3.2 Kết quả đo ADN tổng số bằng máy đo quang phổ 45

Bảng 3.3 Tổng hợp đánh giá sinh trưởng các dòng tế bào huyền phù BY-2 50

Bảng 3.4 Kết quả đo protein tổng số 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các amino acid của miraculin 8

Hình 1.2 Trình tự nucleotide của miraculin và trình tự amino acid suy luận 9

Hình 1.3 Dược phẩm miraculin tại Nhật Bản 14

Hình 1.4 Sản phẩm chứa miraculin sản xuất tại Hoa Kỳ 14

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid 18

Hình 1.6 Quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 21

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện gen nhân tạo miraculin…………22

Hình 3.1 Kết quả colony-PCR khuẩn lạc 39

Hình 3.2 Kết quả chuyển gen vào tế bào BY-2 41

Hình 3.3 Chọn lọc mô sẹo chuyển gen qua 2 lần nuôi cấy chuyển 42

Hình 3.4 Chọn lọc các dòng tế bào mô sẹo chuyển gen ổn định 43

Hình 3.5 Kết quả tách chiết ADN tổng số 46

Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR các dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi mir đặc hiệu gen mir 47

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR các dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi đặc hiệu gen vir 48

Hình 3.8 Các dòng tế bào huyền phù sau 14 ngày nuôi cấy 49

Hình 3.9 Sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY-2 chuyển gen (khối lượng tươi thu được) 51

Hình 3.10 Sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY-2 chuyển gen (khối lượng khô thu được) 51

Hình 3.11 Kết quả điện di protein tổng số 55

PHẦN I MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hiện nay tình trạng béo phì đã tăng lên đáng báo động và nó trở thành một vấn đề sức khỏe của thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển Tổ chức Y tế thế giới định nghĩa: “Béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe Béo phì là tình trạng sức khỏe có nguyên nhân dinh dưỡng.” Hiện

nay, tổ chức Y tế thế giới thường dùng chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index -

BMI) để nhận định tình trạng gầy béo [30]

Ở Việt Nam, trong gần hai thập niên qua, tình trạng thừa cân và béo phì đang có xu hướng tăng lên cùng với sự phát triển kinh tế nhất là các thành phố lớn và các đô thị Trong vòng 3 năm (2007-2010), số người thừa cân béo phì tại Việt Nam đã tăng khoảng 10%, theo số liệu điều tra của Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam Cứ 100 người trong độ tuổi 25-74 thì đến 26 người bị béo phì Viện Dinh dưỡng quốc gia cho biết, tình trạng thừa cân, béo phì tăng nhanh qua mỗi năm Khoảng 20 năm trước, 5% người Việt Nam bị thừa cân, béo phì Năm 2007, hơn 16% người Việt Nam trưởng thành gặp tình trạng này, 40% bị béo bụng Chỉ trong vòng 3 năm sau, đến 2010, tỷ lệ này đã tăng thêm gần 10%, ở mức xấp xỉ 26% Tình trạng thừa cân béo phì chủ yếu tập trung ở các thành phố lớn Điều tra của Viện Dinh dưỡng năm 2010, tình trạng thừa cân, béo phì tại các thành phố lớn chiếm tỷ lệ khoảng 40,4%, còn ở vùng nông thôn là 25,2% [29] Béo phì không chỉ đơn giản là ảnh hưởng đến thẩm mỹ mà còn có nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe, bệnh tật của con người

Nó là nguyên nhân của hàng loạt bệnh như tim mạch, đái tháo đường, rối loạn

hô hấp, viêm xương khớp, sỏi đường mật, ung thư Béo phì có liên quan mật thiết với bệnh đái tháo đường không phụ thuộc vào insullin Một trong những nguyên nhân gây nên bệnh béo phì đó là do chế độ ăn uống liên quan đến

những loại thức ăn chứa nhiều calo trong đó có đường Sử dụng đường đã trở thành một thói quen, sở thích của hầu hết mọi người và vị giác mỗi người đều chấp nhận vị ngọt như một phần tất yếu của thực đơn hàng ngày [2]

Vấn đề được đặt ra là việc tìm kiếm một loại thực phẩm tạo ngọt an toàn

mà không chứa nhiều calo để đáp ứng được thói quen sử dụng đồ ngọt trong khẩu phần ăn của những người béo phì và mắc bệnh tiểu đường và cải thiện vị giác của những bệnh nhân điều trị ung thư Ở Nhật, người ta đã sử dụng miraculin một loại glycoprotein đánh lừa vị giác để tạo cảm giác ngọt thay thế đường dành cho người béo phì và mắc bệnh tiểu đường [9]

Với công dụng của miraculin và đứng trước thực trạng khó khăn của những bệnh nhân béo phì và tiểu đường về chế độ khẩu phần ăn chúng tôi

quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào thuốc lá BY-2” Tính mới của đề tài chúng tôi thực

hiện đó là việc nghiên cứu về miraculin một chất tạo ngọt an toàn thay thế đường mà ở Việt Nam nó hoàn toàn mới, chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào ở Việt Nam công bố về chuyển gen miraculin

2 Mục đích nghiên cứu

Tạo dòng tế bào thuốc lá BY-2 biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens

3.2 Chọn lọc các dòng tế bào chuyển gen

3.3 Đánh giá các dòng tế bào chuyển gen ở mức độ ADN và protein

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển

gen pBI121/35S/Mir hoặc pBI121/HSP/Mir do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

- Dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Chuyển gen mã hoá miraculin vào dòng tế bào thuốc lá BY-2 thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sau đó đánh giá biểu hiện của protein

miraculin tái tổ hợp bằng phương pháp PCR và Dot Blot Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung cho các tài liệu nghiên cứu khả năng chuyển gen quy định tổng hợp protein miraculin vào cây trồng thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và biểu hiện của protein miraculin

sau khi chuyển gen

PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Thần kỳ

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây Thần kỳ đã được nhắc đến vào năm 1725 bởi một nhà thám hiểm người Pháp có tên là Des Marchais sau khi đi khảo sát vùng Tây Phi Đến năm 1852, cây Thần kỳ đã được tiến sĩ W.F.Daniell mô tả tỉ mỉ về đặc tính kỳ lạ này và

định danh khoa học là: Synsepalum dulcificum, thuộc giới: Plantae, ngành:

Magnoliophyta, lớp: Magnoliopsida, bộ: Ericales, họ: Sapotaceae, chi: Sideroxylon, đồng thời đặt tên là cây “Thần kỳ” [17] Sở dĩ cây được gọi là cây Thần kỳ vì quả của nó khi ăn vào thì sau đó ăn các loại thức ăn có vị chua đều cảm thấy có vị ngọt

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái của cây Thần kỳ

Cây Thần kỳ thuộc loại cây tiểu mộc, chậm phát triển, không rụng lá mùa đông, tán rộng tối đa là 1 – 2 m

Bảng 1.1 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây Thần kỳ [4]

STT Các chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả nghiên cứu

Thời gian gieo hạt đến nảy mầm

Thời gian nảy mầm đến lúc có 2 lá mầm

Thời gian nảy mầm đến lúc có hoa

Tốc độ tăng trưởng chiều cao/tháng

Từ khi có nụ đến lần hoa nở đầu tiên

Thời gian nở hết một chùm hoa

Thời gian từ hoa nở đến quả chín

Độ vươn xa của rễ

Ngày Ngày Năm

cm Ngày Ngày Ngày

Cây Thần kỳ có thể trồng được ở vùng đất khô ráo, có độ pH axit, có độ ẩm cao, nắng nhiều Khả năng chịu lạnh đến -7oC, do đó có thể trồng được ở mọi

độ cao của Việt Nam

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh học cây Thần kỳ

Rễ

Rễ Synsepalum dulcificum thuộc loại rễ nông, có rễ cái, đại bộ

phận tập trung ở vùng 0 – 40 cm, độ vươn xa của rễ khá rộng nếu trồng ngoài tự nhiên, thường cách gốc khoảng từ 0 – 100 cm, có nhiều rễ tơ Sự phân bố của rễ còn phụ thuộc đất trồng

Thân và lá

Đây là loại cây tiểu mộc nhỏ, phát triển rất chậm và có thể cao 1,2 –1,5 m nếu trồng trong chậu, cao 3,0 – 4,5 m nếu trồng ngoài tự nhiên Khoảng 10 năm cây mới có thể cao được 1,2 – 1,5 m Tán cây tạo thành hình chóp Có một thân chính, 4 – 5 nhánh phụ

Hoa

Hoa Synsepalum dulcificum nhỏ có màu trắng, mùi rất thơm, có

lông tơ ở mặt ngoài, đường kính khi nở khoảng 0,3 – 0,5 mm Cuống nhỏ dài 0,2 – 0,3 mm Đầu tiên ở nách lá xuất hiện mầm hoa, dần lớn lên thành nụ, trên một cành thường có 15 – 20 nụ ở nách lá, sau này nở thành hoa Hoa mọc tâp trung hay đơn độc từ nách lá ở gần ngọn nhánh Hoa có cánh dính liền ở đáy Cánh hoa chia làm 5 thùy, dính nhau ở đáy tạo thành hình ống

Quả

Chiều dài trung bình của quả khoảng từ 2 – 3,5 cm Đường kính quả khoảng từ 1 – 1,8 cm Trọng lượng quả khoảng 1 – 2 g Vỏ quả mỏng, có một lớp phấn trắng trên bề mặt Khi quả còn non có màu xanh đậm nhưng khi chín quả có màu đỏ, mọng nước Thịt quả khi chín có màu trắng, hơi nhớt, khi ăn lại có vị hơi chua Mỗi quả có một hạt, hạt có dạng hình elip, kích thước từ 1,0 – 1,5

cm Vỏ hạt cứng và gồm có hai mặt, mặt trên trơn và mặt dưới nhám có đường kẻ sọc Bên trong vỏ, hạt gồm 2 tử diệp có màu xanh và áp sát, dính nhau ở cán phôi [4]

1.2 Miraculin

1.2.1 Tính chất của miraculin

Miraculin là một protein có khả năng làm chuyển đổi vị chua chuyển thành vị ngọt mặc dù chính bản thân miraculin không có vị ngọt Bên cạnh đó miraculin còn có khả năng chuyển đổi vị ngọt ngay khi ở nồng độ rất thấp Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng chỉ với 0.4 mM miraculin tiếp xúc phản ứng với 0,02 M axit citric thì vị ngọt đạt được ước tính gấp khoảng 3000 lần so với đường sucrose về trọng lượng [25] Do ó , để cung cấp các hiệu ứng làm ngọt như sucrose, chỉ một lượng nhỏ của miraculin cũng có thể tạo ra hiệu ứng tương tự Điều này có ý nghĩa rất lớn bởi chỉ một lượng nhỏ miraculin thì

bổ sung gần như không đáng kể đến lượng calo cho cơ thể Vì vậy, miraculin

có thể được sử dụng như một chất làm ngọt có hàm lượng calo thấp trong tự nhiên dành cho các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến việc tiêu thụ đường, bao gồm béo phì, tiểu đường

Miraculin không bền ở nhiệt độ cao và bị phân huỷ khi đun nóng Vì vậy khi nấu chín, miraculin sẽ không còn tác dụng chuyển đổi tạo vị ngọt trên

vị giác nữa

Miraculin là một protein lưỡng tính, tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ, không bền trong môi trường acid - base mạnh

Những thức ăn có vị chua như cam, chanh hoặc các loại đồ chua (như dưa chua, rau quả ngâm giấm chua ), cay hoặc đắng như tương ớt, rượu bia đều trở nên ngọt sau khi nếm miraculin [21]

1.2.2 Cấu tạo của miraculin

Miraculin là glycoprotein có độ dài 220 amino acid, gồm đoạn peptide tín hiệu dài 29 amino acid ở đầu và chuỗi polypeptide đơn gồm 191 amino acid Trọng lượng phân tử của miraculin dựa trên trình tự các amino acid và hàm lượng carbonhydrate là 24,6 kDa Hàm lượng carbonhydate chiếm khoảng 13,9% trọng lượng phân tử, có 5 loại cấu trúc của chuỗi oligosarcharide bao gồm: glucosamine, mannose, galactose, xylose, and fucose Dimer đồng hình (homodimer) miraculin có hoạt động thay đổi vị giác ở pH acid Miraculin thường tồn tại ở dạng homotetramer hay dimer của homodimer [27]

Bảng 1.3 Chuỗi phân tử đường của miraculin

Trình tự acid amin của miraculin

Hình 1.1 Các acid amin của miraculin [27]

Trình tự nucleotide mã hóa miraculin

Hình 1.2 Trình tự nucleotide của miraculin và trình tự amino acid suy luận[19]

Chú thắch: Các trình tự amino acid gạch chân được sử dụng cho việc thiết kế mồi PCR Dấu mũi tên cho biết vị trắ phân tách của quá trình dịch mã miraculin Dấu (*) đánh dấu codon kết thúc

1.2.3 Cơ chế tác dụng của miraculin

Khả năng chuyển đổi vị giác của protein miraculin chủ yếu được đảm nhiệm bởi hai histidine đó là His29 và His59 [21] Bình thường, khi chúng ta

ăn thức ăn thì những khẩu vị của thức ăn khi tiếp xúc sẽ làm kắch hoạt những

tế bào tiếp nhận đặc thù chứa bên trong các gai vị giác nằm trên lưỡi và tạo ra

sự kết nối với các tế bào thụ thể ngọt, mặn Ẩ, sau đó gửi đến não những tắn hiệu cho chúng ta biết là khẩu vị ngọt, mặn, đắng, chua hay những vị khác

Miraculin là protein có tắnh chất làm thay đổi cấu hình của các thụ thể trên tế bào vị giác Điều này là do kết quả của sự hoạt hoá các thụ quan vị ngọt trên lưỡi do miraculin tác động và ảnh hưởng này được kéo dài cho đến khi các chồi vị giác trở lại bình thường Protein miraculin không kết nối với bất cứ một tế bào thụ thể mùi vị nào cả do đó miraculin không tạo ra cảm giác

vị giác Tuy nhiên, protein miraculin có thể thay đổi cấu hình các thụ thể của

tế bào vị giác trên lưỡi Trong môi trường pH acid, trong đó có vị chua nói chung, các thụ thể ngọt của G-protein kết hợp cùng thụ thể vị giác trên gai lưỡi được kắch hoạt, hình dạng của các thụ thể thay đổi làm miraculin nối dắnh chặt vào chúng, như cơ chế chìa khóa trong ổ khóa Mà trong phân tử của miraculin có chuỗi các phân tử đường do đó tạo ra vị ngọt trong thời gian miraculin lưu lại trên lưỡi Hiệu ứng này chỉ kết thúc cho đến khi thụ thể vị giác trở lại bình thường Vì miraculin kết hợp khá chặt chẽ vào các thụ thể cảm nhận vị giác ở trên gai lưỡi cho nên ảnh hưởng tạo ngọt của miraculin có thể kéo dài đến vài giờ [21]

Sự tác động của các phân tử miraculin đã làm sai lệch sự định hướng của các thụ thể cảm nhận vị giác trên gai lưỡi, làm cho lưỡi trở nên thích ứng

và nhận định duy nhất với vị ngọt trong một khoảng thời gian nhất định

Thời gian và cường độ của hiện tượng thay đổi vị giác phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như nồng độ miraculin, thời gian tiếp xúc của miraculin với lưỡi, và độ pH acid Tác dụng này có thể kéo dài từ 1 đến 2 giờ và sẽ biến mất nhanh chóng nếu dùng trà nóng hay nước nóng để xúc miệng do miraculin bị phân hủy ở nhiệt độ cao

1.2.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen trên thế giới

Miraculin đóng vai trò lớn trong việc chuyển đổi vị giác tạo cảm giác vị

ngọt, nhưng nguồn gốc của miraculin được chiết xuất từ quả của cây Thần kỳ

sống ở vùng nhiệt đới nên đã hạn chế về khả năng nhân rộng loại cây này tới những vùng khí hậu khác, bên cạnh đó nếu chỉ chiết xuất miraculin từ quả của

cây Thần kỳ thì số lượng thu được sẽ không nhiều như mong đợi, chính vì lí

do này các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên cứu nhằm mục đích chuyển gen mã hóa miraculin vào các loài sinh vật khác để sản xuất miraculin trên quy mô công nghiệp Trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học được công bố về chuyển gen mã hóa miraculin vào các loài sinh vật

Năm 2006, các nhà khoa học đã chuyển gen mã hóa miraculin vào cây rau diếp, và đã biểu hiện thành công miraculin tái tổ hợp tích lũy nhiều trong

lá Cây rau diếp biến đổi gen đã có khả năng cảm ứng vị ngọt Tuy nhiên, sự biểu hiện miraculin trên cây rau diếp chuyển gen không thực sự ổn định, qua các thế hệ tiếp theo thì khả năng tích lũy protein miraculin giảm dần Mặc dù vậy, kết quả này cũng đã chứng tỏ được khả năng sản xuất miraculin ở các loài thực vật ăn được, và nó mở ra một chiến lược mới trong việc sản xuất protein miraculin trên quy mô lớn ở các đối tượng thực vật [25]

Năm 2007, các nhà khoa học đã chuyển gen mã hóa miraculin vào

chủng Aspergillusn oryzae NS4 Kết quả của quá trình chuyển gen thu được

0,5 mg/ml miraculin tái tổ hợp tương đương với 0,1 mg/ml miraculin tự nhiên

về hoạt động làm thay đổi vị giác ở pH = 3,0 [14]

Năm 2008, Sugaya và cộng sự đã hành công trong việc chuyển gen mã hóa miraculin vào cây dâu tây, kết quả thu được hàm lượng miraculin trong quả dâu chuyển gen là 0,5 – 2,0 µg/g thấp hơn hàm lượng miraculin trong quả cây Thần kỳ (145 µg/g ở quả tươi) [24]

Cà chua là một trong những loại cây trồng chính được trồng trên khắp thế giới, và các nhu cầu về sinh trưởng, phát triển của cà chua từ lâu đã được các nhà khoa học hiểu rõ Do đó, sản xuất miraculin tái tổ hợp trong cà chua biến đổi gen đã được các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu từ năm 2007 bởi Sun và cộng sự Trong các đối tượng thực vật ã được chuyển gen tổng hợp miraculin cho đến nay thì thành công nhất là cà chua mặc dù hàm lượng miraculin của cà chua biến đổi gen thấp hơn hai lần so với miraculin tự nhiên

có trong quả Thần kỳ [12] Trong nghiên cứu chuyển gen mã hóa miraculin vào cây cà chua, kết quả thu được đó là miraculin tái tổ hợp được tích lũy cao trong bộ phận lá và quả, hàm lượng tích lũy lên đến 102,5 µg /g trong lá và 90,7 µg /g trong quả tươi [26]

Năm 2011, các nhà khoa học cũng đã chiết xuất thành công miraculin tinh khiết ở quả của cây cà chua chuyển gen và miraculin được chiết xuất cũng đã cho thấy khả năng hoạt tính mạnh trong việc tạo ngọt tương tự như của miraculin tự nhiên trong cây Thần kỳ [9] Những kết quả này ã chứng minh rằng miraculin tái tổ hợp được chiết xuất từ cây cà chua biến đổi gen có thể là một lựa chọn tốt để sản xuất miraculin từ thực vật tự nhiên, hơn nữa miraculin biểu hiện ổn định ở cây cà chua là do độ pH acid ổn định trong cây

cà chua Đến nay có rất nhiều bài báo nghiên cứu về cà chua biến đổi gen chứa miraculin [11], [15]

Năm 2011, các nhà khoa học Hàn Quốc đã thành công trong việc chuyển gen mã hóa miraculin vào cây trồng Miyagawa Wase Satsuma

Mandarin thuộc họ cam quýt Cây trồng Miyagawa Wase Satsuma Mandarin được trồng phổ biến ở Hàn Quốc và Nhật Bản Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng miraculin tái tổ hợp tích lũy một lượng lớn trên lá và thể hiện được hoạt tính tạo ngọt, điều này có ý nghĩa rất lớn, nó mở ra một hướng mới trong việc chuyển gen mã hóa miraculin vào cây thân gỗ [5]

Ngoài ra, gen mã hóa miraculin còn được tái tổ hợp trên một số

loài sinh vật khác như vi khuẩn Escherichia coli, yeast (nấm men), cây

thuốc lá [20]

1.2.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen ở Việt Nam

Ở Việt Nam cũng đã có một số đề tài khoa học nghiên cứu về miraculin, nhưng còn rất ít Các đề tài nghiên cứu về miraculin mới chỉ dừng lại ở việc trồng thử nghiệm cây Thần kỳ và tách chiết hoạt chất miraculin, chưa có công trình khoa học nào được công bố về việc chuyển gen mã hóa miraculin vào các loài thực vật

Năm 2010, nhóm các nhà khoa học Trần Danh Thế và cộng sự của Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh đã bước đầu trồng thử nghiệm và tách chiết hoạt chất miraculin trong quả của cây Thần kỳ

(Synsepalum dulcificum Daniell) [4]

Ở Việt Nam chưa có sản phẩm nào liên quan đến protein miraculin

được sản xuất Cây Thần kỳ được trồng chủ yếu làm cảnh [4]

1.2.6 Tính an toàn và ứng dụng sản xuất của protein miraculin

Miraculin đã được biết đến từ rất lâu với công dụng kì diệu của nó, cho đến nay chưa có một tài liệu khoa học nào nói về tính bất lợi, gây hại của miraculin Bằng thực tế, những người thổ dân ở vùng Tây Phi đã sử dụng nó

từ rất lâu theo mô tả của nhà thám hiểm Des Marchais Miraculin cũng đã

được nghiên cứu trên khỉ nâu Macaca Mulatta [6], trên chuột [7], và trên cả

con người [7], [28] Với những nghiên cứu về tác dụng của miraculin trên não người của các nhà khoa học Chizuko và cộng sự hay của Diamant H và cộng

sự chúng ta có thể hoàn toàn yên tâm về tính an toàn của protein miraculin Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Food and Drug Administration) viết tắt FDA là cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Hoa Kỳ, thuộc Bộ Y

tế và Dịch vụ Nhân sinh Hoa Kỳ cũng đã cho phép sản xuất miraculin như là

xuất các loại thực phẩm tạo ngọt có liên quan đến protein miraculin

Tại Nhật Bản, protein miraculin được ứng dụng sản xuất dưới dạng dược phẩm hỗ trợ những người bị bệnh tiểu đường, ung thư, hay những người mắc bệnh béo phì Loại dược phẩm này tuy không có tác dụng làm giảm đường huyết cho các bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường và người ăn kiêng nhưng vì khả năng tạo cảm giác ngọt giúp bệnh nhân không muốn dùng thêm các chất ngọt chứa nhiều calo khác, nhờ vậy lượng đường hấp thu vào cơ thể

họ sẽ giảm, điều này cũng tốt cho những người đang áp dụng chế độ ăn kiêng Bên cạnh đó, với những bệnh nhân mắc bệnh ung thư và đang dùng phương pháp hóa trị liệu, do hiệu ứng phụ của hóa chất trong máu khiến cho vị giác của họ có mùi vị kim loại, vì thế họ cảm giác ăn không ngon miệng, dược phẩm chứa protein miraculin sẽ giúp họ có cảm giác ngon miệng hơn Miraculin được dùng phổ biến trong số các bệnh nhân tiểu đường và người ăn kiêng, giảm cân, dưới dạng nước ép sinh tố, nước đóng chai, đóng hộp và viên nén miraculin Tại Tokyo có nhiều quán cà phê phục vụ món "cà phê miraculin" Khách uống không cần dùng đường hoặc chất tạo ngọt tổng hợp khác mà dùng trái cây Thần kỳ do hãng "Namco" cung cấp [33]

Hình 1.3 Dược phẩm miraculin tại Nhật Bản [29]

(Nguồn : http://www.thinkgeek.com/product/ab)

Tại Hoa Kỳ, theo Cục quản lí Dược và Thực phẩm (FDA), những chế phẩm

có liên quan đến protein miraculin đều được ghi nhãn là nhóm thực phẩm bổ sung (dietary supplement) thay vì gọi tên ‘‘chất làm ngọt’’ (sweetener) Những người Mỹ ăn kiêng có thể mua miraculin dưới dạng viên nén và sử dụng nhiều trong các bữa tiệc để đánh lừa vị giác của họ

(Nguồn: http://www.miracleberrypill.org)

1.3 Những ưu điểm của dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2

Dòng tế bào thuốc lá BY-2 là dòng tế bào siêu sinh trưởng, được các nhà khoa học Nhật Bản chọn lọc từ nuôi cấy mô của lõi thân cây

Hình 1.4 Sản phẩm chứa miraculin sản xuất tại Hoa Kỳ [31]

thuốc lá Nicotiana tabacum L cv Bright Yellow No 2 vào năm 1968

Dòng tế bào BY-2 có khả năng phát triển đồng nhất và ổn định trên môi trường nuôi cấy đơn giản, giá thành thấp, tốc độ nhân dòng khoảng 100 lần trong vòng một tuần Một đặc điểm ưu việt khác nữa là BY-2 đáp ứng

tốt với quy trình chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Dòng tế bào BY-2 là dòng tế bào thực vật đã được dùng rộng rãi nhất cho việc sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp [23]

1.4 Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens

Năm 1983, cây thuốc lá chuyển gen đầu tiên kháng kháng sinh

kanamycin thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được công bố,

sau ó , nhiều nghiên cứu về kỹ thuật chuyển gen vào thực vật đã được tiến hành rộng rãi Đến nay, số lượng các phương pháp tạo cây trồng biến đổi gen

đã lên đến hàng chục và đã tạo ra hàng trăm loại cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính quý

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân thành hai nhóm phương thức chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp Trong phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian thường là virus hoặc vi khuẩn Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định

mà không cần nhờ các sinh vật trung gian Tuy nhiên, tất cả các phương pháp chuyển gen trực tiếp đòi hỏi kỹ thuật cao, chính xác và rất tốn kém mà khả năng tái sinh sau chuyển gen lại thấp, vì thế, người ta đã tìm ra phương pháp chuyển gen gián tiếp hiệu quả hơn, kinh tế hơn Trong đó, chuyển gen gián

tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng rộng rãi

hơn cả Vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng mang lại hiệu quả cao (lượng bản sao gen biến nạp ít – tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào)

Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được nghiên cứu từ những năm 1960 – 1970 Việc phát hiện ra Agrobacterium

tumefaciens có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu những năm 1980

đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của công

nghệ sinh học thực vật Sử dụng vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens để

chuyển gen vào thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác

và ổn định

1.4.1 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Vào đầu thế kỷ 20, người ta đã biết đến loài vi khuẩn Agrobacterium có

khả năng gây ra các triệu chứng bệnh ở thực vật khi xâm nhiễm qua vết thương Đó là một loài vi khuẩn sống trong đất, thuộc nhóm vi khuẩn

gram âm Trong chi Agrobacterium có các loài chính sau:

- Agrobacterium tumefaciens: gây bệnh khối u hình chóp ở thân

- Agrobacterium rhisogenes: gây bệnh lông tơ ở rễ

- Agrobacterium rubi: gây ra khối u ở các loài dâu đất, mâm xôi

- Agrobacterium radiobacter: sản sinh kháng sinh đặc trưng (agrocin 84) ngăn cản tác hại của các loài Agrobacterium kể trên

Trong đó, chủng Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium

rhisogenes được sử dụng phổ biến trong chuyển gen vào thực vật Theo cơ chế

tự nhiên, hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết các loài thực vật hai lá mầm và một số ít các loài thực vật một lá mầm, kết quả là gây ra những khối u hay hình thành lông tơ ở rễ Về sau, người ta xác định

được rằng trong tế bào của các dạng hoang dại Agrobacterium tumefaciens và

Agrobacterium rhisogenes có chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là

Ti-plasmid (Tumor-inducing Ti-plasmid) chứa một đoạn ADN có thể chuyển sang tế

bào chủ theo cơ chế tự nhiên Do đó, Agrobacterium là một hệ thống chuyển

gen tự nhiên Bằng cách cải biến cắt bỏ những gen gây khối u và lông tơ ở rễ,

cài xen vào vùng T-ADN (Transferred-ADN) những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này

có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển gen vào thực

vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.4.2 Cấu trúc của Ti-plasmid và T-DNA

Phần lớn các loại Ti-Plasmid có kích thước khoảng 200-800 kb và gồm bốn vùng A, B, C, D Trong đó, vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên có tên là T-ADN (Transferred ADN) Tại đây mang 2 hệ gen: một

hệ gen gây khối u cho thực vật có chứa ít nhất 3 gen tổng hợp các phytohormone là auxin và cytokinin, do đó, có liên quan đến việc sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục mà không phụ thuộc vào sự sinh trưởng của cây, hệ gen thứ hai mã hóa cho một số enzyme điều khiển tổng hợp các dẫn xuất của axit amin hay đường gọi là opine Vùng B là vùng tái bản có mang điểm khởi đầu sao chép (oriT) Vùng C liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D có tên gọi là vùng độc (virulence region) có chứa các gen vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-ADN vào hệ gen nhân của tế bào thực vật Ngoài

ra, mỗi Ti-plasmid còn chứa các gen nằm ngoài vùng T-ADN mã hóa cho các enzyme phân giải opine để làm nguồn dinh dưỡng carbon và nitơ cho vi khuẩn

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid

Vùng T-ADN có kích thước khoảng 10 kb – 20 kb, nằm kẹp giữa 2 trật tự

25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và biên phải (right border – RB) Toàn bộ giới hạn giữa hai biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho

sự chuyển ADN Sự mất đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-ADN Quá trình chuyển T-ADN bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB Sự định hướng này rất quan trọng nếu thiếu yếu

tố này việc chuyển gen sẽ không xảy ra hoặc không hiệu quả Trong các gen được mã hóa ở vùng T-ADN có 3 gen rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một gen mã hóa cho AMP - isopentenyl transferase và 2 gen mã hóa cho enzyme tham gia vào hoạt động sinh tổng hợp auxin (tryptophane – 2 mono oxigenase và acetamid hydrolase) Sự hoạt động của các gen này tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin Đặc điểm này được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp

từ trong phần lớn các tế bào không được biến nạp

Hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-ADN sang tế bào thực vật Vùng này có kích thước khoảng 40 kb và bao gồm 6 operon: các vir A, B, D và G là hoàn toàn cần thiết cho việc tạo độc tính, còn virC và E liên quan đến việc tạo thành khối u Trừ virA và G các operon khác đều là cistron Nói chung, gen virA biểu hiện ở mọi điều kiện, gen virC biểu hiện ở khắp các tế bào sinh dưỡng nhưng biểu hiện mạnh ở dịch chiết từ các

mô bị thương tổn Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ đến sự

có mặt của các hợp chất phenol được tiết ra từ các vết thương tổn của cây Từ vết thương cây thuốc lá người ta đã tinh chế và xác định các hợp chất này là acetosyringone và α-hydroxyacetosyringone Chất này vừa có tác dụng làm lành vết thương vừa có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genome thực vật

1.4.3 Cơ chế quá trình chuyển gen ngoài tự nhiên của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Khi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tiếp xúc được với thực vật

nó sẽ gắn vào một tế bào của cây ở vị trí vết thương hở Sau đó vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens sản sinh ra một mạng lưới các sợi cellulose liên

kết chặt vi khuẩn vào bề mặt tế bào bị thương Trước đây, người ta cho rằng

Agrobacterium tumefaciens có thể nhiễm vào cây vì rào cản vật lý là vách tế

bào đã bị thương, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập Tuy nhiên, hiện nay người ta nhận ra rằng các vi khuẩn này đáp ứng với các hợp chất phenol nhất định do tế bào thực vật bị thương tiết ra như acetosyringone và α-hydroxyacetosyringone Các phân tử này (acetosyringone hoặc α-hydroxyacetosyringone) kích thích sự hoạt động của các gen độc Đầu tiên là hoạt động của virA, dấu hiệu để hoạt hoá virA bao gồm pH acid, hợp chất phenol được tiết ra từ thực vật như acetosyringone và một vài loại

monosacharide như glucose, galactose Gen virA hoạt động sinh ra protein virA, protein này đóng vai trò như chất thụ cảm với acetosyringone có mặt trong môi trường Protein virA tự phosphoryl hoá và sau đó phosphoryl hoá protein virG Dạng protein virG không phosphoryl hoá không có hoạt tính Protein virG bị phosphoryl hoá có khả năng điều khiển sự biểu hiện các gen vir khác, bằng cách gắn vào gen chỉ huy nằm sát gen khởi động thuộc các gen vir khác

Chỉ có đoạn sợi đơn ADN giữa trình tự hai biên (LB và RB) của T- ADN mới được chuyển vào và gắn vào genome tế bào thực vật Trong tiến trình chuyển T- ADN, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật

tự biên 25 bp Protein virD1, D2 đóng vai trò chìa khoá trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T-ADN và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên Điểm cắt

là điểm đầu và kết thúc của sợi tái sinh Sau đó, protein virD2 vẫn còn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T- ADN Sự kết hợp ngăn cản exonuclease tấn công vào đầu 5’ của sợi đơn T- ADN và nhận ra đầu 5’ như là đầu dẫn đường cho quá trình chuyển T- ADN vào tế bào thực vật Điều này giải thích tại sao RB cần thiết cho sự chuyển T- ADN Operon D chủ yếu mã hóa một loại endonuclease sẽ tạo ra các vết cắt nói trên tại hai trật tự biên Sự hình thành mạch đơn T- ADN được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein D2 với một hoặc hai protein do virC mã hóa Sau đó, phức hợp sợi đơn T- ADN -virD được bao bọc bởi protein virE2 có nuclease, hơn nữa, sợi đơn T- ADN duỗi thẳng làm giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ 2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào Còn gen virB mã hóa cho ít nhất 11 loại protein để hình thành nên một cầu nối cho phức

hợp trên được chuyển từ Agrobacterium tumefaciens sang tế bào thực vật

Hình 1.6 Quy trình chuyển gen thông qua A tumefaciens

Dựa vào hệ gene của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa Ti plasmid Ðể khai thác và sử dụng Agrobacterium tumefaciens như là một

vector chuyển gene các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T-DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN Nó sẽ được chuyển vào

tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật

T- ADN mang gen ngoại lai

Tế bào thực vật chuyển gen

Cây chuyển gen phát triển từ 1 dòng tế bào mang gen ngoại lai

Vi khuẩn đưa ADN ngoại lai vào tế bào thực vật

Vị trí cắt

enzyme

giới hạn

Enzyme giới hạn cắt Ti- plasmid

ADN ngoại lai cũng được cắt bằng enzyme tương tự

ADN ngoại lai chèn vào vùng T- ADN

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển

gen pBI121/35S/Mir hoặc pBI121/HSP/Mir do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

2.1.2 Vật liệu thực vật

Dòng tế bào thuốc lá BY-2 (Nicotiana tabacum L cv Bright Yellow

No 2) do phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

2.1.3 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121/35S/Mir và cấu trúc vector

pBI121/HSP/Mir mang gen miraculin

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện gen nhân tạo miraculin

(A) pBI121/35S-GUS-tNOS (B) pBI121/35S-Mir-tNOS (C) pBI121/HSP-Mir-tHSP

Trên cơ sở vector biểu hiện pBI121/35S::GUS::NOS mang promoter

CaMV 35S được phân lập từ virut khảm súp lơ, gen chỉ thị GUS và gen kết

thúc NOS, vector này mang gen chọn lọc kháng kháng sinh kanamycin Bằng cách cắt và ghép nối nhờ các cặp enzym cắt giới hạn để thu được vector tái tổ hợp gồm: pBI121/35S::MIR::NOS và pBI121/HSP::MIR::tHSP, các vector

được nhân dòng trong vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt Sau đó, vector tái tổ hợp được biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens Cv58

bằng phương pháp điện biến nạp

Dung dịch điện di ADN:

Dung dịch đệm TAE 50X (Tris base:

121 g, Acid acetic glacial: 28,6 ml;

0,5M EDTA pH 8,0: 50 ml; nước khử

ion vừa đủ: 500 ml)

Dung dịch đệm TAE 1X, Agarose

0,8%, 1%, 1,2%; Ethidium bromide

(EtBr) 0,5 µg/ml Đệm kiểm tra mẫu

ADN (Loading buffer), Thang ADN

ligase 10X, enzyme Taq DNA

polymerase, kháng sinh cefotaxime

và rifamycine, kanamycin, sữa tách béo 0,05%

2.1.5 Môi trường nuôi cấy

Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

LB đặc Yeast extract 5 g/l; Trypton 10 g/l; NaCl 10 g/l;

Môi trường nuôi tế bào

BY-2 chuẩn bị biến nạp

chuyển gen

MT0 MS + 200 mg/l 2,4D + 0,1 g/l

Thiamin + 10 g/l Myo – inosytol + 60 g/l KH2PO4 + 30 g/l sucrose, pH=5,6 ( Môi trường đặc bổ sung 3 g/l Gellan Gum Powder )

Môi trường chọn lọc mô

sẹo chuyển gen

MT1 Môi trường MT0 + 500 mg/l

Cefotaxime +50 mg/l Kanamycine +30 g/l sucrose + 3g/l Gellan Gum Powder, pH=5,6

2.1.6 Máy móc và thiết bị nghiên cứu

Máy ly tâm loại nhỏ

Máy ly tâm loại to

Máy quang phổ định lượng

Axitnucneic Nano Drop

Máy quang phổ Camspec M107

Máy lắc ổn nhiệt Gyromax 737R

Máy lắc Unit wist RT

Nồi hấp khử trùng HV-110…

và các trang thiết bị khác của phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Viện

Hettich, Đức

Thermo Scientific, Hoa Kỳ

Thermo Scientific, Hoa Kỳ Amerex Instrument , Đức Nhật Bản