Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (tt)

Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (LA tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

_ _

LÊ NGỌC TRIỆU

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ

TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62.42.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Đà Lạt, 2017

ĐÀ LẠT, 2016

Công trình được hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

Thầy hướng dẫn 1: PGS TS Nguyễn Văn Kết Thầy hướng dẫn 2: GS TSKH Trần Duy Quý

Phản biện 1: ………

………

Phản biện 2: ………

………

Phản biện 3: ………

………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước

họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Quốc gia

2 Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chi sâm (Panax L thuộc họ ra iaceae một chi th c v t m thuốc

quan trọng v kinh điển trong Đông dược cũng như trong y học hiện đại Kết quả từ các nghiên cứu trong nước gần nhất về th nh phần o i v phân

oại chi Panax đã chỉ ra rằng hiện nay ở Việt Nam có 3 o i: P

vietnamensis Ha v Grushv., P bipinnatifidus Seem., P stipuleanatus Tsai

& Feng v một thứ P vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu &

S.Q.Cai l các taxon có phân bố t nhiên

Lo i đầu tiên được Phạm Ho ng Hộ ghi nh n n m 1970 ở miền Nam

Việt Nam Panax schingseng Nees var japonicum Mak Trong các công

trình xuất bản sau đó, tác giả n y vẫn uôn ghi nh n về s tồn tại của taxon

n y Tuy v y, trong những t i iệu gần nhất về th nh phần o i chi Panax ở

Việt Nam, taxon n y không được nhắc đến

Trong quá trình điều tra khảo sát khu hệ th c v t tại vùng núi Lang

Bian, chúng tôi đã phát hiện một quần thể sâm nh thuộc chi Panax mọc t

nhiên có s khác biệt về cấu trúc c quan dinh dư ng v sinh sản so với các

taxon thuộc chi Panax khác

Do mới được tái phát hiện v rất thiếu các dữ iệu khoa học iên quan đến taxon n y, trước mắt cần phải có các nghiên cứu chuyên sâu về phân tử

v s bộ về th nh phần saponin để xác định rõ vị trí phân oại trong hệ

thống phát sinh chi Panax v bước đầu tìm hiểu khả n ng m thuốc của

taxon n y(được đặt tên sâm Lang Bian Bên cạnh đó, cần nghiên cứu về tính đa dạng v biến động di truyền m c sở cho việc bảo tồn v phát

triển Từ đó, đề t i “Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền

quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng” được tiến

h nh

2 Mục tiêu của đề tài

Đề t i được tiến h nh hướng tới mục tiêu m sáng t vị trí phân oại v quan hệ phát sinh chủng loại của sâm Lang Bian đối với các taxon cùng chi khác; tính đa dạng v biến động di truyền quần thể của sâm Lang Bian, loại

sâm n y có chứa các saponin chính như một số taxon thuộc chi Panax hay

không

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả của đề t i c sở khoa học để công bố, bổ sung v o Danh ục

th c v t, Sách đ Việt Nam một taxon mới đặc hữu Góp phần m rõ về

th nh phần o i của chi Panax ở Việt Nam Kết quả đánh giá đa dạng v

biến động di truyền quần thể th c v t cho phép nh n thức rõ h n về tình

trạng quần thể hay tổng thể taxon Panax phân bố t nhiên tại Lâm Đồng,

tạo c sở cho việc đề xuất phư ng án bảo tồn v phát triển trong tư ng ai Bên cạnh đó, các dữ iệu s bộ về th nh phần saponin c sở ban đầu cho việc xem xét giá trị m thuốc taxon n y

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bản thân taxon sâm Lang Bian, các taxon

Panax khác phân bố tại Việt Nam v trên thế giới trong nghiên cứu về phân

oại; t p hợp các cá thể thuộc hai quần thể taxon n y trong nghiên cứu đa

dạng di truyền quần thể v thân rễ v rễ củ của các taxon thuộc chi Panax

có phân bố tại Việt Nam trong nghiên cứu về phân tích s bộ th nh phần saponin

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi chuyên môn: Với hai nội dung chính của đề t i nghiên cứu vị trí

phân oại v đa dạng di truyền quần thể, s bộ phân tích hoạt chất đối với sâm Lang Bian, phạm vi nghiên cứu chuyên môn của u n án : (1 Xác định vị trí phân oại d a phư ng pháp phân oại th c v t kinh điển d a trên hình thái giải phẫu; (2 Xác định vị trí phân oại v quan hệ phát sinh chủng oại d a trên dữ iệu trình t DN bảo thủ trong nhân v ạp thể; (3 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể d a trên DN fingerprint nảy sinh bằng kỹ thu t sinh học phân tử; v (4 S bộ phân tích hoạt chất của sâm Lang Bian

d a trên phư ng pháp phân tích hóa học kinh điển

Địa điểm nghiên cứu: Điều tra, phân oại v thu th p mẫu th c địa được

tiến h nh ở các vùng có phân bố các taxon thuộc chi Panax tại Việt Nam

Nghiên cứu về phân oại, quan hệ phát sinh d a trên sinh học phân tử cũng như đa dạng v biến động di truyền quần thể được th c hiện tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Trường Đại học Đ Lạt Nghiên cứu về hình thái giải phẫu, phân oại th c v t truyền thống v s bộ về th nh phần saponin được th c hiện tại Bảo t ng th c v t Trường Đại học Đ Lạt (DLU , Bảo t ng th c v t (VTN) v Phòng thí nghiệm hóa hợp chất thiên nhiên - Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên Việc so sánh mẫu v t cũng được tiến h nh tại một số bảo t ng, phòng ưu trữ tiêu bản th c v t trong v ngo i nước

Thời gian nghiên cứu: tiến h nh từ n m 2012 đến n m 2016

5 Những đóng góp mới của luận án

Chứng minh s tồn tại th c tế của một taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng, chỉ ra s mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới về phía Nam Tạo c sở khoa học để công bố,

bổ sung v o Danh ục th c v t, danh ục cây thuốc v Sách đ Việt Nam

một taxon mới đặc hữu Góp phần m rõ về th nh phần o i của chi Panax

ở Việt Nam Xây d ng c sở dữ iệu trình t DNA bảo thủ cho một chủng oại sâm mới, đ ng ký ở ngân h ng gene thế giới để khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn t i nguyên n y

Xây d ng c sở khoa học cho việc hình th nh chiến ược bảo tồn nguồn

t i nguyên th c v t đặc hữu, quý hiếm thông qua kết quả đánh giá về điều tra phân bố, nghiên cứu đa dạng v biến động di truyền quần thể

6 Cấu trúc của luận án:

Phần chính của u n án được trình b y trong 144 trang, 35 bảng số iệu

v 36 hình Không kể phần mở đầu 4 trang, các phần còn ại được chia m các phần: Chư ng I: Tổng quan t i iệu nghiên cứu 39 trang, Chư ng II:

V t iệu, Nội dung v Phư ng pháp nghiên cứu: 17 trang, Chư ng III: Kết quả nghiên cứu v thảo u n: 71 trang, Phần Kết u n v Kiến nghị: 2 trang Ngo i ra còn có các phụ ục Lu n án sử dụng 141 t i iệu tham khảo, trong

đó 22 t i iệu Tiếng Việt, 119 t i iệu tiếng nh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò của các loại nhân sâm trong đời sống

Các nghiên cứu về sâm trên trên thế giới cho thấy các taxon Panax, họ

ra iaceae đều những o i th c v t m thuốc có giá trị kinh tế cao v thường đặt trong tình trạng quý hiếm, cần được bảo tồn

1.2.Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan

hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật

Các phư ng pháp nghiên cứu về phân oại, quan hệ phát sinh chủng oại, đánh giá đa dạng di truyền quần thể d a trên đặc điểm hình thái v dữ iệu phân tử cũng như c sở khoa học của chúng đã được hình th nh, ng y c ng phát triển v ứng dụng rộng rãi Đây chính c sở cho việc tiến h nh nghiên cứu n y

1.3 V trí hệ thống học và phân loại chi Panax, họ Araliaceae

Các kết quả nghiên cứu về phân oại v hệ thống học chi Panax đã trên

thế giới được chỉ ra Theo đó, việc sử dụng hình thái thân rễ v rễ củ trước sau đó đến đặc điểm hình thái khác để phân biệt các taxon phù hợp

Th nh phần o i của chi Panax theo các tác giả khác nhau rất khác nhau

bởi đặc điểm hình thái của các taxon trong chi n y rất đa dạng, dẫn đến quan điểm về hệ thống phát sinh giữa các tác giả không đồng nhất Theo thời gian, ng y c ng có nhiều phát hiện các taxon mới được phát hiện

Theo các t i iệu gần đây thì cho đến hiện nay, ở Việt Nam có 3 o i v 1

thứ có phân bố ở Việt Nam: P vietnamensis, P bipinnatifidus, P

stipuleanatus, P vietnamensis var fuscidiscus được ghi nh n chính thức

Mặc dù được Phạm Ho ng Hộ ghi nh n từ n m 1970 dưới tên khoa học

P schingseng var japonicum v hiệu chỉnh th nh P japonica trong các

công bố sau đó của chính tác giả (1991, 1999, 2003 nhưng taxon tại Lâm

Đồng không được nhắc đến hoặc được cho P vietnamensis m thiếu c

sở giám định mẫu trong các nghiên cứu về sau (Nguyễn T p, 2005; Nguyễn Tiến Bân, 1996&2007; Phan Kế Long v cộng s , 2013

1.4 Quan hệ phát sinh chủng loại chi Panax L dựa trên hệ thống

học mức độ phân t

Để xây nghiên cứu mối quan hệ phát sinh giữa các taxon th c v t nói

chung v chi Panax nói riêng, các nh nghiên cứu đi trước đã sử dụng sử

dụng trình t các vùng bảo thủ một cách riêng rẽ hay phối hợp v biện u n cho kết quả bằng chính các đặc điểm hình thái v phân bố của các taxon Hai hướng nghiên cứu chính bao gồm: nghiên cứu không d a v o giải trình t DN m d a v o đặc điểm DN fingerprint, nghiên cứu d a trên giải trình t các vùng DN bảo thủ Trung gian giữa hai hướng trên nghiên cứu sử dụng DN fingerprint từ các vùng DN bảo thủ

Việc sử dụng các vùng DNA bảo thủ để hỗ trợ cho phân oại trong các

nghiên cứu về các o i thuộc chi Panax khác nhau giữa các tác giả

Các vùng trình t 18S rRN ; ITS1-5,8S rRNA -ITS2 v một phần gene

matK t ra thích hợp trong nghiên cứu n y bởi c sở khoa học trong việc

Việc khảo sát đa dạng di truyền quần thể trong các nghiên cứu được trình b y trên xoay quanh các tiêu chí: mức độ tư ng đồng di truyền giữa

các cá thể trong t p hợp mẫu, tỷ ệ band đa hình (PPB , mức độ dị hợp hay chỉ số đa dạng gene (He , chỉ số biệt hóa gene v khoảng cách di truyền

giữa các t p hợp mẫu (GST v D v chỉ số di cư (Nm)

1.6 Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax

Các nghiên cứu về mặt hóa học ở chi Panax đã tiến h nh trong v ngo i

nước đã chỉ ra các th nh phần hoạt chất của nhóm dược iệu quý n y cũng như trong các taxon riêng rẽ Có thể xem đây một trong các c sở để tham khảo, định hướng v ứng dụng phư ng pháp cho nghiên cứu so sánh

th nh phần saponin giữa đối tượng nghiên cứu v các taxon khác thuộc chi

Panax

1.7 Nhận xét chung

Kết quả từ các nghiên cứu trên các đối tượng cùng chi Panax có trước

v các dữ iệu iên quan từ Genbank một nguồn tham khảo v so sánh tốt trong nghiên cứu về phân oại v quan hệ phát sinh, đánh giá đa dạng v biến động di truyền quần thể v nghiên cứu th nh phần hoạt chất chính (các

saponin ở các taxon Panax Những điều nêu trên góp phần định hướng cho

nghiên cứu n y về mặt học thu t

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1.Vật liệu cho nghiên cứu v trí phân loại và quan hệ phát sinh

chủng loại của sâm Lang Bian và các taxon Panax khác: mẫu thuộc các

taxon Panax tại Việt Nam v mẫu o i Polyscias fruticosa (L.) Harm để

nghiên cứu giải phẫu hình thái v m tiêu bản khô: các mẫu v t cần thu bao gồm: thân rễ, thân củ, lá, hoa, quả (to n cây để m tiêu bản khô v ưu giữ tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên 03/05 mẫu tiêu bản sâm Lang

Bian cùng với các mẫu thuộc các o i Panax đã được định tên có phân bố tại Việt v chuẩn ngoại (outgroup o i Polyscias fruticosa được sử dụng

so sánh, đánh giá quan hệ phát sinh chủng oại Trình t các DN bảo thủ của các mẫu thu th p được công bố trên Genbank (NCBI) Các trình t các

vùng DN bảo thủ tư ng ứng của một số taxon Panax đã được công bố

trên Genbank được sử dụng m chuẩn nội (cùng taxon với các taxon được thu mẫu tại Việt Nam v để so sánh kết quả v phân tích quan hệ phát sinh

(P quinquefolius, P japonicus, P pseudoginseng)

2.1.2 Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian: mẫu á từ t p hợp các cá thể được phát hiện thuộc các quần thể sâm

Lang Bian, trừ các cá thể được giữ nguyên vẹn để m tiêu bản

2.1.3 Vật liệu để nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang

Bian: thân rễ, rễ củ của các taxon thuộc chi Panax phân bố tại Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu vị trí phân oại, quan hệ phát sinh chủng oại giữa sâm Lang

Bian v một số taxon Panax khác d a trên các trình t DNA bảo thủ v đặc

điểm hình thái

- Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian

- Nghiên cứu phân tích, so sánh s bộ th nh phần saponin ở sâm Lang Bian

v một số taxon cùng chi khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu: tiến h nh theo phư ng pháp nghiên cứu th c

v t của K ein v K ein (1970), v Nguyễn Nghĩa Thìn (2007

2.3.2 Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác đ nh v trí

phân loại sâm Lang Bian: theo phư ng pháp của K ein v K ein (1970 v

Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), bao gồm các bước triển khai th c địa v nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Các đặc điểm hình thái của sâm Lang Bian

cũng như các taxon Panax khác được so sánh với nhau v với các bản mô tả

gốc cũng như với các tiêu bản ưu giữ ở các bảo t ng th c v t ở Việt Nam

v thế giới

2.3.3 Tách chiết DNA và kiểm tra chất lượng, hàm lượng DNA: Mẫu á

của từng cá thể được tiến h nh tách chiết DN theo quy trình CT B I cải tiến Kiểm tra chất ượng v nồng độ DN theo phư ng pháp đo OD của Weising v cộng s (2005)

2.3.4 Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự bảo thủ

2.3.4.1 Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ

Các trinh t DNA bảo thủ được khuếch đại bằng PCR với mồi đặc hiệu

v điều kiện phản ứng được cải biến từ phư ng pháp đã sử dụng trong

nghiên cứu có trước, với một phần gene matK: theo Zuo v cộng s (2011),

với vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2: theo Ngan v cộng s (1999 v với

Gene 18S rRNA: theo Komatsu v cộng s (2001)

2.3.4.2 Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA bảo thủ cao

Các trình t có được thông qua việc giải trình t cùng với các trình t

tư ng ứng từ Genbank được sử dụng để phân tích đặc điểm trình t v quan

hệ phát sinh giữa các taxon được khảo sát bằng cách sử dụng phần mềm MEG 5.1 Các vùng DN thuộc bộ gene trong nhân v bộ gene ạp thể được sử dụng riêng rẽ v sau đó phối hợp để phân tích quan hệ phát sinh giữa các taxon khảo sát Tính bất tư ng đồng có thể có giữa các t p hợp trình t khảo sát khi phối hợp trong phân tích quan hệ phát sinh được kiểm tra bằng công cụ Incongruence Length Difference (ILD của phần mềm PAUP* (Swofford, 2003)

2.3.5 Phân tích đa dạng và biến động di truyền quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh bằng kỹ thuật ISSR

2.3.5.1 S dụng kỹ thuật ISSR để hình thành các DNA fingerprint

Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR được th c hiện với dung tích 20 µ

chứa 2 mM MgC 2, 0,25 mM mỗi oại dNTP, 1U Taq DN po ymerase (ThermoScientific , 0,2 µM mồi v khoảng 30 ng khuôn mẫu DN Quá trình khuếch đại DN được tiến h nh trên máy uân nhiệt Peqstar 96X Universa Gradient (Germany với chư ng trình nhiệt sau:

Bước biến tính đầu tiên ở 94 0C trong 5 phút;

10 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0

C trong 45 giây, nhiệt độ gắn mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta trong khoảng 50-570C tùy mồi) trong

45 giây, giảm dần 0,50C/chu kỳ, kéo d i mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây;

36 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây, nhiệt độ bắt mồi thích hợp (Ta) trong 45 giây, kéo d i mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây;

Bước kéo d i mạch cuối cùng ở 720C trong 15 phút

Chọn lọc mồi: Khảo sát t p hợp 45 mồi đã được sử dụng trong các

nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể các o i cùng chi với đối tượng nghiên cứu 5 mẫu DN chọn ngẫu nhiên từ các mẫu thu th p được thử nghiệm khuếch đại với mỗi mồi để s ng ọc mồi với tiêu chí ghi nh n được sản phẩm khuếch đại, có ít nhất 1 band đa hình

Ghi nhận các DNA fingerprint bằng các chỉ thị ISSR: Sản phẩm

khuếch đại được phân tách trên ge agarose 2%, sử dụng đệm TBE với điện thế 60 Vo t trong 3 giờ, ge sau điện di được nhuộm với ethidium bromide (0,5 µg/m , v được chụp ảnh dưới các ánh sáng c c tím có bước sóng 254/312 nm bằng hệ thống Micro Doc Ge Documentation (Mỹ)

2.3.5.2 Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA fingerprint thu nhận được

Phần mềm Microsoft Office Exce 2007 được sử dụng để tính toán các thông số về đa dạng v biến động di truyền Các thông số n y bao gồm: tỷ

ệ phần tr m band đa hình (percentage of po ymorphic bands - PPB , mức

độ dị hợp trông đợi trung bình/chỉ số đa dạng gene (the average expected

heterozygosity - He , chỉ số biệt hóa di truyền giữa các t p hợp mẫu (gene

differentiation among sample sets –GST , khoảng cách di truyền giữa các t p

hợp mẫu (the genetic distance among samp e sets - D v chỉ số về dòng gene hay số ượng cá thể di cư trung bình (Nm) Công thức tính toán các

thông số trên theo phư ng pháp của de Vicente v cộng s ( 2003

Phần mềm chuyên dụng NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2004) được sử dụng để tính toán hệ số tư ng đồng di truyền giữa các cặp mẫu khảo sát v xây d ng

s đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu, sử dụng phư ng pháp

p nhóm UPGM

2.3.6 Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin

Đối tượng để so sánh về s bộ th nh phần hóa học với sâm Lang Bian

(ký hiệu : PVL 2 taxon có quan hệ gần với nó gồm Panax vietnamensis (PV v P vietnamensis var fuscidiscus (PVF v hai biến thể dạng á của

o i P stipuleanatus [ á chét nguyên (PS v á chét xẻ (PSDL)] Các hoạt

chất phân tích 6 chất sau: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 Phân

tích định tính bằng sắc ký ớp m ng theo phư ng pháp của Ho ng Hải nh

v cộng s (2011

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 V trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian

và một số loài Panax khác dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA

bảo thủ

3.1.1 V trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình thái

Đặc điểm hình thái của taxon sâm Lang Bian

Cây có dạng thân thảo, âu n m, cao 50-90 cm Thân rễ dạng đốt, thường

bò ngang, đường kính 1-2,5cm, các đốt xếp gần nhau với khoảng cách giữa các đốt từ 2-5cm, mặt bên ngo i có m u nâu v ng Rễ củ gắn v o phần dưới của thân rễ, dạng phồng ớn, có hình chóp hay gần như dạng hình nón, kích thước 3-5 × 2-4cm Thân khí sinh thẳng, mảnh, nhẵn với phần õi xốp, mang các á kép chân vịt với 3, 4 hoặc hiếm khi 5 á kép mọc vòng ở đỉnh

thân khí sinh, cuống á kép d i 8-13cm, nhẵn, không có á kèm hay những phần phụ giống á kèm

Lá kép thường gồm 5 á chét (hiếm khi đến 7 , gồm ba á chét ớn iền nhau có hình ova hay e ip, kích thước 10–12 × 4–5 cm; hai á chét còn ại

nh h n cũng có dạng oval-e ip với kích thước 4–5 × 2–3 cm; á chét mang 5-8 gân thứ cấp, phiến dạng m ng, có ông ở các gân cả hai mặt á; gốc á dạng nêm hay hẹp dần, mép á chét thường có r ng cưa, hiếm khi mang

r ng cưa đôi; đầu á chét có dạng mũi nhọn ngắn, d i 8mm, cuống á chét

d i 8-11mm

Cụm hoa dạng tán, khoảng 40-80 hoa, cuống cụm hoa d i 10-18cm, có tuyến Các hoa có đường kính 1,5-2cm, cuống hoa d i 4-6mm, đế hoa có dạng chén, đĩa bầu ban đầu dạng h i ồi, m u xanh, sau đó chuyển sang dạng ồi hẳn ên v có m u v ng nhạt; đ i hoa 5, dạng tam giác, d i 0,45–0,55 mm, nhẵn; cánh hoa 5, dạng hình trứng ngược, kích thước 1,4 × 0,75

mm, nhẵn Bao phấn 5, kích thước 0,7–0,8 × 0,3–0,4 mm, chỉ nhị d i

tư ng đư ng hay ngắn h n cánh hoa; vòi nhụy 2 (hiếm khi 1 , kích thước 0,6–0,8 mm; bầu nhụy 2 ô, d i khoảng 1mm Quả có dạng trứng, h i dẹt, đường kính khoảng 4-5 mm, mang 1 (hiếm khi 2 hạt Hạt chắc, dạng trứng với kích thước 3,5–4,5 × 3–4 mm

Hình 3.3 Ảnh chụp đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian

: Sinh cảnh - B-C: Thân, á chét mang tán hoa– D: thân rễ – E: Tán hoa

- F, H-I: Hoa – G: Cuống hoa - J: cánh hoa - K: Đĩa bầu v vòi nhụy – L: Nhị – M: Quả

Với những đặc điểm như trên (hình 3.3), sâm Lang Biang thuộc chi

Panax, họ ra iaceae H n thế nữa, với thân rễ có dạng đốt, nên sâm Lang

Bian rất gần với P vietnamensis var vietnamenis v P vietnamensis var

fuscidiscus theo quan điểm của Hara (1970 , Xiang v Lowry (2007 Các

đặc điểm khác biệt thể hiện giữa 3 taxon n y thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P

vietnamensis và P vietnamensis var fuscidiscus

Đặc điểm Sâm Lang Bian P vietnamensis

Không cân hoặc dạng nêm

Không cân hoặc dạng nêm

3.1.2 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên các trình tự bảo thủ

3.1.2.1 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon

cùng chi dựa trên vùng gene matK

Tiến h nh r soát, so sánh các trình t d i 818 nuc eotide tư ng ứng ở tất

cả các taxon Panax, các taxon được khảo sát khác nhau ở 22 vị trí: 76, 126,

128, 133, 159, 163, 170, 258, 332, 347, 409, 425, 430, 539, 600, 611, 641,

721, 734, 762, 785, 793

Trình t các chuẩn nội P vietnamensis và P vietnamensis var

fuscidiscus trùng với trình t tư ng ứng của mẫu giải trình t Trình t của

P stipuleanatus, P bipinnatifidus trong nghiên cứu n y như nhau v

trùng với trình t chuẩn nội P stipuleanatus

Khoảng cách di truyền giữa sâm Lang Bian v các taxon khác cùng chi

từ 0,0012 (P vietnamensis đến 0,0203 (P stipuleanatus D a v o khoảng

cách di truyền giữa các taxon để xây d ng các cây quan hệ phát sinh chủng

oại, chuẩn ngoại (Polyscias fruticosa xen v o giữa các taxon Panax, điều

n y cũng xảy ra khi sử dụng 5 chuẩn ngoại nhưng khi nâng số chuẩn ngoại

ên 8 thì tất cả các chuẩn ngoại đều tách kh i nhóm các taxon Panax Cây

quan hệ phát sinh chủng oại (sau đây gọi tắt cây quan hệ phát sinh được xây d ng theo phư ng pháp Maximum ike ihood trong trường hợp n y như sau:

Hình 3.9 Cây quan hệ phát sinh dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp ML s dụng 8 chuẩn ngoại

Cây quan hệ chủng oại NJ tư ng ứng cũng có hình thể tư ng t

Qua cây quan hệ phát sinh, có thể nh n thấy sâm Lang Bian, Panax

vietnamensis, Panax vietnamensis var fuscidiscus v chuẩn nội P bipinnatifidus p nhóm với nhau, tuy v y chuẩn nội P bipinnatifidus có

hình thái á v thân rễ ho n to n khác với các taxon còn ại Do v y đề xuất

Panax sp th nh một thứ của P vietnamensis hợp ý h n của P bipinnatifidus S khác biệt trình t gene matK giữa Panax sp v P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus thể hiện ở 9 vị trí 221,

388, 469, 535, 558, 566, 593, 594 v 602

Như v y, trình t một phần vùng gene matK có thể dùng để nh n dạng

s khác biệt giữa các nhóm taxon gồm sâm Lang Bian v các taxon được so

sánh, nhưng không thể hiện s sai biệt giữa hai taxon: P vietnamensis var

fuscidiscus v P japonicus var bipinnatifidus Mặt khác, chỉ ra rằng taxon

P bipinnatifidus được thu th p tại Việt Nam có sai khác ớn so với chuẩn

nội Taxon Polycias fruticosa thể hiện vai trò chuẩn ngoại khi được xem xét

trong tổng thể ớn h n gồm nhiều taxon khác cùng họ

3.1.2.2 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2

Sau khi c n trình t , xác p vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 tư ng ứng với tất cả các trình t đại diện cho các taxon được chọn để khảo sát, tiến h nh r soát, so sánh, các trình t ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 d i 595 đến 608

nuc eotide có được, các taxon Panax được khảo sát khác nhau ở 74 vị trí:

14, 29, 42, 43, 54, 60, 82, 83, 101, 103, 104, 109, 112, 115, 116, 117, 128,

139, 151, 162, 175, 176, 179, 182, 178, 189, 201, 203, 217, 274, 281, 340,