Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro

Việc áp dụng các phương pháp kĩ thuật trong đó có phương pháp nhân giống in vitro có nhiều ưu điểm: Đảm bảo được các đặc điểm di truyền tốt của cây mẹ, tạo quần thể cây con đồng nhất, t

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG THỊ XUÂN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN

(CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY

IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG THỊ XUÂN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN

(CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY

IN VITRO

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thu Ngà

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Xuân

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thu Ngà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập

và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, cùng tất cả các thầy cô, bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ thầy cô và bạn bè để tôi có thể có được kết quả tốt hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017

Tác giả luận văn Hoàng Thị Xuân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3

1.1 Nguồn gốc và phân loại cây bưởi 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái 4

1.2.4 Cây bưởi Diễn 5

1.2 Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của cây bưởi 7

1.2.1 Thành phần hóa học 7

1.2.2 Giá trị sử dụng của cây bưởi 7

1.3 Một số giống bưởi chủ yếu trên thế giới và ở Việt Nam 8

1.3.1 Trên thế giới 8

1.3.2 Ở Việt Nam 9

1.4 Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới và Việt Nam 10

1.4.1 Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới 10

1.4.2 Tình hình sản xuất bưởi ở Việt Nam 11

1.5 Kĩ thuật nhân giống in vitro 13

1.6 Một số thành tựu trong nhân giống cây có múi 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu và hóa chất 22

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22

2.2 Địa điểm nghiên cứu 23

2.3.Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy 23

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 23

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 26

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả khử trùng hạt cây bưởi Diễn 27

3.2 Kết quả tạo chồi in vitro cây bưởi Diễn 28

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy 29

3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy 32

3.2.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy 34

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi ở cây bưởi Diễn 36

3.4 Kết quả tạo cây bưởi Diễn in vitro hoàn chỉnh 39

3.4.1 Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ cây bưởi Diễn 39

3.4.2 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ ở cây bưởi Diễn 41

3.5 Kết quả ra cây ngoài vườn ươm 42

3.5.1 Giai đoạn bầu đất 42

3.5.2 Ra cây ngoài vườn ươm 44

1 Kết luận 46

2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid BAP : 6-Benzyl Amino Purin

MS : Murashige - Skoog (1962)

IAA : Indoly Acetic Acid

IBA : Indoly Butyric Acid

NAA : α - Napthalen Acetic Acid

GA3 : Gibberellin

Kinetin : 6-furturylamino purine

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất cây ăn quả có múi ở Việt Nam giai đoạn

2010- 2014 12 Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến sự nảy mầm

của hạt cây bưởi Diễn (sau 4 tuần) 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy của

mẫu cấy 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi cây bưởi Diễn 37 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ cây bưởi Diễn (sau 8

tuần) 40 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ ở cây bưởi Diễn 41 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của cây bưởi

Diễn in vitro (sau 4 tuần) 43

Bảng 3.9 Kết quả ra cây ngoài vườn ươm 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt cây

bưởi Diễn (sau 4 tuần) 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi của mẫu cấy (sau 8

tuần) 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của

mẫu cấy (sau 8 tuần) 35 Hình 3.5 Ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi cây bưởi Diễn (sau 8

tuần) 38 Hình 3.6 Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh chồi cây bưởi Diễn 40 Hình 3.7 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ ở cây bưởi Diễn (sau

8 tuần) 42 Hình 3.8 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng cây bưởi

Diễn in vitro (sau 4 tuần) 43 Hình 3.9 Cây bưởi Diễn in vitro trồng ở vườn ươm 44

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây Bưởi (Citrus grandis L.) là một trong những loại cây ăn quả thương mại

chủ lực, có lịch sử phát triển lâu đời ở nước ta Do có phổ thích nghi rộng nên được trồng trên khắp các vùng sinh thái của cả nước từ Bắc vào Nam tạo nên những vùng quả đặc sản nổi tiếng như: Bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi Diễn (Từ Liêm, Hà Nội), bưởi Phúc Trạch (Hà Tĩnh), bưởi Da Xanh (Bến Tre), bưởi Đỏ (Thanh Hóa), bưởi Năm Roi,… Mỗi loại bưởi có hương vị đặc trưng riêng Diện tích và sản lượng cây bưởi tăng không chỉ tạo cảnh quan đẹp, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái bền vững, nâng cao hiệu quả kinh tế cho nông hộ mà còn đáp ứng nhu cầu xuất khẩu, tạo điều kiện chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp, thực hiện công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông nghiệp nông thôn Nhiều nhà vườn trồng bưởi sau 4 - 5 năm

có thể thu lãi 40 - 100 triệu đồng/ha, năng suất cao tới 250 quả/cây ở vườn có mật

độ khoảng 1000 - 1200 cây/ha [8]

Cây bưởi là loại cây ăn quả quý, có giá trị dinh dưỡng cao Trong lá, hoa, và

vỏ quả chứa nhiều tinh dầu; trong vỏ quả bưởi còn có pectin, narigin, men tiêu hóa peroxydaza, amilaza,… Quả bưởi có vị ngọt mát, chứa nhiều vitamin, chất khoáng cần thiết cho cơ thể con người [23] Chính vì vậy, cây bưởi còn là cây dược liệu quan trọng có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền của dân tộc

Bưởi thuộc loại cây ăn quả lâu năm chịu ảnh hưởng rất rõ bởi điều kiện ngoại cảnh, biểu hiện qua sinh trưởng, phát triển, năng suất và phẩm chất của quả Hiện nay, Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới đang rơi vào tình trạng nguồn gen cây ăn quả đang dần suy giảm, đặc biệt là các loại cây ăn quả quý Đứng trước việc

đô thị hóa, giới thiệu giống cây trồng mới và biến đổi khí hậu, nguy cơ xói mòn nguồn gen đang diễn ra nhanh chóng Diện tích cây ăn quả phá đi hàng năm cũng không nhỏ do còn gặp rất nhiều khó khăn về dịch bệnh và chất lượng giống Nhiều nông trại sản xuất giống cây áp dụng phương pháp truyền thống như: chiết cành, ghép cành, gieo hạt, [3], [15] Tuy nhiên cây giống được xuất vườn chưa cao, thời gian sinh trưởng kéo dài, kết quả đạt được không ổn định, chất lượng quả không

đồng đều Một số giải pháp trước mắt nhằm duy trì nguồn gen quý đã được triển khai nhưng hiệu quả chưa cao, chưa đồng bộ

Để giữ được và khai thác tốt hơn các vùng cây ăn quả truyền thống, đáp ứng nhu cầu giống tốt cho thị trường trong nước và tiến tới xuất khẩu cần áp dụng các quy trình kỹ thuật mới, dùng giống tốt, sạch bệnh Nhân giống bằng các phương pháp công nghệ tiên tiến có ý nghĩa vô cùng quan trọng và hết sức cần thiết

Việc áp dụng các phương pháp kĩ thuật trong đó có phương pháp nhân giống

in vitro có nhiều ưu điểm: Đảm bảo được các đặc điểm di truyền tốt của cây mẹ, tạo

quần thể cây con đồng nhất, tỷ lệ nhân giống cao, số lượng giống lớn, tạo nguồn giống sạch bệnh (nuôi cấy trong điều kiện vô trùng), tăng tuổi thọ cho cây, thời gian nhân giống nhanh

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây bưởi Diễn ( Citrus grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”

nhằm tạo giống cây tốt, sạch bệnh phục vụ sản xuất và mở rộng diện tích cây có múi Kết quả nghiên cứu làm cơ sở duy trì phẩm chất tốt của cây mẹ để nhân giống ra sản xuất đại trà, góp phần giữ vững thương hiệu bưởi Diễn Đồng thời bổ sung thêm kiến thức nhân giống về cây bưởi Diễn nói riêng và cây ăn quả nói chung

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được điều kiện khử trùng và môi trường nhân giống cây bưởi Diễn trong ống nghiệm

Xác định được giá thể phù hợp cho việc ra cây ngoài vườn ươm

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu phương pháp khử trùng hạt bưởi Diễn nhằm tạo nguồn mẫu sạch trong ống nghiệm

(2) Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP, kinetin và phối hợp BAP + kinetin đến sự phát sinh đa chồi cây bưởi Diễn trong ống nghiệm

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi của cây bưởi Diễn trong ống nghiệm

(4) Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của α-NAA và IBA tới sự tạo cây bưởi Diễn hoàn chỉnh trong ống nghiệm

(5) Nghiên cứu quá trình ra cây ngoài vườn ươm

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc và phân loại cây bưởi

1.1.1 Nguồn gốc

Cây có múi nói chung và cây bưởi nói riêng có lịch sử phát triển lâu đời Có ý

kiến cho rằng: Bưởi (Citrus grandis L.) có nguồn gốc ở Malaysia, Ấn Độ Thuyền

trưởng Shaddock (người Ấn Độ) đã mang giống bưởi tới trồng ở vùng biển Caribe, sau đó theo gót các thủy thủ, cây bưởi được giới thiệu ở Palestin vào năm 900 sau công nguyên và ở châu Âu sau thời gian đó Sau đó được đem trồng ở rất nhiều nước trên thế giới với mục đích thương mại Đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, trải dài từ 40o vĩ bắc xuống 40o vĩ nam [31]

Tác giả Giucovki cho rằng nguồn gốc của bưởi có thể là ở quần đảo Laxongdơ Tác giả Chawalit Niyomdham cũng cho rằng bưởi có nguồn gốc ở Malaysia, sau đó lan sang Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Địa Trung Hải

và Mỹ, vùng sản xuất chính là ở các nước Phương Đông (Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, ) [40], [43]

Như vậy, cho đến nay nguồn gốc của cây bưởi vẫn chưa được thống nhất Bưởi có thể có nguồn gốc từ Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia,… Ngày nay bưởi được trồng tập trung nhiều ở một số nước thuộc châu Á như: Ấn độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Việt Nam và miền Nam Trung Quốc Khí hậu á nhiệt đới hạn chế được nhiều loại sâu bệnh hại nên cây có múi ở những vùng này ngày càng có xu hướng tăng nhanh, phát triển mạnh về diện tích, năng suất, sản lượng và chất lượng quả [39]

1.1.2 Phân loại

Sự phân loại cây có múi khá phức tạp vì có rất nhiều giống trong sản xuất và các dạng con lai của các giống này, hiện tượng hạt đa phôi, đột biến và hiện tượng đa bội thể cũng là những nhân tố gây khó khăn cho việc phân loại cam quýt Hiện nay tồn tại hai hệ thống phân loại cây có múi được nhiều người áp dụng: Tác giả Tanaka cho rằng cam quýt gồm 160 - 162 loài, ông quan sát thực tiễn sản xuất và cho rằng các giống cam quýt qua trồng trọt đã có nhiều biến dị trở thành giống mới Tác giả Swingle đã phân chia cam quýt ra thành 16 loài, bảng phân loại của Swingle đơn giản

hơn nên được sử dụng nhiều hơn, tuy nhiên các nhà khoa học vẫn phải dùng bảng phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết đến

từng giống

Cây bưởi (danh pháp khoa học: Citrus grandis L.) thuộc loài: Citrus Citrus grandis, chi Citrus, họ Rutaceae, bộ Sapindales (tên khác: Citrus paradisi) [31], [59]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Bưởi thuộc cây thân gỗ gồm các bộ phận chính là: Rễ, thân, cành, lá, hoa, quả,

và hạt Hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp

Rễ cây bưởi là rễ cọc Cây mọc từ hạt, rễ chính ăn sâu xuống đất phân hóa thành 2-3 rễ lớn khác có nhiều rễ phụ Trồng bằng cành, cây không có rễ chính rõ, nhiều rễ bên, rễ phát triển to nhưng không đâm thẳng xuống

Thân cây bưởi thường có tiết diện tròn, vỏ cây có chứa nhiều túi tinh dầu thơm,có gai, cao khoảng 3 - 5 m, có nhiều tán nhỏ Ở nước ta cây bưởi chủ yếu trồng bằng chiết ghép cành nên thường có nhiều cành gốc, có cây có tới 7- 8 cành hay 10 cành, đường kính tán 4 - 6 m

Sinh trưởng cành của cây có múi nói chung và bưởi nói riêng phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện môi trường và kỹ thuật chăm sóc Nhìn chung cây ít tuổi chưa cho quả sinh trưởng của cành Sự phát sinh lộc thường xảy ra quanh năm, nghĩa là một năm thường có nhiều đợt cành xuất hiện Khi cây trưởng thành đã cho quả thì thường chỉ có

4 đợt lộc trong năm đó là lộc xuân, lộc hè, lộc thu và lộc đông Ở những vùng khô hạn hoặc rét sớm thì chỉ có 3 đợt lộc xuân, hè và thu không có lộc đông

Lộc xuân: Xuất hiện từ tháng 2 đến tháng 4 hàng năm Số lượng cành xuân nhiều, cành ngắn Cành xuân mang hoa gọi là cành quả

Lộc hè: Xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 7 hàng năm, sinh trưởng không đều,

cành thường to, dài, đốt thưa Cành hè: là cành sinh dưỡng có nhiệm vụ cung cấp

dinh dưỡng cho cành quả và là cành mẹ của cành thu

Lộc thu: Xuất hiện từ tháng 8 đến tháng 10 hàng năm, Cành không mang quả

và phần lớn từ cành hè, có vai trò quan trọng trong việc mở rộng tán,tăng cường khả năng quang hợp của cây

Lộc đông: Xuất hiện vào tháng 11 và tháng 12 hàng năm, đợt cành này ít, cành ngắn, lá vàng xanh

Cây bưởi có bộ lá xanh quanh năm, có cây lá sống đến 15 tháng, và có thể sống tới 3 - 5 năm Lá có màu xanh đậm, trong lá có nhiều tinh dầu, khi vò lá có mùi thơm Dạng lá đơn, eo lá khá lớn có hình tim bầu, đỉnh lá chia thuỳ rõ Lá bưởi vừa là

cơ quan quang hợp, hô hấp, vừa là nơi dự trữ Nhà trồng bưởi có thể nhìn bộ lá để biết tình trạng của cây để có chế độ chăm sóc hợp lý giúp cây phát triển tốt nhất

Hoa bưởi hình thành ở nách lá,thường có màu trắng và có mùi hương rất dễ chịu Cây bưởi thụ phấn nhờ côn trùng vì vậy cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó Hoa bưởi mọc thành cụm, lưỡng tính, hoa đều, cánh hoa rời nhau và mẫu bốn, bầu có từ 13 - 15 noãn, nhị hoa nhiều gấp 3 - 4 lần số cánh hoa Có 2 loại hoa: hoa đơn và hoa chùm (6 - 10 bông), cây có hoa đơn thường có tỉ lệ đậu quả cao hơn Trên một cây, cành ngọn thường nở hoa sớm hơn và có thể nở đến 60 nghìn hoa Theo Trần Văn Hâu (2009), khả năng cho trái của cây có múi tùy thuộc rất lớn vào lá

và diện tích lá được hình thành khi ra hoa và các đợt sinh trưởng [8]

Quả bưởi là loại quả to nhất trong họ cam quýt, là dạng quả mọng, mỗi quả gồm có: Vỏ quả, thịt quả và hạt Trọng lượng trung bình đạt từ 0,8 - 1,4kg tùy giống bưởi Quả hình cầu to, vỏ dầy, có nhiều túi dầu, màu sắc tùy theo giống Thịt quả có 9- 13 múi dày, trong múi có các tép mọng nước có sắc tố tạo thành màu quả Quả có

vị ngọt hoặc chua tùy loại, mỗi loại có hương thơm đặc trưng riêng rất dễ để phân biệt với bất kì loại quả nào trong nhóm cây ăn quả có múi Mỗi quả có 15 - 30 hạt tùy giống, có 2 dạng hạt đa phôi hay đơn phôi Hạt bưởi có 2 lá mầm Hạt có 2 lớp: màng ngoài cứng chứa nhiều lignin có màu vàng trắng, màng trong mỏng Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10oC đến 30oC, tốt nhất là 25- 30oC [4], [7], [29]

1.2.4 Cây bưởi Diễn

Về nguồn gốc, bưởi Diễn có thể là một biến dị của bưởi Đoan Hùng Khoảng

90 năm trước, cụ Lý Năm là người đầu tiên trồng giống bưởi này tại thôn Đức Diễn,

xã Phú Diễn, Phú Minh, huyện Từ Liêm, Hà Nội Giờ đây, Phú Diễn - nơi trồng giống bưởi này đã trở thành tên gọi riêng cho chính nó và bưởi Diễn đã trở thành một loại quả đặc sản nổi tiếng của thủ đô Hà Nội Ngày nay bưởi Diễn được trồng và phát triển tốt tại một số vùng sinh thái khác nhau chủ yếu ở Hà Nội (Đan Phượng, Phúc Thọ, Hoài Đức, Chương Mỹ, Quốc Oai, ), Bắc Giang (Hiệp Hoà, Tân Yên, Yên

Thế, ) Hưng Yên (Văn Giang, Tiên Lữ, ), Thái Nguyên (Đồng Hỷ) với diện tích trên 1000 ha và đang tiếp tục được mở rộng [8]

Về mặt hình thái, bưởi Diễn thuộc cây thân gỗ gồm các bộ phận chính là: Rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt Lá đơn, có màu xanh vàng Quả bưởi tròn, vỏ quả nhẵn, khi chín vỏ quả màu vàng sáng, trọng lượng trung bình từ 0,8 - 1kg, tỷ lệ phần ăn được từ

60 - 65%, múi và vách múi dễ tách rời nhau Thịt quả màu vàng xanh, múi ráo, tép mọng nước, ăn giòn, có vị ngọt mát, mùi thơm đặc trưng Hạt bưởi ít, trung bình khoảng 5 -10 hạt/quả thông thường có từ 12-14 múi Thời gian thu hoạch muộn hơn bưởi Đoan Hùng, thường trước tết nguyên đán khoảng 15 - 20 ngày Bưởi Diễn là giống cây đặc thù, chất lượng quả phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của cây Cây càng cao tuổi càng cho quả chất lượng [1], [8]

Về tình hình sản xuất: Năm 2001, ba xã Phú Diễn, Minh Khai, Xuân Phương

có 151 ha bưởi, cho thu 2650 tấn quả, đến năm 2002 thu 2966 tấn quả trên diện tích

169 ha Người ta tính được hiệu quả kinh tế của trồng bưởi gấp 4 - 5 lần so với trồng lúa, 1 ha bưởi Diễn sau 5 năm tuổi có thể đạt năng suất 50 - 60 nghìn quả, tương đương khoảng 800 triệu đồng Tuy nhiên, vài năm gần đây, ở đa số các địa phương trồng bưởi Diễn tại Hà Nội, năng suất và chất lượng bưởi có phần suy giảm, từ 15 tấn/ha năm 2006 - 2007, xuống còn 10,2 tấn/ha năm 2010 Hoa ra nhiều nhưng tỷ lệ đậu quả thấp Các nguyên nhân chưa được nghiên cứu cu ̣ thể Qua 6 năm liên tiếp đến nay cây bưởi Diễn trên chính đất Phú Diễn (Từ Liêm) mất mùa không rõ nguyên nhân cùng với việc thời tiết không thuận lợi, sâu bệnh hại ngày càng tăng làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng, năng suất cây bưởi Diễn, đồng thời tốc độ đô thị hóa nhanh, một số nhà vườn phá vườn bưởi để xây dựng nhà trọ,…

Theo Hoàng Thị Hòa - Giám đốc Trung tâm Phát triển cây trồng Hà Nội cho biết: Nhờ triển khai chương trình phát triển cây ăn quả giai đoạn 2011 - 2015 đã thay đổi được tư tưởng sản xuất có tính tự cung tự cấp, chuyển đổi sang sản xuất hàng hóa

và hướng tới xuất khẩu Diện tích bưởi Diễn đang tiếp tục được mở rộng, năng suất các mô hình đã tăng đều qua các năm, đặc biệt năm 2016 năng suất đạt khoảng 20 tấn/ha/năm, tăng 5 tấn so với năm 2015 Hiệu quả kinh tế năm 2016 đạt 328 triệu đồng/ha/năm, tăng 248 triệu đồng so với năm 2014 [45]

Theo Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn Hà Nội, hiện Sở đã hoàn thiện chương trình "Phát triển sản xuất cây ăn quả ứng dụng công nghệ cao giai đoạn 2016

- 2020" Như vậy, đến hết năm 2020, thành phố sẽ có trên 3000 ha bưởi an toàn, chất lượng cao Đẩy mạnh ứng dụng kỹ thuật đồng bộ hóa, ứng dụng công nghệ cao trong sản xuất bưởi,tăng cường công tác đào tạo, tập huấn về quản lý, kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch, bảo quản cho cán bộ, nông hộ các vùng trồng bưởivà xây dựng thương hiệu, nhãn hiệu sản phẩm Xây dựng mạng lưới quản lý chuỗi sản phẩm từ khâu sản xuất đến khâu tiêu thụ Tiếp tục khai thác tốt các thị trường tiêu thụ truyền thống và xây dựng hệ thống phân phối chuyên nghiệp, hiệu quả, kết nối với các doanh nghiệp, tiêu thụ lâu dài và ổn định cho giống bưởi Diễn [16]

1.2 Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của cây bưởi

Bưởi là loại cây ăn quả quen thuộc với người Việt Nam, đặc biệt ở Nam Bộ Quả bưởi chín là loại trái cây giàu dinh dưỡng, là món ăn tráng miệng giàu vitamin, hương hoa bưởi thơm thoang thoảng rất được nhiều người tiêu dùng ưa thích Bưởi không chỉ là loại cây ăn trái nhiều dinh dưỡng mà còn có nhiều ứng dụng trong y học

cổ truyền của dân tộc

1.2.1 Thành phần hóa học

Trong nước bưởi có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin và khoáng chất cần thiết cho sức khỏe con người Đặc biệt có chứa nhiều vitamin C giúp tăng cường sức đề kháng cho cơ thể và làm đẹp Trong 100g nước ép bưởi có thành phần dinh dưỡng gồm: nước 89%, glucid 9%, protein 0,6%, lipid 0,1% Đặc biệt rất giàu vitamin C: 90

- 100mg, axit hữu cơ 0,2 - 1%, chất đạm 0,9%, chất béo 0,1%, Fe 0,2 mg, P2O5 15 - 25mg, pectin 0,45 - 0,5% và các khoáng Ca 20%, P 20%, Mg 12%, S 7%

Ngoài ra, trong thành phần vỏ quả chứa một lượng tinh dầu khoảng 0,8%- 0,84% Tinh dầu vỏ quả chứa d-limonen, a-pinen, linadol, geranidol, citral, ancol, acid citric Vỏ bưởi còn chứa nhiều flavonoid như naringosid, hesperidin, diosmin, diosmetin, hesperitin [32], [35]

1.2.2 Giá trị sử dụng của cây bưởi

Từ xưa tới nay, quả bưởi thường được dùng để ăn tráng miệng, làm nước giải khát, làm mứt Nhiều tác dụng của quả bưởi đối với cơ thể con người còn chưa được hiểu rõ Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, mỗi bộ phận của cây bưởi đều có tác dụng

riêng: Dịch ép quả bưởi có tính thanh nhiệt và có chứa nhiều vitamin, khoáng chất rất

có lợi cho sức khoẻ con người Từ lá bưởi cho đến hạt bưởi khi kết hợp với một số loại thảo dược khác tạo nên các vị thuốc vô cùng hữu hiệu Lá, hoa, quả non chứa nhiều tinh dầu, dùng làm nguyên liệu chiết tinh dầu thơm, dùng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo Lá bưởi vị đắng, the, tính ấm, có tác dụng tán hàn, tán khí, thông kinh lạc, giải cảm, trừ đờm, tiêu thực, hoạt huyết, tiêu sưng, tiêu viêm, được dùng nấu với các lá thơm khác để xông Vỏ ngoài quả bưởi chứa tinh dầu: có vị cay, đắng, tính ấm, có tác dụng trị ho, lý khí, giảm đau, hỗ trợ tiêu hoá và trị cảm cúm, có thể trích lấy pectin làm thuốc cầm máu và dùng như gôm chải tóc Cơm bưởi vị ngọt, chua, tính mát, không độc, có tác dụng kiện tỳ, trị ho, giải rượu (làm mứt, nấu chè, làm nem chay) Hạt bưởi

vị đắng, tính ấm, chứa chất béo, có tác dụng trị đau thoát vị bẹn, sa đì Bột than hạt bưởi có thể dùng chữa trốc đầu ở trẻ em; Dịch ép múi bưởi chứa một lượng lớn đường

tự nhiên,dùng làm nước giải khát tốt, giàu chất chống oxy hóa, chất xơ, vitamin A Hàm lượng vitamin C trong trái bưởi là chất hóa học của quả trong tự nhiên có thể làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu của cơ thể, đồng thời còn có lợi cho việc hấp thụ canxi, sắt giúp tăng cường thể chất Thường xuyên ăn bưởi có tác dụng hỗ trợ việc trị liệu đối với các bệnh nhân cao huyết áp, bệnh tiểu đường, bệnh xơ cứng động mạch Ngoài ra bưởi còn có công dụng giúp giảm béo và làm đẹp [11]

Theo y học hiện đại, các nhà khoa học đã chứng minh rằng bưởi có khả năng làm giảm nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt, giúp sửa chữa hư hỏng DNA trong các tế bào tuyến tiền liệt của con người Kiểm chứng thực tế cho thấy, những bệnh nhân đang trong quá trình uống thuốc hạ huyết áp hay thuốc giảm đau, nếu ăn bưởi sẽ giúp làm tăng công dụng trị bệnh của thuốc [38]

1.3 Một số giống bưởi chủ yếu trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Trên thế giới

Trên thế giới, bưởi (Citrus grandis L.) được trồng chủ yếu ở các nước có khí

hậu nhiệt đới, đặc biệt là các quốc gia thuộc châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Lào, Philippine, Malaysia,… Mặc dù bưởi là loài có sự đa dạng di truyền rất lớn, song trong sản xuất không phải tất cả các giống đều được trồng với mục đích để ăn tươi hoặc trao đổi buôn bán, mà ở mỗi nước chỉ có 1 số giống phát triển mang tính đặc sản địa phương

Ở Thái Lan tập đoàn giống bưởi rất phong phú Theo Prasert Anupunt - Viện làm vườn Thái Lan, các giống phổ biến trong sản xuất trồng ở các tỉnh miền Trung như Nakhon Pathom, Samut Sakhon, Samut songkhram, Ratchaburi và Nothaburi là: Khao Tongdee, Khao Phuang, Khao Phan, Khao Hawm, Khao nhan phung, Khao kheaw, Khao Jeeb, Khao Yai, Tubtim và Sai Nham Phung Một số giống khác như: Khao Tangkwa, Som Krun, Khao Udom Sook và Manorom được trồng ở Chai Nat và Nakhon Sawan; giống Khao Uthai là giống đặc sản của tỉnh Uthai Thani; giống Takhoi và Som Pol được trồng phổ biến ở Phichit; giống Pattavia chỉ trồng ở vùng phía nam như ở tỉnh Surat Thani, Songkhla, Narathiwat và Pattani [39]

Ở Trung Quốc, bưởi trồng nhiều ở các tỉnh Quảng Đông, Quảng Tây, Tứ Xuyên, Hồ Nam, Chiết Giang, Phúc Kiến và Đài Loan Các giống bưởi nổi tiếng của Trung Quốc được biết đến: bưởi Văn Đán, Sa Điền, bưởi ngọt Quan Khê, Đây là những giống đã được Bộ nông nghiệp Trung Quốc công nhận là hàng nông nghiệp chất lượng cao và cấp huy chương vàng Ở Đài Loan có giống bưởi nổi tiếng là bưởi Văn Đán, do có đặc tính tự thụ, phôi không phát triển nên không có hạt, chất lượng rất tốt được nhiều người ưa chuộng [2]

Ở Malaysia có 24 giống bưởi được trồng phổ biến trong sản suất, bao gồm cả giống trong nước và nhập nội [39]

1.3.2 Ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện thuận lợi thích hợp với nhiều loại cây Cây bưởi ở nước ta rất phong phú, đa dạng và được trồng ở hầu khắp các tỉnh thành, hình thành những vùng trồng bưởi lớn, đặc trưng mang tính đặc sản địa phương Một số giống nổi tiếng ở các địa phương được trồng với mục đích sản xuất hàng hóa

Bưởi Đoan Hùng được trồng nhiều ở huyện Đoan Hùng tỉnh Phú Thọ Có

2 giống tốt đó là bưởi Tộc Sửu xã Chi Đám và bưởi Bằng Luân xã Bằng Luân

Bưởi Diễn có nguồn gốc từ bưởi Đoan Hùng Là loại quả đặc sản nổi tiếng của đất Hà thành

Bưởi Quế Dương còn được gọi là bưởi Ta, bưởi Tháp Thượng

Bưởi Thanh Trà là một trong những đặc sản của tỉnh Thừa Thiên Huế được trồng chủ yếu trên đất phù sa dọc theo sông Hương, sông Bồ, sông Ô Lâu, thuộc các

xã: Thuỷ Biều, Hương Long, Kim Long, Hương Hồ, Hương Thọ, Hương An, Hương Vân, thị trấn Hương Trà và thị trấn Phong Điền

Bưởi Da Xanh có nguồn gốc từ ấp Thanh Sơn, xã Thanh Tân, huyện Mỏ Cày, tỉnh Bến Tre, được trồng nhiều nhất tại xã Mỹ Thạnh An, thị xã Bến Tre Bưởi Năm Roi được trồng nhiều trên đất phù sa ven sông Hậu ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Hậu Giang, Bến Tre, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long [7], [24]

Trồng bưởi mang lại hiệu quả kinh tế cao,song sản xuất vẫn mang tính tự phát, thiếu quy hoạch nên còn nhiều bất cập Trong những năm gần đây hiện tượng mất mùa liên tục xảy ra với một số giống bưởi đặc sản Để nâng cao và ổn định năng suất, phẩm chất các giống bưởi đặc sản cần có những nghiên cứu cơ bản cho từng giống, ở mỗi vùng sinh thái khác nhau

1.4 Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới và Việt Nam

1.4.1 Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới

Cây ăn quả có múi được trồng rộng khắp trên thế giới: châu Á, Bắc Mỹ, Nam

Mỹ, châu Âu, châu Phi, châu Úc Ở châu Mỹ, châu Âu sản phẩm chủ yếu là sản xuất bưởi chùm dùng cho chế biến nước quả Châu Á là cái nôi của họ cam quýt, đây cũng

là khu vực sản xuất bưởi lớn trên thế giới được sử dụng để ăn tươi là chủ yếu

Hàng năm, trên thế giới sản xuất khoảng 4 - 5 triệu tấn bưởi cả 2 loại bưởi

chùm (Citrus paradisi) và bưởi (Citrus grandis) chiếm 5,4 - 5,6% tổng sản lượng cây

có múi, Trong đó chủ yếu là bưởi chùm chiếm 2,8 - 3,5 triệu tấn, còn lại bưởi chiếm một lượng rất ít khoảng 1,2 - 1,5 triệu tấn.Theo FAO, năm 2013 tổng sản lượng cam quýt trên thế giới đạt 135,169 triệu tấn Quốc gia có sản lượng lớn nhất trên thế giới

là Trung Quốc đạt 32,1 triệu tấn, Brazin 19,9 triệu tấn, Mỹ 10,3 triệu tấn, Ấn Độ 9 triệu tấn, Mehico 7,18 triệu tấn [44]

Ở Mỹ, việc chọn tạo giống cam quýt nói chung và giống bưởi nói riêng rất được chú trọng Vì vậy, đây là quốc gia có bộ giống bưởi đưa vào sản xuất tốt nhất thế giới, với nhiều giống cho quả không hạt (thể bất dục đực, bất dục cái, thể tam bội,…) Năm 2009, sản lượng quả bưởi của Mỹ đạt 1.182.970 tấn và là quốc gia xuất khẩu bưởi chùm lớn nhất thế giới Theo Mung (2008), hiện nay một số nước như Trung Quốc, Thái Lan, Philippines cũng đang phát triển trồng bưởi theo hướng xuất

khẩu và nhiều giống bưởi đã được thị trường thế giới chấp nhận như bưởi Sa Điền (Trung Quốc), bưởi Văn Đán (Đài Loan), bưởi KaoPhung (Thái Lan),… [38]

1.4.2 Tình hình sản xuất bưởi ở Việt Nam

Việt Nam được thiên nhiên ưu đãi về khí hậu, đất đai, nguồn nước Đây là điều kiện rất thuận lợi để phát triển các vùng chuyên canh cây ăn quả nhiệt đới với nhiều chủng loại có giá trị kinh tế cao và có vai trò quan trọng trong mô hình vườn - ao - chuồng cũng như sản xuất trang trại Cây có múi được trồng khắp cả nước từ Bắc vào Nam Có 3 vùng trồng chủ yếu:

Vùng Đồng bằng sông Cửu Long: Cây có múi có tổng diện tích 74.400 ha, chiếm 54% và sản lượng 880.800 tấn/năm, chiếm 65% so với cây có múi của cả nước Đặc biệt có các giống cây có múi đặc sản nổi tiếng được người tiêu dùng ưa chuộng và mua với giá cao (bưởi Da Xanh của Bến Tre; bưởi Năm Roi của Vĩnh Long, Hậu Giang; quýt Hồng của Đồng Tháp; quýt Đường của Trà Vinh,…)

Vùng Bắc Trung bộ: Theo thống kê năm 2009, diện tích cây có múi toàn vùng

là 16.550 ha, trong đó có 12.520 ha cho thu hoạch Trong vùng này có hai vùng bưởi đặc sản đó là bưởi Thanh Trà của Huế, bưởi Phúc Trạch của Hương Khê, Hà Tĩnh Với ưu việt của mình, diện tích bưởi Phúc Trạch ngày càng được mở rộng Trong năm 2008, diện tích bưởi Phúc Trạch lên đến 1600ha, trong đó có khoảng 1250 ha đã cho quả, sản lượng quả bình quân những năm gần đây đạt 15-17 nghìn tấn/năm [6]

Vùng Trung du và miền núi phía Bắc: Cây có múi ở vùng này được trồng ở những vùng đất ven sông, suối như sông Hồng, sông Lô, sông Gâm, sông Chảy Hiện chỉ còn một số vùng tương đối tập trung là Bắc Sơn, Bắc Quang có 474 ha chiếm 17,5% diện tích cây có múi với giống bưởi Đoan Hùng Ở trung du và vùng núi phía Bắc, được trồng nhiều ở Hà Nội, Bắc Giang, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang; Vùng Bắc Trung bộ: Huế, Hương Khê; Vùng đồng bằng sông Cửu Long Với diện tích hàng ngàn hecta, nghề trồng cam quýt đã vươn lên trở thành một nghề sản xuất - xuất khẩu [1], [8]

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, đến năm 2014 cả nước có 56.600 nghìn ha cây có múi, sản lượng đạt 708,6 nghìn tấn Như vậy, trong những năm vừa

qua trong khi diện tích hầu như không tăng thì năng suất đã tăng đáng kể, từ 113,620 tạ/ha năm 2010 lên 127,283 tạ/ha năm 2014

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất cây ăn quả có múi ở Việt Nam

giai đoạn 2010- 2014 Chỉ tiêu Diện tích(ha) Năng suất(tạ/ha) Sản lượng(tấn)

(Nguồn: Niên giám thống kê 2014 [20])

Để đưa trái cây Việt Nam thâm nhập vào các thị trường khó tính, được thị trường thế giới chấp nhận, đồng thời xây dựng chiến lược tiêu thụ sản phẩm, rút ngắn thời gian giữa sản xuất và tiêu thụ - kế hoạch: "Phát triển sản xuất cây ăn quả ứng dụng công nghệ cao giai đoạn 2016 - 2020" đã được đưa ra Tăng cường công tác đào tạo, tập huấn về quản lý, kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch, sơ chế, bảo quản và xây dựng thương hiệu, nhãn hiệu sản phẩm cho cán bộ, nông hộ các vùng trồng bưởi Xây dựng mạng lưới quản lý chuỗi sản phẩm từ khâu sản xuất đến khâu tiêu thụ Tiếp tục khai thác tốt các thị trường tiêu thụ truyền thống và xây dựng hệ thống phân phối chuyên nghiệp, hiệu quả, kết nối với các doanh nghiệp, tiêu thụ lâu dài và ổn định Trái cây Việt Nam phải sản xuất theo tiêu chuẩn GAP Do đó, công tác xúc tiến thương mại, đặc biệt là việc chuyển giao tiến bộ kỹ thuật thâm canh cho nông dân nhằm nâng cao năng suất, chất lượng theo hướng vệ sinh an toàn thực phẩm là mục tiêu quan trọng hàng đầu [1], [16]

Một số nghiên cứu định hướng phát triển cây ăn quả ở Việt Nam đã khẳng định: phát triển cây ăn quả là một hướng góp phần chuyển dịch cơ cấu nông nghiệp, nông thôn.Về lâu dài, sản xuất cây ăn quả phải trở thành chính, phấn đấu tỉ trọng đạt

20 - 25% trong giá trị trồng trọt, đưa kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 15 - 18% trong kim ngạch xuất khẩu nông sản vào những năm 2020 [26]

1.5 Kĩ thuật nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh

vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất [22]

Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang thông tin di truyền giống nhau Do

đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau Các tế bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường Quá trình này có thể thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính và được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là phát triển thành tế bào mô sẹo Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào [22], [28]

Ưu điểm của kĩ thuật nhân giống invitro

Trong những năm gần đây, ngành công nghiệp nhân giống in vitro đang phát

triển và mở rộng mạnh mẽ trên toàn cầu Nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người về sản xuất lương thực, thực phẩm, phục tráng giống cây quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng chất lượng cây giống phục vụ cho sản xuất nông nghiệp, lâm nghiệp không ngừng tăng lên. Kĩ thuật nhân giống in vitro có ưu điểm nổi bật hơn

các phương pháp nhân giống cổ điển khác

(1) Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Kĩ thuật

nhân giống invitro đảm bảo nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo ra

hàng triệu cây Tốc độ này khoảng 36-1012/năm như ở khoai tây: từ 50 giống của ngân hàng giống thế giới sau 6 tháng nhân giống được mười vạn cây khoai tây

(2) Nhân được một số lượng lớn cây giống có sự đồng nhất về mặt di truyền trong một diện tích nhỏ Trong 1m2 diện tích có thể để được tới 18.000 cây

(3) Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh Vì vậy, đảm bảo cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh, có sức tăng trưởng nhanh

(4) Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng đến 15kg) Giống cây dễ bảo quản, các cây giống giữ ở nhiệt độ 40C trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%

(5) Hoàn toàn chủ động được kế hoạch sản xuất cây trồng, quá trình sản xuất

có thể được vận chuyển ở bất kì thời gian nào trong năm

(6) Trẻ hóa vật liệu giống [22], [24]

Các phương thức nhân giống in vitro

Trước đây, đối với các loại cây ăn quả có múi, người ta thường sử dụng phương pháp nhân giống vô tính (giâm, chiết, ghép) Các biện pháp này có ưu điểm: Cây giống đồng đều về mặt di truyền, cây sớm ra hoa kết quả, Tuy nhiên, các phương pháp này có hệ số nhân giống thấp, tốn thời gian đưa giống vào sản xuất, khả năng nhiễm bệnh cao

Ngày nay, kĩ thuật nhân giống in vitro đã được sử dụng phổ biến hơn bởi

những khả năng vượt trội hơn so với phương pháp nhân giống vô tính Đối với cây ăn

quả có múi, có ba phương thức trong nhân giống invitro chủ yếu: Nuôi cấy mô phân

sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây; Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng:

Mô phân sinh đỉnh thường là các đỉnh chồi hoặc đỉnh cành có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, chồi mới hình thành hoặc các cành non, vì thế khả năng phân chia mạnh, không có virus xâm nhập Đỉnh sinh trưởng bao gồm toàn bộ phần

mô phân sinh đỉnh có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh trưởng

và một phần của mô xung quanh được bao bọc bởi lớp cutin, dài 0,25-0,30mm Vì mẫu đưa vào nuôi cấy nhỏ do đó đòi hỏi kỹ thuật lấy mẫu và môi trường nuôi cấy phải phù hợp Kích thước mẫu ảnh hưởng đến sự sống sót và tái sinh cây

Xét về nguồn gốc cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng có 3 khả năng: (i) Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn); (ii) Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ; (iii) Cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên, khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh

Xét về phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng có hai phương thức:

(1) Phương thức phát triển trực tiếp: từ nuôi cấy chồi đỉnh hoặc chồi nách Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như: khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có

cả ở cây một lá mầm như dứa sợi, mía,…

(2) Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm): bằng cách nuôi cấy mầm (đỉnh sinh trưởng) để tạo thành cây con Chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá mầm như: phong lan, dứa, huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương thứ này trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp trong nhân giống các cây ăn quả và cây lâm nghiệp như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ đề,… cũng bắt đầu có kết quả trên 30 chi khác nhau [17]

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Tế bào thực vật có tính toàn năng nên các bộ phận của cơ thể thực vật đều có

thể sử dụng trong nhân giống in vitro như: đoạn thân: cam, chanh, bưởi,…; mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, ; nhánh củ ở hành, tỏi,…

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường tạo mô sẹo có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Khối mô sẹo thu được có thể đưa vào môi trường nhân sinh khối hoặc đem tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy phù hợp Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ và khá đồng nhất về mặt di truyền Nuôi cấy mô sẹo thường được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ phát sinh biến dị tế bào soma lại cao hơn Vì vậy, cần phải sử dụng mô sẹo vừa mới phát sinh (mô sẹo sơ cấp) để thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn mô sẹo

có thể thu được cây giống sạch virus [17], [22]

Quy trình nhân giống in vitro

Để nhân giống in vitro cây trồng cần thực hiện tốt các kĩ thuật chủ yếu sau: Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu từ vật liệu làm gốc nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro cây con mang những đặc tính và tính trạng của cây mẹ

ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt… Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy để tạo nguyên liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước:

(i) Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vô trùng

(ii) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

(iii) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi

trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro)

Sau khi khử trùng (phần thích hợp của thực vật), mẫu cấy sẽ được chuyển vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng và nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp.Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn 3

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Ở giai đoạn này yêu cầu cần phải sử dụng các chất kích thích sinh trưởng để thúc đẩy hình thành các cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó có thể phát sinh thành cây hoàn chỉnh trực tiếp qua nách hoặc đỉnh sinh trưởng Hoặc chồi mới hình thành gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo Giai đoạn nhân chồi quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cấy sạch đã tạo ra được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Thành phần và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1-2 tháng tùy loài cây Tỉ lệ nhân nhanh

khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển Giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng

Giai đoạn 4: Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Người ta thường sử dụng chất kích thích trưởng thuộc nhóm auxin như: IAA, NAA, IBA Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần Khi cây có đủ các bộ phận rễ, thân, lá đảm bảo cây sinh trưởng, phát triển bình thường, tiến hành đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên Giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng

của quy trình nhân giống in vitro Đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi

đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển,… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [10], [19]

Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chất này được phân thànhcác nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin

Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu

tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α-naphtylaxetic axit(NAA), indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích quá trình phân chia tế bào và thường được sử dụng nhiều nhất, α-NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con

Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von Nhóm này tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên như: ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp

Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 - Benzyl amino purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin Hiện nay một thế hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, như thidiazuron (TDZ) - một cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thay thế thành công cho tái sinh trực tiếp với tần

số cao của phôi vô tính

Trong nuôi cấy tùy từng loại mô và mục đích nuôi cấy có thể sử dụng riêng rẽ từng nhóm auxin hoặc cytokinin hoặc sử dụng kết hợp cả 2 nhóm auxin và cytokinin với hàm lượng khác nhau [17], [22], [40]

Các yếu tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Mô nuôi cấy

Tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,… khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hoocmon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi

mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá,… rất khác nhau Do đó việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định Các kết quả nghiên cứu cho thấy, để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh [22]

Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi

cấy đòi hỏi các yêu cầu sau: Vô trùng mô cấy, vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường

và nút đậy Trong thao tác cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy.Ngoài

ra, còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm, khuẩn [13], [28]

Ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng

nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố Cường độ ánh sáng trên dàn nuôi cấy

phải là ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên (230 -780 nm) Nhiệt độ của phòng nuôi cấy được duy trì từ 25 -28oC [13]

Môi trường nuôi cấy

Tất cả các môi trường nuôi cấy đều gồm năm thành phần chính sau: các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nguồn cacbon, các chất điều hòa sinh trưởng, chất độn Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin, hoặc không xác định như: nước dừa, dịch chiết nấm men,…vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy Trong những năm 60 nhiều môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và được sử dụng cho đến ngày

nay, đó là các môi trường: Môi trường nghèo chất dinh dưỡng White, Knop (1953), Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963); Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968) [17]

1.6 Một số thành tựu trong nhân giống cây có múi

Đã có nhiều công trình nghiên cứu khác nhau nhằm hoàn thiện quy trình nuôi

cấy in vitro cây có múi trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Trên thế giới

Trong nghiên cứu của Sunette L (2004), khi nhân giống quýt Mega-loxycarpa Lush ở Ấn Độ cho thấy, môi trường thuận lợi nhất cho sự tạo chồi từ đoạn thân làMS

cơ bản bổsung BAP 0,25mg/l + NAA 0,5mg/l, môi trường MS cơ bản bổsung BAP 1mg/l và kinetin 0,5mg/l cho hệ số nhân chồi lần lượt là 4,7 và 4,4 Chồi non ra rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 2mg/l, số rễ/chồi đạt 4,4 [43]

Theo nghiên cứu của Rezadost M.H và cs (2013), khi nghiên cứu tái sinh in

vitro cây cam chua (Citrus aurantium L.) đã công bố, hạt cam chua nảy mầm tốt nhất

trên môi trường MS có bổ sung BAP 2mg/1 và NAA 0,1mg/l Tỉ lệ tạo chồi từ đoạn thân tốt nhất trên môi trường có BAP 2,5mg/l, kéo dài chồi đạt hiệu quả tối ưu trên môi trường có GA3 0,5mg/l [37]

Tác giả Ehsan E và cs đã nghiên cứu tái sinh in vitro từ mô trưởng thành của

cây cam ngọt Thomson Kết quả cho thấy, chồi thí nghiệm phát triển tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung BAP 1mg/l,NAA 0,1mg/l (3,2chồi/mẫu) Khi cắt mẫu theo chiều dọc hoặc chiều ngang đoạn thân có tỷ lệ phản ứng tạo chồi 56% Rễ phát sinh trên môi trường MS cơ bản có NAA ( 0,5 - 1mg/l) Tỉ lệ tạo rễ cao nhất đạt 76% [33]

Nghiên cứu môi trường nhân nhanh giống Cam ngọt (Citrus sinensis L

Osbeck), tác giả Shahid A K và cs (2011) đã chỉ ra, môi trường tạo mô sẹo tốt nhất

là BAP 1mg/l và NAA 0,5mg/l (98%) Môi trường tạo đa chồi tối ưu là môi trường

MS cơ bản có bổ sung BAP 1,5mg/l và NAA 1mg/l, tỉ lệ mẫu tạo đa chồi khoảng 90% và đạt 10 chồi/mẫu sau 35 ngày nuôi cấy Số rễ được tạo ra nhiều nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung IBA 2,5 mg/l (3,4 rễ/cây) [42]

Trong nghiên cứu nhân giống cây chanh từ lá mầm, Anna K P và cs (2015)

đã công bố, khi kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cả auxin và cytokinin trên môi trường MS cơ bản với nồng độ kinetin 0,2mg/l và NAA 1mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo đa chồi là 97% Môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 3,5mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo

đa chồi đạt 85% Các chồi tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS cơ bản + BAP 5mg/l+NAA 1mg/l, tỉ lệ tạo rễ đạt 82% [30]

đã chỉ ra, hạt nảy mầm trên môi trường MS cơ bản có bổ sung đường 25g/l và agar 8g/l Môi trường thuận lợi cho sự phát sinh chồi từ các đoạn thân mầm trên môi trường MS cơ bản + BAP 3mg/l + NAA 0,5mg/l, tỉ lệ mẫu tạo đa chồi là 45,5%.Các chồi tạo rễ trên môi trường MS cơ bản + IBA 1mg/l + NAA 0,5mg/l [41]