Hoàn thiện hệ thống nhân giống vi thủy canh cây hoa cúc trắng (Chrysanthemum morifolium)

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium) là một loài hoa trồng chậu và cắt cành phổ biến trên thế giới [138] với hàng tỷ cành được bán ra mỗi năm và được ưa chuộng bởi màu sắc phong phú (trắng, vàng, xanh, đỏ, tím, hồng,…) cũng như hình dáng và kích cỡ hoa rất đa dạng. Ở Việt Nam, cây hoa cúc được du nhập từ thế kỷ XV, người Việt xem hoa cúc là biểu tượng của sự thanh cao, một trong bốn loài thảo mộc được xếp vào hàng tứ quý “tùng, cúc, trúc, mai” [21]. Khi sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến. Cây hoa cúc được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp giâm cành. Phương pháp nhân giống này đơn giản, tiết kiệm và được thực hiện ở điều kiện ex vitro. Tuy nhiên, phương pháp này có một số điểm hạn chế như hệ số nhân giống thấp, chất lượng cây giống kém vì các đoạn chồi thu nhận từ cây mẹ sẽ bị thoái hóa hoặc nhiễm virus sau vài thế hệ [58]. Do đó, người dân luôn cần một số lượng lớn cây giống sạch bệnh để phục vụ sản xuất. Vi nhân giống được chứng minh là phương pháp hữu hiệu để nhân nhanh giống cây trồng với số lượng lớn trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, các chồi nuôi cấy trong bình thủy tinh còn nhiều nhược điểm như khí khẩu bị dị dạng, nồng độ CO 2 thấp, độ ẩm cao (95%) [139]. Sự thành công của phương pháp vi nhân giống phụ thuộc rất nhiều vào khả năng thuần hóa cây giống trong điều kiện vườn ươm. Trong điều kiện in vitro, cây giống đã quen với những điều kiện lý tưởng được kiểm soát trong quá trình sinh trưởng, đến giai đoạn thích nghi, cây giống phải chống chịu với nhiều tác nhân bất lợi bên ngoài như: nấm bệnh, nhiệt độ thay đổi, độ ẩm thấp, nghèo dinh dưỡng,… Sự thay đổi đột ngột đó làm cho tỷ lệ sống sót của cây giống giảm đáng kể. Một số nghiên cứu cho thấy, các điều kiện ngoài tự nhiên đã tác động đến sự thay đổi sinh lý bên trong cơ thể thực vật; điều đó dẫn đến những hình thái, sinh lý và cấu trúc giải phẫu bất thường khi cây thích nghi. Điển hình như khí khẩu không hoạt động, hệ thống rễ yếu, tầng biểu bì mỏng [73], sự thay đổi hàm lượng đường, tinh bột,… trong giai đoạn thích nghi [131]. Vì vậy, hiểu rõ sự thay đổi khác nhau trong sinh lý, sinh hóa cây trồng là vấn đề quan trọng để đưa ra những biện pháp cải thiện khả năng sống sót và thích nghi của cây giống ngoài vườn ươm. Hệ thống vi thủy canh (microponic system) là hệ thống nhân giống kết hợp giữa vi nhân giống (micropropagation) và thủy canh (hydroponic), đây là một phương pháp có tiềm năng trong sản xuất cây giống. Phương pháp này kế thừa nhiều ưu điểm của kỹ thuật thủy canh và phương pháp vi nhân giống, có thể khắc phục một số hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống như: hiện tượng thủy tinh thể, giảm bớt sự ức chế của ethylen do thoáng khí tốt,... Hahn và cs (1996, 1998, 2000) đã báo cáo rằng, cây hoa cúc trong hệ thống này sinh trưởng mạnh hơn so với hệ thống nuôi cấy in vitro [45-47]. Hệ thống vi thủy canh với giá thể film nylon đã được nghiên cứu bởi Nhut và cs (2005, 2005b) trên một số cây trồng (cúc, hoa chuông, bibi,…) và bước đầu cũng cho thấy tính khả quan của phương pháp này như cây cho sự sinh trưởng và phát triển tốt, nuôi cấy không cần điều kiện vô trùng, không cần bổ sung đường, agar vào môi trường nuôi cấy, dễ thực hiện và áp dụng thực tiễn. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ mới đưa ra mô hình thí nghiệm, khả năng áp dụng thực tiễn chưa cao và khó đưa vào sản xuất thương mại [9, 87]. Theo xu hướng hiện nay, hệ thống này được nghiên cứu cải tiến theo hai xu hướng: (1) hiện đại hóa các thiết bị nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy; (2) đơn giản hóa với các thiết bị, vật liệu đơn giản, rẻ tiền nhưng vẫn đảm bảo được sự phát triển tốt của cây, nâng cao chất lượng cây giống, dễ dàng áp dụng trên quy mô lớn. Vì vậy, xu hướng thứ hai được chúng tôi lựa chọn nhằm đơn giản quy trình sản xuất cũng như dễ ứng dụng vào thực tiễn sản xuất. Đề tài “Hoàn thiện hệ thống nhân giống vi thủy canh cây hoa cúc trắng (Chrysanthemum morifolium)” được thực hiện nhằm đánh giá khả năng tăng trưởng của cây hoa cúc trong hệ thống vi thủy canh, đánh giá được hiệu quả nhân giống, đưa ra một mô hình sản xuất cây giống trong hệ thống vi thủy canh phù hợp và có thể nhân giống

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

*****

HOÀNG THANH TÙNG

HOÀN THIỆN HỆ THỐNG NHÂN GIỐNG

VI THỦY CANH CÂY HOA CÚC TRẮNG

(Chrysanthemum morifolium)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ THỰC VẬT

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan i

Danh mục chữ viết tắt ii

Mục lục iv

Danh mục các hình và biểu đồ xii

Danh mục các bảng xvi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 THỦY CANH 5

1.1.1 Khái niệm 5

1.1.2 Các yêu cầu cơ bản của hệ thống thuỷ canh 6

1.1.3 Dung dịch dinh dưỡng thủy canh 7

1.2 VI THỦY CANH 8

1.2.1 Sơ lược về phương pháp vi thủy canh 8

1.2.2 Ưu điểm của phương pháp vi thủy canh 9

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về phương pháp thủy canh in vitro và vi thủy canh 10

1.2.3.1 Phương pháp thủy canh in vitro 10

1.2.3.2 Phương pháp vi thủy canh 11

1.2.4 Những hạn chế của các nghiên cứu trước đây 13

1.3 SƠ LƯỢC VỀ CÂY HOA CÚC 14

1.3.1 Phân loại 15

1.3.2 Giá trị kinh tế 15

1.3.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ giống cây hoa cúc tại Đà Lạt – Lâm Đồng 16

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CÂY HOA CÚC 17

1.4.1 Các phương pháp nhân giống cây hoa cúc truyền thống 17

1.4.1.1 Phương pháp gieo hạt 17

1.4.1.2 Phương pháp tách mầm giá 17

1.4.1.3 Phương pháp giâm cành 18

1.4.1.4 Những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống 20

1.4.2 Nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp vi nhân giống 21

1.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY 23

1.5.1 Sự thoáng khí và nồng độ khí CO2 và O2 23

1.5.2 Thành phần và thể tích môi trường 24

1.5.3 Giá thể 24

1.5.3.1 Định nghĩa 24

1.5.3.2 Agar và một số loại giá thể 25

1.5.3.3 Giá thể film nylon 25

1.6 NANO BẠC 27

1.6.1 Giới thiệu 27

1.6.2 Hiệu quả kháng vi sinh vật của nano bạc 28

1.6.3 Hiệu quả của hạt nano lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật 30

1.6.4 Hiệu quả của hạt nano lên quá trình quang hợp 32

1.6.5 Tính an toàn của nano bạc 32

1.7 HỆ THỐNG CHIẾU SÁNG ĐƠN SẮC 33

1.7.1 Hệ thống chiếu sáng đơn sắc trong nhân giống vô tính thực vật 33

1.7.2 Vai trò của ánh sáng đơn sắc trong nghiên cứu sự tái sinh, sinh trưởng và phát triển của thực vật 34

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 VẬT LIỆU 38

2.1.1 Vật liệu thực vật 38

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 38

2.1.3 Thiết bị chiếu sáng 39

2.1.4 Giá thể film nylon 40

2.1.5 Hệ thống nuôi cấy 40

2.1.6 Môi trường nuôi cấy 41

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 41

2.2.1 Thiết lập hệ thống vi thủy canh 41

2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng tăng trưởng chồi cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 41

2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc lên khả năng kháng khuẩn trong môi trường vi thủy canh hộp nhựa tròn 41

2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng LED lên sự gia tăng sinh trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 41

2.2.5 Đánh giá hiệu quả nhân giống của phương pháp vi thủy canh so với phương pháp nhân giống in vitro 42

2.2.6 Trồng thử nghiệm cây cúc trong hệ thống vi thủy canh ra vườn ươm đến giai đoạn ra hoa 42

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 42

2.3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tiền xử lý IBA lên khả năng ra rễ của

cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 42 2.3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự

tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 43 2.3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự tăng trưởng

của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 43 2.3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện thoáng khí lên sự tăng

trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 43 2.3.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc trong môi trường

nuôi cấy vi thủy canh hộp nhựa tròn đến khả năng tăng trưởng của cây cúc 44 2.3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc trong môi trường

nuôi cấy vi thủy canh hộp nhựa tròn đến khả năng kháng vi sinh vật 44 2.3.1.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc trong môi trường nuôi cấy

vi thủy canh hộp nhựa tròn đến khả năng tăng trưởng của cây cúc ở giai đoạn vườn ươm 44 2.2.1.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại ánh sáng khác nhau lên sự tăng

trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 45 2.2.1.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại ánh sáng khác nhau lên khả

năng tích lũy chlorophyll trong lá của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 45

2.2.1.10 Đánh giá hiệu quả của phương pháp vi thủy canh và vi nhân

giống cây hoa cúc 46

2.2.1.11 Nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn và hình chữ nhật lên sự tăng trưởng của cây cúc 46

2.2.1.12 Trồng thử nghiệm cây cúc trong hệ thống vi thủy canh ra vườn ươm đến giai đoạn ra hoa 46

2.3.2 Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu 47

2.3.2.1 Xác định các chỉ tiêu tăng trưởng 47

2.3.2.2 Một số công thức tính được tiến hành khi thu nhận số liệu 47

2.3.2.3 Quan sát hình thái khí khẩu 48

2.3.3 Phương pháp xử lý thống kê 48

2.4 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 48

2.4.1 Điều kiện nuôi cấy in vitro 48

2.4.2 Điều kiện nuôi cấy vườn ươm 49

2.4.3 Điều kiện trồng và chăm sóc ở đồng ruộng 49

2.5 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 51

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52

3.1 THIẾT LẬP HỆ THỐNG VI THỦY CANH 52

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG CỦA CHỒI CÚC TRONG HỆ THỐNG VI THỦY CANH HỘP NHỰA TRÒN 55

3.2.1 Ảnh hưởng của tiền xử lý IBA lên khả năng ra rễ của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 55

3.2.2 Ảnh hưởng thể tích môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 58

3.2.3 Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự tăng trưởng của cây cúc trong

hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 62

3.2.4 Ảnh hưởng của điều kiện thoáng khí lên sự tăng trưởng của cây cúc

trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 65 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC LÊN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG

VÀ KHÁNG KHUẨN TRONG MÔI TRƯỜNG VI THỦY CANH HỘP NHỰA TRÒN 70 3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng tăng trưởng của cây

cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 70 3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng kháng vi sinh vật

trong môi trường nuôi cấy vi thủy canh hộp nhựa tròn 73

3.3.3 Ảnh hưởng của nano bạc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn

đến khả năng tăng trưởng của cây cúc ở giai đoạn vườn ươm 75 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA HỆ THỐNG CHIẾU SÁNG LED LÊN SỰ GIA TĂNG SINH TRƯỞNG CÂY CÚC TRONG HỆ THỐNG VI THỦY CANH HỘP NHỰA TRÒN 78 3.4.1 Ảnh hưởng của loại ánh sáng khác nhau lên sự tăng trưởng của cây

cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn 78 3.4.2 Khả năng tích lũy chlorophyll trong lá của cây cúc trong hệ thống vi

thủy canh hộp nhựa tròn dưới các loại ánh sáng khác nhau 80

3.4.3 Khả năng thích nghi và tăng trưởng cây cúc trong hệ thống vi thủy

canh hộp nhựa tròn dưới điều kiện chiếu sáng khác nhau ở giai đoạn vườn ươm 81 3.5 HIỆU QUẢ NHÂN GIỐNG CỦA PHƯƠNG PHÁP VI THỦY CANH

SO VỚI PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO 83

3.5.1 Hiệu quả nhân giống của phương pháp vi thủy canh và phương pháp

vi nhân giống 83

3.5.2 Ảnh hưởng của các hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn và hộp nhựa

hình chữ nhật lên sự tăng trưởng của cây cúc 89

3.6 TRỒNG THỬ NGHIỆM CÂY CÚC TRONG HỆ THỐNG VI THỦY CANH RA VƯỜN ƯƠM ĐẾN GIAI ĐOẠN RA HOA 91

Chương 4 BÀN LUẬN 99

4.1 THIẾT LẬP HỆ THỐNG VI THỦY CANH 99

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TÁC ĐỘNG LÊN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG CỦA CHỒI CÚC TRONG HỆ THỐNG VI THỦY CANH HỘP NHỰA TRÒN 100

4.2.1 Tiền xử lý IBA lên khả năng ra rễ 100

4.2.2 Thể tích môi trường nuôi cấy 101

4.2.3 Mật độ mẫu cấy 103

4.2.4 Điều kiện thoáng khí 104

4.3 TÁC ĐỘNG CỦA NANO BẠC LÊN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG KHUẨN TRONG MÔI TRƯỜNG VI THỦY CANH HỘP NHỰA TRÒN 106

4.4 TÁC ĐỘNG CỦA HỆ THỐNG CHIẾU SÁNG LED LÊN KHẢ NĂNG NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG CÂY GIỐNG 109

4.5 HIỆU QUẢ NHÂN GIỐNG CỦA PHƯƠNG PHÁP VI THỦY CANH SO VỚI PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO 114

4.5.1 Hiệu quả nhân giống của phương pháp vi thủy canh và phương pháp nhân giống truyền thống 114

4.5.2 Ảnh hưởng của hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn và hình chữ nhật lên sự tăng trưởng của cây cúc 118

4.6 TRỒNG THỬ NGHIỆM CÂY CÚC TRONG HỆ THỐNG VI THỦY CANH RA VƯỜN ƯƠM ĐẾN GIAI ĐOẠN RA HOA 121

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 122

DANH MỤC CÁC CÁC CÔNG TRÌNH 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO 126

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Hệ thống vi thủy canh (microponic) 9 Hình 1.2 Quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp giâm cành 19 Hình 1.3 Nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp giâm cành 20

Hình 2.1 Cây cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat cv “Jimba”) in vitro

Hình 3.5 Cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn với thể tích

môi trường khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 60

Hình 3.6 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn với thể tích môi trường khác nhau sau 8 tuần tại vườn ươm 62

Hình 3.7 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn với mật độ khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 63

Hình 3.8 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn với mật độ khác nhau sau 8 tuần ở vườn ươm 64

Hình 3.9 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn với điều kiện thoáng khí khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 66

Hình 3.10 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn với điều kiện thoáng khí khác nhau sau 8 tuần ở vườn ươm 69

Hình 3.11 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn bổ sung nồng độ nano bạc khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 71

Hình 3.12 Hình thái lá của một số cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn bổ sung 10 ppm nano bạc sau 2 tuần nuôi cấy được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi 72

Hình 3.13 Hình thái rễ của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn bổ sung nồng độ nano bạc khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi 72

Hình 3.14 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn bổ sung nồng độ nano bạc khác nhau sau 4 tuần ở giai đoạn vườn ươm 77

Hình 3.15 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn bổ sung nồng độ nano bạc khác nhau sau 8 tuần ở giai đoạn vườn ươm 78

Hình 3.16 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn dưới các loại ánh sáng khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 80

Hình 3.17 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn dưới các loại ánh sáng khác nhau sau sau 4 tuần ở vườn ươm 82

Hình 3.18 Cây cúc nuôi cấy vi thủy canh 87

Hình 3.19 Đóng gói cây giống 88

Hình 3.20 Hình thái khí khẩu lá của cây in vitro và vi thủy canh sau 2 tuần nuôi cấy 88

Hình 3.21 Hình thái rễ của cây in vitro và vi thủy canh sau 2 tuần nuôi cấy 89

Hình 3.22 Hệ thống vi thủy canh HT và HCN1 sau 2 tuần nuôi cấy 90

Hình 3.23 Hệ thống vi thủy canh HCN2 sau 2 tuần nuôi cấy 91

Hình 3.24 Cây cúc in vitro và vi thủy canh ở giai đoạn vườn ươm 92

Hình 3.25 Các giai đoạn của cây hoa cúc nuôi cấy vi thủy canh ở vườn ươm 94 Hình 3.26 Hoa của cây cúc nuôi cấy vi thủy canh sau 16 tuần ở giai đoạn

vườn ươm 95

Hình 3.27 Cây hoa cúc nuôi cấy vi thủy canh ở giai đoạn đồng ruộng 96 Biểu đồ 3.1 Sự thay đổi thể tích môi trường nuôi cấy trong hệ thống vi thủy

canh hộp nhựa tròn sau 2 tuần nuôi cấy 61

Biểu đồ 3.2 Chiều cao cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn với

thể tích môi trường khác nhau sau 8 tuần tại vườn ươm 61

Biểu đồ 3.3 Chiều cao cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn với

mật độ khác nhau sau 8 tuần ở vườn ươm 65

Biểu đồ 3.4 Sự thay đổi độ ẩm tương đối trong hệ thống vi thủy canh với

điều kiện thoáng khí khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 67

Biểu đồ 3.5 Chiều cao cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn với

điều kiện thoáng khí khác nhau sau 8 tuần ở vườn ươm 68

Biểu đồ 3.6 Tích lũy chlorophyll của lá cây cúc trong hệ thống vi thủy canh

hộp nhựa tròn bổ sung nồng độ nano bạc khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 73

Biểu đồ 3.7 Tích lũy chlorophyll của lá cây cúc trong hệ thống vi thủy canh

hộp nhựa tròn bổ sung nồng độ nano bạc khác nhau sau 4 tuần ở giai đoạn vườn ươm 76

Biểu đồ 3.8 Tích lũy chlorophyll của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp

nhựa tròn dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 81

Biểu đồ 3.9 Chiều cao cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn

dưới các loại ánh sáng khác nhau sau 4 tuần ở vườn ươm 83

Biểu đồ 3.10 Sự thay đổi nồng độ CO2 (ppm) trong hệ thống vi thủy canh và

và vi nhân giống sau 2 tuần nuôi cấy 85

Biểu đồ 3.11 Sự thay đổi nồng độ O2 (%) trong hệ thống vi thủy canh và và

vi nhân giống sau 2 tuần nuôi cấy 85

Biểu đồ 3.12 Chiều cao cây cúc in vitro và vi thủy canh ở giai đoạn vườn

ươm 93

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn sau 2 tuần nuôi

cấy 55

Bảng 3.2 Cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn sau 4 tuần ở

giai đoạn vườn ươm 57

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên sự tăng trưởng của cây cúc

trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn sau 2 tuần nuôi cấy 59

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự tăng trưởng của cây cúc

trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn sau 2 tuần nuôi cấy 63

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của điều kiện thoáng khí lên sự tăng trưởng của cây

cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn sau 2 tuần nuôi cấy 67

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên khả năng tăng trưởng của

cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn sau 2 tuần nuôi

cấy 70

Bảng 3.7 Định danh và định lượng vi sinh vật trong môi trường vi thủy

canh hộp nhựa tròn bổ sung các nồng độ nano bạc khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 74

Bảng 3.8 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn bổ sung nồng độ nano bạc khác nhau sau 4 tuần ở giai đoạn vườn ươm 76

Bảng 3.9 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa

tròn dưới các loại ánh sáng khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 79

Bảng 3.10 Sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh và vi nhân

giống sau 2 tuần nuôi cấy 84

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của các hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn và hộp

nhựa hình chữ nhật lên sự tăng trưởng của cây cúc sau 2 tuần nuôi cấy 90

Bảng 3.12 Các giai đoạn phát triển của cây cúc vi nhân giống và vi thủy canh

ở giai đoạn vườn ươm 93

Bảng 3.13 So sánh khả năng sinh trưởng và phát triển của cây cúc vi nhân

giống và vi thủy canh ở giai đoạn ra hoa 94

Bảng 4.1 Ước lượng giá thành cho 600 cây giống của hệ thống vi thủy canh

hộp nhựa hình chữ nhật và vi nhân giống 120

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium) là một loài hoa trồng chậu và cắt

cành phổ biến trên thế giới [138] với hàng tỷ cành được bán ra mỗi năm và được ưa chuộng bởi màu sắc phong phú (trắng, vàng, xanh, đỏ, tím, hồng,…) cũng như hình dáng và kích cỡ hoa rất đa dạng Ở Việt Nam, cây hoa cúc được du nhập từ thế kỷ

XV, người Việt xem hoa cúc là biểu tượng của sự thanh cao, một trong bốn loài thảo mộc được xếp vào hàng tứ quý “tùng, cúc, trúc, mai” [21]

Khi sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến Cây hoa cúc được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp giâm cành Phương pháp nhân giống này đơn giản, tiết kiệm và được

thực hiện ở điều kiện ex vitro Tuy nhiên, phương pháp này có một số điểm hạn chế

như hệ số nhân giống thấp, chất lượng cây giống kém vì các đoạn chồi thu nhận từ cây mẹ sẽ bị thoái hóa hoặc nhiễm virus sau vài thế hệ [58] Do đó, người dân luôn cần một số lượng lớn cây giống sạch bệnh để phục vụ sản xuất

Vi nhân giống được chứng minh là phương pháp hữu hiệu để nhân nhanh giống cây trồng với số lượng lớn trong thời gian ngắn Tuy nhiên, các chồi nuôi cấy trong bình thủy tinh còn nhiều nhược điểm như khí khẩu bị dị dạng, nồng độ CO2

thấp, độ ẩm cao (95%) [139] Sự thành công của phương pháp vi nhân giống phụ thuộc rất nhiều vào khả năng thuần hóa cây giống trong điều kiện vườn ươm Trong

điều kiện in vitro, cây giống đã quen với những điều kiện lý tưởng được kiểm soát

trong quá trình sinh trưởng, đến giai đoạn thích nghi, cây giống phải chống chịu với nhiều tác nhân bất lợi bên ngoài như: nấm bệnh, nhiệt độ thay đổi, độ ẩm thấp, nghèo dinh dưỡng,… Sự thay đổi đột ngột đó làm cho tỷ lệ sống sót của cây giống giảm đáng kể Một số nghiên cứu cho thấy, các điều kiện ngoài tự nhiên đã tác động đến sự thay đổi sinh lý bên trong cơ thể thực vật; điều đó dẫn đến những hình thái, sinh lý và cấu trúc giải phẫu bất thường khi cây thích nghi Điển hình như khí khẩu

không hoạt động, hệ thống rễ yếu, tầng biểu bì mỏng [73], sự thay đổi hàm lượng đường, tinh bột,… trong giai đoạn thích nghi [131] Vì vậy, hiểu rõ sự thay đổi khác nhau trong sinh lý, sinh hóa cây trồng là vấn đề quan trọng để đưa ra những biện pháp cải thiện khả năng sống sót và thích nghi của cây giống ngoài vườn ươm

Hệ thống vi thủy canh (microponic system) là hệ thống nhân giống kết hợp giữa vi nhân giống (micropropagation) và thủy canh (hydroponic), đây là một phương pháp có tiềm năng trong sản xuất cây giống Phương pháp này kế thừa nhiều ưu điểm của kỹ thuật thủy canh và phương pháp vi nhân giống, có thể khắc phục một số hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống như: hiện tượng thủy tinh thể, giảm bớt sự ức chế của ethylen do thoáng khí tốt, Hahn và cs (1996,

1998, 2000) đã báo cáo rằng, cây hoa cúc trong hệ thống này sinh trưởng mạnh hơn

so với hệ thống nuôi cấy in vitro [45-47] Hệ thống vi thủy canh với giá thể film

nylon đã được nghiên cứu bởi Nhut và cs (2005, 2005b) trên một số cây trồng (cúc, hoa chuông, bibi,…) và bước đầu cũng cho thấy tính khả quan của phương pháp này như cây cho sự sinh trưởng và phát triển tốt, nuôi cấy không cần điều kiện vô trùng, không cần bổ sung đường, agar vào môi trường nuôi cấy, dễ thực hiện và áp dụng thực tiễn Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ mới đưa ra mô hình thí nghiệm, khả năng áp dụng thực tiễn chưa cao và khó đưa vào sản xuất thương mại [9, 87] Theo xu hướng hiện nay, hệ thống này được nghiên cứu cải tiến theo hai xu hướng: (1) hiện đại hóa các thiết bị nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy; (2) đơn giản hóa với các thiết bị, vật liệu đơn giản, rẻ tiền nhưng vẫn đảm bảo được sự phát triển tốt của cây, nâng cao chất lượng cây giống, dễ dàng áp dụng trên quy mô lớn

Vì vậy, xu hướng thứ hai được chúng tôi lựa chọn nhằm đơn giản quy trình

sản xuất cũng như dễ ứng dụng vào thực tiễn sản xuất Đề tài “Hoàn thiện hệ

thống nhân giống vi thủy canh cây hoa cúc trắng (Chrysanthemum

morifolium)” được thực hiện nhằm đánh giá khả năng tăng trưởng của cây hoa cúc

trong hệ thống vi thủy canh, đánh giá được hiệu quả nhân giống, đưa ra một mô hình sản xuất cây giống trong hệ thống vi thủy canh phù hợp và có thể nhân giống

với số lượng lớn Bên cạnh đó, vai trò của ánh sáng đơn sắc cũng như nano bạc bổ sung vào môi trường nuôi cấy cũng được nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài

Đề tài này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố (tiền xử lý auxin, thể tích, mật độ, điều kiện thoáng khí, nano bạc, ánh sáng, ) lên sự tăng

trưởng của cây cúc trắng (Chrysanthemum morifolium) trong hệ thống vi thủy canh

và khả năng thích nghi, tăng trưởng và ra hoa ở giai đoạn vườn ươm Từ những kết quả của nghiên cứu này, luận án sẽ hoàn thiện hệ thống nhân giống vi thủy canh cây hoa cúc trắng

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về việc đưa ra hệ thống nhân giống vi thủy canh cây hoa cúc trắng

Đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực nhân giống ở thực vật

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Đây là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực nhân giống thực vật Đề tài đã đề xuất mô hình vi thủy canh phù hợp, tạo được nguồn cây giống đồng nhất với số lượng lớn

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu

Hệ thống vi thủy canh với giá thể film nylon được sử dụng để nghiên cứu quá

trình tăng trưởng của cây hoa cúc trắng (Chrysanthemum morifolium)

Phạm vi nghiên cứu của đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá khả năng tăng trưởng của cây hoa cúc trắng trong hệ thống vi thủy canh dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau, vai trò của nano bạc trong vấn đề kháng khuẩn cũng như ánh sáng đơn sắc trong nâng cao chất

lượng cây giống; qua đó, đưa ra hệ thống vi thủy canh lớn hơn, dễ dàng đóng gói, vận chuyển và thương mại

Ngoài ra, đề tài còn tiến hành trồng thử nghiệm trên điều kiện đồng ruộng để đánh giá hiệu quả của hệ thống vi thủy canh so với phương pháp vi nhân giống hiện nay

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện in vitro và đồng ruộng tại

Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Công ty Giống cây trồng miền Nam (Huyện Lâm Hà, Tỉnh Lâm Đồng) từ tháng 10 năm 2014 đến tháng 4 năm 2017

Những đóng góp mới của luận án

Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam đã xây dựng được quy trình nhân giống của cây cúc trắng từ giai đoạn cây giống trong hệ thống vi thủy canh đến giai đoạn cây thương phẩm và trồng thử nghiệm ở giai đoạn đồng ruộng

Đề tài đã đánh giá được vai trò của nano bạc lên sự gia tăng khả năng tăng trưởng cũng như kháng lại một số vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy vi thủy canh

Đề tài đã ứng dụng hệ thống chiếu sáng đơn sắc trong nâng cao chất lượng cây giống

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỦY CANH

1.1.1 Khái niệm

Thủy canh thường được định nghĩa như là “trồng cây trong nước” Tuy nhiên, thật ra việc cung cấp nuớc và dung dịch dinh dưỡng cho cây có thể trực tiếp qua tiếp xúc giữa rễ và dung dịch như định nghĩa ở trên nhưng cũng có thể gián tiếp qua các giá thể trơ nên chúng ta có thể mở rộng định nghĩa thuỷ canh là “trồng cây không sử dụng đất” [71]

Việc trồng cây không có đất thật sự đem lại rất nhiều thuận lợi Khi sử dụng một môi trường sạch khuẩn, tất nhiên ta sẽ không phải lo lắng cho việc trừ cỏ dại, trừ sâu và côn trùng có hại trong đất [111] Hơn nữa khi dùng kỹ thuật thuỷ canh, cây trồng sẽ có được môi trường sống đầy đủ các thành phần dinh dưỡng thiết yếu

Do vậy, cây sẽ sinh trưởng và phát triển nhanh hơn, việc canh tác cũng đơn giản hơn đối với rau và cây hoa Một thuận lợi lớn của kỹ thuật thủy canh là cho phép thiết lập hệ thống nuôi trồng tự động Khi sử dụng hệ thống tự động, người làm vườn có thể linh hoạt được thời gian chăm sóc cây trồng [115], [118]

Đặc biệt, do đặc điểm của kỹ thuật thuỷ canh là không cần đất nên đây chính

là giải pháp cho ngành nông nghiệp ở những đất nước vốn có ít đất canh tác - các thành phố lớn hoặc vùng đất cằn cỗi Các nước tiên tiến đã nhanh chóng ứng dụng

kỹ thuật này để sản xuất rau sạch, cây kiểng Trong tương lai, khi dân số ngày một gia tăng, đời sống được nâng cao, đất đai trở nên khan hiếm, thì kỹ thuật thủy canh

sẽ dần thay thế phương pháp trồng trọt truyền thống Vì không chỉ đem lại những món lợi nhuận khổng lồ cho ngành nông nghiệp, kỹ thuật này còn giúp giữ gìn môi trường được trong sạch, đây chính là mục tiêu được coi trọng hàng đầu để góp phần nâng chất lượng cuộc sống của con người [108]

1.1.2 Các yêu cầu cơ bản của hệ thống thuỷ canh

Trong một dung dịch, hoặc môi trường trơ, việc duy trì độ acid hay độ kiềm (dựa vào pH), độ dẫn điện (Electrical Conductivity – EC) trong một khoảng giá trị phù hợp với hệ thống rễ của thực vật được gọi là hoạt động đệm Việc này cần phải được thực hiện nhân tạo trong các hệ thống thủy canh Ở bất kỳ hệ thống thủy canh nào, các yêu cầu cơ bản sau cần được duy trì ở mức độ thích hợp [128]:

– Duy trì pH của dịch dinh dưỡng trong khoảng 5,8 đến 6,5 và độ dẫn điện EC trong khoảng 1,5 đến 2,5 dS/m, các khoảng giá trị này thích hợp cho sự tăng trưởng của cây Nếu giá trị pH và EC chệch ra khỏi các khoảng này sẽ làm giảm khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và sẽ làm tổn thương rễ cây Thực vật là những vật chỉ thị tốt nhất điều kiện dinh dưỡng Nhìn vào những triệu chứng rối loạn dinh dưỡng ở thực vật để điều chỉnh dịch dinh dưỡng cho phù hợp

– Tránh những biến động nồng độ dịch dinh dưỡng đột ngột, vì những biến động này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến độ pH và EC

– Duy trì nhiệt độ dung dịch tốt Nếu nhiệt độ tăng, cây tăng hô hấp và đòi hỏi nhiều oxygen Tại thời điểm đó, nồng độ oxygen hoà tan giảm Điều này đặc biệt quan trọng đối với việc nuôi cấy trong nhà kính hay nhà lưới, do bên trong nhiệt độ tăng cao trong suốt buổi trưa Phải tiến hành nhiều biện pháp để chống lại sự tăng nhiệt này

– Luôn đảm bảo rằng có nhiều oxygen hoà tan trong dịch dinh dưỡng để rễ có thể hấp thu tốt Thiếu oxygen sẽ làm giảm khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và do

đó làm giảm sản lượng cây Trong hệ thống đóng, nếu dung dịch thu nhận lại được cho chảy vào thùng từ một độ cao nhất định thì sẽ có sự thông khí tự nhiên

– Trong kỹ thuật ngâm rễ, phải duy trì đủ không gian bên trên dịch dinh dưỡng

do sự tăng trưởng nhanh và số lượng rễ phụ thuộc vào không khí, 2/3 đầu rễ non phải ở trong không khí và phần còn lại phải chìm trong dung dịch

– Trong kỹ thuật ngâm rễ, trong suốt quá trình phát triển, khi mức dung dịch trong thùng chứa giảm, nồng độ ion sẽ tăng cao, điều này ảnh hưởng không tốt đến

sự tăng trưởng của cây Nếu quan sát thấy điều này, phải loại bỏ dung dịch cũ và thay bằng dung dịch mới

– Phải đảm bảo đủ ánh sáng cho các cây nuôi trồng thủy canh Ánh sáng và tất

cả các yêu cầu khác cũng giống như khi nuôi trồng trên đồng ruộng

– Luôn phải sử dụng hạt giống và vật liệu nuôi trồng sạch bệnh, sạch sâu bọ cho hệ thống thủy canh Loại bỏ hoặc hủy bất kỳ cây nào nhiễm bệnh càng sớm càng tốt

– Nếu quan sát thấy có các sinh vật ký sinh trên giá thể rắn, phải loại bỏ các cây trong đó và tiến hành khử trùng môi trường tăng trưởng Nước cung cấp cũng cần phải đảm bảo sạch các sinh vật ký sinh

– Tảo có thể phát triển trong hệ thống thủy canh và ngăn cản các ống nhỏ dẫn dịch thủy canh Sử dụng các ống màu đen để tránh các vấn đề như vậy Giữa các lần nuôi trồng, phải rửa sạch hệ thống bằng nước chlor loãng Sau khi rửa nước chlor, rửa qua bằng nước sạch trước khi trồng các cây mới

– Phải có đủ chỗ cho cây tăng trưởng, và khi thân mềm phát triển phải có giá thể đỡ thân

– Trong kỹ thuật kết hợp mở, có khả năng các chất dinh dưỡng bị lắng lại khi cung cấp nước Do đó, có thể bổ sung dịch dinh dưỡng liên tục thay vì bổ sung nước và chất dinh dưỡng riêng

1.1.3 Dung dịch dinh dưỡng thủy canh

Tất cả các thành phần dinh dưỡng cần thiết được cung cấp cho cây ở dạng dung dịch, chứa muối và phân bón tan trong nước Phương pháp thủy canh cho phép người canh tác kiểm soát các thành phần cần thiết bằng cách điều chỉnh hay thay đổi dung dịch dinh dưỡng cho phù hợp với từng giai đoạn tăng trưởng của cây

và cung cấp chúng với một lượng cân bằng Các chất dinh dưỡng hiện diện ở dạng ion trong dung dịch thủy canh, cây trồng không cần phải tìm kiếm hay cạnh tranh với các sinh vật khác như khi trồng trong đất Do đó, việc tối ưu hoá điều kiện dinh dưỡng của hệ thống thủy canh cũng dễ hơn nhiều so với trong đất Dung dịch dinh dưỡng dùng cho dung dịch thủy canh phải đáp ứng được những điều kiện sau:

Độ pH: Giá trị pH tối thích nằm trong khoảng 5,5 – 6,5 [119] Giá trị pH càng lệch ra khỏi khoảng này thì càng có ảnh hưởng tiêu cực lên hệ thống thủy canh, pH trên 7,5 sẽ làm giảm khả năng hấp thu sắt và có thể xảy ra hiện tượng úa vàng thân,

pH dưới 6,0 sẽ làm giảm mạnh khả năng hoà tan acid phosphoric, ion calcium và mangan Có thể sử dụng các chất đệm hoá học để giữ ổn định giá trị pH

Độ dẫn điện: Giá trị độ dẫn điện (EC) tốt nhất là trong khoảng 1,5 – 2,5 dS/m

[65] Giá trị EC cao hơn sẽ ngăn cản sự hấp thu chất dinh dưỡng, EC thấp sẽ ảnh hưởng đến sức sống và năng suất cây Khi cây hấp thu chất dinh dưỡng và nước từ dung dịch, tổng nồng độ muối và EC đều thay đổi

Tính dung hợp của các thành phần trong dung dịch dinh dưỡng: Tránh những loại công thức pha chế dung dịch có chứa nhiều tạp chất như cát, đất sét, hay bùn; cũng cần phải tránh các công thức pha chế có chứa các muối không hoà tan hoặc hoà tan kém, hay có chứa các chất tương tác với nhau tạo ra chất không tan [128]

1.2 VI THỦY CANH

1.2.1 Sơ lược về phương pháp vi thủy canh

Phương pháp vi nhân giống (nhân giống in vitro) ra đời tạo nên một cuộc cách

mạng trong lĩnh vực nhân giống thực vật, giúp cung cấp nhanh với số lượng lớn các giống cây quý theo yêu cầu mà vẫn giữ được đặc tính di truyền của thực vật Tuy nhiên, những giới hạn của điều kiện vi nhân giống làm giảm sức sống của cây nuôi

cấy mô Trong môi trường nuôi cấy in vitro truyền thống, độ ẩm tương đối cao,

nhiệt độ không đổi, cường độ dòng photon quang hợp thấp, nồng độ CO2 dao động lớn, sự hiện diện của đường, muối và chất điều hoà tăng trưởng ở nồng độ cao trong môi trường, sự tích lũy khí ethylen và những chất độc khác, vi sinh vật không hiện diện trong môi trường [60] Những điều kiện trên ngăn cản sự thoát hơi nước, làm giảm quang hợp, giảm hấp thu nước, chất khoáng và CO2 và thúc đẩy hô hấp trong

tối Điều này dẫn đến tỷ lệ cây chết khá cao khi chuyển ra vườn ươm

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu cải tiến để tìm ra một hệ thống vi nhân giống mới, trong đó môi trường nuôi cấy có thể được kiểm soát một

cách thuận lợi Hệ thống nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng cũng đã ra đời với mục

đích khắc phục một số nhược điểm của phương pháp truyền thống Chẳng hạn như việc hạn chế được sự lây nhiễm nhờ không sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy Thay vào đó, phương pháp quang tự dưỡng chú trọng điều khiển điều kiện vật

lý của môi trường như hàm lượng CO2, chất lượng ánh sáng, quang kỳ, nước Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế do tiêu tốn nhiều chi phí cho hệ

thống kiểm soát tự động các điều kiện môi trường và công lao động cấy chuyền

Vi thủy canh (microponic) là một phương pháp sản xuất cây giống kết hợp vi nhân giống (micropropagation) và thủy canh (hydroponic) Trong đó, mô thực vật được cung cấp chất dinh dưỡng ở quy mô nhỏ Phương pháp này bước đầu đã thể hiện những đặc tính ưu việt và có thể khắc phục nhiều nhược điểm của các hệ thống

vi nhân giống in vitro truyền thống [45]

Trong các nghiên cứu trước đây của Nhut và cs (2005b) hệ thống vi thủy canh (Hình 1.1) [87] đã áp dụng thành công trên các đối tượng cúc Trong nghiên cứu này, hệ thống vi thủy canh được thực hiện với giá thể film nylon ống và vật chứa là các hộp nhựa tròn Đại Đồng Tiến Các chồi cây có thể tiền xử lý với auxin

Hình 1.1 Hệ thống vi thủy canh (microponic)

1.2.2 Ưu điểm của phương pháp vi thủy canh

Vi thủy canh lấy ý tưởng từ phương pháp thủy canh để ứng dụng cho giai đoạn cuối của quá trình nhân giống Đặc điểm của phương pháp này là điều kiện nuôi cấy không cần vô trùng, có thể khắc phục một số thiệt hại do nhiễm nấm, khuẩn Vì thế,

có thể giảm đáng kể chi phí đầu tư vào hộp vô trùng, các cơ sở hạ tầng khác và việc điều khiển môi trường nuôi cấy cũng đơn giản hơn phương pháp quang tự dưỡng [87]

Hơn nữa, do điều kiện môi trường của hệ thống vi thủy canh là gần với điều kiện tự nhiên nên việc thuần hoá cây con ngoài vườn ươm thuận lợi hơn rất nhiều

Trong hệ thống vi thuỷ canh, các chồi cây in vitro được thuần hoá dần trong điều

kiện gần điều kiện tự nhiên, cụ thể là môi trường không vô trùng, độ thoáng khí cao, giúp cho cây có thể tự quang hợp để lấy nguồn carbon từ CO2, thay vì từ đường như hệ thống vi nhân giống truyền thống Vì vậy, khi đến giai đoạn ra vườn ươm, cây hoàn toàn có thể thích ứng kịp thời với môi trường mới

Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp nhân giống in vitro Nó có thể

rút ngắn bớt giai đoạn trong quy trình nhân giống bằng việc kết hợp giai đoạn ra rễ

với giai đoạn thuần dưỡng ex vitro thành giai đoạn ra rễ in vitro Do đó, sẽ rút ngắn

được thời gian nhân giống, tiết kiệm được chi phí sản xuất cũng như chi phí về điện năng, tiền công nhân viên và các chi phí phát sinh khác [45 – 47]

Phương pháp này không sử dụng đường, agar mà đây là một trong các nguyên nhân chính làm gia tăng giá thành sản phẩm nên phương pháp này sẽ làm giảm được chi phí sản xuất Hơn nữa, do không sử dụng đường trong quá trình nuôi cấy nên sẽ không cần vô trùng và giảm được chi phí cho việc hấp vô trùng môi trường

và công lao động cho việc cấy chuyền, cũng như giảm được tỷ lệ nhiễm

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về phương pháp thủy canh in vitro và vi thủy canh

1.2.3.1 Phương pháp thủy canh in vitro

Năm 2004, Nhut và cs đã nghiên cứu về hình thành củ bi trực tiếp của cây

khoai sọ (Colocasia esculenta spp.) cũng như cảm ứng tăng trưởng của cây con ở

giai đoạn vườn ươm trong hai hệ thống (1) nuôi trồng trong đất (2) và nuôi trồng trong hệ thống thủy canh hộp xốp sau 15 hoặc 30 ngày [93] Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ sống sót, chiều cao cây và số lá của cây trồng trong hệ thống thủy canh cao hơn trong nuôi cấy đất Các cây giống khoai sọ được nuôi cấy trong hệ

thống thủy canh cũng có hiệu quả cao hơn đối với những cây trồng trong đất khi chúng được chuyển đến đồng ruộng

Nguyen và cs (2005) đã sử dụng hệ thống thủy canh in vitro trong sản xuất PLB của cây địa lan (Cymbidium spp.) Đây là loài cây ưa ẩm và có khả năng chịu

ẩm tốt nên rất phù hợp với hệ thống mới Trong cùng thể tích môi trường, hệ thống

thủy canh in vitro với giá đỡ ở độ cao 1 cm (nghĩa là gần mặt dịch lỏng hơn) cho

PLB có khối lượng tươi cao hơn so với hệ thống có giá đỡ cách 2 cm Hơn nữa, khi

so sánh ảnh hưởng của các thể tích môi trường lên sự hình thành PLB trong hệ thống có giá đỡ ở độ cao 1 cm thì nhận thấy rằng môi trường có thể tích 70 ml cho

trọng lượng PLB tươi cao nhất Qua những kết quả ban đầu, hệ thống thủy canh in

vitro mới tỏ ra rất thích hợp với mục tiêu này Đây là hệ thống “thủy canh trong ống

nghiệm” được thiết lập lần đầu tiên và được công bố trên các tạp chí quốc tế [85]

Dương Tấn Nhựt và cs (2005) đã nghiên cứu phương pháp thủy canh in vitro

trong việc nâng cao chất lượng cây hoa African violet phục vụ người trồng hoa [8] Sau 30 ngày nuôi cấy, các cây trong hệ thống thủy canh trực tiếp bắt đầu trổ hoa, hoa có màu sắc đẹp và bền (từ 2 đến 3 tháng) So với nghiệm thức trồng cây trong đất, sau 30 ngày vẫn chưa ra hoa, hoa của các cây trồng trong đất có tuổi thọ ngắn hơn Riêng về bộ lá, các cây African violet trong hệ thống thủy canh trực tiếp có bộ

lá dày, rậm, xanh tốt, không bị các biểu hiện thường gặp như thối nhũn ở phương pháp trồng và chăm sóc thông thường Tuy nhiên, do không có giá thể, lá cây African violet trong hệ thống thủy canh có xu hướng mọc ngả xuống (theo hướng trọng trường), không thể xoè rộng như trong trường hợp trồng trong đất Các cây thí nghiệm bắt đầu có nụ, tỷ lệ nụ của các cây trong hệ thống thủy canh trực tiếp cao

hơn so với các cây trồng ngoài đất sau 30 ngày Phương pháp thủy canh in vitro

trong sản xuất của khoai tây bi cũng được nghiên cứu bởi Nhut và cs (2006) [88]

1.2.3.2 Phương pháp vi thủy canh

Thuật ngữ vi thủy canh (microponic) lần đầu tiên được mô tả bởi Hahn và cs (1996) trên đối tượng cây hoa cúc để xem liệu nó có thể đơn giản hóa các giai đoạn

tăng trưởng thực vật, ra rễ, thích nghi với môi trường và nhân giống với kết quả tốt

hơn so với hệ thống in vitro thông thường Kết quả cho thấy rằng, sự tăng trưởng

của cây hoa cúc trong hệ thống vi thủy canh cao hơn nhiều so với cây cúc trong hệ

thống in vitro [45] Trong hệ thống này, cây có thể tăng trưởng nhanh hơn và khỏe

mạnh hơn mà không có sự thoái hóa, cũng không đòi hỏi phải tiến hành những bước

nuôi cấy phức tạp như trong nuôi cấy in vitro Ngoài ra, nó còn tiết kiệm thời gian

và công lao động, vì các giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, nhân số lượng, ra chồi và ra rễ được tiến hành liên tiếp [45]

Hệ thống này cũng được nghiên cứu trên đối tượng là cây hoa cúc

(Chrysanthemum grandiflorum ‘Bongwhang’) nhằm mục đích làm giảm một số khó khăn trong nuôi cấy in vitro như hiện tượng thủy tinh thể, giúp đơn giản hóa quá

trình nuôi cấy và đã thu được một số kết quả khả quan Hahn và cs (1998, 2000) đã báo cáo rằng, cây hoa cúc trong hệ thống vi thủy canh sinh trưởng mạnh hơn so với

cây cúc trong hệ thống in vitro với thời gian ngắn hơn, thể hiện ở cả khối lượng

tươi, khối lượng khô, kích thước lá, số lượng lá, mật độ khí khẩu và tốc độ quang hợp [46 – 47]

Ra rễ thường là giai đoạn cuối của quá trình vi nhân giống trước khi đưa cây

ra vườn ươm Thông thường việc ra rễ vẫn còn được thực hiện trên môi trường vô trùng Nhưng gần đây đã có những nghiên cứu mới thực hiện việc ra rễ trong điều kiện không còn vô trùng đã thu được một số kết quả khả quan trên đối tượng cây hoa cúc, đây là một bước tiến xa của việc ứng dụng kỹ thuật thủy canh vào lĩnh vực nuôi cấy mô Nhut và cs (2005b) đã chứng minh hiệu quả của phương pháp vi thủy canh so với phương pháp vi nhân giống trong sản xuất cây hoa cúc Trong nghiên cứu này, các chồi cúc (3 cm) được tiền xử lý với NAA (α-Naphtaleneacetic acid) ở các nồng độ khác nhau (100, 500 và 1000 ppm) trong khoảng thời gian 10 – 30 phút Kết quả thực nghiệm cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa những chồi được tiền xử lý với NAA (500 ppm) trong thời gian 20 phút và những chồi cúc ở các nồng độ khác và không được tiền xử lý [87]

Đối với cây hoa chuông Nhựt và cs (2005) cũng đã chỉ ra rằng các cây trong

hệ thống vi thủy canh có chiều cao, khối lượng tươi cao hơn và số lá nhiều hơn so với hệ thống bình thủy tinh sau 6 tuần nuôi cấy [9] Ngoài ra, các cây vi thủy canh

có bộ lá xanh tốt hơn, thân lớn hơn so với các cây trong hệ thống bình thủy tinh Khả năng tạo rễ ở các cây vi thủy canh mạnh hơn, cụ thể ở tuần thứ 2 đã có sự xuất hiện rễ, sau 3 tuần bộ rễ phát triển mạnh so với cây trong hệ thống đối chứng phải sau 3 tuần mới bắt đầu xuất hiện rễ Tất cả các cây được chuyển ra vườn ươm có tỷ

lệ sống sót cao (khoảng 80% cây từ hệ thống bình thuỷ tinh, và 98% cây từ hệ thống

vi thuỷ canh)

Như những bằng chứng rõ ràng trong thí nghiệm này, hệ thống vi thủy canh có nhiều ưu điểm so với vi nhân giống truyền thống ở nhiều khía cạnh khác nhau

Không giống với vi nhân giống, quá trình tăng trưởng chồi, ra rễ in vitro trong hệ

thống vi thủy canh có thể xảy ra khi điều kiện môi trường tối ưu Hầu hết, cây vi thủy canh không cần thời gian nhất định để ra rễ và thích nghi (quá trình này được xem là quan trọng nhưng phức tạp và tốn thời gian trong hệ thống vi nhân giống

truyền thống) Một khi chồi cúc in vitro được chuyển sang hệ thống vi thủy canh,

quá trình tăng trưởng chồi, ra rễ và thích nghi xảy ra cùng lúc, không có sự biến dạng và biến đổi chức năng

1.2.4 Những hạn chế của nghiên cứu trước đây

Những nghiên cứu trước đây của Hahn và cs (1996, 1998, 2000) thực hiện trên đối tượng cây hoa cúc đã chỉ ra rằng cây hoa cúc trong hệ thống vi thủy canh tăng

trưởng mạnh hơn so với hệ thống nuôi cấy in vitro [45 – 47] Trong nghiên cứu này, các tác giả đã sử dụng kỹ thuật lớp mỏng dinh dưỡng cho hệ thống vi thủy canh trên giá thể trơ là rockwool, dung dịch dinh dưỡng được hoàn lưu nhờ vào một máy bơm nhỏ Điều kiện môi trường (nhiệt độ, nồng độ CO2 và độ ẩm của không khí, pH, EC

và nhiệt độ môi trường) được kiểm soát Chính vì vậy, sự tăng trưởng của cây vẫn cần yếu tố vô trùng và điều khiển tự động của máy bơm

Trong nghiên cứu của Nhut và cs (2005b) đưa ra mô hình vi thủy canh với giá

thể film nylon cho thấy, cây tăng trưởng tốt hơn so với hệ thống nhân giống in vitro

[83] Việc tiền xử lý ra rễ với NAA trong thời gian 20 phút cho số rễ cũng như các chỉ tiêu tăng trưởng khác tối ưu hơn so với các auxin khác [87] Tuy nhiên, những nghiên cứu này chỉ đưa ra mô hình ở phòng thí nghiệm chưa được ứng dụng vào thực tiễn, đơn giản hóa quy trình nhân giống phục vụ sản xuất với số lượng cây giống lớn cụ thể, dễ thực hiện bởi người dân và dễ dàng vận chuyển

Vi thủy canh là một phương pháp chưa có nhiều nghiên cứu trên nhiều đối tượng với các hệ thống khác nhau Theo xu hướng hiện nay, hệ thống này được nghiên cứu cải tiến theo hai xu hướng: một là hiện đại hóa với các thiết bị nhằm tối

ưu hóa được môi trường và đưa ra điều kiện tối ưu cho sự phát triển của cây; hai là các nghiên cứu nhằm đơn giản hóa cách thực hiện với các thiết bị, vật liệu đơn giản,

rẻ tiền nhưng vẫn đảm bảo được sự phát triển tốt của cây và nâng cao chất lượng cây giống, dễ dàng áp dụng trên quy mô lớn

Vì vậy, để đơn giản quy trình sản xuất cũng như dễ ứng dụng nên xu hướng thứ hai được chúng tôi tiến hành nghiên cứu Luận án này được thực hiện nhằm khảo sát tác động của một số yếu tố lên sự tăng trưởng của cây hoa cúc trong hệ thống vi thủy canh và qua đó đưa ra mô hình sản xuất cây giống với số lượng lớn, sạch bệnh và có chất lượng tốt phục vụ sản xuất, giúp người dân dễ thực hiện, đơn giản trong quá trình đóng gói, vận chuyển hướng tới phân phối cây giống đến người dân và xa hơn là xuất khẩu

1.3 SƠ LƯỢC VỀ CÂY HOA CÚC

Cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium) thuộc chi Chrysanthemum, họ

Asteraceae, là một trong những loại cây trồng làm cảnh lâu đời và quan trọng trên thế giới, có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nó là loại hoa thương phẩm rất được ưa chuộng ở phương Đông và phương Tây, không chỉ vì sự đa dạng về màu sắc và hình dáng mà còn vì dễ nhân giống, dễ điều khiển sự ra hoa theo ý muốn và giữ được tươi lâu Chính vì vậy, cây cúc trở thành loại hoa cắt cành thương phẩm

phổ biến trên thế giới, đứng thứ hai sau cây hoa hồng [125] Giá trị thương mại của cây hoa cúc vào khoảng 145 triệu USD tại Mỹ năm 2009 [130] Cúc là cây có giá trị kinh tế cao, do đó nó được trồng hầu hết ở các vùng trên thế giới

Cúc không cần phải chăm sóc nhiều, thậm chí có thể chịu được một vài điều kiện khắc nghiệt và mang đến cảnh quan đẹp mắt, dễ chịu Cúc có thể được trồng trong chậu nhỏ, to hay được trồng thành cụm lớn ngoài vườn rồi lấy hoa để trang trí Do vậy, ngày càng nhiều những thí nghiệm nhằm cải tiến chất lượng của cây hoa cúc được tiến hành, làm cho nó ngày một đa dạng về màu sắc và hình dạng, cũng như tăng khả năng chống chịu nấm bệnh và thích nghi tốt với môi trường

Có thể nói, cúc đã và đang mang lại nguồn lợi rất lớn cho các nhà kinh doanh Ngoài giá trị như một cây cảnh, cúc còn là một loại dược liệu rất tốt Ở Việt Nam,

từ xa xưa, người dân đã biết dùng cánh hoa cúc tươi hoặc phơi khô để pha trà hay đơn giản là nấu nước uống Một số bài thuốc đông y còn sử dụng cúc như một vị thuốc có tác dụng sơ phong tiết nhiệt, làm nhẹ đầu mắt, cảm cúm, hiệu quả kháng

viêm và cải thiện hệ miễn dịch của hoa cúc có thể rút ngắn thời gian bệnh và làm giảm các triệu chứng ho, sốt, nhức đầu, nghẹt mũi [18]

1.3.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây hoa cúc tại Đà Lạt – Lâm Đồng

Năm 2010, Lâm Đồng mới có 5.127 ha trồng hoa, sản lượng trên 1,1 tỷ cành, nhưng đến năm 2015 đã tăng lên 7.594 ha và đạt hơn 2,334 tỷ cành Thị trường tiêu thụ hoa Lâm Đồng chủ yếu nội tiêu (89,3%), cung cấp cho Nha Trang, Đà Nẵng, các tỉnh miền Đông Nam Bộ, Hà Nội và lớn nhất là Thành phố Hồ Chí Minh (TP.HCM) Hoa cúc đã xuất sang Nhật (59,28%), Úc (3,29%), Trung Quốc (1,62%) Xuất sang Hàn Quốc, Bỉ, Thái Lan, Philippin, Singapore, Pakistan, Nga, Campuchia,… chỉ với lượng nhỏ Hoạt động xuất khẩu chủ yếu tập trung ở các doanh nghiệp có vốn đầu tư nước ngoài và các công ty trong nước có khả năng khai thác thị trường tốt như Đà Lạt Hasfarm, Bonnie Farm, Apolo, Innova,… Đà Lạt Hasfarm xuất khẩu chiếm tới 90% tổng lượng hoa xuất khẩu của tỉnh Năm 2010, Lâm Đồng xuất khẩu 180,1 triệu cành, giá trị 21,974 triệu USD; năm 2014, xuất

215 triệu cành đạt giá trị 28,670 triệu USD; năm 2015, xuất 250 triệu cành (10,7%

tổng sản lượng), giá trị 26 triệu USD [15]

Là trung tâm trồng hoa lớn nhất tỉnh; diện tích trồng hoa của Đà Lạt tăng từ 85

ha (1995) lên 4.799 ha (2015), chiếm 63,2% diện tích và 67% lượng hoa Lâm Đồng với những vùng trồng hoa chuyên canh của Đà Lạt như khu vực Thái Phiên (phường 12), An Sơn (phường 4), Vạn Thành - Cam Ly (phường 5), Hà Đông (phường 8) xã Xuân Thọ, Xuân Trường và phát triển mạnh ra các vùng phụ cận với huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương, Di Linh Hiện nay, hoa Đà Lạt có trên

400 loài hoa với hàng ngàn giống hoa bản địa từ lâu đời hay xuất xứ từ châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Thái Lan,…), châu Âu (Pháp, Hà Lan), châu Mỹ, châu Phi, châu Úc Năm 2011, sản phẩm hoa Đà Lạt được Cục sở hữu trí tuệ cấp nhãn hiệu chứng nhận độc quyền “Hoa Đà Lạt”

Đà Lạt là nơi lý tưởng cho sinh trưởng và phát triển của các giống hoa cúc nên một số công ty nước ngoài đã lập công ty hoặc liên doanh sản xuất ở đây như

Chánh Đài Lâm, Hasfarm, chỉ riêng công ty Hasfarm (100% vốn đầu tư nước ngoài) chuyên sản xuất hoa cúc cắt cành cũng như các loại cúc giống, đặc biệt là hoa cúc chùm đã cung cấp 60% sản lượng hoa cho TP.HCM và một số tỉnh phía Bắc

Nếu xét về cơ cấu chủng loại tất cả các loại hoa thì trước những năm 1997 diện tích hoa hồng nhiều nhất chiếm 31% nhưng đến nay diện tích trồng hoa cúc đã vượt lên chiếm khoảng 35% (với diện tích khoảng 2.500 ha), trong đó hoa hồng chỉ còn 29,4% [15] Theo điều tra của Công ty cổ phần Hoa Đại Việt (Lâm Đồng), việc canh tác hoa và sản xuất cây giống cúc tại Đà Lạt trong những năm qua vẫn chưa đáp ứng về công nghệ Cụ thể, nhà kính với khung tre (90%), nông dân tự trao đổi kinh nghiệm sản xuất với nhau (60%) và nguồn giống tự gieo ươm và mua tại các

cơ sở nhỏ lẻ (hơn 70%) Chính vì vậy, chất lượng cây giống không đảm bảo, dễ bị sâu bệnh, cây mẹ được sử dụng nhiều lần cho giâm ngọn dẫn đến thoái hóa giống Với diện tích canh tác ngày càng một gia tăng cũng như đáp ứng các nhu cầu khắt khe về xuất khẩu thì chất lượng cây giống ban đầu và có thể sản xuất cây giống với quy mô lớn, sạch bệnh dễ vận chuyển, thương mại hóa và nâng cao giá thành của cây giống là vấn đề rất đáng được quan tâm

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CÂY HOA CÚC

1.4.1 Các phương pháp nhân giống truyền thống

1.4.1.1 Phương pháp gieo hạt

Gieo hạt là phương pháp dễ thực hiện, có thể mua hạt bên ngoài thị trường sau

đó tiến hành lên luống, làm đất rồi gieo hạt Tuy nhiên, đa số hoa cúc đều rất ít hoặc không có hạt, cây con hầu hết không có bông đẹp như cây mẹ, thời gian sinh trưởng chậm và thường lâu có hoa Phương pháp này hiện nay rất ít người thực hiện, chỉ áp dụng quy mô hộ gia đình trồng làm cảnh quan xung quanh nhà [140]

1.4.1.2 Phương pháp tách mầm giá

Cúc là loại cây lưu niên, sống từ năm này qua năm khác, các cành trên tàn lụi thì các mầm dưới lại mọc lên nhưng cành bé, hoa nhỏ dần Thông thường, sau mỗi

vụ thu hoạch, các mầm giá phát sinh rất nhiều Ta chọn và tỉa những mầm mập, khỏe, có rễ đem trồng sang vườn ươm hoặc vườn sản xuất Cách làm này rất đơn giản, trước kia người dân hay áp dụng

Mầm giá thường to khỏe nên khả năng sinh trưởng phát triển mạnh, cho hoa tốt nhưng thời gian từ trồng đến cho hoa lâu hơn so với giâm cành (vì tuổi sinh trưởng của mầm giá trẻ hơn so với cành nhánh đem giâm) Còn một nhược điểm nữa là hình dáng tự nhiên của cúc ở ruộng sản xuất không đều Trong thực tế sản xuất với quy mô nhỏ, ta có thể tăng số lượng cây mà vẫn đảm bảo chất lượng Khi đem trồng ở ngoài vườn sản xuất, từ những cây cúc có nhiều mầm chồi phát sinh xung quanh gốc, tách những mầm này đem trồng để cho thu hoa [4]

Mầm giá phát sinh xung quanh gốc nhiều hay ít tùy giống, tùy đất tốt, xấu và điều kiện chăm sóc Nếu ta không có ý định tận dụng mầm giá, thì tốt nhất khi mầm vừa nhú lên, ta vặt bỏ để tập trung dinh dưỡng nuôi cây chính

1.4.1.3 Phương pháp giâm cành

Đây là biện pháp kỹ thuật đơn giản đang được sử dụng phổ biến bởi các cơ sở sản xuất cũng như người nông dân tại Đà Lạt Muốn có cành giâm tốt phải chuẩn bị vườn cây nguyên liệu (cây mẹ) Với phương pháp này, chỉ cần 1 ha cây mẹ, sau 4 tháng có thể thu được 4.000.000 cây giống đạt chất lượng Số lượng cây giống này

có thể đủ cho 10 ha cây thương phẩm [4]

Việc lựa chọn bố trí vườn cây mẹ, cần phải đạt tiêu chuẩn của vườn sản xuất hoa Ngoài ra, cần phải có một số yêu cầu khác, đó là cao ráo, kín gió, thuận tiện cho việc vận chuyển, bảo quản mầm cây con và có điều kiện làm nhà che nylon đơn giản để tránh mưa to, gió lớn, bão lụt, nắng nóng cao Những mầm cây mẹ được chọn để đem trồng là những cây ra rễ nhiều, khoẻ mạnh, không sâu bệnh Cần lên luống cao, thoát nước, trồng với khoảng cách 15 × 15 cm (mật độ 400.000 cây/ha) [2] Cây mẹ sau khi trồng ở vườn ươm khoảng 10 – 15 ngày, ta có thể tiến hành bấm ngọn lần 1 và bấm ngọn lần 2 sau 20 ngày nữa vì lúc này cây sẽ xuất hiện nhiều nhánh (Hình 1.2)

Hình 1.2 Quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp giâm cành [4]

Khi những nhánh này đạt chiều cao từ 12 – 15 cm, lấy 3 nhánh tốt nhất, số còn lại loại bỏ hết Sau 25 ngày kể từ ngày bấm ngọn lần 2, tiến hành cắt cành lần 1 (mỗi lần cắt 3 – 4 cành) Sau đó tiếp tục cắt cành lần 2, 3 (mỗi lần cách nhau 25 ngày) Sau 3 đến 4 lần cắt cành, ta có thể thay thế hoặc chăm sóc cải tạo cây mẹ

Bấm ngọn lần 1

Bấm ngọn lần 2Vườn ươm

Kết thúc

Bón thúc lần 2

25 ngày

1.4.1.4 Những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống

Các phương pháp nhân giống trên có thể được thực hiện bởi người nông dân,

cơ sở sản xuất cây giống tại vườn ươm, những phương pháp này không đòi hỏi trình

độ kỹ thuật cao, chỉ cần thuê nhân công theo mùa vụ, dễ thực hiện Tuy nhiên, những phương pháp này cho hệ số nhân giống thấp, chất lượng cây giống kém (cây con bị thoái hóa và nhiễm virus sau vài thế hệ) Giá thể sử dụng là đất, xơ dừa chưa qua xử lý hoặc xử lý chưa kĩ làm cho cây con dễ bị lây bệnh trong đất, khó kiểm soát (Hình 1.3)

Hình 1.3 Nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp giâm cành

a, b: Chuẩn bị đất; c: Cây giống sử dụng làm giâm ngọn; d: Vỉ xốp; e, f: Cho đất,

xơ dừa vào vỉ xốp; g, h: Cây giâm ngọn; i: Cây giâm ngọn sau 10 – 15 ngày;

j, k: Thu nhận cây giâm ngọn; l: Vận chuyển cây bằng xe tải

Một vấn đề nữa là khả năng vận chuyển cây giống cũng gặp rất nhiều khó khăn, cây con được nhân giống trong các vỉ xốp hoặc trồng trực tiếp trên đất rất khó

để vận chuyển đi xa Chúng được cho vào sọt nhựa hay cho vào bao nylon nếu vận chuyển ở khoảng cách xa thì cây dễ bị mất nước, héo rũ làm giảm khả năng sống

sót Vì vậy, không đáp ứng được nhu cầu cây giống ở những khu vực xa cơ sở sản xuất cây giống cũng như xuất khẩu Do đó, cây giống được nhân giống tại vườn ươm chủ yếu để sản xuất tại chỗ, khó mở rộng vùng trồng và hướng tới xuất khẩu

để tăng giá trị của cây giống Chính vì những lý do trên làm cho giá thành cây giống chưa cao (40 – 200 đồng; tùy theo mùa vụ và loài)

1.3.2 Nhân giống bằng phương pháp vi nhân giống

Khi diện tích sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến Nhiều năm qua, thực tế cho thấy những phương pháp truyền thống không đáp ứng kịp nhu cầu giống, mặt khác còn mang nguy cơ làm lây lan bệnh hại và làm thoái hóa giống Vì vậy, trong sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng đều và

đồng nhất về mặt di truyền, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây hoa cúc rất

hiệu quả khi kết hợp giai đoạn này với kỹ thuật giâm cành

Để tạo ra những cây giống đồng đều, khỏe mạnh, giá thành thấp thì việc lựa chọn nguồn cây mẹ ban đầu làm nguồn giống là rất quan trọng Thông thường, tại

các phòng thí nghiệm hay các cơ sở sản xuất nhỏ sẽ sử dụng cây in vitro, sau đó đưa

ra trồng tại vườm ươm nhằm thuần hóa cho cây giống thích nghi với điều kiện môi trường Đây là thế hệ đầu tiên (G0), từ thế hệ này sau khoảng 1 – 1,5 tháng trồng tại vườn, các ngọn cúc sẽ được cắt ngọn và tiếp tục nhân giống thế hệ thứ hai (G1),… Tiếp tục những công đoạn này tới thế hệ thứ 5 hoặc thứ 6 (G4 hoặc G5), những đọt cúc này mới được sử dụng làm cây giống Người nông dân sử dụng những đọt cúc này cho ra rễ trên vỉ xốp với giá thể là đất mùn hoặc phối trộn với xơ dừa làm nguyên liệu cho quá trình trồng hoa cắt cành và giá thành cây giống ở giai đoạn này cũng vừa phải (40 – 200 đồng) tùy từng giống và theo mùa vụ Sau khoảng 10 lần

sử dụng cây mẹ làm nguồn giống để ngắt ngọn thì cây mẹ sẽ được thay thế Vì ở giai đoạn này cây dễ bị nhiễm virus, thoái hóa giống,… Những giai đoạn nhân giống ngoài vườn ươm có thể thực hiện bởi người nông dân vì không cần những thao tác quá phức tạp, điều kiện vô trùng và chỉ cần lao động phổ thông

Phương pháp vi nhân giống tuy mang lại rất nhiều lợi ích nhưng vẫn có những giới hạn chưa khắc phục được Cây con có thể bị ảnh hưởng do được nuôi cấy trong điều kiện bình kín: cây dễ dị dạng, khí khẩu mất chức năng,…; tiến trình nhân giống phức tạp (bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau và kéo dài trước khi có thể thích ứng và trồng ngoài vườn ươm); điều kiện nuôi cấy vô trùng đặc trưng có ảnh hưởng rất lớn lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật sau khi đưa chúng ra khỏi bình nuôi cấy và thích ứng ngoài vườn ươm,…

Một nhược điểm của phương pháp vi nhân giống là rất khó khăn trong việc xuất khẩu cây giống Thông thường, cây giống được nuôi cấy trong các bình nuôi cấy vô trùng trên môi trường chứa đường, agar (đây là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật như nấm khuẩn phát triển); vì vậy, chúng thường gặp khó khăn trong khâu kiểm định để xuất khẩu giống ra nước ngoài Muốn xuất khẩu được cây giống nhằm gia tăng hiệu quả kinh tế thì chúng phải trải qua nhiều công đoạn nghiêm ngặt và có

và cây trồng [34] Trong khi đó, nhiệt độ ở hầu hết các phòng nuôi cấy được giữ trong khoảng 24 – 26°C ban ngày và 17 – 19°C ban đêm Tuy nhiên, mức dao động nhiệt độ cần được kiểm soát khác nhau tùy theo loài thực vật và giai đoạn tăng trưởng, ví dụ như các giai đoạn hình thành mô sẹo, cảm ứng chồi, cảm ứng rễ Các nhà khoa học Nhật Bản đã đề nghị hệ thống nuôi cấy mô quang tự dưỡng [39] Trong đó, cây được nuôi trong bình nuôi cấy lớn có đầy đủ các khí (CO2, O2),

độ ẩm tuyệt đối và thành phần dinh dưỡng nuôi cấy cũng được kiểm soát Tuy nhiên, hệ thống này vẫn có một số bất lợi là chi phí để kiểm soát môi trường trong bình nuôi cấy khá cao, cây con vẫn phải tăng trưởng trong điều kiện vô trùng

1.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY

1.5.1 Sự thoáng khí và nồng độ khí CO 2 và O 2

Nồng độ CO2 cao có nhiều tác động có lợi lên sự kéo dài chồi và sự phát triển

của lá dựa trên sự tháo gỡ của chồi ngủ và đốt cây Theobroma cacao, một loài rất

khó nhân giống [38]

Fujiwara và cs (1987) cho rằng, tốc độ quang hợp thấp và sự kém phát triển

của cây in vitro là do nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy thấp trong suốt quá trình quang hợp [40] Nói cách khác, nồng độ CO2 thấp trong bình nuôi cấy trong hầu hết quang kỳ sẽ ức chế khả năng quang hợp của cây, từ đó buộc cây phải sinh trưởng theo phương thức dị dưỡng hay tự – dị dưỡng nhờ vào sự hấp thu đường từ môi

trường như nguồn carbon chủ yếu của cây [60] Khi cường độ quang hợp của cây in

vitro được gia tăng sẽ làm gia tăng tỷ lệ sống sót của cây in vitro khi đưa ra ngoài

vườn ươm Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng cây trồng chứa diệp lục có khả năng quang hợp tăng khi nuôi cấy trên môi trường chứa CO2 [60]

Bình nuôi cấy được thiết kế để ngăn chặn vi khuẩn nhưng hạn chế sự trao đổi khí giữa bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy, từ đó ảnh hưởng đến thành phần các khí bên trong bình nuôi cấy Thông thường, việc đậy kín bình nuôi cấy ngăn ngừa

sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thoát hơi nước quá mức từ môi trường và mẫu cấy Cũng giống như ánh sáng, sự tích lũy các khí và hơi nước quá mức ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy như sự kéo dài chồi, sự nảy chồi

và khối lượng tươi của chồi

Một hệ thống bình nuôi cấy kín nhưng được làm thông thoáng để giảm hiện tượng thủy tinh thể và nâng cao sự sinh trưởng của cây dâu tây [64] Nói tóm lại, việc tăng cường trao đổi khí giữa các bình nuôi cấy và môi trường bên ngoài nhằm tăng hàm lượng CO2 ở mức tối ưu trong bình nuôi cấy nhằm tăng cường quang hợp

của cây in vitro, giảm hàm lượng O2 trong bình nuôi cấy xuống khoảng 10% [122]

Trong điều kiện nuôi cấy thoáng khí, cây có khả năng hình thành rễ thứ cấp

ngay trong giai đoạn in vitro, điều này cải thiện tỷ lệ sống sót của cây khi đưa ra

giai đoạn vườn ươm Việc cải thiện chế độ thoáng khí trong bình nuôi cấy có thể đạt được thông qua việc sử dụng màng lọc thoáng khí được gắn lên các lỗ của bình để ngăn bụi, vi khuẩn và nhờ sự khuếch tán mà CO2 từ bên ngoài sẽ di chuyển vào bên trong các hệ thống nuôi cấy, thành phần khí trong bình sẽ dần thay đổi bằng với thành phần khí bên ngoài bình [10]

1.5.3 Giá thể

1.5.3.1 Định nghĩa

Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu được sử dụng làm vật nâng đỡ, tạo môi trường cho rễ phát triển và bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển Vật liệu làm giá thể không chỉ đơn thuần là chắc chắn mà còn có đặc tính ổn định trong mọi điều kiện để có khả năng nâng đỡ, trao đổi khí,… Bên cạnh đó,

trong môi trường in vitro, yếu tố vô trùng là rất quan trọng, quyết định đến sự thành

bại của quy trình, nên vật liệu làm giá thể phải chịu được nhiệt độ cao trong quá trình hấp và không bị biến tính Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại giá thể được sử dụng trong nuôi cấy Mỗi loại đều có ưu thế và hạn chế nhất định nên chỉ phù hợp cho một vài đối tượng và mục đích sử dụng chuyên biệt [96]

1.5.3.2 Agar và một số loại giá thể

Agar là loại giá thể thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô Agar có

phổ hoạt động rộng và thích hợp với hầu hết các quy trình nhân giống in vitro như:

kích thích hình thành và nhân chồi, cảm ứng và tạo mô sẹo, phát triển phôi, thực hiện chuyển gene,… cho đến nay, mặc dù có rất nhiều loại giá thể khác với những

ưu điểm mới nhưng agar vẫn được sử dụng phổ biến hơn hết [94]

Qua quá trình sử dụng, giá thể agar vẫn còn nhiều hạn chế, có tác động trực tiếp đến chất lượng cây giống Do cấu trúc agar có độ thoáng khí thấp nên rễ phát

triển không tốt trong in vitro và tỷ lệ sống sót không cao khi đưa ra ngoài vườn

Hơn nữa, lực khuếch tán của cation trong môi trường có agar thấp nên mẫu cấy chỉ

có thể sử dụng một phần nhỏ chất dinh dưỡng đưa vào môi trường Trong quá trình khắc phục những hạn chế của agar, một số loại giá thể khác được đưa vào thay thế như: rookwool, oasis, gelatin, aginate, phytagel,… [99]

Rookwool là loại giá thể có độ thoáng khí cao Trước đây, rookwool được sử

dụng làm giá thể gieo hạt Sau đó được cải tiến và đưa vào ứng dụng trên in vitro và

chứng minh được một số ưu điểm đối với quá trình nhân giống của một số đối tượng nhất định Chồi của cây dâu tây phát triển tốt hơn trên giá thể rookwool có bổ sung 100 ml môi trường MS lỏng dưới đèn đơn sắc so với những giá thể khác [89] Tuy nhiên, những giá thể mới này thì không phổ biến và giá thành tương đối cao Vì vậy, việc tìm kiếm một giá thể mới rẻ, phổ biến và hiệu quả cao là một việc làm cần thiết

1.5.3.3 Giá thể film nylon

Neoflon đã được sử dụng để thiết kế hệ thống nuôi cấy [123] Neoflon là polymer có tính bền vững nhất về mặt hóa học, đặc biệt là bền với nhiệt, trơ về mặt hóa học đối với hydrocarbon, ethylene glycon…, có nhiệt độ nóng chảy từ 265 –

310C; do đó, chúng có thể được khử trùng trong nồi áp suất ở nhiệt độ cao nhưng vẫn an toàn Khả năng truyền khí (O2, N2 và CO2) của loại film này tốt hơn so với