Nghiên cứu phân lập các hợp chất Tritecpen từ lá cây mâm xôi (Rubus Alceaefolius poir.)

Ngày nay với sự hỗ trợ của các máy móc hiện đại có thể giúp conngười phân lập được rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiênnhiên, cùng với sự đa dạng của thiên nhiên Việt Na

TRƯỜNG ĐẠ I HỌ C SƯ PHẠ M HÀ

C

MỞ ĐẦU

Trong điều kiện phát triển của xã hội hiện nay chất lượng cuộc sốngcủa con người đã được nâng lên, tuổi thọ tăng lên… Tuy nhiên cùng với sựphát triển đó thì con người cũng đang phải đối đầu với những nguy cơ mắcnhiều những căn bệnh hiểm nghèo Nguyên nhân đó là do ôi nhiễm bầu khôngkhí, ôi nhiễm nguồn nước…Việc nghiên cứu tìm ra các loại thuốc có nguồngốc từ thiên nhiên có hiệu quả cao, dễ tìm nguồn nguyên liệu, ít tác dụng phụ,

ít độc tính để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác phục

vụ lợi ích của con người đã và đang là vấn đề được các nhà khoa học hết sứcquan tâm

Nằm ở khu vực nhiệt đới gió mùa có rất nhiều điều kiện thuận lợi chocác thảm thực vật phát triển như : nhiệt độ trung bình 15-280C, độ ẩm cao,lượng mưa lớn… nước ta có một kho tài nguyên thiên nhiên vô giá với nguồndược liệu phong phú và đa dạng thuộc loại bậc nhất thế giới Theo các tài liệu

đã công bố [1] thì Việt Nam có khoảng 12000 loài thực vật, từ xa xưa nhândân ta đã biết dùng các loại thảo dược để chữa bệnh và có rất nhiều bài thuốcquý còn được lưu truyền đến ngày nay Các bài thuốc này có rất nhiều ưuđiểm trong chữa bệnh như ít độc tính, ít tác dụng phụ, dễ tìm nguyên liệu.Nguồn kinh nghiệm quý báu xuất phát từ các bài thuốc cổ truyền này có vaitrò hết sức quan trọng với sự phát triển của ngành y học nói chung và ngànhHóa học các hợp chất thiên nhiên nói riêng

Ngày nay với sự hỗ trợ của các máy móc hiện đại có thể giúp conngười phân lập được rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiênnhiên, cùng với sự đa dạng của thiên nhiên Việt Nam hứa hẹn sẽ là nơi tìm rarất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần quan trọng trong việctìm ra các phương thuốc chữa các căn bệnh hiểm nghèo hiện nay

TRƯỜNG ĐẠ I HỌ C SƯ PHẠ M HÀ

C

Cây Mâm xôi được sử dụng rộng rãi trong dân gian để chữa một sốbệnh về tiêu hóa [4] như : chữa chậm tiêu, kém ăn, một số bệnh về gan, dùngcho phụ nữ sau khi sinh để hồi sức…Chính vì những lí do trên em đã chọn đề

tài “ Nghiên cứu phân lập các hợp chất tritecpen từ lá của cây Mâm xôi”.

Nhiệm vụ của khóa luận

1 Phân lập một số hợp chất tritecpen từ cây Mâm xôi

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng cácphương pháp phổ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Những nghiên cứu tổng quan về cây Mâm xôi

1.1.1 Thực vật học

Cây Mâm xôi hay còn được gọi là đùm đũm có tên khoa học là Rubus

alceaefolius Poir, thuộc họ Hoa hồng - Rosaceae Đây là loài cây bụi nhỏ,

thân leo có gai to và dẹt Cành mọc vươn dài, có nhiều lông Lá đơn, mọc so

le, hình bầu dục, hình trứng hoặc gần tròn, chia thùy nông, không đều, gânchân vịt, mép khía răng, mặt trên màu lục sẫm phủ lông lởm chởm, mặt dưới

có nhiều lông mềm, mịn màu trắng xỉn, cuống lá dài cũng có gai, lá kèm sớmrụng Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm ngắn, lá bắc giống lákèm, hoa màu trắng, cánh hoa 5, mỏng hình tròn, nhị rất nhiều thường dàibằng cánh hoa, chỉ nhị dẹt, lá noãn nhiều Quả hình cầu, gồm nhiều quả hạch

tụ họp lại như dáng Mâm Xôi do đó có tên cây Mâm xôi, khi chín màu đỏtươi, ăn được Cây ra hoa tháng 2-3, quả tháng 5-7 [1, 2]

Hình 1.1.1 Cây Mâm xôi Rubus alceaefolius Poir.

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự [1], trên thế giới chi Rubus có khoảng

hơn 400 loài, hầu hết là cây bụi, mọc thẳng hay bụi trườn, phân bố chủ yếu ởvùng ôn đới, cận nhiệt đới và cả ở vùng nhiệt đới Bắc bán cầu Một vài loàiđược trồng lấy quả Ở Việt Nam, chi này có 51 loài, 7 thứ, trong đó Mâm xôi

là loài phân bố tương đối rộng rãi ở khắp các tỉnh vùng núi thấp, trung du vàđồng bằng Cây ưa sáng và ẩm, thường mọc trùm lên các cây bụi và cây leokhác ở ven rừng ẩm, rừng núi đá vôi, đồi, nhất là trong các trảng cây bụi ưasáng trên đất sau nương rẫy Ở vùng đồng bằng, Mâm xôi mọc lẫn trong cáclùm bụi quanh làng, hai bên đường đi Cây này sinh trưởng, phát triển nhanh.Những cây ít bị chặt phá ra hoa quả nhiều hàng năm Cây có khả năng tái sinhmạnh sau khi bị chặt phá

1.1.3 Công dụng

Lá, cành và rễ Mâm xôi có vị ngọt nhạt, tính bình, có tác dụng thanhnhiệt, tán ứ, tiêu viêm, chỉ huyết, kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon miệng.Cành lá phơi khô, nấu nước uống thay chè, dùng cho phụ nữ sau khi đẻ mấtsức và những người ăn không tiêu, đầy bụng Ngoài ra cành và lá Mâm xôicòn được dùng phối hợp với Mộc thông, Ô rô để chữa viêm tuyến vú, viêmgan cấp và mãn tính Quả có vị ngọt, tính bình, được dùng thay vị Phúc bồn

tử trong y học cổ truyền, có tác dụng bổ gan thận, giữ tinh khí, làm trángdương, mạnh sức Quả được dùng chữa thận hư, liệt dương, di tinh, đái són,đái buốt [1, 2]

Ở Ấn Độ người ta dùng quả Mâm xôi làm thuốc chữa bệnh đái dầm củatrẻ em Nước sắc lá và vỏ thân được dùng làm thuốc điều kinh, chữa tiêuchảy

Ở Trung Quốc, Mâm xôi được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa albumin niệu, viêm tuyến vú và viêm gan mãn tính Ở một số vùng của

Trung Quốc, nó còn được sử dụng để chữa một số bệnh ung thư nhất định.Theo kết quả nghiên cứu của Cui C - B và cộng sự, rễ Mâm xôi thể hiện hoạttính ức chế mạnh chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 của dòng tế bào tsFT210 (Chu kỳ

tế bào, con đường duy nhất để tế bào sinh sôi, là một quá trình sinh học đượckiểm soát chặt chẽ và thực tế ung thư là sự tăng sinh vô hạn độ không mongmuốn của các tế bào ung thư với sự thoái hóa của chu kỳ tế bào Do đó, cácchất ức chế chu kỳ tế bào có khả tiềm tàng trong điều trị ung thư) [6]

1.1.4 Thành phần hoá học

Theo các sách về cây thuốc Việt Nam [1, 2], quả Mâm xôi chứa cácaxit hữu cơ (chủ yếu là axit xitric, malic, salycilic), đường, pectin Lá chứatanin Tuy nhiên, hiện nay còn rất ít công trình nghiên cứu được công bố về

loài R alceaefolius Mới chỉ có các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu loài

này và cũng chỉ nghiên cứu về cây thuốc này mọc ở Trung Quốc Còn ở ViệtNam hoàn toàn chưa có nghiên cứu nào về cây thuốc quí này

Theo sự tra cứu của chúng tôi, từ cây R alceaefolius mọc ở Trung

Quốc, năm 1998 Gan L và các đồng nghiệp đã phân lập được: axit corosolic

(1), axit tormentic (2), niga-inchigoside F1 (3), trachelosperoside E-1 (4) và suavissimoside R1 (5) [7] Năm 2000, Gan L và các đồng nghiệp lại công bố phân lập của alcesefoliside (6), hyperoside (7), vomifoliol (8), β-sitosterol (9), daucosterol (10) và dotriacontyl alcohol (11) [8] Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Cui C - B đã công bố sự phân lập của rubuphenol (12) sanguiin H-2

ethyl ester (13), axit ellagic (14), ethyl gallate (15), β-D-glucopyranose (16) và 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose (17)

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-[6]

Dưới đây chúng tôi dẫn ra cấu trúc của một số hợp chất đã được phân

lập từ loài R alceaefolius.

Các hợp chất đã được phân lập từ cây Rubus alceaefolius

HO

O H

OH O

HO

O OH

O HO

OH O OH

OH HO

H

OH O

O O O

OH O

1.2 Giới thiệu về lớp chất tritecpen [3, 4, 5]

1.2.1 Giới thiệu chung

Tecpen là một lớp hợp chất thiên nhiên mà cấu trúc có thể phân chiathành các đơn vị isopren, chúng có công thức chung là (C5H8)n n 2 Căn

cứ vào số đơn vị isopren hợp thành người ta phân loại như sau:

Loại tecpen Khung cacbon Số lượng C Thí dụ

Ngoài ra trong thiên nhiên, người ta gặp một số polime mà phân tử củachúng gồm hàng chục ngàn mắt xích iso-C5 Đó là politecpen, quen thuộc

nhất là cao su thiên nhiên mà mỗi mắt xích iso-C5 có một liên kết đôi đều ởcấu hình cis:

H3C

C C CH3

H

poli - cis - isopren

Dưới đây là một số công thức của Tecpen

CH2

6 H2C 7

CH

2

H2C CH2 C

CH2 4 3

2 1 H3C CH

OH O

Mentol và Menton được tách từ tinh dầu bạc hà, Limonen được tách từ vỏcam chanh

Sabinen được tách từ dầu cây Juniperus Sabina, Cedren được tách từ cây Hoàng đàn, còn Camphen có nhiều trong tinh dầu như long não.

Các tritecpen phân bố rộng rãi trong giới thực vật, cho đến những nămbảy mươi có khoảng 500 hợp chất tritecpen được xác định cấu trúc Một sốtritecpen có tác dụng sinh lý, dược lý như: kháng khuẩn, kháng nấm, khángviêm và kháng một số dạng ung thư, ngoài ra còn có tác dụng lên hệ thần kinhtrung ương, điều hoà nội tiết, hạ cholesterol máu và chống xơ vữa động mạch

Các dẫn xuất chứa oxi của tritecpen có nhiều và thường ở dạng đa

vòng, dạng 5 vòng sáu cạnh rất hay gặp trong tự nhiên đặc biệt là Fiđelin và

Fidelanol.

Sự đóng vòng của sq ualen o xit t rong chu ỗi thuyền - gh ế - thu yền - gh ế

dẫn đến sự hình thành cation cầu nối như hình vẽ sau:

HO

R

Cation biến đổi tiếp tạo thành các hợp chất khác nhau, sau đây là một

số hợp chất tiêu biểu:

CO 2 H H

H

AcO

1.2.2.2 Sự đóng vòng của squalen epoxit trong chuỗi ghế ghế ghế

-thuyền

Đóng vòng của squalen epoxit

H

trong chuỗi ghế - ghế - ghế - thuyền

tạo ra cation có cấu dạng như hình H

dammar là các chất dammarendiol I

HOhay dammarendiol II (đồng phân

epime ở vị trí C20)

dammarendiol

H

20

Sự chuyển vị cation trên tạo ra H

Từ cation trung gian trên các cation khác được hình thành và qua đótạo ra các tritecpen khác như Taraxerol, Glutinol, Germanicol, Amyrin,Friedelin, Lupeol, Phyllanthol…

Sơ đồ minh hoạ như sau:

H H

H

Shionon Ebelin Lacton Baccharis oxit

H

Germanicol Amyrin Taraxerol Multiflorenicol Glutinol

H

Taraxasterol

H H

H

1.2.2.3 Sự đóng vòng của squalen trong các chuỗi ghế ghế ghế ghế

-ghế, ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền, ghế - thuyền - ghế - ghế - thuyền

Đó ng vòng của squ al en th eo cấu dạng g hế - g hế - ghế - ghế - ghế dẫn

tới các cation trung gian từ đó hình thành các diplopten, tetrahymanol vàcác tritecpen năm vòng

OH

H H

Diplopten Tetrahymanol

Đóng vòn g th eo cấ u d ạng gh ế - gh ế - gh ế - ghế - thuyền của squa l en dẫn

tới sự hình thành của morotenol và các hợp chất liên quan qua cation trunggian như hình vẽ sau:

Đó ng vòng th eo cấu d ạng gh ế - gh ế - g hế - gh ế - t huyền của s qua l en

kết hợp chuyển vị tạo ra các hợp chất như neomotiol và fernen

H

HO

neomotiol

Một đại diện quan trọng cho nhóm các tritecpen dẫn ra từ cấu dạng ghế

- thuyền - ghế - ghế - thuyền là Arborinol

H

HO HO Arborinol

1.2.2.4 Sự đóng vòng của squalen một cách đồng thời từ hai đầu

Một nhóm nhỏ tritecpen là sản phẩm của sự oxi hoá đồng thời từ haiđầu của phân tử squalen Các hợp chất tiêu biểu của nhóm này là onocerin vàtritecpen 5 vòng thuộc khung serraten với chất đại diện là serratendiol

1.3 Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu thực vật, tùy vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất có độ phân cực vừa phải…) mà

ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cựckhác nhau Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người takhông chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phải phối hợp một tỉ lệnhất định để tạo ra một hệ dung môi mới Tuy nhiên những thành phần tantrong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cầnphải được lựa chọn hết sức cẩn thận Nó cần hòa tan những chất chuyển hóathứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứngvới chất nghiên cứu) không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi nàynên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng nếu chúng cólẫn các chất khác có thể ảnh hưởng tới hiệu quả và chất lượng của quá trìnhchiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankylphtalat, tri-n-butyl-axetynitat và tributylphotphat Những chất này có thể lẫnvới dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản như cácthùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa

Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphotphtalat [di-(2-etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này làm sai lệch kết quả phân lậptrong quá trình nghiên cứu hóa thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tínhtrong quá trình thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây.Clorofoc, metylen clorit và metanol là những dung môi thường được lựachọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (như lá, rễ, thân, củ)

Những tạp chất của clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứngvới một vài hợp chất như các ankanoit tạo ra muối bậc bốn và các sản phẩmkhác tương tự như vậy có một lượng nhỏ axit HCl cũng có thể gây ra sựphân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác Bởiclorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác

khéo léo cẩn thận ở nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc.

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn cáchidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽthấm tốt hơn qua màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽthu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Trái lại clorofoc khả năng phân cực thấp hơn có thể rửa giải các chấtnằm ngoài tế bào Các ancol phần lớn là các chất chuyển hóa phân cực cùngvới các hợp chất phân cực trung bình và thấp vì vậy khi chiết bằng ancol thìcác chất này cũng bị hòa tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trongnước dường như là dung môi tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên thì cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùngmetanol trong suốt quá trình chiết Ví dụ như trechlonolide A thu được từTrechonaetes laciniata được chuyển hóa thành trechlonolide B bằng quátrình metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phânhủy 1-hidroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythoxy novogranatense đượcchiết trong metanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ lá cây

mà thả vào đó là dung dịch nước của metanol

Đietyl ete hiếm khi được sử dụng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc đồng thời nó có xu hướng tạo ra peroit dễ nổ,peroxit của đietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng cóthể tạo thành exetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quátrình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được sử dụng đối với quátrình phân tách đặc trưng, cũng có khi sử dụng các dịch chiết bằng axit, bazơ

có thể tạo ra các sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấptrong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợpcho quá trình chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trìnhtạo thành chất mong muốn.

Sau khi chiết thành dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt

độ không quá 300C – 400C, với một vài hóa chất có thể thực hiện ở nhiệt độcao hơn

1.3.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

 Chiết ngâm

 Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

 Chiết sắc với dung môi nước

 Chiết lôi cuốn với hơi nướcChiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãinhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức vàthời gian, thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một khóa ở dưới đáy đểtạo tốc độ chảy cho quá trình rửa tách dung môi, dung môi nóng hoặclạnh.Trước kia máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiệnnay có thể dùng bằng bình thủy tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phươngpháp chiết tách liên tục bởi mẫu được ngâm trong dung môi trong máy chiếtkhoảng 24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra Cần lưu ý sau một quá trìnhchiết 3 lần dung môi, cặn thu được không còn chứa những chất giá trị nữa.Bởi vì khi chiết các ankaloit ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợpchất này ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặctrưng như Dragendorff và tác nhân Mayer Cũng vậy các flavonoid thường

là những hợp chất màu bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh

dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết Khi chiết các chất béonồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của các cặn tiếptheo đó sẽ biểu hiện sự kết thúc quá trình chiết Trong trường hợp các lactoncủa sesquitecpen và glicozid trợ tim, phản ứng keđe có thể được sử dụngbiểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽcho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể cho biết khi nàoquá trình chiết kết thúc.

Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để chọn dungmôi thích hợp và lựa chọn quá trình chiết hợp lí nhằm đạt kết quả cao Ngoài

ra có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà

ta có thể thu một số hợp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí (chromoatography) là một trong những phươngpháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việcphân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nóiriêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chấthấp thụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh

Sắc kí gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với các tínhchất của chúng ( tính bị hấp thụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lựckhác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển độngdọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này tới lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lạiquá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha

tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tácyếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất quaquá trình sắc kí.

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữahai pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sựphụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ cua dung dịch( hoặc với chất khí là áp suất riêng phần ) gọi là định luật hấp phụ đơn phân

tử đẳng nhiệt Langmuir :

n = n bC 1+bC

n : lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞ : lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b : hằng số

C : nồng độ của chất bị hấp thụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành 2 nhóm lớn:

- Sắc kí khí

- Sắc khí lỏngDựa vào cách tiến hành sắc kí người ta chia ra thành các phương pháp sắc kí chủ yếu sau :

1.4.3.1 Sắc kí cột

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp thụ là pha tĩnh gồmcác loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảoYMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằngthủy tinh hoặc kim loại nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh) Độ mịn củachất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năngtách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyếtcàng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ

có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trườnghợp nếu lực trọng trường không đủ lớn gây ra hiện tượng tắc cột (dung môikhông chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trungbình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rấtquan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêucầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc kí, tỉ lệ giữaquãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf

này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chấthấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ

lệ này thấp (từ 1/5- 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào

hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số nàytrong khoảng 1/20 – 1/30

Trong sắc kí cột việc đưa chất lên cột rất quan trọng, tùy thuộc vàolượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng cácphương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến nhất

là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách