Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (panax sp ) phân bố tự nhiên tại lâm đồng

Mục tiêu của đề tài Đề tài được tiến hành hướng tới mục tiêu làm sáng tỏ các vấn đề: - Quần thể sâm mới được phát hiện có các đặc điểm khác biệt về di truyền so với các taxon khác hay k

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

_ _

LÊ NGỌC TRIỆU

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ

TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

ĐÀ LẠT, 2017

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

_ _

LÊ NGỌC TRIỆU

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI

TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Đà Lạt, ngày 21 tháng 12 năm 2017

Tác giả luận án

Lê Ngọc Triệu

Trang 4

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận án, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Kết, GS.TSKH Trần Duy Quý, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi có thể tôi hoàn thành luận án

Xin được trân trọng cám ơn quý thầy cô thuộc Ban đào tạo sau đại học -Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp, Trường Đại học Đà Lạt đã truyền đạt các kiến thức, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực hiện luận án

Để có được các kết quả nghiên cứu trong luận án này, tôi xin chân thành cám

ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia và đặc biệt là TS Trần Văn Tiến

đã tạo điều kiện cho tôi tham gia, thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân loại và đánh giá

đa dạng di truyền chi sâm (Panax L.) ở Việt Nam” Xin được tri ân đến Lãnh đạo Viện

Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên cũng như các anh em, bạn bè đồng nghiệp gần xa,… đã chia sẻ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ tôi, người đã sinh thành, nuôi dưỡng tôi nên người và vợ tôi đã luôn động viên và chia sẻ để tôi phấn đấu hoàn thành luận án này

Lê Ngọc Triệu

Trang 5

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cám ơn ii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 3

5 Những đóng góp mới của luận án 4

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Vai trò của các loại sâm trong đời sống 5

1.2 Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật 7

1.2.1 Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật 7

1.2.1.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái 7

1.2.1.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử 8

1.2.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật 10

1.2.2.1 Các phương pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại 11

1.2.2.2 Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật 11

1.2.2.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể 14

1.3 Vị trí hệ thống học và phân loại chi Panax, họ Araliaceae 16

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới 16

1.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam 22

1.4 Quan hệ phát sinh chi Panax L dựa trên hê ̣ thống ho ̣c mức đô ̣ phân tử 23

1.4.1 Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax không dựa vào giải trình tự DNA 25

1.4.1.1 Các nghiên cứu trên thế giới 25

1.4.1.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam 26

Trang 6

1.4.2 Các nghiên cứu dựa trên giải trình tự các vùng DNA bảo thủ 27

1.4.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới 27

1.4.2.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam 32

1.4.3 Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax sử dụng DNA fingerprint từ các vùng DNA bảo thủ 33

1.5 Các nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở chi Panax 34

1.6 Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax 39

1.7 Nhận xét chung 41

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Vật liệu nghiên cứu 44

2.1.1 Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại của sâm Lang Bian và các taxon Panax khác 44

2.1.2 Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian 46

2.1.3 Vật liệu cho nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin của sâm Lang Bian 46

2.2 Nội dung nghiên cứu 47

2.3 Phương pháp nghiên cứu 47

2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu 47

2.3.1.1 Thu thập, xử lý mẫu để nghiên cứu hình thái thực vật học, lưu trữ và nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại 50

2.3.1.2 Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể 50

2.3.1.3 Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu sơ bộ về thành phần saponin 51

2.3.2 Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác định vị trí phân loại sâm Lang Bian 51

2.3.3 Tách chiết DNA và kiểm tra chất lượng, hàm lượng DNA trong các mẫu 52

2.3.4 Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự bảo thủ 52

2.3.4.1 Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ 52

2.3.4.2 Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA bảo thủ cao 55

2.3.5 Phân tích đa dạng và biến động di truyền trong quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh bằng kỹ thuật ISSR 55

2.3.5.1 Sử dụng kỹ thuâ ̣t ISSR để hình thành các DNA fingerprint 56

2.3.5.2 Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA fingerprint thu nhận được 57

2.3.6 Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin 59

Trang 7

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 Vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và một số loài khác cùng chi dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA bảo thủ 61

3.1.1 Vị trí phân loại thực vật của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình thái 61

3.1.2 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên các trình tự bảo thủ 66

3.1.2.1 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng gene matK 66

3.1.2.2 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 75

3.1.2.3 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi khác dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA 84

3.1.2.4 Khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào việc phối hợp các vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK 90

3.1.3 Vị trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên quan hệ phát sinh chủng loại với các taxon Panax khác ở mức độ phân tử và đặc điểm hình thái 102

3.2 Đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian 104

3.2.1 Kết quả thu thập, chuẩn bị mẫu và chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền quần thể 104

3.2.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD 110

3.2.3 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR 116

3.2.4 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu 122

3.3 Kết quả nghiên cứu về phân tích, so sánh sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian và một số taxon cùng chi khác 129

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 132

1 Kết luận 132

2 Kiến nghị 132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 134

TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: PHỔ ĐỒ TRÌNH TỰ CÁC VÙNG DNA BẢO TỒN CỦA CÁC TAXON ĐƯỢC THU THẬP TRONG NGHIÊN CỨU

PHỤ LỤC 2: SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG BẢO TỒN GIỮA CÁC TAXON KHẢO SÁT

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA KHUẾCH ĐẠI BẰNG CÁC MỒI ISSR

Trang 8

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

DDBJ: DNA Data Bank of Janan

ISSR: Inter Simple Sequence Repeats

ITS: Internal transcribed spacer

IUCN: International Union for Conservation of Nature LD: Lạc Dương

M-R2: Majonoside R2

NCBI: National Centre for Biotechnology Information N-R1: Notoginsenosid R1

PPB: percentage of polymorphic bands

PS: Panax stipuleanatus (lá chét nguyên)

PSDL: Panax stipuleanatus (lá chét xẻ)

PV: Panax vietnamensis

PVF: Panax vietnamensis var fuscidiscus

PVL: Panax vietnamensis var langbianensis

RAPD: Random Amplified Polymorphic

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

rRNA: ribosomal RNA

SCAR: Sequence Characterized Amplified Region

SNP: Single Nucleotide Polymorphism

SSR: Simple sequence Repeat - Microsatellites

VNTR: Variable Number of Tandem Repeats - Minisatellites

Trang 9

loại 44 2.2 Mã truy cập các trình tự 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 và một

phần gene matK của các mẫu thu thập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên

cứu phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại 45 2.3 Các trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 và gen matK đƣợc lấy từ

Genbank sử dụng trong nghiên cứu phân tích quan hệ phát sinh chủng loại 45 3.1 So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P vietnamensis và P

vietnamensis var fuscidiscus 62

3.2 Thành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự một phần gene matK ở các

taxon đƣợc khảo sát 68 3.3 Những vị trí khác biệt ở trình tự một phần gene matK của đối tƣợng nghiên

cứu so với các taxon khác cùng chi 69 3.4 Khoảng cách di truyền giữa các taxon đƣợc khảo sát dựa trên trình tự một

phần vùng gene matK 70

3.5 Sự khác biệt giữa trình tự gene matK giữa Panax sp., P vietnamensis và P

vietnamensis var fuscidiscus 72

3.6 So sánh trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các mẫu thuộc taxon Panax

vietnamensis từ các nguồn khác nhau 77

3.7 Thành phần, số lƣợng nucleotide các trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 khảo

sát 78 3.8 Những vị trí khác biệt ở trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 của đối tƣợng

nghiên cứu so với các taxon cùng chi 79 3.9 Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dự trên trình tự vùng ITS1–

5,8SrRNA–ITS2 81 3.10 Sai khác giữa sâm Lang Bian với Panax vietnamensis và P vietnamensis

var fuscidiscus dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 84

Trang 10

3.11 Phành phần và số lượng nucleotide các trình tự vùng 18S rRNA ở các taxon

được khảo sát 86

3.12 Các vị trí khác biệt giữa các taxon Panax khảo sát dựa trên trình tự vùng

gene 18S rRNA 87 3.13 Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dựa trên trình tự 18S rRNA 88 3.14 Đặc điểm thành phần và số lượng nucleotide của các trình tự phối hợp ở các

taxon khảo sát 94

3.15 Khoảng cách di truyền giữa các taxon Panax được khảo sát dựa trên sự phối

hợp ba trình tự DNA bảo thủ 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một

phần gene matK 95

3.16 Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể LD 105 3.17 Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể DR 106 3.18 Đặc điểm các mồi ISSR được chọn lọc và sử dụng để làm nảy sinh DNA

fingerprint làm cơ sở đánh giá đa dạng di truyền 107 3.19 Tỷ lệ band đa hình ở mức độ tổng thể mẫu nghiên cứu, quần thể và các

nhóm tuổi trong quần thể 109 3.20 Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể

LD 111 3.21 Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể

LD 112 3.22 Hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở

quần thể LD 113 3.23 Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể

DR 117 3.24 Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể

DR 118 3.25 Hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở

quần thể DR 119 3.26a Hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi lớn thuộc quần

thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR 123 3.26b Hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi nhỏ thuộc quần

thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR 124 3.27 Thành phần saponin theo chất chuẩn của các mẫu khảo sát 130

Trang 11

DANH MỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

1.1 Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Wen và cộng

sự (1996) 28

1.2 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phối hợp trình tự gene trnK và gene 18S rRNA theo Komatsu và cộng sự (2003) 32

2.1 Bản đồ địa hình điều tra thu thập mẫu đối với sâm Lang Bian 48

2.2 Bản đồ không ảnh tổng thể khu vực phân bố sâm Lang Bian 49

3.1 So sánh hình thái giữa sâm Lang Bian, Panax vietnamensis và Panax vietnamensis var fuscidiscus 63

3.2 Hình vẽ mô tả đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian 64

3.3 Ảnh chụp đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian 65

3.4 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự một phần gene matK 66

3.5 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum likelihood 71

3.6 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Neiborgh joining 71

3.7 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum likelihood sử dụng 5 chuẩn ngoại 73

3.8 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Neiborgh joining sử dụng 5 chuẩn ngoại 73

3.9 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum likelihood sử dụng 8 chuẩn ngoại 74

3.10 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Neiborgh joining sử dụng 8 chuẩn ngoại 75

3.11 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 76

3.12 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum likelihood 82

3.13 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Neiborgh joining 82

3.14 Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Yang và cộng sự (2001) 83

Trang 12

3.15 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự 18S rRNA 85

3.16 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum likelihood 89

3.17 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Neiborgh joining 89

3.18 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum likelihood 96

3.19 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Neiborgh joining 97

3.20 A Mẫu tiêu bản Panax bipinnatifidus; B Mẫu Lectotype của P bipinnatifidus; C Mẫu P stipuleanatus ở Lai Châu, Việt Nam ; D Mẫu P bipinnatifidus ở Lai Châu, Việt Nam 99

3.21 Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum likelihood 100

3.22 Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Neiborgh joining 101

3.23 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phương pháp Maximum parsimony 101

3.24 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 844A ở quần thể LD 107

3.25 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR UBC873 ở quần thể LD 108

3.26 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 814 ở quần thể DR 108

3.27 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR HB12 ở quần thể DR 108

3.28 Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể LD 115

3.29 Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể DR 121

3.30 Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể trong tổng thể nghiên cứu 126

3.31 Sơ đồ dạng cây vềquan hệ di truyền các cá thể thuộc hai nhóm lá chét nguyên và lá chét xẻ loài P stipuleanatus theo Trieu và cộng sự (2016) 127

3.32 Sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin của các taxon được khảo sát và các chất chuẩn 129

Trang 13

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chi sâm (Panax L.) thuộc họ Araliaceae là một chi thực vật làm thuốc quan trọng

và kinh điển trong Đông dược cũng như trong y học hiện đại Panax ginseng là một

trong số các loài thuộc chi sâm đã góp phần đưa Hàn Quốc trở nên nổi tiếng khắp thế

giới về dược liệu Hiê ̣n nay trên thế giới đã phát hiê ̣n được nhiều loài sâm như : Panax ginseng C.A.Mey., P japonicus (T.Nees) Mey., P quinquefolius L., P notoginseng (Burkill) F.H.Chen, P zingiberensis C.Y.Wu & Feng, P vietnamensis Ha et Grushv.,

P pseudoginseng Wall., P stipuleanatus Tsai & Feng, P trifolius L.…, phân bố ở Đông Á, vùng Himalaya, Indochina và Bắc Mỹ Do có giá trị làm thuốc cao nên nhiều loài sâm đã bị khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt trong tự nhiên Các quốc gia trên thế giới có phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi này như Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung Quốc… đều đã đưa ra các chương trình bảo tồn, phát triển và hạn chế khai thác tự nhiên để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên nhiều phương diện về các loài thuộc chi Panax đã được tiến hành từ khá lâu , đă ̣c biê ̣t là loài P vietnamensis vốn là đă ̣c hữu của Viê ̣t

Nam và đến nay đã trở thành cây thuốc trọng điểm quốc gia và đã được đầu tư nhiều tiền của, công sức để bảo tồn, phát triển Kết quả từ các nghiên cứu gần nhất về thành

phần loài và phân loại chi Panax đã chỉ ra rằng hiện nay ở Việt Nam có 3 loài: P vietnamensis Ha và Grushv., P bipinnatifidus Seem., P stipuleanatus Tsai & Feng và một thứ là P vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai là các taxon

có phân bố tự nhiên và đang trong tình trạng nguy cấp theo tiêu chuẩn IUCN

Loài đầu tiên được Phạm Hoàng Hộ ghi nhận năm 1970 ở miền Nam Việt Nam là

Panax schingseng Nees var japonicum Mak Theo tác giả, loài này mọc dưới tán rừng

râ ̣m lá rô ̣ng, thường xanh, ẩm ở vùng núi Lang Bian, tỉnh Lâm Đồng Trong các công trình xuất bản sau đó về thành phần loài thực vật Việt Nam, tác giả này vẫn luôn ghi

nhận về sự tồn tại của taxon này nhưng dưới tên khoa học khác là P japonica (Nees) Mayer Tuy vậy, trong những tài liệu gần nhất về thành phần loài chi Panax ở Việt

Nam, taxon do Phạm Hoàng Hộ ghi nhận có phân bố ở vùng Lạc Dương, Lâm Đồng không được nhắc đến, thay vào đó, một số tài liệu ghi nhận có sự phân bố tự nhiên của

P vietnamensis tại đây

Trong quá trình điều tra khảo sát khu hê ̣ thực vâ ̣t ta ̣i vùng núi Lang Bian, huyện Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 10 năm 2010, nơi mà Phạm Hoàng Hộ đã ghi

nhận có sự phân bố của một taxon Panax từ năm 1970, chúng tôi đã phát hiê ̣n mô ̣t

Trang 14

quần thể sâm nhỏ thuô ̣c chi Panax mọc tự nhiên Qua nghiên cứu về hình thái thân rễ,

lá, hoa, quả ban đầu cho thấy các cá thể thuô ̣c quần thể có sự khác biệt về cấu trúc cơ

quan dinh dưỡng và sinh sản so với các taxon thuộc chi Panax khác

Do mới được tái phát hiện và rất thiếu các dữ liệu khoa học liên quan đến taxon này, trước mắt cần phải có các nghiên cứu chuyên sâu về phân tử và sơ bộ về thành

phần saponin để xác định rõ vị trí phân loại trong hệ thống phát sinh chi Panax và

bước đầu tìm hiểu khả năng làm thuốc của taxon này Bên cạnh đó, do khu phân bố của quần thể sâm mới tái phát hiện rất hẹp, số lượng cá thể ít nên cần thông tin về tính

đa dạng và biến động di truyền làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển

Để có thêm cơ sở khoa ho ̣c cho viê ̣c phân loa ̣i , khẳng đi ̣nh nguồn tài nguyên quý hiếm vừa phát hi ện nói trên của Viê ̣t Nam đối với thế giới cũng như bảo tồn và phát

triển chúng phu ̣c vu ̣ cho công tác nghiên cứu và sử dụng về sau , đề tài “Nghiên cứu

phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng” được tiến hành

2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài được tiến hành hướng tới mục tiêu làm sáng tỏ các vấn đề:

- Quần thể sâm mới được phát hiện có các đặc điểm khác biệt về di truyền so với các taxon khác hay không?, quan hệ phát sinh chủng loại của nó đối với các taxon cùng chi khác thế nào?;

- Tính đa dạng và biến động di truyền trong quần thể của đối tượng này ra sao?;

- Taxon mới phát hiện này có chứa các saponin chính như một số taxon thuộc chi

Panax hay không? và dựa trên các dược chất này, có sự khác biệt giữa taxon khảo sát

so với các taxon cùng chi khác không?

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả đề tài minh chứng cho sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax,

họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng vốn đã gây nhiều tranh luận do một thời gian dài không tìm thấy mẫu vật, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên

thế giới về phía Nam

Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật, Sách đỏ Việt Nam một taxon mới, đặc hữu và góp phần làm rõ về thành phần loài của

chi Panax ở Việt Nam Việc xây dựng cơ sở dữ liệu DNA bảo thủ cho các giống/loài,

đăng ký ở ngân hàng gene thế giới là việc làm cần thiết để khẳng định chủ quyền quốc

Trang 15

gia về tài nguyên thực vật, đặc biệt là đối với nguồn tài nguyên đặc hữu, quý hiếm mới phát hiện lại nói trên

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả đánh giá đa dạng và biến động di truyền trong quần thể thực vật cho

phép nhận thức rõ hơn về tình trạng các quần thể cũng như tổng thể taxon Panax phân

bố tự nhiên tại Lâm Đồng, tạo cơ sở cho việc đề xuất phương án bảo tồn và phát triển trong tương lai Bên cạnh đó, các dữ liệu sơ bộ về thành phần saponin là cơ sở ban đầu cho việc xem xét giá trị làm thuốc taxon này

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong nghiên cứu vị trí phân loại của taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng, đối tượng nghiên cứu là bản thân taxon thực vật này (Panax sp., được gọi là sâm Lang Bian), các taxon Panax khác phân bố tại Việt Nam và trên thế giới

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, đối tượng nghiên cứu là tập hợp các cá thể thuộc hai quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng

Trong nghiên cứu về phân tích sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian, đối

tượng nghiên cứu là thân rễ và rễ củ của các taxon thuộc chi Panax có phân bố tại Việt

Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu điều tra, phân loại và thu thập mẫu thực địa được tiến hành ở các

vùng có phân bố các taxon thuộc chi Panax tại Việt Nam, tập trung vào khu vực phát

hiện quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng và các khu vực lân cận

Trang 16

Nghiên cứu về phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sinh học phân tử cũng như đa dạng di truyền quần thể được thực hiện tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp, trường Đại học

Đà Lạt

Nghiên cứu về hình thái giải phẫu, phân loại thực vật truyền thống và sơ bộ về thành phần saponin được thực hiện chủ yếu tại Bảo tàng thực vật Trường Đại học Đà Lạt (DLU), Bảo tàng thực vật (VTN) và Phòng thí nghiệm hóa hợp chất thiên nhiên - Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên Việc so sánh mẫu vật cũng được tiến hành tại một số bảo tàng, phòng lưu trữ tiêu bản thực vật trong và ngoài nước

Thời gian nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2012 đến năm 2016

5 Những đóng góp mới của luận án

Chứng minh sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới

về phía Nam

Tạo cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật, danh lục cây thuốc và Sách đỏ Việt Nam một taxon mới đặc hữu Góp phần làm rõ về thành phần

loài của chi Panax ở Việt Nam

Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA cho một chủng loại sâm mới, đăng ký ở ngân hàng gene thế giới để khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyên này

Xây dựng cơ sở khoa học cho việc hình thành chiến lược bảo tồn nguồn tài nguyên thực vật đặc hữu, quý hiếm thông qua kết quả đánh giá về điều tra phân bố, nghiên cứu đa dạng và biến động di truyền trong quần thể

Trang 17

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vai trò của các loại sâm trong đời sống

Sâm (Ginseng) được hiểu là bất kỳ loài nào trong số các loài cây thảo lưu niên

có củ nạc sinh trưởng chậm thuộc chi Panax, họ Araliaceae Các loài sâm được đặc

trưng bởi khả năng làm thuốc nhờ có chứa các loại ginsenoside Ginsenoside hay còn gọi là panaxoside có bản chất là steroid glycoside và triterpene saponin vốn có nhiều hoạt tính sinh học và giá trị làm thuốc cao

Lịch sử sử dụng sâm bắt đầu từ 4.500 năm trước và tài liệu ghi nhận về sâm sớm nhất được biết đã có từ 2.000 năm trước Về giá trị kinh tế, các loại sâm là những nguồn cây thuốc có giá trị kinh tế rất cao đối với nhân loại, được mua bán tại trên 35 quốc gia với kim ngạch đạt đến 2,1 tỷ USD vào năm 2013 và khoảng một nửa trong số

đó là từ Hàn Quốc Trong nhiều năm lịch sử, Triều Tiên – Hàn Quốc là các quốc gia cung cấp lớn nhất và Trung quốc là quốc gia tiêu thụ sâm lớn nhất thế giới (Baeg và

So, 2013)

Giá trị của các loại sâm rất khác nhau tùy vào loài, xuất xứ, độ tuổi, có nguồn gốc trồng hay từ tự nhiên Theo ghi nhận thực tế của chúng tôi trong quá trình điều tra,

trong khi giá bán của P vietnamensis 15-30 triệu đồng/kg tại Kon Tum thì giá bán của

P vietnamensis var fuscidiscus là 4-6 triệu đồng/kg; của P stipuleanatus là 3-5 triệu đồng/kg và của P bipinnatifidus là 2-4 triệu đồng/kg tại Lai Châu Trong khi giá bán tại Hàn Quốc của P ginseng (Nhân sâm đỏ) trồng là 250 USD/kg thì giá 1 củ sâm tự

nhiên cùng loại là 2.000 – 20.000USD/kg tùy vào tuổi

Chính vì có giá trị kinh tế cao mà nhiều loài thuộc chi Panax đã được trồng

dưới nhiều hình thức: mô hình vườn rừng (Li và cộng sự, 2011; Artyukova và cộng sự,

2004), trồng thuần thâm canh cũng như được sản xuất in vitro công nghiệp (Nguyen

Trung Thanh và cộng sự, 2014; Grażyna và cộng sự, 2013) Những hoạt động này đã hình thành nên nghề trồng sâm hay các nhà máy sản xuất lớn, tạo việc làm cho nhiều người (Proctor và cộng sự, 2011)

Do có giá trị làm thuốc và giá trị kinh tế lớn mà những quốc gia trên thế giới có

sự phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi Panax như Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung

Quốc… đều đã đưa ra các chương trình bảo tồn, phát triển và khai thác đôi khi đến mức nghiêm ngặt để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này (Bai và cộng sự, 1997; Jennifer và Hamrick, 2004; Eidus và Leopold, 2013) Ở nước ta đã có nhiều chương

Trang 18

trình, dự án nghiên cứu triển khai để bảo tồn, phát triển tập trung vào đối tượng được

xem là đặc hữu của Việt Nam là P vietnamensis Hiện nay, Trung tâm Sâm và Dược

liệu thành phố Hồ Chí Minh được xem là một trong những đơn vị được đầu tư để nghiên cứu và phát triển Sâm Ngọc Linh Gần đây nhất là việc xây dựng Trung tâm quốc gia nghiên cứu phát triển Sâm Ngọc Linh, là hạng mục đầu tiên của Dự án đầu tư

“Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống, canh tác, mở rộng sản xuất, xây dựng và phát triển thương hiệu quốc gia cho Sâm Ngọc Linh”, được thực hiện trên

cơ sở thỏa thuận hợp tác giữa Bộ Khoa học và Công nghệ với Ủy ban nhân dân tỉnh Kon Tum và giao cho Cục Phát triển thị trường và Doanh nghiệp - Bộ Khoa học và công nghệ chủ trì thực hiện (http://www.most.gov.vn)

Do có giá trị cao mà nhiều loài Nhân sâm bị làm giả, có thể bằng các loài khác

cùng chi Panax hay thậm chí những loài có quan hệ phát sinh chủng loại rất xa Ví dụ, Mirabilis jalapa L và Phytolacca acinosa Roxb là hai loài thường được dùng làm giả cho P ginseng, P notoginseng, P japonicus, P trifolius và P mayor (Ngan và cộng

sự, 1999); Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) bị làm giả bởi Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus), Tam thất hoang (P stipuleanatus), Sâm Vũ diệp (P stipuleanatus lá xẻ, từng được xem là P bipinnatifidus) để bán tại các vùng Kon Tum,

Quảng Nam, Lâm Đồng

Các taxon thuộc chi Panax đã biết đều là các đối tượng có giá trị dược dụng cao

và được xem là thần dược cuộc sống bởi khả năng chống các bệnh kinh niên, chống oxy hóa của chúng (Lee và cộng sự, 2016), do vậy đã có hàng loạt các công trình nghiên cứu trên thế giới và cũng như ở Việt Nam được tiến hành nhằm thúc đẩy sản xuất, khai thác, sử dụng hiệu quả Nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa dược và dược lý, tiếp đến là nghiên cứu về nhân giống, canh tác, chế biến, hệ thống học thực vật, đa dạng di truyền, bảo tồn đa dạng nguồn gene… và kết quả là có một số lượng lớn các công trình được công bố trên các tạp chí, sách chuyên khảo và các thông tin trên các phương tiện đại chúng liên quan đến sâm Nói cách khác, các loại sâm là đối tượng thực vật có một sự cuốn hút lớn đối với những người làm công tác nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực trên toàn thế giới Những công trình nghiên cứu về sâm vẫn đang được triển khai cho dù những phát hiện đột phá về mặt thành phần loài gần đây không nhiều

Trang 19

1.2 Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan

hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật

1.2.1 Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật

Cơ sở nền tảng của việc phân loại, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền ở sinh vật chính là nghiên cứu sự giống hay khác nhau giữa chúng, sự khác nhau đó có thể nhận biết bằng hình thái hay thông qua các phương pháp sinh học phân tử Tùy vào các mục đích và hoàn cảnh nghiên cứu cụ thể

mà sự tương đồng hay khác nhau của sinh vật được xem xét ở những mức độ khác nhau về số lượng cá thể khảo sát, đặc điểm hình thái ghi nhận hay phương pháp làm nảy sinh DNA fingerprint bao gồm cả các DNA barcode (Duminil và Michele, 2009)

1.2.1.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất sớm Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là hai đơn vị phân loại (taxon) càng có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần nhau Bất cứ sự khác nhau nào giữa hai cá thể đều được nghiên cứu, nhưng không phải bất cứ đặc điểm nào cũng có thể dùng làm đặc điểm phân loại Những đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm, liên quan đến những cấu trúc ít biến đổi của cơ thể sinh vật thường được sử dụng

để phân biệt và xác định các taxon bậc cao, những biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế cách ly sinh sản được dùng để xác định các taxon bậc thấp Các nhà nghiên cứu thường kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả

so sánh (Pellegrino và cộng sự, 2005)

Mặc dù phương pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ưu điểm là tiện lợi, nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các đặc điểm giữa các loài hoá thạch với các loài đang sống để tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa chúng, nhưng việc lựa chọn

và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trong những khâu khó nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức mà còn đòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại học Bên cạnh đó, phương pháp này nhiều khi không chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và không phân biệt được các loài đồng hình (Krishnan và cộng sự, 2011) Mặt khác, bởi hình thái chính là kết quả của biểu hiện gene trong một điều kiện ngoại cảnh nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức độ thường biến cao Hơn nữa, các đặc điểm hình thái có nhiều điểm hạn chế như: các biến đổi hình thái không phát hiện được ở một số loài; các nghiên cứu sử dụng đặc

Trang 20

điểm hình thái nói chung thường giới hạn trong một hay một vài locus trong toàn bộ

bộ gene; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát được vào cuối chu kỳ sống; nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các sinh vật được khảo sát gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền của quần thể (Duminil và Michele, 2009)

1.2.1.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử

Chỉ thị (Marker) phân tử đã có những đóng góp lớn vào lĩnh vực nghiên cứu sự

đa dạng quần thể thông qua các kỹ thuật làm nảy sinh các DNA fingerprint và phát hiện những biến động di truyền giữa các cá thể, quần thể và loài Trước đây, khi sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền chưa phát triển, thì chỉ thị hình thái thường được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng này

Trong những thập kỷ qua, việc sử dụng các marker phân tử để phản ánh các đa hình ở mức độ DNA đã đóng vai trò ngày càng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật và đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu di truyền Có thể chia marker phân tử thành hai loại chính: marker sinh hóa và marker phân tử dựa trên cơ sở DNA Những marker phân tử dựa trên cơ sở DNA có thể phân biệt thành 2 kiểu, thứ nhất là các marker không dựa trên cơ sở PCR (RFLP) và thứ hai là kiểu marker dựa trên cơ sở PCR (RAPD, AFLP, SSR, ISSR SNP …) Việc phát triển các kiểu marker mới và đặc trưng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong tìm hiểu về biến động bộ gene cũng như tính đa dạng di truyền ở các thực vật cùng hay khác loài (Kumar và cộng sự, 2009)

Các kiểu khác nhau của marker phân tử được sử dụng để đánh giá đa hình DNA được phân thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ sở phản ứng chuỗi polymer hóa (PCR) Những marker phân tử thường được sử dụng bao gồm: RFLP, RAPD, AFLP, VNTR, SSR, ISSR, CAPS, SCAR, SNP, Kỹ thuật giải trình tự DNA (Weising và cộng sự, 2005)

Giới thiệu về kỹ thuật ISSR

ISSR là các đoạn DNA có kích thước khoảng 100-3000 bp nằm giữa các microsatellite cận kề và ngược hướng nhau Kỹ thuật này do Zietkiewicz và cộng sự báo cáo năm 1994 Các mồi dựa trên trình tự microsatellte được sử dụng để khuếch đại các trình tự DNA nằm giữa các SSR ISSR được khuếch đại bằng PCR sử dụng trình

tự lõi microsatellite với vai trò là các mồi cùng với một số nucleotide chọn lọc với vai trò là các neo giữ vào các vùng không lặp cận kề (16-18bp) Khi sử dụng kỹ thuật ISSR, khoảng 10-60 các đoạn DNA từ nhiều locus được hình thành đồng thời, tách

Trang 21

nhau ra thông qua điện di trên gel và được ghi nhận như là sự hiện diện hay vắng mặt của các đoạn có kích thước đặc trưng

Ưu điểm chính là không cần có dữ liệu trình tự dùng cho việc xây dựng mồi Bởi tiến trình phân tích bao gồm việc sử dụng PCR, chỉ một lượng ít khuôn mẫu DNA được yêu cầu (khoảng 5-50ng cho một phản ứng) Hơn thế, ISSR phân bố ngẫu nhiên trên toàn bộ bộ gene Phần lớn ISSR là các marker trội, cho dù thỉnh thoảng chúng thể hiện tính chất như marker đồng trội Nhược điểm: bởi ISSR là kỹ thuật đa locus, các hạn chế của nó có thể là sự di chuyển đồng thời của các đoạn DNA không đồng nhất

có cùng kích thước

Ứng dụng: do DNA fingerprint đa locus nhận được, phân tích ISSR có thể được ứng dụng để nghiên cứu trong xác định về di truyền, quan hệ bố mẹ, nhân dòng và nhận dạng dòng, nghiên cứu về hệ thống phân loại học ở mức độ các loài gần nhau Thêm vào đó, ISSR được xem như hữu dụng trong việc nghiên cứu lập bản đồ gene (Godwin và cộng sự, 1997), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể (Li và cộng sự, 2011; Reunova và cộng sự, 2010)

Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing)

Quá trình xác định thứ tự các base nucleotide dọc theo mạch DNA được gọi là việc xác định trình tự (sequencing) Giải trình tự được ứng dụng rộng rãi trong dự đoán chức năng gene, nhân dòng phân tử hay các mối liên hệ tiến hoá, đa dạng sinh học và công nghệ sinh học nói chung Trong lĩnh vực phân loại dựa trên phân tử, nghiên cứu phát sinh các taxon… thì chỉ cần phân tích xác định và so sánh trình tự một vài gene chỉ thị (marker) hoặc DNA barcode giữa các loài cần khảo sát mà không cần thiết phải xác định trình tự toàn bộ bộ gene

Phương pháp đang được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong việc giải trình tự hiện nay đó là giải trình tự bằng máy tự động Cơ sở của những phương pháp này vẫn

sử dụng các dideoxynucleotide, việc đánh dấu phóng xạ được thay bằng đánh dấu huỳnh quang trên các ddNTP, và kết quả được ghi nhận thông qua một hệ thống máy tính Trình tự sau khi được xác định bằng hệ thống máy tự động chưa thể sử dụng ngay cho việc phân tích Việc đọc base tự động do các máy thực hiện (automated base-calling) có một tỷ lệ sai sót nhất định tuỳ theo phương pháp và loại máy sử dụng Khi một base bị đọc sai có thể dẫn đến nhiều sai lầm nghiêm trọng trong việc phân tích sau này Do vậy, những biện pháp hiệu chỉnh lại trình tự cần được chính con người trực tiếp thực hiện nhằm khắc phục tối đa việc xác định sai trình tự (Schadt và cộng sự, 2010)

Trang 22

1.2.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật

Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên nền tảng những đặc điểm giống

và khác nhau trong phạm vi nhóm sinh vật nào đó, từ đó xây dựng lại các cây quan hệ phát sinh chủng loại để thể hiện quá trình tiến hóa (Felsenstein, 1985) Trong hệ thống học kinh điển, cây quan hệ phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên các dữ liệu về hình thái Từ khi có sự phát triển mạnh mẽ của thông tin di truyền, việc xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu phân tử đã trở thành công việc thực hành thông dụng và được biết đến dưới tên gọi là phân tích quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng dữ liệu phân tử - molecular phylogeny (Lio và Goldman, 1998) Các dữ liệu được biểu hiện dưới dạng trình tự DNA, trình tự protein và các DNA fingerprint

Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng dữ liệu phân tử để xây dựng lại quá trình tiến hóa bao gồm bốn bước Khi sử dụng các trình tự DNA làm dữ liệu mang tính thông tin thì bước đầu tiên là chọn và căn trình tự Việc này được tiến hành nhằm xác định các vị trí tương đồng và thăm dò các sai khác về trình tự DNA Bước thứ hai

là xây dựng mô hình toán để mô tả lịch sử tiến hóa của các trình tự Mô hình tính toán cho phép đánh giá khoảng cách di truyền giữa hai trình tự tương đồng Khoảng cách di truyền được đo bằng số lượng được các thay thế tại một vị trí xảy ra trong quá trình tiến hóa Các khoảng cách di truyền được biểu diễn bởi chiều dài nhánh trong cây quan

hệ phát sinh chủng loại Bước thứ ba là áp dụng một phương pháp phân tích phù hợp

để tìm hình thể của cây và chiều dài các nhánh vốn mô tả mối quan hệ phát sinh chủng loại Bước cuối cùng là giải thích, biện luận Ngày nay, các mô hình toán được thực hiện trong rất nhiều các phần mềm máy tính như MOLPHY (Adachi và Hasegawa, 1995), PHYLIP (Felsenstein, 1995), PASSML (Lio và Goldman, 1998), PAUP* (Swofford, 2003) and MEGA (Tamura và cộng sự, 2011)

Việc bao gồm thêm một hay một vài taxon ngoài nhóm (outgroup – chuẩn ngoại) là một tiêu chí quan trọng trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại Các taxon ngoài nhóm được cho là không thuộc cùng nhóm với các taxon đang khảo sát và

có thể là bất kỳ taxon nào có quan hệ gần với nhóm taxon đang nghiên cứu nhưng không là tổ tiên của chúng Chuẩn ngoại được dùng với mục đích so sánh trong việc xác định tính khác biệt về đặc điểm và xác định chiều hướng thay đổi trong việc thay đổi trang thái đặc điểm (Swofford và cộng sự, 1996)

Bên cạnh đó, việc kiểm tra độ tin cậy của cây quan hệ phát sinh chủng loại được suy luận ra là cần thiết Phương pháp kiểm tra thông dụng nhất là phân tích

Trang 23

bootstrap Phương pháp này được áp dụng vào nghiên cứu phân tích phát sinh (Felsenstein, 1985) Độ tin cậy càng cao khi giá trị bootstrap càng cao

1.2.2.1 Các phương pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại

Cây quan hệ phát sinh chủng loại được xây dựng nhằm mô hình hóa lịch sử tiến hóa của một nhóm các trình tự hay các sinh vật Việc tái hiện mối quan hệ phát sinh chủng loại có thể được thực hiện bằng các phương pháp dựa trên khoảng cách di truyền hoặc dựa trên đặc điểm như trình bày sau đây:

+ Các phương pháp dựa trên khoảng cách

Hai thuật toán thông dụng dựa trên so sánh khoảng cách theo cặp là phương pháp lập nhóm không có trọng số dùng trung bình số học (UPGMA - Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages) (Sneath và Sokai, 1973) và Gom cụm lân cận (Neighbor joining) (Saitou và Nei, 1987) Bước đầu tiên trong các phép phân tích này là tính toán xây dựng ma trận khoảng cách theo cặp giữa các taxon được khảo sát thông qua các đặc điểm khác nhau về trình tự của chúng Để hiệu chỉnh, thông thường người ta sử dụng hiệu chỉnh khoảng cách bằng một mô hình tiến hóa nào đó, chẳng hạn như mô hình Jukes-Cantor, mô hình Felsentein, mô hình hai thông số của Kimura,

mô hình Tamura, mô hình Tamura và Nei

+ Các phương pháp dựa trên đặc tính

Trong khi các phương pháp dựa trên khoảng cách đưa thông tin trình tự thành một con số đơn (biểu diễn khoảng cách) thì các phương pháp dựa trên đặc tính lại cố gắng suy luận mối quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ các đặc tính riêng lẽ như các nucleotide hay amino acid Thuộc nhóm phương pháp này là các phương pháp Giản tiện tối đa (Parsimony) không dựa trên mô hình tiến hóa và hai phương pháp Maximum likelihood và Bayesian, là những phương pháp suy luận dựa vào xác xuất

1.2.2.2 Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật

Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới sinh vật Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh DNA fingerprint Tính phổ biến của các dữ liệu phân tử trên Genbank hiện nay đã cho phép mở rộng phân tích ra các taxon khác ngoài các taxon thu được mẫu

Trang 24

Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại và quá trình tiến hóa ở thực vật Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene

ty thể và bộ gene lạp thể Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy ra không đồng đều (Kimura, 1980) Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất, trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9

thay thế cho một vị trí trong một năm Bộ gene lạp thể có mức độ thay thế nhanh hơn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9

thay thế cho một vị trí trong một năm Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ thay thế nucleotide nhanh hơn gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm (Gaut,1988) Tỷ lệ thay thế nucleotide ở thực vật khác về căn bản so với sự tiến hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động vật Trong lịch sử tương đối ngắn của

hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà nghiên cứu tập trung nhiều vào bộ gene lục lạp,

về sau đã chuyển hướng sang các trình tự gene trong nhân (Soltis và Soltis, 1998)

+ Bộ gene lục lạp: Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông

thường được đặc trưng bởi phân tử dạng vòng Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ gene, khoảng 135-160kb với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR) segments] chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy region) và một vùng SSC (small single-copy region) (Judd và cộng sự, 1999) Thành phần, kích thước, cấu trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo thủ cao trong các nghiên cứu về tiến hóa Tính bảo thủ cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh chủng loại Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa theo các tỷ lệ khác nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide (Downie và Palmer, 1992) Tính bảo thủ cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật (Soltis

và Soltis, 1998)

Có thể thấy những vùng trình tự ở lục lạp thường được sử dụng trong nghiên

cứu quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật gồm: gene rbcL, gene atpB (Soltis và

Soltis, 1998), 16S rRNA, gene matK (Sharma và cộng sự, 2012) và vùng trình tự không mã hóa thường trnL-F (Muller và cộng sự, 2006)

Gene matK có tên đầy đủ là Maturase K, là gene mã hóa cho protein Maturase

vốn đóng vai trò enzyme trong việc loại bỏ các intron trong quá trình chuyển từ tiền RNA thông tin (pre-mRNA) thành RNA trưởng thành Gen này nằm trên vùng LSC

(large single copy region), có độ dài xấp xỉ 1500bp, đồng phiên mã với gene trnK

Trang 25

(Chieba và cộng sự, 1996) Gene matK gồm 1 đoạn ORF chứa 509 codon nằm trong intron của gene trnK và dường như chưa rõ chức năng Các nghiên cứu sử dụng trình

tự gene matK để xây dựng cây phát sinh cho thấy gene matK có tính đa dạng hơn

những gene khác có trong lục lạp, do đó trở thành gene marker quan trọng để giúp

phân loại thực vật (Sharma và cộng sự, 2012) Bởi gene matK có thể dễ dàng được

khuếch đại cùng với vùng intron không mang mã ở hai đầu của nó, mở rộng trình tự lên đến 2400-2700bp nên việc sử dụng vùng này được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài và trong một loài (Soltis và cộng sự,

1996) Mặc khác, một phần gene matK cũng thường được sử dụng để xây dựng quan

hệ phát sinh chủng loại (Zuo và cộng sự, 2011)

+ Các trình tự bảo thủ ở bộ gene trong nhân: Bộ gene trong nhân có kích

thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1,1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene Phần lớn các nỗ lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA ribosome trong nhân Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene nhỏ hơn là 5,8S Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời những gene vừa đề cập Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S là khoảng 160bp Họ gene rRNA chứa các vùng bảo thủ cao như 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh chủng loại ở các mức độ phân loại cao Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong so sánh các loài và những chi gần nhau

Các trình tự 18S rRNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S Cho

dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau Kích thước trên 3000bp của 26S rRNA đã cản trở việc sử dụng nó, đặc biệt là trong việc giải trình tự toàn bộ gene Trái lại, kích thước của 18S rRNA khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng PCR và giải trình tự Thực tế cho thấy cây quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng trình tự 18S rRNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh chủng

loại sử dụng trình tự rbcL ở nhiều mức độ phân loại thực vật hạt kín (Soltis và Soltis,

1997)

Gene 5,8S rRNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rRNA nhưng ít khi được sử dụng để suy luận quan hệ

Trang 26

phát sinh chủng loại bởi tính bảo thủ cao và kích thước bé (164-165bp) Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích quan hệ phát sinh chủng loại tương đương với gene 18S rRNA

Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rRNA với gene 5,8S rRNA còn ITS2 phân cách gene 5,8S rRNA với gene 26S rRNA Vùng ITS hiện hữu một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa (Baldwin và cộng sự, 1995) Có rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự vùng ITS đã được mô tả (Taberlet và cộng sự, 1991) Các trình tự ITS biến động một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh chủng loại ở những taxon có quan hệ họ hàng gần Các trình tự ITS được sử dụng rất thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa (Bellarosa và cộng sự, 2005)

+ Bộ gene ty thể: Các nghiên cứu phân tử về DNA ty thể chính là tâm điểm

chính của nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại ở mức độ phân tử trên động vật Sự thay đổi nhanh chóng của cấu trúc, kích thước và hình thể bộ gene ty thể gây ra tình trạng khó mà phân tích được bộ gene này ở thực vật Điều này khiến cho bộ gene ty thể ở thực vật khác hẳn với bộ gene ty thể ở các sinh vật khác

Ngoài việc sử dụng các vùng DNA riêng rẽ khác nhau trong các bộ gene ở thực vật, Soltis và cộng sự (1999) cũng như Qiu và cộng sự (1999) đã chỉ ra rằng việc phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên việc phối hợp các trình tự có trong các bộ gene khác nhau là xác thực hơn xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào một gene riêng rẽ bởi gene hay bộ gene trong những trường hợp đặc biệt có thể không thể hiện đúng quy luật Việc phối hợp dữ liệu giữa các trình tự rDNA trong nhân và DNA lạp thể có thể được thực hiện ở các loài thụ phấn chéo và ở cả con lai khác loài

vì rDNA trong nhân di truyền từ cả bố và mẹ còn DNA lục lạp thì theo dòng mẹ

1.2.2.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể

Đa dạng di truyền quan trọng đối với sự sống còn của các loài hoang dại và là nguồn biến động di truyền của các chủng cây trồng Sự đa dạng di truyền giúp cho một loài sinh vật cụ thể có khả năng đáp ứng lại những điều kiện khác nhau của môi trường sống, từ đó có khả năng tồn tại khi có sự biến đổi của môi trường cũng như có thể mở rộng khu phân bố ra các khu vực (Beardmore, 1983) Đánh giá sự đa dạng di truyền của một quần thể là một trong những việc làm cần thiết để có thể phác thảo ra những

chiến lược bảo tồn in situ và ex situ Các kiến thức về sự đa dạng di truyền quần thể

còn giúp các nhà quản lý, hoạch định chiến lược có hướng khai thác và bảo vệ nguồn tài nguyên di truyền một cách phù hợp Tính đa dạng di truyền cao là điều mong mỏi

Trang 27

của các nhà chọn giống bởi vì đó chính là nguồn nguyên liệu phong phú cho công công tác lai tạo ra giống mới hay cải tiến đặc tính (Weising và cộng sự, 2005)

Nghiên cứu về di truyền quần thể chính là tìm hiểu, mô tả mức độ đa dạng trong cấu trúc di truyền, các biến động di truyền trong quần thể và giữa các quần thể với nhau, đánh giá mối quan hệ giữa các cá thể hay nhóm cá thể trong quần thể, giữa các quần thể trong tổng thể nghiên cứu cũng như biến động di truyền qua các thế hệ Cấu trúc di truyền quần thể chịu ảnh hưởng của các yếu tố: sự cho ̣n lo ̣c tự nhiên , sự trôi da ̣t gene ngẫu nhiên , đô ̣t biến, hê ̣ thống giao phấn không ngẫu nhiên , sự di cư di truyền (giữa các quần t hể) Năm yếu tố ảnh hưởng lớn nhất này chính là động lực của tiến hóa (Matthew, 2009)

Công cu ̣ căn bản mang tính tiền đề cho viê ̣c đánh giá các yếu tố ảnh hưởng nói trên là định luật Hardy-Weinberg Khi sử dụng dữ liệu DNA fingerprint để nghiên cứu

về đa dạng di truyền quần thể, các tiêu chí hướng đến là:

- Mức độ đa dạng di truyền, được thể hiện qua các thông số như:

+ Tỷ lệ band/locus đa hình (PPB): một gene được xem là đa hình khi bất kỳ tần

số allele nào của nó bé hơn 1 Chỉ tiêu này có được khi quan sát trực tiếp và thể hiện

sự đa dạng di truyền trong quần thể, tỷ lệ này càng cao thì quần thể càng đa dạng

+ Mức độ dị hợp - Heterozygosity, H e (hay còn gọi là tính đa da ̣ng gene ) Tính

dị hợp là mối quan tâm lớn nhất khi đ ánh giá về đa dạng di truyền Nó thường là thông số đầu tiên hiê ̣n diê ̣n trong mô ̣t tâ ̣p hợp dữ liê ̣u cho ta biết về cấu trúc và các biến cố lịch sử của chủng quần Tính dị hợp cao nghĩa là có nhiều biến động di truyền vàngươ ̣c la ̣i Thông thường, mức đô ̣ di ̣ hợp quan sát được so sánh với mức dị hợp kỳ vọng theo quy luật cân bằng Hardy-Weinberg Nếu mức đô ̣ di hợp thấp hơn trông đợi thì có sự nội phối hay tự thụ , nếu cao hơn thì cho là có hiê ̣u ứng phá vỡ sự cô lập (tức

có sự hỗn hợp của hai quần thể bị cô lập trước đây ) Có một vài phép đo mức độ di

hơ ̣p và giá tri ̣ mức đô ̣ di ̣ hợp trong các phép đo này trong dải từ 0 đến gần 1 (trong hê ̣ thống với mô ̣t lượng lớn các allele cân bằng tần số ) Mức độ dị hợp có thể được tính trên một locus hay xuyên suốt các locus khảo sát (de Vicente, 2003)

- Sự biệt hóa di truyền giữa các tập hợp con trong tập hợp được nghiên cứu: có thể ở các mức độ: nhóm cá thể mang đặc tính chung nào đó, tiểu quần thể trong quần thể hay quần thể trong tổng thể nghiên cứu Sự biệt hóa di truyền có thể được xem xét

ở một locus nào đó hay xuyên suốt các locus để chỉ ra sự biệt hóa về tần số allele ở quy mô tương ứng cũng như mức độ đóng góp đa dạng di truyền do sự khác nhau của các tập hợp con vào tập hợp lớn hơn Mức độ biệt hóa giữa các tập hợp được hệ thống

Trang 28

hóa như sau: 0 - 0,05: mức nhỏ; 0,05 - 0,15: mức vừa phải; 0,15 - 0,25: mức lớn; trên 0,25: mức rất lớn (de Vicente, 2003)

- Hệ số tương đồng di truyền giữa các cá thể dựa trên sự xuất hiện hay vắng mặt của band: có nhiều chỉ số khác nhau về cách tính toán phụ thuộc vào quan niệm của các tác giả để đo mức độ tương đồng di truyền giữa các cá thể nhưng các chỉ số được

sử dụng nhiều là chỉ số Jaccard; chỉ số Dice; chỉ số của Sokal & Michener và chỉ số Nei &Li (de Vicente, 2003)

- Khoảng cách di truyền giữa các mẫu thường được tính toán như phần bổ sung cho các chỉ số tương đồng đề cập trên (Weising, 2005)

- Khoảng cách di truyền giữa các tập hợp mẫu : Để tính toán khoảng cách này , cần một phép đo đạc vốn ràng buột với khoảng cách tiến hóa chung của các mẫu Có một số cách thức đo đạc nhưng công thức tính khoảng cách di truyền của Nei là

thường được sử dụng nhất, bản chất của cách tính này là khoảng cách giữa hai tập hợp được suy luận dựa trên độ đồng nhất giữa chúng (Mohammadi và Prasanna, 2003)

- Chỉ số về dòng gene di cư hay số lượng cá thể di cư trung bình: các dữ liệu về biệt hóa quần thể cho phép đánh giá tỷ lệ di cư giữa các quần thể với điều kiện xem như các quần thể này đặt trong sự cân bằng (ví dụ, không có sự chọn lọc, tỷ lệ đột biến

và thời gian thế hệ là như nhau) Trong thực tế, các quần thể thường không hội đủ tất

cả các giả thiết như trên nên giá trị về dòng gene di cư được tính toán gián tiếp, vì thế chỉ mang tính chất đánh giá thô (Weising và cộng sự, 2005)

1.3 Vị trí hệ thống ho ̣c và phân loại chi Panax, họ Araliaceae

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Chi sâm (Panax L.) là một chi có số lượng loài rất ít trong số khoảng 70 chi củ a

họ Araliaceae trên thế giới được Carl von Linnaeus mô tả năm 1753 với chỉ hai loài là

P quinquefolius L và P trifolius L Theo Linnaeus điểm khác biệt so với các chi

khác trong họ Araliaceae là bầu 2 ô, hoa mẫu 5, xếp van hay xếp lợp Trong giai đoạn này, khi số lượng loài được phát hiện còn ít, nên tác giả chỉ giới hạn ở các đặc điểm của hoa: hoa vừa xếp lợp vừa xếp van Đây là đặc điểm chính của chi để phân biệt với các chi khác của họ Araliaceae Tuy nhiên, với cách sắp xếp này thì đặc điểm của chi

Panax bao gồm một số chi khác thuộc họ Araliaceae, đặc biệt là chi Nothopanax

(Linnaeus, 1754)

Trang 29

Theo quan điểm trên, De Candolle (1830) đã chuyển một số loài thuộc chi

Nothopanax vào chi Panax Kể từ đây vị trí phân loại và mối quan hệ phát sinh chủng loại của chi Panax không có sự đồng nhất về quan điểm giữa các tác giả khác nhau

Decaisne và Planchon (1854) cho rằng đặc điểm chính của chi Panax là đài xếp van, nên chuyển 2 loài P quinquefolius và P trifolius sang chi Aralia, đồng thời đồng nhất hoá các chi Polyscias Forest, Cheirodendron Nutt, Pseudopanax Koch và Maralia Pet vào chi Panax Như vậy, với cách sắp xếp như trên, các tác giả đã cho rằng đặc điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp van còn có đặc điểm thân gỗ

và thân thảo Đồng ý với quan điểm trên, các tác giả Bentham và Hooker (1867),

Clarke (1879) tiếp tục sát nhập chi Nothopanax vào chi Panax, đồng thời chuyển chi Panax vào tông (tribe) Panaceae Ở thời điểm này, số lượng loài thuộc chi Panax lên

đến 25, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi, Newzeland và Australia

Seemann (1868) xem xét lại vị trí phân loại chi Panax và cho rằng đặc điểm giới hạn hình thái của chi Panax không rõ ràng kể từ khi được Linnaeus mô tả lần đầu tiên Theo tác giả, đặc điểm chính để phân biệt chi Panax so với các chi khác trong họ Aralaiaceae là đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô Với đặc điểm này thì 2 loài P quinquefolius và

P trifolius thuộc về chi Panax và có mối quan hệ gần với chi Aralia Đối chiếu với

đặc điểm của các chi khác thuộc họ Araliaceae, tác giả ghi nhận có một đặc điểm đặc

biệt dẫn ra sự khác biệt giữa chi Panax so với chi khác là thân dạng củ Qua đó, tác giả chuyển các loài có thân dạng củ trước đây ở các chi khác vào chi Panax, đồng thời chuyển một số loài không có thân dạng củ ra khỏi chi Panax Như vậy, chi Panax có 3

đặc điểm quan trọng làm cơ sở để phân biệt với các chi khác trong họ Araliaceae là: thân dạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô Với quan điểm trên, tác giả đã chuyển 61 loài ra

khỏi chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P trifolium L., P quinquefolius L., P ginseng Mey., P pseudoginseng Wall., P japonicus Mey và P bipinnatifidus Seem Với loài P fructicosus có đặc điểm là đài xếp van, Seemann xếp vào chi Nothopanax

và đồng thời lấy loài này là type danh pháp cho chi Nothopanax Có lẽ đây là quan điểm được nhiều nhà nghiên cứu về chi Panax cho là phù hợp hơn cả

Một lần nữa để khẳng định lại quan điểm của Seeman (1868), Harm (1897) đã nghiên cứu tất cả các đặc điểm của các loài sâm phân bố trên thế giới như: cơ quan

sinh sản, cơ quan sinh dưỡng và cho rằng chi Panax có nguồn gốc từ chi Aralia, điểm

khác biệt ở đây là thân dạng củ Britton và Brown (1913) tiếp tục xem xét vị trí phân

loại chi Panax và đồng tình với quan điểm của Seeman (1868) và Harm (1897), chỉ ra loài P quinquefolius có đặc điểm đại diện cho chi: thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp lợp,

bầu 2 ô, và loài được mô tả lần đầu tiên, nên lấy loài này làm type danh pháp cho chi

Trang 30

Hoo (1961) khi nghiên cứu về hệ thống, mối quan hệ phát sinh chủng loại và

phân bố của taxon trong họ Araliaceae, và cho rằng Panax có nguồn gốc phát sinh từ Acanthopanax Vì Acanthopanax có đặc điểm hoa mẫu 5, lá có lông cứng mọc trên gân lá, thân thảo hay thân dạng cây bụi nhỏ Tác giả cho rằng điểm thân thảo là đặc điểm tương đồng quan trọng nhất, Aralia hầu như không có đặc điểm này Quan điểm

này của Hoo hầu như không nhận được sự đồng tình của các nhà nghiên cứu về sâm

Năm 1970, Hara một lần nữa xem xét đặc điểm của chi Panax dựa trên mẫu vật của các loài thuộc chi Panax ở châu Á thu được ngoài tự nhiên cũng như dựa trên mẫu

lưu giữ ở các Bảo tàng thực vật Qua đó, tác giả thống nhất với các quan điểm nghiên

cứu trước đó về đặc điểm của chi Panax: thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu 2 ô và có mối quan hệ gần với chi Aralia Tuy nhiên, theo tác giả các loài trong chi Panax có đặc điểm hình thái biến đổi rất lớn so với các bậc phân loại khác trong họ Araliaceae Do đó, việc định loại các loài trong chi Panax là việc rất khó

khăn nếu chỉ dựa vào một đặc điểm hình thái nào đó Theo tác giả để phân biệt các loài

thuộc chi Panax, trước tiên xếp loài vào 1 trong 3 chuẩn hình thái của thân rễ

(Rhizome type): thân rễ có dạng thân củ (carot type); thân rễ có đốt kéo dài; và thân rễ

có đốt ngắn như đốt trúc Tiếp theo đó là các đặc điểm hình thái lá, đài, tràng, số lượng chỉ nhụy, quả Cách phân loại dựa vào hình thái thân rễ trước rồi mới đến các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng và sinh dưỡng được các nhà khoa học Trung Quốc áp dụng

trong khóa phân loại chi Panax ở Trung Quốc (Xiang và Lowry, 2007)

Wen (1993), Wen và Zimmer (1996), Plunkett và cộng sự (1996) dựa vào đặc

điểm hình thái, hình thái giải phẫu, hạt phấn và sinh học phân tử cho rằng chi Panax

có mối quan hệ gần gũi với chi Aralia

Bảng 1.1 Đặc điểm hình thái tương đồng và khác biệt giữa chi Aralia và chi Panax

Cấu trúc của lá (leaf architecture)

Noãn (carpel)

Cách sắp xếp hoa

Nội nhũ (endosperm)

Hạt phấn (pollen)

Panax Hình chân vịt

(palmately compound) 2-3

Trang 31

Có lẽ cho đến thời điểm hiện nay, các hệ thống quan điểm dựa vào hình thái giải

phẫu và sinh học phân tử đều thống nhất và cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần với chi Aralia, điểm khác khác biệt chủ yếu dễ dàng nhận thấy so với chi Aralia là

thân dạng củ, lá kép hình chân vịt, noãn 2-3

Sau năm 1970, vị trị phân loại và hệ thống phát sinh của chi Panax hầu nhƣ

không thay đổi Tuy nhiên do đặc điểm hình thái có biến đổi rất lớn, ngay trong một loài ở các vùng phân bố khác nhau thì có đặc điểm hình thái cũng khác nhau (Hara, 1970), đồng thời ngày càng có nhiều phát hiện mới Do vậy, từ đó đến nay, việc ghi

nhận số lƣợng taxon trong chi Panax có sự thay đổi theo thời gian và tùy vào quan

điểm của các nhà nghiên cứu

Ở nửa đầu của thập niên 1970, quan niệm về thành phần loài sâm châu Á của các nhà nghiên cứu cũng rất khác nhau và có sự bổ sung nhanh chóng những taxon mới, thể hiện qua bảng 1.2

Bảng 1.2 Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên

cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1970-1975 Hara (1970) Hoo và Tseng

(1973)

Hoo và Tseng (1975)

Zhou và cộng sự (1975)

Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng

P pseudoginseng P pseudoginseng P pseudoginseng P pseudoginseng

subsp

pseudoginseng

var pseudoginseng var pseudoginseng P japonicus

subsp himalaicus var elegantior var elegantior var japonicus

var angustifolius var angustifolius var angustifolius var angustifolius var bipinnatifidus var bipinnatifidus var bipinnatifidus var bipinnatifidus subsp japonicus var japonicus var japonicus var major

var angustatus

var wangianus var notoginseng var notoginseng P notoginseng

P zingiberensis P zingiberensis

P stipuleanatus

Gần đây, quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon thuộc chi Panax đã đƣợc

bổ sung các dữ liệu dựa trên việc so sánh trình tự các DNA bảo thủ, tuy vậy vẫn chƣa

có sự thống nhất giữa các nhóm tác giả (bảng 1.3)

Trang 32

Bảng 1.3 Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên

cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014 Wen, 1996 Zuo, Wen, 2011&2014 Shu, Komatsu, 2003

Panax ginseng Panax ginseng Panax ginseng

P japonicus P japonicus P japonicus (Japan)

P vietnamensis var fuscidiscus

P pseudoginseng P pseudoginseng P pseudoginseng

P notoginseng P notoginseng P notoginseng

P stipuleanatus P stipuleanatus P stipuleanatus

Từ thành phần taxon của chi Panax qua các thời kỳ có thể nhận thấy việc ghi

nhận các taxon của các tác giả khác nhau do các nguyên nhân: tính đa dạng về hình

thái trong chi Panax; quan điểm về hệ thống phát sinh dựa vào đặc điểm hình thái rất

đa dạng; việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ khác nhau để hỗ trợ cho nghiên cứu phân loại; các phát hiện mới về taxon

Bên cạnh cách phân loại dựa trên các hình thái thông thường còn có một số phương thức phân loại khác dựa trên thành phần hoạt chất và số lượng nhiễm sắc thể, điển hình là các nghiên cứu:

Tsai và Feng (1975) khảo sát thành phần hoạt chất trong các loài Sâm ở Trung Quốc Thông qua đó, các tác giả đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính tồn tại

trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane gồm có các loài: P ginseng,

Trang 33

P notogingseng và Triterpenoid oleanane gồm các loài: P pseudoginseng, P zingiberensis, P japonicus, P japonicus var angustifolius, P japonicus var major, P japonicus var bipinatifidus, P stipuleanatus Ngoài ra, kết hợp với các đặc điểm hình

thái của thân rễ, các tác giả chia các loài Sâm ở Trung Quốc thành 2 nhóm chính: Nhóm 1 gồm các loài có thân rễ ngắn, giống thân củ cà rốt, hạt lớn, đồng thời hoạt chất chính là tetracyclic triterpenoid có trong thân rễ; Nhóm 2 gồm các loài có thân rễ dài hay dạng đốt trúc, hạt nhỏ, đồng thời có hoạt chất pentacyclic triterpenoid

Trong Từ điển Bách khoa dược học (Nguyễn Duy Cương và Nguyễn Hữu

Quỳnh, 1999) có ghi nhận rằng theo tác giả Tanaka thì chi Panax có đến 8 loài và 11

taxon dưới loài được phân thành 3 nhóm dựa vào thành phần hoạt chất

Yang (1981) sử dụng số lượng nhiễm nhiễm sắc thể xây dựng mối quan hệ phát

sinh chủng loại các loài Panax., tác giả đã chỉ ra số lượng nhiễm sắc thể của 7 loài Sâm (Bảng 2.4) Hai loài P gingseng và P quinquefolius không là tổ tiên của chi Panax vì 2n = 48 (44), mà tổ tiên của chi Panax phải là P japonicus với bộ nhiễm sắc

thể 2n = 24)

Bảng 1.4 Số lượng nhiễm sắc thể theo Yang (1981)

Loài Số lượng nhiễm sắc thể Nguồn

Panax ginseng 2n = 44 Sugiura (1936)

2n = 44 Graham (1966) 2n = 44 Yang (1981) 2n = 48 Harn and Whang (1963)

P japonicus n = 24 Matsuura and Suto (1935)

P wangianus 2n = 48 Kurosawa in Hara (1970)

Các loài thuộc chi Panax có phân bố ở Bắc bán cầu , từ trung tâm Hymalaya ,

qua Trung Quốc, vùng Viễn Đông nước Nga , khu vực Triều Tiên - Nhâ ̣t Bản, đến Bắc

Mỹ, mô ̣t nhánh khác là từ Hymalaya đi về phía Đông Nam đến Viê ̣t Nam Các khu vực phân bố nhìn chung có điều kiện khí hâ ̣u ôn đới và Á nhiê ̣t đới Trước khi đối tượng

nghiên cứu của luâ ̣n án này được công bố thì Sâm Viê ̣t Nam P vietnamensis được xem

là loài sâm có phân bố về phía Nam nhất của thế giớ i Trong chi Panax có 2 loài phân

bố ở Đông Bắc Mỹ: Panax quinquefolius L and P trifolius L (Seemann, 1868;

Proctor và Bailey, 2011); các loài còn lại phân bố Đông Trung Á (Hara 1970; Wen và

Trang 34

Zimmer, 1996) Trung tâm đa dạng nhất của chi Panax tập trung ở Đông, Nam, Trung

Trung Quốc và một phần Đông Nam Châu Á (Hara 1970; Wen và Zimmer, 1996; Zuo

và cộng sự, 2014)

1.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam , không nhiều tác giả nghiên cứu phân loại chi Panax, các công

trình nghiên cứu chủ yếu là ghi nhận có phân bố ở Việt Nam và mô tả loài mới cho khoa học (Phạm Hoàng Hộ, 1970 & 2000; Ha & Grushvitzky, 1985; Nguyễn Tập, 2005; Nguyễn Thị Phương Trang và cộng sự, 2011; Phan Kế Long và cộng sự, 2013)

Loài đầu tiên được ghi nhận ở miền Nam Việt Nam là Panax schingseng Nees var japonicum Mak do Phạm Hoàng Hộ ghi nhận năm 1970 Theo tác giả , loài này

mọc dưới tán rừng rậm lá rộng, ẩm ở vùng núi Lang Bian, tỉnh Lâm Đồng

Năm 1985, hai tác giả Hà Thị Dụng và Grushvitzky đã cô ng bố một loài mới

cho khoa học là P vietnamensis Ha et Grushv dựa trên mẫu vâ ̣t thu thâ ̣p từ vùng núi Ngọc Linh, tỉnh Kon Tum Theo các tác giả, loài này khác so với P japonicus (Nees)

Meyer ở đặc điểm đầu lá dài, mép lá có răng cưa đều, chỉ nhụy 1, ít khi 2, quả dẹp

Vào năm 1991, Phạm Hoàng Hộ đã xuất bản bộ sách “Cây cỏ Viê ̣t Nam” lần đầu tiên ở Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ, 1991) Trong đó đã ghi nhận có 3 loài sâm phân bố ở Việt Nam , đó là P bipinnatifidus Seem ở Hoàng Liên Sơn , P pseudogingseng Wall ở Sa Pa và loài P schingseng Nees var japonicum Mak ( vốn

đươ ̣c ghi nhâ ̣n trong “Cây cỏ miền Nam Viê ̣t Nam” xuất bản năm 1970 của cùng tác

giả) đươ ̣c thay thế bằng P japonica (Nees) Mayer với phân bố là khu vực núi Lang Bian và Kom Tum Tuy nhiên không đề câ ̣p đến P vietnamensis đã được 2 tác giả Hà

Thị Dụng và Grushvitzky công bố vào năm 1985 Đến năm 1999, Phạm Hoàng Hộ đã

mở rô ̣ng việc ghi nhận về chi Panax ở Việt Nam , theo đó P vietnamensis phân bố ở

Gia Lai và Kon Tum được bổ sung vào phiên bản này , nâng số lươ ̣ng loài thuô ̣c chi

Panax ghi nhận ta ̣i Viê ̣t Nam lên 4 loài (Phạm Hoàng Hộ, 1999, 2000)

Theo điều tra nghiên cứu của Viê ̣n Dược liê ̣u , Trung tâm Sâm và dược liê ̣u thành phố Hồ Chí Mi nh và Viê ̣n Sinh thái tài nguyên thực vâ ̣t cho thấy ở Viê ̣t Nam có phân

bố tự nhiên của các loài P vietnamensis Ha et Grushv., P pseudoginseng Wall và P bipinnatifidus Seem Điều này được thể hiện rõ hơn trong công bố của tác giả Nguyễn Tập (2005) thì ở Việt Nam có 5 loài thuộc chi Panax, 3 loài sâm mọc tự nhiên là P vietnamensis Ha et Grushv ở vùng núi Ngọc Linh và hai loài P stipuleanatus H T Tsai et K.M Feng và P bipinnatifidus Seem ở sườn Đông Bắc dãy núi Hoàng Liên

Trang 35

Sơn và vài nhánh phụ kề của nó thuộc 6 xã của Huyện Bát Xát và Sapa của tỉnh Lào

Cai Thông tin về các loài Panax mọc tự nhiên tại vùng núi phía Bắc Việt Nam nói

trên được chính tác giả Nguyễn Tập và cộng sự khẳng định một lần nữa vào năm 2006 (Nguyễn Tập, 2006)

Kết quả nghiên cứu về thành phần loài tự nhiên của tác giả Nguyễn Tâ ̣p nêu trên tương đồng với ghi nhận trong hai phiên bản Sách đỏ Viê ̣t Nam năm 1996 và 2007: ở

Viê ̣t Nam có ba loài Panax phân bố tự nhiên là P bipinnatifidus, P stipuleanatus và

P vietnamensis Trong phiên bản xuất bản năm 2007, các tác giả ghi nhận loài P vietnamensis có phân bố trong nước ở Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai và Lâm Đồng

và trên thế giới có ở Trung Quốc

Nguyễn Thị Phương Trang và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ở vùng Phong

Thổ, Lai Châu nhận thấy ở đây có phân bố một taxon thuộc chi Panax, rất gần với sâm

Việt Nam dựa trên hình thái cũng như so sánh trình tự ITS-rNDA và có thể là loài mới Tuy vậy, nghiên cứu tiếp theo nhóm tác giả Phan Kế Long và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng taxon phân bố tại Lai Châu, giáp ranh với tỉnh Vân Nam của Trung quốc chính là

một thứ của loài Panax vietnamensis đã được công bố từ năm 2003 là P vietnamensis var fuscidiscus Komatsu, Shu & Cai

Như vậy theo các tài liệu gần đây thì cho đến hiện nay, ở Việt Nam có 3 loài và

1 thứ có phân bố ở Việt Nam: P vietnamensis, P bipinnatifidus, P stipuleanatus, P vietnamensis var fuscidiscus được ghi nhận chính thức Loài P bipinnatifidus được

Viện Dược liệu ghi nhận và nhà thực vật học người Trung Quốc là Ngô Chỉnh Dật xác định tên khoa học vào năm 1964 (Nguyễn Văn Tập, 2007), tuy nhiên so với mẫu chuẩn (type species), đặc biệt là hình thái thân rễ và rễ củ thì cần phải xem xét lại việc định danh cho taxon này thông qua hình thái và sinh học phân tử

1.4 Quan hê ̣ phát sinh chi Panax L dựa trên hê ̣ thống ho ̣c mức đô ̣

phân tử

Một cách tự nhiên , phần lớn các nhà thực vâ ̣t khi khảo sát thực địa hay làm việc với các tiêu bản thực vật đều dựa vào các đặc điểm hình thái giải phẫu của thân, rễ, lá, hoa… để phân loại, định danh cho các loài thực vật Tuy nhiên, viê ̣c xác đi ̣nh loài dựa trên đặc điểm hình thái thường phải là nhưng chuyên gia về phân loại , và hơn thế nữa, các đặc điểm hình thái luôn biến đổi theo các giai đoa ̣n si nh trưởng khác nhau của sinh

vâ ̣t, điều này dẫn đến việc phân loại trở nên khó khăn và phức tạp (Steele và Pires,

Trang 36

2011) Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc phân lập các vùng gene bảo thủ cao phục vụ cho việc phân loại và nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon đã trở nên dễ dàng hơn rất nhiều trong những thập kỷ gần đây Dựa vào các dữ liê ̣u phân tử có thể cung cấp thêm các bằng chứng cho viê ̣c đưa ra các quyết đi ̣nh mang tính hê ̣ thống , mà hầu như không p hụ thuộc vào hình dạng hay tình trạng sinh lý của cây được lấy mẫu phân tích (Steele và Pires, 2011)

Việc sử dụng cơ sở dữ liệu phân tử trong nghiên cứu phân loại và hệ thống học, quan hệ tiến hóa của sinh giới nói chung, thực vật nói riêng đã trở nên rất phổ biến và hình thành nên một chuyên ngành mới được gọi là phylogenetics, được định nghĩa là khoa học về hệ thống học thực vật sử dụng công cụ di truyền phân tử

Bản chất của việ c sử dụng các công cu ̣ phân tử trong phân loại là các bâ ̣c phâ n loại (taxon) khác nhau sẽ có bộ gene khác nhau dẫn đến sự khác nhau về : tương tác bằng enzyme cắt ma ̣ch , sản phẩm khuếch đại bằng PCR hay sản phẩm trao đổi chất và cao nhất là trình tự nucleotide của DNA Nhìn chung, có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử từ đơn giản đến phức ta ̣p đã được ứng du ̣ng để phân biê ̣t các taxon thực vâ ̣t và có rất nhiều những công trình được công bố trong lĩnh vực này

Ở sinh vật tiền nhân, ranh giới của các chi được đề xuất là khi tỷ lệ % các protein bảo tồn [percentage of conserved proteins (POCP)] thấp hơn 50% (Qin và cộng sự, 2014) Cũng ở sinh vật tiền nhân nhưng dựa trên trình tự 16S rRNA, Kim và cộng sự (2014) đã xác định mức khác biệt trung bình giữa các loài là 0,0145, trùng với các đề xuất của các tác giả trước đó là trong khoảng 0,01-0,018 Ở các sinh khuẩn như

Streptomices albovinaceus, S globisporus và S griseinus, khoảng cách di truyền giữa các loài dựa trên vùng 16S rRNA là bằng không và dựa trên gene gyrB là từ 0,0016

đến 0,0032 (Kim và cộng sự, 2012)

Ở nấm, để giải quyết các vấn đề chưa rõ về hệ thống học, Jeewon và Hyde (2016) đề xuất rằng sử dụng cả các đặc điểm hình thái và phân tử để định loại, các vùng DNA bảo thủ được đề xuất là ITS và tối thiểu một vùng gene mã hóa cho protein Để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phân tử đối với một taxon mới cần phải so sánh với 4-5 taxon có sẵn Để chỉ ra loài mới thì loài đó cần có khác biệt trên 1,5% các nucleotide thuộc vùng ITS với giá trị bootstrap tối thiểu là 60%

Ở thực vật bậc cao, Hala và Ashraf (2016) đã chỉ ra khoảng cách di truyền giữa các chủng nông nghiệp của loài Cải dầu dựa trên vùng ITS dao động từ 0,002 đến 0,106 Kim và cộng sự (2016) nhận thấy ơ các loài thuộc chi Mẫu đơn Paeonia,

Trang 37

khoảng cách di truyền giữa các loài trong khoảng 0,0235 – 0,0273 dựa trên trình tự

ITS, 0,0049 – 0,0122 dựa trên trình tự matK và 0,003 – 0,004 dựa trên trìn h tự rbcL

Ở mức độ giữa các mẫu thuộc cùng loài, khoảng cách di truyền trong khoảng 0,0018 –

0,0095 dựa trên trình tự ITS, 0 – 0,0005 dựa trên trình tự matK và 0– 0,0007 dựa trên trìn h tự rbcL Ở chi Dendrobium thuộc họ Lan (Orchidaceae), khoảng cách di truyền giữa các section từ 0,013 đến 0,112 dựa trên tổ hợp gene matK và vùng ITS Khoảng cách giữa các loài dựa trên gene matK là 0,003-0,023 và vùng ITS là 0,014-0,187

(Kornsorn và cộng sự, 2015)

Có thể nhận thấy có hai khuynh hướng nghiên cứu chính và một khuynh hướng

trung gian về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax dựa

trên dữ liệu phân tử:

1.4.1 Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các

taxon trong chi Panax không dựa vào giải trình tự DNA

Trước khi việc xác định trình tự trở nên phổ biến, việc nghiên cứu về phân loại

và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon không định hướng vào vùng mang tính bảo thủ mà dựa vào các kỹ thuật hình thành DNA fingerprint là rất phổ biến ở nhiều taxon

động, thực vật, trong đó có các taxon thuộc chi Panax Hiện nay, cách làm này vẫn được duy trì và phát triển để tiến hành xác định các loại dược liệu từ chi Panax

1.4.1.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Tại nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là Hàn Quốc, việc sử dụng các chỉ thị phân

tử không phải trình tự DNA trong phân loại chi Panax đã được triển khai nhiều và đạt

được nhiều kết quả mang tính ứng dụng cao

Shim và cộng sự (2003) tiến hành phân biê ̣t P.ginseng (Hàn Quốc ) với các taxon Panax khác gồm Nhân sâm SheoAn (Trung Quốc ), P notoginseng (Trung Quốc), P japonicus (Nhâ ̣t Bản) và hai loại sâm thu ộc loài P quinquefolius từ Mỹ và

Canada đươ ̣c thu thâ ̣p từ 6 vùng khác nhau Công viê ̣c phân biê ̣t bao gồm cả viê ̣c thăm

dò các hoạt chất bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng và sử dụng kỹ thuật RAPD với các

mồi 80 mồi ngẫu nhiên 10-mer Kết quả cho thấy khó phân biê ̣t được P ginseng với các taxon khác trong chi Panax Các mồi OP-5A cho mô ̣t band đă ̣c trưng cho tất cả các

mẫu; Mồi OP-13B có thể xem là marker RAPD duy nhất để phân biê ̣t các taxon sâm đươ ̣c khảo sá t Những kết quả này cho phép phân biê ̣t Nhân sâm Hàn quốc (P ginseng) với các taxon khác ở mức độ phân tử

Năm 2007, Kim và cộng sự đã phát triển các chỉ thị Microsatellite mới để nhận

dạng P ginseng Nhóm nghiên cứu đã xây dựng một thư viê ̣n được làm giàu

Trang 38

microsatellite của P ginseng và 251 trình tự microsatellite mới được xác định Các

trình tự lặp 3 được xác định là nhiều nhất (46,6%), tiếp đó là các t rình tự lặp 2 nucleotide (23,1%) Kiểu lặp (AG)n là phổ biến nhất (23,1%), tiếp theo là (AAC)n (22,3%) Thông qua việc xác đi ̣nh kiểu gene của 91 microsatellite bằng cách sử du ̣ng

tâ ̣p hợp các mồi đă ̣c hiê ̣u cho chỉ thi ̣, nhóm tác giả đã xác định 11 chỉ thị đa hình trong

loài cũng như 14 chỉ thị đa hình phân biệt P ginseng và P quinquefolius Cấu trúc

allele chính xác của các marker đa hình được xác đi ̣nh và các allele cũng được đă ̣t tên Dan và cộng sự (2010) dựa vào có 2.492 trình tự đầu cuối nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC end sequence) từ 2.167 dòng BAC trong một thư viện chứa 106.368 BAC đại

diên cho DNA bộ gene của P ginseng để chọn lọc 35 microsatellite có kiểu đơn vị lặp

từ 11 đến 30 nucleotide Thử nghiệm 35 cặp mồi được thiết kế cho 35 microsatellite

đã chọn ở các chủng P ginseng cho thấy 12 trong số chúng là đa hình, 19 là đơn hình

và 3 không có sản phẩm khuếch đại Chỉ số dị hợp trông đợi trong khoảng 0,7500 đến 0,9678 và chỉ số dị hợp quan sát trong khoảng 0,5645 đến 0,7109 Thử nghiệm thêm

các chủng thuộc P quinquefolius từ Mỹ và Canada cho thấy các mồi có khả năng khuếch đại ở P ginseng cũng thể hiện kết quả ở P quinquefolius Từ đó, nhóm tác giả

đề xuất và có thể sử dụng các chỉ thị ISSR có được trong việc phân biệt các chủng P ginseng và P quinquefolius, cũng như trong việc lập bản đồ gene

Lee và cộng sự (2011) đã phát triển mô ̣t chỉ thi ̣ SCAR dẫn xuất từ ISSR để nhâ ̣n

dạng các chủng giống sâm P ginseng để xác định sự phân biệt các chủng nông nghiệp

có đặc tính tốt p hục vụ cho chọn giống Các tác giả đã khảo sát 80 mồi ISSR trên 6

chủng thuộc P ginseng và 2 chủng sâm nước ngoài thuô ̣c hai loài P quinquefolius và

P notoginseng 34 trong số 85 mồi ISSR hình thành các lo cus đa hình với tần suất trung bình 6,9 locus/mồi Các mẫu kiểm tra được nhận thấy có khác biệt rõ ràng bằng cách sử dụng các mồi này Các mồi UBC -821, UBC-868 và UBC -878 làm nảy sinh

các band đa hình giữa các chủng P ginseng và cho phép phân biệt c húng với các mẫu

P quinquefolius và P notoginseng Hệ chỉ thi ̣ SCAR được đưa vào để làm tăng khả năng tái lă ̣p của các đa hình , mô ̣t chỉ thi ̣ SCAR là PgI 821C650 được chuyển đổi thành công từ đa hình khuếch đa ̣i ngẫu nhiên sử dụng mồi UBC-821 Kết quả đã thể hiê ̣n đa hình giữa các mẫu sâm Thêm vào đó, đa hình đă ̣c hiê ̣u cho chủng Nhân sâm Sunwon được hình thành bằng cách xử lý sản phẩm PCR bằng mồi PgI 821C650 với enzyme

giới ha ̣n Taq I Kết quả này là công cu ̣ chỉ thi ̣ DNA hữu ích để xác đi ̣nh Nhân sâm Hàn

Quốc, đă ̣c biê ̣t là chủng Sunwon , quản lý hạt giống và các chương trình chọn giống được hỗ trơ ̣ bằng chỉ thi ̣ phân tử

Trang 39

1.4.1.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Việc sử dụng các chỉ thị phân tử như RADP, SSR, ISSR trong phân loại và phân tích quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon thực vật ở Việt Nam đã được

triển khai khá nhiều, tuy nhiên trên đối tượng các taxon Panax thì chỉ ghi nhận được

nghiên cứu “Sử dụng chỉ thị phân tử DNA kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam” do Viện Dược liệu chủ trì và tiến

sĩ Nguyễn Văn Tập làm chủ nhiệm Trong công trình này, với quan điểm có ba loài

sâm mọc tự nhiên tại Việt Nam là P vietnamensis, P bipinnatifidus và P stipuleanatus, Nguyễn Văn Tập và cộng sự (2007) cho rằng có ba dạng hình thái lá ở

hai taxon được cho là hai loài là lá chét xẻ thùy, lá chét xẻ thùy sâu và lá chét xẻ thủy nông Kết quả phân tích dữ liệu có được từ việc sử dụng 13 mồi RAPD trên 5 mẫu lá chét xẻ thùy sâu, 4 mẫu lá chét xẻ thùy nông và 8 mẫu lá chét nguyên cùng với 14 mẫu

từ loài P vietnamensis cho thấy chúng lập thành ba nhóm: nhóm thứ nhất gồm các mẫu P vietnamensis, nhóm thứ hai gồm các mẫu có lá chét xẻ thùy thuộc loài P bipinnatifidus và nhóm thứ ba gồm các mẫu có lá chét nguyên thuộc loài P stipuleanatus trong cây quan hệ phát sinh chủng loại Dựa trên hệ số tương đồng di

truyền giữa các mẫu và sự lập nhóm của chúng, các mẫu lá xẻ trung gian là thuộc loài

P bipinnatifidus Khoảng cách di truyền giữa P vietnamensis và hai loài P bipinnatifidus và P stipuleanatus lần lượt là từ 0,75 đến 0,81 và từ 0,71 đến 0,78, giữa

P bipinnatifidus và P stipuleanatus là 0,51 đến 0,61

Qua các công trình nghiên cứu vừa trình bày trên, có thể nhận thấy nhiều chỉ thị phân tử khác nhau đã và vẫn đang được sử dụng trong nghiên cứu phân loại và phân

tích quan hệ phát sinh chủng loại ở các taxon thuộc chi Panax Tuy nhiên mục tiêu chủ

yếu ở đa số các nghiên cứu là góp phần làm nhanh chóng và thuận tiện hóa việc xác thực mẫu, phân biệt các taxon hơn là phân tích quan hệ phát sinh chủng loại

1.4.2 Các nghiên cứu dựa trên giải trình tự các vùng DNA bảo thủ

Viê ̣c nghiên cứu phân loại cũng như mối quan hệ phát sinh chủng loại của các

loài thuộc chi Panax có thể được tiến hành dựa trên các dữ liệu phân tử và biện luận

thông qua các đặc điểm hình thái Việc sử du ̣ng các chỉ thị phân tử khác nhau để nhâ ̣n

dạng taxon cũng như làm rõ mối quan hệ giữa các taxon khác nhau trong chi Panax đã

được áp dụng vào các hoạt động thực tiễn như chọn giống, xác định nguồn gốc dược liệu, đăng ký, công bố taxon mới và nghiên cứu về tiến hóa của chi này

Trang 40

1.4.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Tổng hợp các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon

thuộc chi Panax dựa vào các trình tự DNA bảo thủ có thể nhận thấy có một số nhóm

nghiên cứu chính trong việc chọn lọc các vùng bảo thủ cao để phân tích, đánh giá

Ở nhóm nghiên cứu thứ nhất, các nhà nghiên cứu sử dụng các trình tự vùng gene bảo thủ đơn lẻ để phân tích

Fushimi và cô ̣ng sự (1996) sử dụng trình tự gene 18S rRNA để phân biê ̣t 3 loài

Panax là P ginseng, P japonicus and P quinquefolius, cho thấy chúng khác nhau ở

các vị trí 497, 499, 501 và 712 trên vùng trình tự 18S rRNA cùng có chiều dài 1809bp Wen và Zimmer (1996) khi nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại và địa

thực vật chi Panax đã khảo sát 12 loài Panax với 6 chuẩn ngoại thuộc chi Aralia, kết

quả chỉ ra rằng tổng chiều dài các vùng ITS1, 5,8S rRNA và ITS2 biến động từ 606 đến 608bp trong đó ITS1 là 220–221 bp, 5,8S là 163bp và ITS2 là 222–224 bp Từ đó

các tác giả chỉ ra chi Panax có quan hệ gần với chi Aralia

Hình 1.1 Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Wen và

cộng sự (1996)

Kết quả về quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2

theo cả hai phương pháp Neighbor joining và Maximum likelihood cho thấy: P trifolius tách biệt khỏi nhóm các taxon Panax còn lại thành nhánh riêng tương tự như chuẩn ngoại Aralia racemosa; P stipuleanatus và P pseudoginseng lập nhóm với

nhau tạo nhánh lớn riêng tách khỏi nhánh các taxon còn lại gồm 2 nhánh: nhánh thứ

nhất chỉ có P notoginseng và nhánh thứ hai gồm 3 phân nhánh: (1) là nhóm gồm P sinensis, P major và P bipinnatifidus 2; (2) là nhóm gồm P omeiensis, P

Định dạng
Số trang	182
Dung lượng	8,19 MB