SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)

SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)SKKN KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)

MỤC LỤC

TÓM TẮT 2

1 GIỚI THIỆU 2

2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

2.1 Phương tiện 3

2.2 Phương pháp nghiên cứu 4

2.2.1 Quy trình 4

2.2.2 Khảo sát kiểu nhân 4

3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 5

3.1 Quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời và cố định 5

3.1.1 Thời gian thu mẫu 5

3.1.2 Xử lý mẫu trước khi cố định 5

3.1.3 Cố định mẫu vật 6

3.1.4 Nhuộm mẫu vật 7

3.1.5 Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định 7

3.1.6 Làm trong mẫu 8

3.2 Nhận diện tiền kỳ giữa của quá trình nguyên phân 8

3.3 Khảo sát kiểu nhân 8

3.3.1 Hình dạng nhiễm sắc thể 8

3.3.2 Số lượng nhiễm sắc thể 9

3.3.3 Những nghiên cứu về kiểu nhân của hành ta (Allium ascalonicum L.) 13

4 KẾT LUẬN 13

TÀI LIỆU THAM KHẢO 14

KHẢO SÁT KIỂU NHÂN CỦA HÀNH TA (ALLIUM ASCALONICUM L.)

TÓM TẮT

Mục tiêu của đề tài là: i) Tìm quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời và cố định nhiễm sắc thể ở rễ hành ta (Allium ascalonicum L.), ii) Thực hiện 30 tiêu bản hiển vi cố định rễ hành ta (Allium ascalonicum L.), iii) Khảo sát kiểu nhân của hành ta (Allium ascalonicum L.) Rễ hành ta (Allium ascalonicum L.) được xử lý sốc nhược trương với citrat natri 0,1% hoặc xử lý với 8 – oxyquinoline Các tiêu bản hiển vi tạm thời và cố định thực hiện theo phương pháp ép với chất cố định là Carnoy biến đổi và phẩm nhuộm là aceto -carmine 1% Kiểu nhân của hành ta (Allium ascalonicum L.) được xác định dựa trên khảo sát về hình dạng, số lượng và kích thước của nhiễm sắc thể trong

tế bào ở giai đoạn tiền kỳ giữa (prometaphase) hoặc kỳ giữa (metaphase) của quá trình nguyên phân Kết quả là đã tìm được quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời và cố định nhiễm sắc thể hành ta (Allium ascalonicum L.) và thực hiện 30 tiêu bản hiển vi cố định nhiễm sắc thể hành ta (Allium ascalonicum L.) với độ tương phản cao, tế bào không bị teo, quan sát rõ hình thái nhiễm sắc thể Kiểu

nhân của hành ta (Allium ascalonicum L.) là K (n = 8) = 6m + 1sm + 1st.

Từ khóa: Allium ascalonicum L., acetocarmine, kiểu nhân (karyotype), nhiễm

sắc thể đồ, sốc nhược trương, 8 – oxyquinoline

1 GIỚI THIỆU

Do sự ổn định về hình thái của mỗi nhiễm sắc thể và sự cố định về số lượng nên sự mô tả hình thái của nhiễm sắc thể được gọi là kiểu nhân (karyotype) đặc trưng cho mỗi loài (Phạm Thành Hổ, 2004)

Kiểu nhân được xác định bằng số lượng, kích thước, hình thái nhiễm sắc thể, những tính trạng đặc trưng cho bộ nhiễm sắc thể của mỗi loài Nghiên cứu kiểu nhân có ý nghĩa lớn đối với phân loại thực vật, lai xa, đa bội hóa, đột biến, v.v… Kiểu nhân của các loài thực vật rất khác nhau và đặc trưng cho từng loài (Trần Tú Ngà, 1982)

Việc nghiên cứu kiểu nhân (karyotype) sẽ giúp hiểu rõ hơn về hình thái, kích thước cũng như sự sắp xếp của nhiễm sắc thể ở quá trình phân bào nguyên

nhiễm (mitosis), đặc biệt là ở giai đoạn tiền kỳ giữa (Phùng Thị Thanh Tâm, 2005) Đồng thời, việc nghiên cứu kiểu nhân của một loài sẽ đưa ra được những tiêu chuẩn chung để phân loại bộ nhiễm sắc thể của những loài cùng chi

Nhiễm thể đồ là sự biểu diễn kiểu trung bình của mỗi nhiễm sắc thể, trên cơ

sở nghiên cứu chúng trong nhiều tế bào Trên nhiễm thể đồ chỉ biểu diễn một nhiễm sắc thể trong mỗi cặp Mỗi nhiễm sắc thể được uốn thẳng dưới hình thức lược đồ trên đó có chỉ vị trí của tâm động Trong nhiễm thể đồ các nhiễm sắc thể được xếp theo trật tự kích thước giảm dần Nhiễm sắc thể đầu tiên là lớn nhất

Hiện nay đã có một số nghiên cứu về kiểu nhân như: kiểu nhân của Allium

fistulosum L., Allium sativum L., Allium cepa L và kiểu nhân của một số loài lai giữa Allium wakegi Araki và Allium ascalonicum L., Allium wakegi Araki và Allium fistulosum L Một nghiên cứu gần đây ở Thái Lan (10/01/2010) đã khảo sát hình

thái nhiễm sắc thể một cách tổng quát của một số loài thuộc chi Allium như Allium

fistulosum L., Allium cepa L., Allium sativum L., Allium ampeloprasum Kích thước

trung bình của nhiễm sắc thể từ 3.893 µm đến 6.059 µm và hầu hết nhiễm sắc thể có

tâm cân (Rangsiruji et al, 2010)

Hành ta (Allium ascalonicum L.) là đối tượng sử dụng phổ biến trong giảng

dạy, có số lượng nhiễm sắc thể tương đối ít, là đối tượng dễ tìm và phổ biến ở đồng

bằng sông Cửu Long Mặc dù số lượng nhiễm sắc thể của hành ta (Allium

ascalonicum L.) tương đối ít nhưng kích thước nhiễm sắc thể dài, khó khảo sát số

lượng và hình thái Theo Trần Tú Ngà, mẫu vật xử lý với dung dịch 8 – oxyquinoline Sau khi xử lý, nhiễm sắc thể có bề dày tăng lên đến 1,5 lần Ngoài ra, mẫu vật còn được xử lý với citrat natri

Chính vì những thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo

sát kiểu nhân của hành ta (Allium ascalonicum L.) nhằm đưa ra được những kết

luận ban đầu về kiểu nhân của hành ta, làm tài liệu tham khảo cho những nghiên cứu về kiểu nhân của những loài thuộc chi Allium, là tài liệu phục vụ cho quá trình dạy và học ở các trường Trung học phổ thông, Cao đẳng và Đại học

2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương tiện

Thiết bị và dụng cụ: tủ sấy, kính hiển vi, lọ thủy tinh, bình tam giác, kim mũi nhọn, lame, lammelle, ống nhỏ giọt, đĩa petri…

Vật tư và hóa chất: giấy thấm, trứng gà, nước cất, cồn tuyệt đối, xylene, axit acetic, carmine alum lack, glycerin, Baume canada, citrat natri, 8 - oxyquinoline…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình

- Giâm hành ta (Allium ascalonicum L.) trong cát ẩm từ 1 – 2 ngày và thu rễ

vào buổi sáng từ 8h30 đến 10 giờ sáng

- Xử lý mẫu trước khi cố định:

+ Xử lý với 8 – oxyquinoline: cho 0,58 g 8 – oxyquinoline vào 200

ml nước cất ấm đã để sẵn trong tủ hút, cho rễ vừa thu được vào dung dịch 8 – oxyquinoline đã pha trong 3 giờ ở nhiệt độ từ 10 – 14oC

+ Xử lý sốc nhược trương: cho rễ vừa thu được vào citrat natri có nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,3%

- Cố định: cho mẫu vật sau khi xử lý vào dung dịch Carnoy biến đổi trong 4 giờ

- Nhuộm mẫu: ngâm mẫu vật trong dung dịch aceto-carmine trong khoảng 45 phút

- Làm mủn mẫu vật: đun mẫu vật chứa trong dung dịch aceto-carmine từ 5 –

7 phút

- Tách lame và lammelle: chọn những tiêu bản có mẫu đẹp, đặt trên băng đá CO2 từ 150 – 180 phút Sau đó, dùng lưỡi lam tách lam khỏi lammelle

- Khử nước: chuyển tiêu bản lần lượt qua những lọ thủy tinh chứa cồn có nồng độ là 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, cồn tuyệt đối từ 5 – 17 giây

- Làm trong mẫu: làm trong mẫu bằng n – butanol và xylen

- Dán nhãn: dán nhãn lên tiêu bản ghi rõ tên tiêu bản, ngày, tháng, năm làm tiêu bản

2.2.2 Khảo sát kiểu nhân

- Hình dạng nhiễm sắc thể: nhận diện tiền kỳ giữa của quá trình nguyên phân trên các tiêu bản cố định (mẫu đã được xử lý với citrat natri) để khảo sát hình dạng của nhiễm sắc thể

- Kích thước nhiễm sắc thể: Ở tiêu bản có kỳ giữa đẹp, trong đó các nhiễm sắc thể cùng nằm trong một mặt phẳng, không chồng chéo lên nhau thì có thể dùng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính để đo kích thước nhiễm sắc thể và dùng phần mềm photoshop chỉnh sửa ảnh (Trần Tú Ngà, 1982)

- Đếm số lượng nhiễm sắc thể: chọn 30 tế bào ở tiền kỳ giữa hoặc kỳ giữa của quá trình nguyên phân trên các tiêu bản cố định (mẫu đã được xử lý với citrate natri hoặc 8 – oxyquinoline), đếm ố lượng nhiễm sắc thể trong tế bào và thống kê xử lý để khảo sát số lượng nhiễm sắc thể trong một tế bào, giả thuyết ban đầu trong một tế bào

hành ta (Allium ascalonicum L.) có 2n = 16 nhiễm sắc thể với độ tin cậy là 95%.

- Lập kiểu nhân: dựa trên kết quả về khảo sát hình dạng, số lượng và kích thước để lập kiểu nhân Nguyên tắc lập kiểu nhân theo Levan (1964) như sau: + Nhiễm sắc thể dài xếp trước, ngắn xếp sau

+ Nếu nhiễm sắc thể có kích thước bằng nhau thì nhiễm sắc thể tâm cân xếp trước, tâm lệch xếp sau

+ Đánh số và phân nhóm rồi xếp nhiễm sắc thể thường trước, nhiễm sắc thể giới tính xếp sau (không có ở kiểu nhân của tế bào dinh dưỡng, tế bào soma)

Bảng 1 Phân loại nhiễm sắc thể

Vị trí tâm động Tỉ lệ cánh (r) Phân loại nhiễm sắc thể

Vùng chính giữa

Vùng giữa

Vùng gần giữa

Vùng gần tận

Vùng tận

1 1,1 – 1,7 1,7 – 3 3,1 – 7

> 7

M: tâm cân m: tâm cân Sm: tâm lệch giữa St: tâm lệch mút T: tâm mút

3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời và cố định

3.1.1 Thời gian thu mẫu

Mẫu vật được thu trong thời gian khoảng 8 giờ đến 8 giờ 45 phút

3.1.2 Xử lý mẫu trước khi cố định

- Sốc nhược trương với citrat natri

Chúng tôi đã tiến hành một số nghiệm thức và kết quả như sau:

Bảng 2 Nghiệm thức nồng độ và thời gian sốc nhược trương

0,1 30 Đa số nhiễm sắc thể chưa phân tán, tế bào

trương lên

45 Nhiễm sắc thể phân tán, nằm rời rạc, tế bào trương lên không bị vỡ

60 Nhiễm sắc thể phân tán tốt

0,2

30 Nhiễm sắc thể chưa phân tán, tế bào trương lên

45 Nhiễm sắc thể phân tán chưa nhiều

60 Nhiễm sắc thể phân tán nhưng vẫn còn chồng lên nhau

0,3

30 Nhiễm sắc thể chưa phân tán, nằm chồng lênnhau

45 Nhiễm sắc phân tán chưa nhiều

60 Nhiễm sắc thể phân tán nhưng vẫn nằm

chồng lên nhau

- Sốc hành ta (Allium ascalonicum L.) trong citrat natri 0,1% trong 45 phút

làm tế bào trương lên, nhiễm sắc thể phân tán trong tế bào và có thể quan sát nhiễm sắc thể kép, tâm động, thể kèm và đếm được số lượng nhiễm sắc thể Những mẫu

có nhiễm sắc thể nằm phân tán trong tế bào khi xử lý với citrate natri thì được sử dụng để khảo sát hình dạng, số lượng và kích thước của nhiễm sắc thể

- Xử lý với 8 - oxyquinoline

Mẫu vật được xử lý với 8 – oxyquinoline quan sát được thể kèm, đếm được

số lượng nhiễm sắc thể nhưng kích thước tăng lên khoảng 1,5 lần Vì khi xử lý với

8 – oxyquinoline thì kích thước nhiễm sắc thể thay đổi nên không dùng mẫu xử lý với 8 – oxyquinoline để khảo sát hình dạng và kích thước nhiễm sắc thể

Hình 3 Nhiễm sắc thể mang thể kèm

3.1.3 Cố định mẫu vật

Tâm động

Chromatid

Thể kèm

Hình 1 Nhiễm sắc thể kép ở tiền kỳ giữa Hình 2 Nhiễm sắc thể mang thể kèm

Thể kèm

10µm

Chúng tôi chọn Carnoy biến đổi làm dung dịch cố định vì với tính chất thấm nhanh vào mẫu vật và dễ nhuộm sau khi cố định của dung dịch carnoy Những đối

tượng khác nhau sẽ có thời gian cố định khác nhau Đối với hành ta (Allium

ascalonicum L.) chúng tôi chọn thời gian cố định là 4 giờ.

Kết quả cho thấy dung dịch và thời gian cố định trên thích hợp với hành ta

(Allium ascalonicum L.), trên tiêu bản quan sát các tế bào không bị biến dạng

3.1.4 Nhuộm mẫu vật

Khâu quan trọng nhất trong quá trình nhuộm là phải tạo độ tương phản giữa

tế bào chất và nhiễm sắc thể Trong số các loại phẩm nhuộm thì carmine là loại phẩm nhuộm thường được sử dụng để nhuộm nhân tế bào thực vật Trong thí nghiệm nhằm tăng sự bắt màu phẩm nhuộm, chúng tôi sử dụng acetocarmine 1% kết hợp với sắt (III) clorua (FeCl3)

Bảng 3 Nghiệm thức thời gian và nhiệt độ nhuộm mẫu (nhiệt độ phòng thí nghiệm)

30 Nhiễm sắc thể và tế bào chất bắt màu hồng nhạt

60 Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế bào chất bắt màu

hồng nhạt

90 Nhiễm sắc thể bắt màu hồng rất đậm

120 Nhiễm sắc thể và tế bào chất bắt màu hồng rất đậm

Kết luận: Khi nhuộm mẫu vật với acetocarmine kết hợp với dung dịch sắt (III) clorua (FeCl3) trong 60 phút, tế bào có độ tương phản cao, nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế bào chất bắt màu hồng nhạt

3.1.5 Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định

Trong quá trình nghiên cứu muốn giữ lại những mẫu vật tốt để làm tài liệu dùng cho học tập hoặc giảng dạy, tiêu bản tạm thời phải được chuyển thành tiêu bản cố định

Chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định

- Tiêu bản tạm thời được đặt trên băng đá khô trong ngăn lạnh của tủ lạnh,

khoảng 120 – 180 phút, khi tiêu bản đã đóng băng, dùng lưỡi lam gỡ lammelle ra khỏi lame

- Tiến hành khử nước trong các lọ cồn có nồng độ khác nhau từ thấp đến

cao Cụ thể như sau:

Cồn 750 15 giây Cồn tuyệt đối 10giây

Cồn 800 15 giây

Trước khi tìm được nghiệm thức này chúng tôi đã thử rất nhiều nghiệm thức khác Nếu thời gian khử nước trong các lọ cồn quá lâu (nhất là đối với cồn có nồng

độ cao) tế bào sẽ bị teo, ngược lại thời gian khử nước không đủ tế bào sẽ bị mất màu sau vài ngày, thậm chí tế bào có thể bị vỡ do còn nước

Kết quả cho thấy: khi khử nước với nghiệm thức trên tế bào có độ tương phản cao, quan sát rõ nhiễm sắc thể

3.1.6 Làm trong mẫu

Chúng tôi làm trong mẫu trong n – butanol và xylen và kết quả là tế bào quan sát rõ, độ tương phản cao

n – butanol 10 giây

3.2 Nhận diện tiền kỳ giữa của quá trình nguyên phân

Đặc điểm của tế bào ở tiền kỳ giữa của quá trình nguyên phân: Để tiến hành khảo sát kiểu nhân của hành ta Chúng tôi chọn những tế bào ở tiền kỳ giữa và kỳ giữa, vào giai đoạn tiền kỳ giữa của quá trình nguyên nhiễm, các nhiễm sắc thể xoắn cực đại và nằm rải rác chưa tập trung về mặt phẳng xích đạo của tế bào

Hình 4 Tế bào ở tiền kỳ giữa

3.3 Khảo sát kiểu nhân

3.3.1 Hình dạng nhiễm sắc thể

Nhiễm sắc thể được khảo sát ở tiền kỳ giữa (prometaphase) hoặc kỳ giữa (metaphase) của quá trình nguyên phân Lúc này, nhiễm sắc thể có hình dạng đặc trưng của loài

10µm

Allium ascalonicum L.

Kết quả nghiên cứu cho thấy tế bào rễ hành (Allium ascalonicum L.) ở tiền

kỳ giữa hoặc kỳ giữa có nhiễm sắc thể kép gồm 2 chromatid đính nhau ở tâm động (Hình 6) Khi xử lý mẫu với citrat natri 0,1%, quan sát được thể kèm của nhiễm sắc thể và thể kèm luôn xuất hiện trên cặp nhiễm sắc thể có tâm lệch mút (Hình 5)

Theo Rangsiruji et al., (2010), hành ta (Allium ascalonicum L.) là loài có

mang thể kèm trên nhiễm sắc thể và kết quả nghiên cứu cũng quan sát được thể

kèm ở hành ta (Allium ascalonicum L.).

Hình 7 Nhiễm sắc thể mang thể kèm (Nguồn: Rangsiruji et al., 2010)

3.3.2 Số lượng nhiễm sắc thể

Chọn các tế bào ở tiền kỳ giữa (prometaphase) có nhiễm sắc thể phân tán và đếm được Đếm số nhiễm sắc thể trên 30 tế bào, xử lý thống kê tìm giá trị trung bình và phương sai được kết quả như sau:

Hình 5 Nhiễm sắc thể mang thể kèm Hình 6 Nhiễm sắc thể kép ở tiền kỳ giữa

Bảng 4. Thống kế số lượng nhiễm sắc thể

NST: Nhiễm sắc thể

Giả thiết X = 16 với độ tin cậy 1 – α = 95%, ε = 0,34  khoảng ngẫu nhiên

là (15,83 ± 0,34) t = - 0,98  chấp nhận giả thiết số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào bằng 16

Khi khảo sát những tế bào ở tiền kỳ giữa (prometaphase) được xử lý bằng 8 – oxyquinoline hay citrat natri 0,1% đều đếm được số lượng nhiễm sắc thể Ngoài ra, khi xử

lý mẫu với 8 – oxyquinoline còn quan sát được nhiễm sắc thể mang thể kèm (Hình 9)

3.3.3 Kích thước nhiễm sắc thể

+ Đo trên mẫu bằng trắc vi thị kính

Chọn những tế bào ở tiền kỳ giữa có nhiễm sắc thể nằm rải rác, dùng trắc vi thị kính và trắc vị vật kính đo kích thước nhiễm sắc thể, dựa vào kết quả đo, dùng phần mềm photoshop để tách rời từng chiếc nhiễm sắc thể ra, sau đó lập kiểu nhân

và nhiễm sắc đồ của hành ta (Allium ascalonicum L.).

Hình 8 Nhiễm sắc thể được xử lý với

8 - oxyquinoline

Hình 9 Nhiễm sắc thể được xử lý với

citrat natri 0,1%

Thể kèm

5 6

7 1

10 9

8 3

11 12

13

14 15

16

1

2

3 4 5

7

6

8 9

11 10

14

12 13 15

16

Hình 10 Nhiễm sắc thể ở tiền kỳ giữa

Bảng 5 Phân loại nhiễm sắc thể hành ta (Allium ascalonicum L.) (Hình 10)

Cặp

NST Vị trí tâm động L (µm) S (µm) C (µm) (µm)SAT L/S (µm)

L: chiều dài cánh dài; S: chiều dài cánh ngắn; C: Tổng chiều dài NST; SAT: chiều dài thể kèm; L/S: tỉ lệ cánh

Hình 11 Kiểu nhân của hành ta (Allium ascalonicum L.)

+ Đo trên ảnh

Hình 12 Nhiễm sắc thể ở tiền kỳ giữa

Bảng 6 Phân loại nhiễm sắc thể hành ta (Allium ascalonicum L.) (Hình 13)

Cặp Vị trí tâm động L (cm) S (cm) C (cm) SAT (cm) L/S

10µm

10µm