PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO

Xuất phát từ ý tưởng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự do”; với mục đích là thu nhận được chủng Azotobacter và A

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH

LỜI CẢM ƠN

Em xin gởi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy, truyền đạt và trang bị cho em những kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em xin gởi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Như Nhứt và cô Biện Thị Lan Thanh

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em có cơ hội làm việc, học tập và thực hiện tốt đề tài tốt nghiệp

Em chân thành cảm ơn kỹ sư Đỗ Hoành Quân đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Anh như một người thầy, người bạn đã sẵn sàng giúp

đỡ và chia sẻ với em những khó khăn, bế tắc khi thực hiện đề tài này

Xin gởi lời cảm ơn đến:

Những người bạn của lớp DH06SH đã cùng tôi san sẻ những buồn vui, cùng nhau học tập và trao đổi kiến thức trong suốt thời sinh viên

Toàn thể nhân viên Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường đã chỉ dạy, hỗ trợ cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Đặc biệt cho con gởi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến gia đình nhất là Mẹ

đã luôn bên cạnh, tin tưởng, ủng hộ con và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con để con

có thể vững bước đến ngày hôm nay

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010

Phạm Ngọc Hà

TÓM TẮT

Trong khí quyển, nitơ là một trong những nguyên tố dồi dào nhất, nó chiếm tới 80

% thể tích khí quyển, tuy nhiên thực vật lại không thể sử dụng trực tiếp được Một vấn đề cần đặt ra là làm sao để sử dụng nguồn đạm phong phú này một cách hiệu quả và hữu ích cho cây trồng Xuất phát từ ý tưởng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự do”; với mục đích là thu nhận được

chủng Azotobacter và Azospirillum có khả năng cố định đạm tốt để biến nitơ trong khí

quyển thành dạng nitơ hữu ích cho cây trồng

Để thực hiện mục đích trên, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp chính sau: phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân lập và làm thuần, xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục, xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

Với những phương pháp trên, chúng tôi thu nhận được một số kết quả sau: phân

lập được 20 chủng trên môi trường đặc trưng cho Azotobacter và 30 chủng trên môi trường đặc trưng cho Azospirillum Trong đó, đã chọn ra được hai chủng có những đặc trưng giống với Azotobacter có kí hiệu là Az 2.2 và Az 5.1 phát triển và cố định đạm tốt

trên môi trường Fedorow với nguồn carbon là 2 - 2,5 % mannitol, pH tối ưu 7 - 8, thời gian nuôi cấy thích hợp là 120 giờ Hai chủng được chọn lọc khác có những đặc điểm

tương tự với giống Azospirillum có kí hiệu là As 2.5 và As 4.1; chúng phát triển và cố

định đạm tốt trên môi trường NFb với nguồn carbon là 1 % sucrose, pH tối ưu 7 - 7,5, thời gian nuôi cấy thích hợp là 120 giờ

SUMMARY

In the atmosphere, nitrogen is one of the abundant elements, occupy 80% of the atmosphere volumn However, plants are not able to absorb directly The problem is offered is how to use the rich source of nitrogen efficiently and to be useful for plants Therefore, we carried out the thesis “ Isolation, selection and collection biomass free

nitrogen-fixing organism” to collect Azotobacter and Azospirillum strains and to produce

bioproduct being able to fix nitrogen well to transfer from molecular nitrogen in the atmosphere to useful nitrogen for plant

For the above purpose, some main methods were used There included collecting sample, isolating and homogenizing, determining cellular density by the optical density method, determining total nitrogen the Kjeldahl method

By the mentioned methods, we collected results such as: isolated 20 strains by

Azotobacter’s selective medium and 30 strains by Azospirillum’s selective medium There

were 2 strains having specific characteristics similar to Azotobacter They were named Az

2.2 and Az 5.1 developing and fixing nitrogen well in Ferodow medium with 2 - 2,5 % mannitol, optimal pH 7 - 8, and a 120-hour incubation period was Two different selected

strains named As 2.5 and As 4.1 had specific characteristics similar to Azospirillum; they

developed and fixed nitrogen fairly well in NFb medium with 1% sucrose, optimal pH 7 - 7,5, a 120-hour incubation period

Key words: Azotobacter, Azospirillum, free nitrogen-fixing organism

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nguồn nitơ trong tự nhiên 3

2.2 Vai trò của nitơ đối với thực vật 5

2.3 Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 6

2.3.1 Quá trình khoáng hóa 6

2.3.2 Quá trình phản nitrat hóa 6

2.3.3 Quá trình cố định nitơ phân tử 6

2.4 Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ 8

2.4.1 Phân loại 8

2.4.2 Đặc điểm 8

2.4.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên 9

2.5 Đặc điểm của một số loài vi sinh vật cố định đạm 9

2.5.1 Azotobacter 9

a Đặc điểm hình thái 9

b Đặc điểm phân loại 10

c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 11

2.5.2 Azospirillum 14

a Đặc điểm hình thái 14

b Đặc điểm phân loại 15

c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 16

2.6 Ứng dụng của Azotobacter và Azospirillum 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Vật liệu 21

3.2.1 Mẫu thí nghiệm 21

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 21

3.2.3.Các môi trường dùng cho thí nghiệm 21

3.3 Phương pháp thí nghiệm 22

3.3.1 Tăng sinh vi khuẩn 22

3.3.2 Phương pháp định lượng vi sinh vật 23

3.3.3 Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 23

3.3.4 Thí nghiệm 1: phân lập và làm thuần 24

3.3.4.1 Lấy mẫu 24

3.3.4.2 Phân lập Azotobacter 24

3.3.4.3 Phân lập Azospirillum 24

3.3.5 Thí nghiệm 2 25

3.3.6 Thí nghiệm 3 25

3.3.6.1 Quan sát hình thái tế bào, xác định Gram 25

3.3.6.2 Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn đã chọn lọc 26

a Thử nghiệm khả năng sử dụng carbon 26

b Thí nghiệm xác định quan hệ đối với oxy 26

c Thử nghiệm oxydase 27

d Thí nghiệm xác định khả năng tạo thành indol 28

e Thử nghiệm tính di động trong môi trường thạch mềm 29

3.3.7 Thí nghiệm 4 29

a Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon 29

b Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ carbon 29

c Khảo sát ảnh hưởng của pH 30

d Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1.Kết quả 31

4.1.1.Thí nghiệm 1: phân lập và làm thuần 31

4.1.2 Thí nghiệm 2 33

4.1.3 Thí nghiệm 3 36

4.3.5 Thí nghiệm 4 38

a Ảnh hưởng của nguồn carbon 38

b Ảnh hưởng của nồng độ carbon 42

c Ảnh hưởng của pH 46

d Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49

4.2 Thảo luận 53

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

ACC deaminase 1-aminocyclopropane-1-carbonxylate deaminase

NCBI National Center for Biotechnology Information

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng nitơ được cố định 5

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 13

Bảng 2.3 Các loài Azospirillum 16

Bảng 2.4 Những đặc điểm sinh lý, sinh hóa 18

Bảng 3.1 Các môi trường dùng cho thí nghiệm 21

Bảng 4.1 Giá trị pH của 20 mẫu đất đã thu thập 31

Bảng 4.2 Danh mục các chủng vi sinh vật 32

Bảng 4.3 Danh mục các chủng vi sinh vật 33

Bảng 4.4 Hàm lượng nitơ của 20 chủng 34

Bảng 4.5 Hàm lượng nitơ của 30 chủng 35

Bảng 4.6 Kết quả nhuộm Gram 37

Bảng 4.7 Kết quả thử nghiệm sinh lý, sinh hóa 38

Bảng 4.8 Hàm lượng nitơ tổng số 38

Bảng 4.9 Mật độ tế bào của 2 chủng Az 39

Bảng 4.10 Hàm lượng nitơ tổng số 40

Bảng 4.11 Mật độ tế bào của 2 chủng As 41

Bảng 4.12 Hàm lượng nitơ tổng số 42

Bảng 4.13 Mật độ tế bào của 2 chủng Az 43

Bảng 4.14 Hàm lượng nitơ tổng số 44

Bảng 4.15 Mật độ tế bào của 2 chủng As 45

Bảng 4.16 Hàm lượng nitơ tổng số 46

Bảng 4.17 Mật độ tế bào của 2 chủng Az ở các pH 47

Bảng 4.18 Hàm lượng nitơ tổng số của 2 chủng As ở các pH 48

Bảng 4.19 Mật độ tế bào của 2 chủng As ở các pH khác nhau 48

Bảng 4.20 Hàm lượng nitơ tổng số 49

Bảng 4.21 Mật độ tế bào ở các thời gian khác nhau của 2 chủng Az 50

Bảng 4.22 Hàm lượng nitơ tổng số 51

Bảng 4.23 Mật độ tế bào ở các thời gian khác nhau của 2 chủng As 52

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quá trình tuần hoàn đạm 3

Hình 2.2 So sánh giữa cây lúa thiếu nitơ 5

Hình 2.3 Chu trình nitơ trong tự nhiên 7

Hình 2.4 Cấu trúc hoàn chỉnh của nitrogenase 8

Hình 2.5 Tế bào Azotobacte 9

Hình 2.6 Tế bào Azospirillum 15

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 22

Hình 4.1 Biểu đồ hàm lượng nitơ 20 chủng vi khuẩn 34

Hình 4.2 Biểu đồ hàm lượng nitơ 30 chủng vi khuẩn 35

Hình 4.3 Khuẩn lạc của các chủng chọn lọc 36

Hình 4.4 Nhuộm Gram các chủng chọn lọc 37

Hình 4.5 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau 39

Hình 4.6 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 40

Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn carbon 41

Hình 4.8 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 41

Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng của các nồng độ mannitol 43

Hình 4.10 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 44

Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng của các nồng độ sucrose 44

Hình 4.12 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 45

Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng của các giá trị pH 46

Hình 4.14 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 47

Hình 4.15 Biểu đồ ảnh hưởng của các giá trị pH 48

Hình 4.16 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 49

Hình 4.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 50

Hình 4.18 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 51

Hình 4.19 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 52

Hình 4.20 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào 53

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí

N2 với liên kết 3 rất bền vững (N≡N), ở dạng này thực vật không thể sử dụng trực tiếp được Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong phân tử N2, tạo ra các loại đạm dễ tiêu như urê, nitrat…

Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của nhiều chất xúc tác Do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém, ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người

Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, việc nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ khí quyển vào đất mà không gây tác động xấu đến môi trường và sức khỏe con người đã và đang được nghiên cứu Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase của chúng

Azotobacter và Azospirillum là hai giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng

làm giàu nguồn đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được Chúng có khả năng này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N2 trong không khí thành NH3

dưới tác dụng của enzyme nitrogenase Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng, khoáng của thực vật (NO3-, PO43-, K+, Fe2+) và sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (IAA, ILA…) Hai vi sinh vật trên phân

bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao Do đó, việc phân lập và tuyển chọn chủng giống

có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan trọng

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn

và thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự do”

1.2 Yêu cầu

™ Phân lập các chủng Azotobacter và Azospirillum có khả năng cố định đạm

™ Tuyển chọn và thu nhận sinh khối một số chủng vi khuẩn Azotobacter và

Azospirillum có hoạt tính cố định đạm cao để ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh

1.3 Nội dung thực hiện

™ Phân lập, làm thuần các chủng vi sinh vật từ các mẫu đất thu thập tại các vùng khác nhau trên môi trường chuyên biệt

™ Chọn lọc các chủng Azospirillum và Azotobacter có khả năng cố định đạm cao

™ Quan sát hình thái tế bào, xác định Gram và một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chính của các chủng vi khuẩn chọn lọc

™ Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và khả năng cố định đạm (nguồn carbon, nồng độ carbon, pH, thời gian nuôi cấy) của các chủng chọn lọc

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn nitơ trong tự nhiên

Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH4+, NO2-, NO3- Trong đất có 2 dạng nitơ tồn tại đó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ trong xác, chất bài tiết

từ sinh vật Các hợp chất chứa nitơ trong xác và chất bài tiết của động vật và thực vật bị một số loại nấm và vi khuẩn phân giải

Trong đất thông khí tốt, amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat Phần lớn hợp chất nitrat được thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất đi do mưa rửa trôi và tác dụng của phản nitrat hóa Khi nước trong đất ở trạng thái bão hòa do mưa hoặc ngập nước, do thiếu oxy mà sinh ra phản nitrat hóa

Hình 2.1 Quá trình tuần hoàn đạm chủ yếu trong tự nhiên

Hình 2.1 là quá trình tuần hoàn đạm chủ yếu trong tự nhiên Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất, một phần như gốc rễ được trả lại đất, phần còn lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết và xác trả lại đất Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành đạm ở dạng hữu hiệu

Trên thực tế trong tuần hoàn này đạm bị mất đi khá nhiều Phần lớn phân người và gia súc theo nước chảy ra biển do tưới, do mưa mà số lượng lớn đạm trong đất bị rửa trôi, cuối cùng chảy vào biển Số đạm này, một phần được trả lại bằng phân bón có nguồn gốc

từ sản phẩm của biển, nhưng phần rất lớn là ở dạng mà thực vật lục địa hầu như không thể

sử dụng được nữa, nghĩa là bị loại ra khỏi hệ thống tuần hoàn

Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N2) chiếm khoảng 80 %, ở dạng nguyên tử kép (N2) được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N) Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO3- và NH4+ Để sử dụng được nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con đường chính

từ đó gây hại thậm chí là tiêu diệt các sinh vật Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa học gây hại rất lớn đối với cá, động vật thân mềm và con người Một ví dụ cụ thể ở những người sống ở nông thôn và sử dụng giếng nước chứa nitrat cao thì thường có hiện tượng oxy kết hợp với hemoglobin (gọi là hiện tượng Methemoglobinemia) điều này gây hại đến tế bào máu Ngoài ra, việc lạm dụng phân đạm tổng hợp hóa học còn gây tác hại cho đất (như đất bị bạc màu, chua, chai…) hay ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm (như việc tồn dư các hợp chất chứa đạm)

™ Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện được một quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ Việc sử dụng phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật trên vẫn đảm bảo cho năng suất cây trồng khi hạn chế sử dụng phân bón hóa học lại cho sản phẩm rất an toàn, lượng nitrat giảm đáng kể, đất không

bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật

có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn Ngoài

ra, còn có các con đường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy

Bảng 2.1 Hàm lượng nitơ được cố định bởi các con đường khác nhau

(10 12 g/năm) Không phải con đường sinh học

2.2 Vai trò của nitơ đối với thực vật

Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp

lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao động từ 1 - 3

% Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong

đời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của cây trồng Thiếu nitơ, cây

sinh trưởng kém, chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân

cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên năng suất giảm Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh

hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất của cây trồng

Cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ đổ, giảm năng suất nghiêm

trọng và đôi khi không có thu hoạch

Hình 2.2 So sánh giữa cây lúa thiếu nitơ (trái) và được cung cấp đầy đủ nitơ (phải)

2.3 Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên

2.3.1 Quá trình khoáng hóa

Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần thể

vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau Giai đoạn này có sự tham gia của các

chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia

vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3-), một dạng thích hợp

để cho cây trồng hấp thu

2.3.2 Quá trình phản nitrat hóa

Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ

2.3.3 Quá trình cố định nitơ phân tử

Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme nitrogenase mới

Hình 2.3 Chu trình nitơ trong tự nhiên.

™ Cơ chế cố định đạm của vi sinh vật

Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:

N2 + 8 H+ + 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3 trong sự hiện diện của ATP và chất khử như dithionite trong phòng thí nghiệm hay ferredoxin trong cơ thể sống Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi 2 thành phần, đó

là protein có phân tử nhỏ Một thành phần gọi là protein sắt - molypden (Mo - Fe protein) còn gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II Thành phần I và thành phần II của nitrogenase đều rất mẫn cảm với oxy, vì vậy nên hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí

Hình 2.4 Cấu trúc hoàn chỉnh của nitrogenase

2.4 Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ

là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn

và thực vật được xem như là sự tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh Hầu hết những vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu; hay xạ khuẩn - vi khuẩn Gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây thân gỗ, cây 2 lá mầm và cây bụi Ban

đầu, những vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu được phân loại thành chi Rhizobium, do đó,

những vi khuẩn này thường được nói đến như là những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia) Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ Đậu được phân loại thành nhiều chi, trong đó,

hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium, Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và

Bradyrhizobium

™ Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do (không cộng sinh) là những vi khuẩn cố định đạm không xâm nhập vào thực vật theo hướng cộng sinh chuyên biệt Trong số này quan

trọng nhất là loài thuộc chi Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas và Clostridium

2.4.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên

Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cung cấp đạm cho cây trồng Tuy nhiên, bên cạnh đó, các vi khuẩn cố định nitơ còn được biết đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như: kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng cách tạo ra các enzyme như ACC deaminase, hay tạo ra các hormon thực vật như IAA, cytokinin và GA3; Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân chống lại bệnh sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ

2.5 Đặc điểm của một số loài vi sinh vật cố định đạm

2.5.1 Azotobacter

Azotobacter được phân lập và nuôi cấy thuần

khiết từ năm 1901 do nhà vi sinh vật Hà Lan Beijerinck

Đó là loài Azotobacter chroococcum Về sau người ta

tìm thấy nhiều loài khác trong giống Azotobacter

a Đặc điểm hình thái

sinh bào tử Tế bào sinh sôi nảy nở theo lối phân cắt giản

đơn

Hình 2.5 Tế bào Azotobacter

trên kính hiển vi (×1000) Chúng không tạo bào tử nhưng tạo thành bào xác (kyste, cyste), có thành mỏng,

có tính đa hình Vi khuẩn này thuộc loại hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong điều

kiện vi hiếu khí Tế bào vi khuẩn có dạng từ hình cầu đến hình que Khi còn non tế bào có dạng hình que đầu tròn

Hầu hết các loài Azotobacter đều có lông roi (flagella) nhưng chỉ có A agile và A

vinelandii là có sự di động rõ ràng Sự sắp xếp của lông roi có rất nhiều tranh cãi nhưng

theo quan sát của Hofer, Krasilnikov và cộng sự bằng kính hiển vi thì hầu hết Azotobacter

có lông roi nằm ở bên; ngoại trừ A insique có lông roi nằm ở 1 cực và A nigricans có

lông roi dạng hình nhẫn đặc biệt (peculiar ring-shaped configuration) Kích thước trung bình khoảng 2,0 - 7,0 µmvà 1,0 - 2,5 µm, đôi khi có chiều dài đạt đến 10 - 12 µm Khi

già, tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng hình

cầu Sinh chất xuất hiện nhiều hạt, đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan

sát dưới kính hiển vi, cho thấy khi già tế bào Azotobacter được bao bọc bởi một lớp vỏ

nhầy khá dày, vỏ nhầy đó chứa khoảng 75 % là chất hydrid của uronic acid và chỉ chứa khoảng 0,023 % nitơ

Ngoài ra, trong các bình nuôi cấy có thể thấy xuất hiện những dạng khổng lồ của tế

bào Azotobacter; cũng có khi xuất hiện những dạng nhỏ bé đến 0,2 µm, thậm chí đôi khi

xuất hiện cả những dạng qua lọc hết sức nhỏ bé Khi gặp điều kiện thuận lợi, các dạng này có thể nhanh chóng phát triển thành các tế bào bình thường Tóm lại, hình dạng tế bào

Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện

phát triển

Trên các môi trường không chứa nitơ, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng tròn, lồi,

đôi khi nhăn nheo và xuất hiện màng bao nhầy nhớt Khi nuôi cấy lâu trên môi trường

đặc, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc màu nâu đen (tùy loài Azotobacter)

b Đặc điểm phân loại

Theo Becking (1974), Azotobacter có 4 loài: A chroococcum, A beijerinckii, A

vinelandii, A agilis

9 Azotobacter chrococcum: có kích thước tế bào 2,0 × 3,1 μm, tạo nang xác, có khả

năng di động được, có tiên mao Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường Có khả năng đồng hóa mannitol, tinh bột, glucose…

9 Azotobacter beijerinskii: có kích thước tế bào 2,4 × 5,0 μm, có khả năng tạo nang

xác, không có lông roi, không di động được Khi già có màu vàng hoặc màu nâu, sắc

tố không khuếch tán vào môi trường Có khả năng đồng hóa mannitol không đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri

9 Azotobacter vinelandii: tế bào có kích thước 1,5 × 3,4μ , có khả năng tạo nang xác, m

có tiên mao, có khả năng di động Loài này sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố này khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannitol và benzoat natri

9 Azotobacter agllis: tế bào có kích thước 2,8 × 3,3 μm Không tạo nang xác, có lông

roi, có khả năng di động được Khi già khuẩn lạc có màu vàng lục huỳnh quang, sắc

tố khuếch tán vào môi trường Không có khả năng đồng hóa benzoat natri, mannitol

c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Azotobacter có khả năng cố định nitơ, sự cố định nitơ của chúng có liên quan tới

sự tăng nhanh số lượng tế bào, thông thường có thể cố định được 15 - 20 mg nitơ trên mỗi gram glucose, sucrose hay mannitol dưới điều kiện tối ưu Thí nghiệm của Fischer với 48

dòng A chroococcum trong 7 ngày đã thu được lượng nitơ nằm trong khoảng 13 - 19,5

mg (trung bình là 17,8 mg) trên gram mannitol Đối với các nguồn carbon khác như acetic acid, lactic acid và gluconic acid trong môi trường có bổ sung đầy đủ molypden thì

Azotobacter có thể cố định được 10 - 13 mg trên mỗi gram carbon Khi sống trong môi

trường có nguồn nitơ hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất thấp hoặc không

có Trên các môi trường không chứa nitơ, khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo Một số chủng Azotobacter có khả năng sử dụng nitrit, nitrat Hai loại amino acid thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter là glutamic acid

và asparaginic acid

Vi khuẩn Azotobacter có khả năng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau:

alcohol (ethanol, propanol, butanol, 2,3 - butylene glycol, glycerol, sorbitol, mannitol, inositol), dạng muối Na hay Ca của acid hữu cơ (acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, lactic acid, glyceric acid, pyruvic acid, malic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, oxalacetic acid, citric acid, tricarballylic

acid, gluconic acid và saccharic acid), các mono-, di- và trisaccharide (glucose, fructose, galactose, sorbose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, trehalose, melizitose, raffinose)

và các loại polysaccharide (dextrin, tinh bột, glycogen) Thêm vào đó, Azotobacter còn có

khả năng sử dụng benzoic acid, salicylic acid thậm chí là phenol Chúng không có khả năng sử dụng methanol, formic acid, oxalic acid, erythritol, xylose, arabinose (rhamnose

và mannose) Do đó, Azotobacter phát triển mạnh ở môi trường giàu chất hữu cơ dễ đồng

hóa Đất có bón phân xanh, phân chuồng, rơm rạ có khả năng thúc đẩy sự phát triển của

Azotobacter Trong đất, Azotorbacter đồng hóa rất tốt các sản phẩm phân giải của

cenlulose

Sự phát triển của Azotobacter cũng rất cần những yếu tố khoáng sau: P, S, K, Ca,

Mg, Fe và Mo Azotobacter mẫn cảm cao đối với P, Ca Chúng có thể sử dụng P ở dạng

phosphate, glycerolphosphate và 1,6 - hexosediphosphate Quá trình cố định nitơ của

Azotobacter chỉ bắt đầu xảy ra khi nồng độ PO43- đạt đến 4 mg trong 100 ml môi trường Ngược lại, khi nồng độ PO43- đạt tới 800 mg trong 100 ml quá trình cố định N sẽ bắt đầu ngừng lại Những điều tra ở Việt Nam cho thấy trong đất có lượng chứa CaO cao hơn 0,4

% luôn có mặt một số lượng lớn các tế bào Azotobacter, chúng hầu như không phát triển

trong đất có có chứa lượng CaO dưới 0,25 % (Nguyễn Lân Dũng, 1965) Ca cần thiết thường được bổ sung dưới 2 dạng calcium carbonat và calcium diphosphate (CaCO3, CaHPO4) và chỉ có thể thay thế bởi strontium (Burk và Lineweaver) Riêng đối với A

chroococcum, nồng độ CaCl2 thích hợp nhất là 0,01 %, nếu cao hơn sẽ ảnh hưởng không

tốt đối với hoạt động cố định N của chúng, có tác giả đã dùng A chroococum như là loài

vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về vôi của đất Theo Greaves và Anderson, S chỉ được sử dụng ở dạng sulphate; Greene tìm thấy hiệu quả khi bổ sung 0,05 mg S trên gram mannitol Theo Bortels, Krzemieniewski, Kovats và Rippel thì hàm lượng Fe cần thiết cho điều kiện tối ưu là 20 - 40 ppm ở dạng iron (III) sulfate hay iron (III) chloride

hexahydrate Nguyên tố Mg được Azotobacter đòi hỏi với số lượng cao hơn sắt khoảng 10

lần Mg có thể được thay thế bởi Mn Horner và Burk đã có báo cáo cho rằng khi sử dụng

cả Mg và Mn cho A chroococcum thì loài này sẽ tăng trưởng tốt hơn Hàm lượng Mo cần thiết vẫn đang còn có nhiều giả thiết và yếu tố này có thể được thay thế bởi vanadium

Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí có khuynh hướng phát triển trên bề mặt của môi

trường nuôi cấy Meyerhof và Burk nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy với sự phát

triển của A chroococum và đã kết luận rằng chúng phát triển tối ưu ở trong không khí với

20 % O2 nhưng vẫn có thể phát triển ở 0,12 % O2 Williams và Wilson tìm ra rằng ở áp suất O2 là 0,5 atm thì A vinelandii phát triển tốt nhất

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài Azotobacter nói chung

Azotobacter phát triển ở nhiệt độ 10 - 45oC, nhiệt độ tối ưu thông thường là 30oC

Tuy nhiên, nhiệt độ phát triển tối ưu thay đổi theo loài và một vài dòng A chrooccum có

thể phát triển ở 5 - 7oC

Azotobacter rất mẫn cảm với pH Chúng có thể phát triển được ở pH 4,5 - 9,0, nhưng

pH thích hợp nhất đối với Azotobacter là pH 7,2 - 8,2 pH tối ưu của A chroococcum và

A vinelandii là gần 7,5; với A beijerinckii (Yamagata và Itano) là gần 6,8

Azotobacter đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất Ẩm độ thích hợp nhất là 75 - 80 %

Tinh bột Mannitol Ramnose

Di động Flagella (Tiêm mao) Petitrichous (Chu mao) Lophotrichous (Chùm mao) Monotrichous (Đơn mao) Sinh bào xác

Sinh vỏ nhày Thường gặp trong đất Sống ở nước ngọt

Tỷ lệ %GC trong DNA

_ Đen

+ + _ + +

+ + + 65-66

_ Nâu

_ _ _ _

+ + +

66

Lục

_ + + + +

+ + +

66

Trắng

_ _ _ + +

_ + _ + 53-54

Ngoài khả năng cố định đạm, Azotobacter còn có khả năng tiết ra hormon thực vật

(IAA), các vitamin (B1, B6, nicotinic acid, pentotenic acid, biotin…) Bên cạnh đó,

Azotobacter còn có khả năng tiết ra các loại kháng sinh thuộc nhóm Anixomixin để chống

nấm Một số chủng A.chroococum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm có phổ tác dụng khá rộng (ức chế Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria …).

2.5.2 Azospirillum

Vào năm 1922, Beijerinck - nhà vi sinh vật học và thực vật học người Hà Lan đã

phát hiện một chủng vi khuẩn giống với Spirillum trong môi trường thiếu khoáng nitơ có

nguồn carbon là lactate hay malate từ đất vườn Ông nhận thấy rằng khi dùng môi trường trên để nuôi cấy chủng vi khuẩn mới này thì có sự gia tăng hàm lượng nitơ, trong khi đó, trong môi trường không có sự hiện diện của chủng này thì không có biểu hiện như vậy

Do chủng này dễ nuôi cấy trên môi trường muối khoáng với acid hữu cơ và cũng có hình

dạng giống với Spirillum trong những điều kiện nhất định, Beijerinck đã xem chủng này

là một thành viên của chi Spirillum và là sinh vật trung gian kết nối giữa chi Spirillum và

Azotobacter Ban đầu ông đặt tên chủng mới này là “Azotobacter spirillum”, nhưng sau

đó lại đổi tên thành “Spirillum lipoferum” Năm 1932, Schroder đã tiến hành nghiên cứu lại về S lipoferum nhưng hầu hết thất bại khi chứng minh sự cố định nitơ bởi những

chủng vi khuẩn thuần Vì thế chủng này đi vào quên lãng trong nhiều năm Vào năm

1963, Becking đã phân lập được một số vi khuẩn tương tự với S lipoferum có khả năng

cố định nitơ rõ rệt Mười năm sau đó, Favilli đã tiến hành định danh vi khuẩn cố định nitơ

phân lập được từ mẫu đất tại Italy là Spirillum lipoferum và chứng minh được khả năng

cố định nitơ của chủng này trong canh trường lỏng có bổ sung một lượng nhỏ cao nấm men Vào năm 1978, Tarrand và cộng sự đã công bố trong tài liệu nghiên cứu khóa phân

loại di truyền một loài vi khuẩn tên là “Azospirillum lipoferum”, bởi vì loài này có độ tương đồng di truyền cũng như có nhiều đặc điểm tương ứng với mô tả của Beijerinck về

S lipoferum, đặc biệt, chúng hình thành những tế bào có hình dạng giống với Spirillum

trong điều kiện nhất định Cũng trong năm 1978, Tarrand và cộng sự cũng đã phát hiện

thêm loài Azospirillum brasilense

a Đặc điểm hình thái

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Spirillaceae Tế bào có dạng hình cầu, hình

que hay xoắn từ nửa vòng đến vài vòng, kích thước trung bình 0,9 - 1,2 µm, tế bào đôi khi

có Gram thay đổi Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn

bề mặt khuẩn lạc rắn và khô sau vài ngày để trong tủ

ấm Khuẩn lạc của một số dòng có màu hồng sáng đến

hồng đậm trên môi trường phân lập có bổ sung trên môi

trường có bổ sung đỏ công-gô.Trong tế bào có những

hạt poly-β-hydroxybutyrate hiện diện

Hình 2.6 Tế bào Azospirillum

dưới kính hiển vi (×7000)

b Đặc điểm phân loại

Theo bảng phân loại của Bergey thì Azospirillum gồm 5 loài:

9 Azospirillum lipoferum: được phân lập đầu tiên bởi Beijerinck (1925) từ đất cát nghèo nitơ ở Netherlands và được đặt tên là Spirillum lipoferum Loài vi khuẩn này

được phân lập trễ hơn từ đất (Schroder, 1932) và từ rong biển ướt (H C Derx; unpublished; 1949; cited in Becking, 1963) và là vi khuẩn hình cầu có ở cây nhiệt đới (Becking, 1982) Được mô tả chi tiết lần đầu tiên bởi Tarrand: khuẩn lạc có màu hồng, gồ cao, có rìa Khi cấy trên môi trường khoai tây, tế bào có kích thước

trung bình 1,3 - 5 µm A lipoferumm có hình xoắn, di động bằng lông roi, có khả

năng sử dụng glucose, α-aceto glutarate, citrat làm nguồn carbon khi nuôi trên môi trường vô đạm, cần biotin cho sự phát triển

9 Azospirillum brasilense: có đặc điểm hình thái giống A lipoferum, có khả năng sử

dụng glucose, sucrose, α-aceto glutarate Tế bào không có nhiều hình dạng khi môi trường trở nên kiềm

9 Azospirillum irakense: tế bào có chiều rộng 0,6 - 0,9 µm, có khả năng sử dụng

glucose, sucrose Trên môi trường dịch thể không sử dụng được myo-inosytol, có khả năng phân giải pectin

9 Azospirillum halopraeferens: tế bào có chiều rộng 0,7 - 1,4 µm, có khả năng sử

dụng α-aceto glutarate như nguồn carbon Trên môi trường vô đạm không sử dụng glucose, sucrose, cần biotin cho sự phát triển trên môi trường có áp suất cao

9 Azospirillum amzonense: khuẩn lạc màu trắng, lớn, gồ cao, tế bào có chiều rộng

0,8 - 1 µm, có khả năng sử dụng glucose, sucrose trên môi trường vô đạm

Tuy nhiên, theo các nghiên cứu gần đây của các tác giả Magalhaes và cộng sự (1983), Falk và cộng sự (1986), Reinhold và cộng sự (1987), Khammas và cộng sự

(1989), Ben Dekhil và cộng sự (1997) Azospirillum gồm 7 loài đó là Azospirillum

doebereinerae, Azospirillum lipoferum, Azospirillum largimobile, Azospirillum brasilense, Azospirillum amazonense và Azospirillum irakense

Cho đến tháng 6 năm 2008, đã có 12 loài vi khuẩn thuộc chi Azospirillum được

định danh theo nguồn từ ngân hàng dữ liệu gene NCBI Tên các loài vi khuẩn đã định danh được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.3 Các loài Azospirillum đã được định danh (nguồn từ NCBI)

c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Các loài của giống Azospirillum phân bố rất rộng rãi, chúng được phân lập từ vùng

thảo, ngũ cốc, thực phẩm và đất ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới ở các nhiệt độ khác nhau trên khắp thế giới (Dobereiner và cộng sự, 1976; Bally và cộng sự, 1983; Ladha và cộng

sự, 1987; Kirchhof và cộng sự, 1997; Gunarto và cộng sự, 1999) Các loài Azospirillum

cũng được phát hiện trong rễ của các loại cây trên nhưng chúng không tạo ra nốt sần

Tất cả các dòng Azospirillum hoang dại đều có khả năng cố định nitơ như các vi

sinh vật tự do có mối liên hệ với cây trồng và chúng còn tham gia vào sự chuyển hóa trong chu trình nitơ (Heulin và cộng sự, 1989; Hurek và cộng sự, 1988; Tarrand và cộng

sự, 1978)

Azospirillum là sinh vật hóa tự dưỡng (chemoorganotrophic) với oxy là chất nhận

điện tử cuối cùng trong chuỗi trao đổi chất của sự hô hấp, tuy nhiên cũng có một vài dòng

có thể tự dưỡng nhờ hydro tự nhiên

Nhiệt độ phát triển tối ưu nằm trong khoảng 34 - 370C Một vài loài phát triển tốt ở

pH 7, một số khác thì phát triển tốt trong điều kiện pH thấp hơn Chúng đều có phản ứng oxydase dương tính Phát triển tốt trong môi trường có chứa các nguồn carbonhydrate sau: malate, succinate, lactate và pyruvate Một vài dòng yêu cầu biotin

Azospirillum ngoài khả năng cố định nitơ còn sản sinh ra các hormone ngoại tiết có

khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật như: IAA, ILA, cytokinin, GA3… Thêm vào

đó, chúng còn có khả năng khử nitrat, tạo ABA, sản xuất siderophore (hợp chất nhỏ có ái lực với sắt sao) và những phân tử tín hiệu không xác định có thể giúp quá trình trao đổi chất và tăng khả năng hút NO3-, P2O5 và K+ của thực vật bằng cách làm cho rễ cây phát

triển dài ra Điều này có thể do Azospirillum có thể sử dụng enzyme pectinase phân giải

pectin để làm mềm lớp phiến mỏng trên rễ nên tăng khả năng hút khoáng

Bên cạnh đó, Holguin và Glick (2001) đã chứng minh được loài A brasilense có

thể biểu hiện gene ACC - deaminase, kích thích sự phát triển của cây cải dầu và cà chua ACC-deaminase là enzyme phân cắt 1-aminocyclopropan-tiền chất ethylen, giúp giảm hàm lượng ethylen ở thực vật Theo Glick và cộng sự (1998), sự thay đổi nồng độ hormone ethylen ở cây trồng là một cơ chế hữu hiệu kích thích thực vật tăng trưởng

Bảng 2.4 Những đặc điểm sinh lý, sinh hóa chính của các loài Azospirillum

Nhu cầu biotin

Giá trị pH tối ưu

Xuất hiện tế bào dị hình

_

d + + _ + _

d + _

30 6,0-7,0 +

+ + + + + + _

+ + +

37 5,7-6,8 +

+ + + + + + n.d

+ + _

28 n.d

+

n.d

_ + + + _ _

_ + +

41 6,8-8,0 _

_

d + _ _ _ _

_ _ _

37 6,0-7,8 _

d + _ _ + _ +

_ _ _

35 5,7-6,5 _

+ + _ _

d _ +

_ _ _

33 5,5-8,5 +

“_” ít hơn 10% các chủng nghiên cứu có kết quả dương tính; “+”nhiều hơn 90% các chủng

nghiên cứu có kết quả dương tính; “d” khoảng từ 11-89% các chủng nghiên cứu có kết quả

dương tính; “n.d.” không được xác định

2.6 Ứng dụng của Azotobacter và Azospirillum

Việc sử dụng Azospirillum trên cây trồng đã làm tăng rõ rệt sự phát triển của nhiều loại cây Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng sử dụng Azospirillum đã làm tăng trọng

lượng chất khô, tổng số nitơ trong cành non và hạt, tăng tổng số chồi, số bông, sớm hình thành bông ngọn, tăng số bông và hạt trên bông, tăng trọng lượng hạt, tăng chiều cao cây, kích thước lá và tỷ lệ mầm cao (Albrecht và cộng sự, 1981; Baldani và Dobereiner, 1980; Bashan, 1986; Bouton và Zuberer, 1979; Bouton và cộng sự, 1979; Conhen và cộng sự, 1980; Hegazi và cộng sự, 1983; Kapulnik và cộng sự., 1981s; Mertens và Hess, 1984; Millet và Feldmen, 1986; O’Hara và cộng sự, 1981; Pacovsky và cộng sự, 1985b; Schank

và cộng sự, 1981 và 1985; Warembourg và cộng sự, 1987; Yahalom và cộng sự, 1984) Thêm vào đó, chủng vi khuẩn này còn có tác dụng kích thích sự phát triển của hệ thống rễ

như làm tăng chiều dài rễ Azospirillum có thể làm tăng tổng sản lượng cây trồng 10 - 30

% (Kapulnik và cộng sự, 1981; Rao và cộng sự, 1983; Watanabe và Lin, 1984) Hiện nay,

có rất ít phương pháp để sử dụng Azospirillum, phương pháp đơn giản nhất vẫn là chứa

các chủng vi khuẩn trong dịch lỏng và bổ sung trực tiếp trên đất hay hạt Kỹ thuật này được sử dụng trong nhà kính hay thử nghiệm trên đồng ruộng (Albrecht và cộng sự, 1981; Fallik và cộng sự, 1988; Millet và Feldman, 1986; Reynders và Vlassak, 1982; Smith và

cộng sự, 1984) nhưng biện pháp này không cho hiệu quả cao do Azospirillum tồn tại rất ít

trong đất và vắng mặt chất mang Một biện pháp có hiệu quả hơn là sử dụng chất mang hữu cơ (Okon, 1985; Sadasivam và cộng sự, 1986)

Việc ứng dụng của Azotobacter trên cây trồng đã được thử nghiệm thành công

trong phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng (Becking, 1992) Sử dụng vi khuẩn này có lợi cho cây trồng là nhờ sự phân phối nitơ đã cố định của vi khuẩn cho cây, sự tăng khả năng hòa tan của phospho (enhancement of soluble P availability), sinh kháng sinh chống lại các vi khuẩn gây bệnh và nấm (Brown, 1974; Jagnow, 1987; Abbas và Okon, 1993) Sản

phẩm hormone thực vật (IAA) và vitamin hòa tan cũng được tạo bởi Azotobacter, các

chất ngoại sinh này có hoạt tính sinh học làm tăng sự phát triển của cây trồng ở các mức

độ khác nhau (Oertli, 1987; Okon và Itzigsohn, 1995) Ngoài ra, các hormone thực vật và vitamin cũng có tác dụng kích thích sự phát triển của bộ rễ và ảnh hưởng có lợi đến các

vi khuẩn cộng sinh với rễ cây họ Đậu (Brown và Carr, 1984; Martinez-Toledo và cộng

sự, 1991; Rodelas và cộng sự, 1999)

Trên thế giới đã có một thí nghiệm trên thực địa tại Bangladesh chứng minh hiệu

quả thực tế khi áp dụng hai chủng vi khuẩn cố định đạm Azotobacter và Azospirillum trên lúa vụ đông xuân Khi sử dụng Azospirillum trên cây lúa đông xuân với phân đạm dưới

dạng ure ở các mức độ khác nhau (0, 60, 80, 100 và 120 kg/ha thì sản lượng hạt cao nhất

ở lúa có sử dụng Azospirillum và bón phân đạm 100 kg/ha và cao hơn 1,34 tấn/ha so với chỉ sử dụng phân đạm ure 120 kg/ha Tương tự, Azotobacter cũng giúp tiết kiệm 20 kg N/ha và có sản lượng gạo tăng 1,24 tấn/ha Khi sử dụng hỗn hợp Azospirillum và

Azotobacter cũng có kết quả thống kê tương tự

Trong nhiều năm, ở nhiều nước khác nhau, người ta đã sản xuất ở quy mô công

nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm Azotobacter và gọi là azotobacterin Đó là

những dịch nuôi cấy Azotobacter được hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất

hữu cơ đã trung hòa và bổ sung thêm một ít phân P, K… Azotobacterin khi dùng để bón cho cây trồng thường đưa đến những hiệu quả không lớn và không ổn định (nếu có làm tăng sản lượng thường cũng không tăng quá 10 % so với đối chứng) Đa số các tác giả cho rằng hiệu quả của việc sử dụng azotobacterin chỉ tương đối với các đất giàu chất hữu

cơ hoặc trong trường hợp được bón thêm nhiều phân khoáng Có lẽ tác dụng chủ yếu của chúng không phải ở khía cạnh cố định nitơ mà là ở khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây trồng Ở Việt Nam, việc ứng dụng chế phẩm azotobacterin chỉ đạt hiệu quả cao khi bón phân đầy đủ (cần bón vôi và bón phân

lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất) Đối với vi khuẩn Azospirillum, trên thị

trường hiện nay xuất hiện phân bón có tên thương mại là Azogin và Rhizolu

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

™ Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 2/2010 đến tháng 7/2010

™ Các thí nghiệm được thực hiện tại chi nhánh công ty TNHH Gia Tường, tỉnh Bình

Dương

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

Nguồn mẫu thí nghiệm là 20 mẫu đất xung quanh các cây như lúa, ngô, rau khoai

nước… ở một số vùng có diện tích trồng trọt lớn: Hà Nội, Đồng Nai, Long An, Nghệ An,

Lâm Đồng.(Phụ lục B1)

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Bao gồm: bình Kjeldahl, máy Parnas-wargner, tủ hút khí độc (Hoffer), kính hiển vi

(Olympus), cân phân tích, máy đo pH, máy đo quang phổ kế (Spectrophotometer), máy

lắc tròn, máy vortex, nồi hấp vô trùng autoclave, bếp đun, lò microwave, tủ lạnh và một

số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm vi sinh, sinh hóa

3.2.3 Các môi trường dùng cho thí nghiệm

Bảng 3.1 Các môi trường dùng cho thí nghiệm (Phụ lục A1 - 4)

Môi trường Azotobacter Azospirillum

Nhân sinh khối và hoạt hóa

3.3 Phương pháp thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm

3.3.1 Tăng sinh vi khuẩn

Huyền phù hóa sinh khối vi khuẩn trong ống thạch nghiêng với 9 ml nước muối sinh lý, vortex đều, hút 1 ml huyền phù dịch vi khuẩn vào trong erlen chứa 150 ml môi trường Fedorow hoặc NFb đã hấp vô trùng Sau đó, đem đi nuôi cấy trên máy lắc ở nhiệt

Quan sát hình thái tế bào, xác định

Gram và một số đặc điểm sinh lý, sinh

hóa

- Khả năng sử dụng carbon

- Thử nghiệm oxydase

- Khả năng tạo thành indol

- Tính di động trong môi trường thạch

mềm

Những chủng vi khuẩn đã qua sàng lọc

Thí nghiệm 4

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên

sự tăng trưởng và khả năng cố định đạm

Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, vortex đều Hút 1 ml dịch trong ống nghiệm trên cho vào trong erlen chứa 150 ml môi trường Fedorow hoặc NFb lỏng đã được hấp vô trùng Tiến hành ủ trên máy lắc tại nhiệt độ phòng trong vòng 5 ngày

3.3.2 Phương pháp định lượng vi sinh vật

Xác định đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật độ tế bào được biểu thị qua hàm logN/ml

™ Mục đích

Xác định gián tiếp mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp đo độ đục, làm cơ sở để xác định mật độ tế bào trong các thí nghiệm

™ Nguyên tắc

Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và

có độ đục bởi sự hiện diện bởi các phần tử trong môi trường lỏng gây cản trở ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Do vậy, tế bào khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục, độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tuyến tính giữa mật độ

tế bào và độ đục Do vậy có thể định lượng được mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy đo quang phổ kế (Spectrophotometer) ở bước sóng 600 nm

lượng NH3 phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu

và đưa về phòng thí nghiệm nhanh chóng

3.3.4.2 Phân lập Azotobacter

Cân 10 g đất, nghiền mịn cho vào trong erlen chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng, lắc trong 30 phút, để lắng lấy phần dịch bên trên đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau: 10-2, 10-3, 10-4… Ở mỗi nồng độ, hút 0,1 ml dung dịch huyền phù cho vào các đĩa chứa môi trường Ashby đã vô trùng, dùng que trans trải đều

Đem các đĩa này ủ ở nhiệt độ phòng Sau 48 - 72 giờ quan sát, chọn những khuẩn lạc đơn đặc trưng trên môi trường Ashby (những khuẩn lạc màu trắng, vàng hay đen và có màng bao nhầy) đem đi làm thuần bằng cách: cấy ria trên nhiều đĩa, sau 48 - 72 giờ quan sát chọn những khuẩn lạc có đặc điểm như trên tiếp tục ria trên nhiều đĩa (quá trình này được thực hiện lặp lại nhiều lần cho đến khi trên đĩa có các khuẩn lạc đồng nhất) Sau đó cấy vào các ống nghiệm thạch nghiêng và giữ ở trong tủ lạnh để tiến hành các thí nghiệm

3.3.4.3 Phân lập Azospirillum

Cân 10 g đất, nghiền mịn cho vào trong erlen chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng để trên máy lắc trong vòng 30 phút Lấy 1 ml dịch huyền phù vào erlen trên, cho vào erlen chứa 50 ml môi trường chọn lọc NFb bán lỏng (hemi solid - state NFb) Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày

Sau 5 ngày nuôi cấy, chọn những erlen môi trường NFb đục và có sự thay đổi màu (xanh dương) so với màu ban đầu (xanh lá cây) và có sự xuất hiện của lớp màng mỏng (pellicle) Hút 1 ml dịch lỏng chỗ lớp màng mỏng pha loãng ở các nồng độ khác nhau: 10-

2, 10-3, 10-4 Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút 0,1 ml dịch huyền phù trải trên các đĩa chứa môi trường CRA đã vô trùng, dùng que trans trải đều

Đem các đĩa này ủ ở nhiệt độ phòng Sau 48 - 72 giờ quan sát, chọn những khuẩn lạc có màu hồng, đỏ tươi hay đỏ đậm đem đi làm thuần bằng cách: cấy ria trên nhiều đĩa, sau 48 - 72 giờ quan sát chọn những khuẩn lạc có đặc điểm như trên tiếp tục ria trên nhiều đĩa (quá trình này được thực hiện lặp lại nhiều lần cho đến khi trên đĩa có các khuẩn lạc đồng nhất) Sau đó cấy vào các ống nghiệm thạch nghiêng và giữ ở trong tủ lạnh để tiến hành các thí nghiệm

3.3.5 Thí nghiệm 2: chọn lọc các chủng Azotobacter và Azospirillum có khả năng cố

định đạm cao

Các chủng vi khuẩn phân lập được tăng sinh trên các môi trường tương ứng (đối với vi khuẩn phân lập trên môi trường Ashby tăng sinh trên môi trường Fedorow; vi khuẩn phân lập trên môi trường CRA tăng sinh trên môi trường lỏng NFb) Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành xác định hàm lượng nitơ tổng số (mục 3.3.3) Từ đó, chọn ra chủng có khả năng cố định đạm cao và tăng sinh tốt nhất

3.3.6 Thí nghiệm 3: quan sát hình thái tế bào, xác định Gram và một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng chọn lọc

3.3.6.1 Quan sát hình thái tế bào, xác định Gram

™ Mục đích

Trong khóa luận này chúng tôi tiến hành phân lập và nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm

Azotobacter và Azospirillum, cả hai là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi và

đều có dạng hình que hay hình cầu (Azotobacter có dạng hình cầu đến hình que,

Azospirillum có dạng hình que hơi xoắn) có kích thước trung bình khá nhỏ (Azotobacter:

khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài Sau khi nhuộm với crystal violet, mẫu được tiếp tục xử lý với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ crystal violet bên trong tế bào

Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hòa tan lipid và làm tan màng ngoài của thành tế bào Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp crystal violet và tế bào Gram âm bị khử màu, do đó có màu hồng

™ Tiến hành (Phụ lục B4)

3.3.6.2 Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn đã chọn lọc

a Thử nghiệm khả năng sử dụng carbon

Tiến hành tăng sinh các chủng chọn lọc trên môi trường tương ứng (Fedorow và NFb) thay thế nguồn carbon chính của môi trường bằng các nguồn carbon sau: mannitol, malic acid, glucose, tinh bột, rỉ đường, sucrose, lactose ở pH 7 Sau 5 ngày nuôi cấy, quan sát sự đổi màu của môi trường

Với môi trường NFb, khi vi khuẩn có khả năng sử dụng carbon sẽ làm thay đổi pH của môi trường Môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu vàng khi pH acid và từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương khi pH kiềm

Với môi trường Fedorow khi vi khuẩn có khả năng sử dụng carbon thì môi trường sẽ

trở nên đục hơn và sinh sắc tố vàng, nâu hay đen

b Thí nghiệm xác định quan hệ đối với oxy

™ Nguyên tắc

Căn cứ vào quan hệ đối với oxy người ta chia vi sinh vật ra làm 4 nhóm:

Nhóm 1: Hiếu khí (aerobe): không thể phát triển được khi không có oxy

Nhóm 2: Kỵ khí (anaerobe): không thể phát triển được khi có mặt oxy, loại này còn gọi là loại kỵ khí bắt buộc

Nhóm 3: Kỵ khí không bắt buộc (facultative anaerobe): phát triển được cả trong điều kiện hiếu khí lẫn điều kiện kỵ khí

Nhóm 4: Vi hiếu khí (microaerophilic organism): chỉ phát triển khi có một tỷ lệ oxy thấp

Muốn xác định xem một loại vi khuẩn là thuộc nhóm nào có thể làm như sau: chế tạo môi trường thạch - thịt - pepton - glucose (phụ lục A5), phân vào các ống nghiệm (mỗi ống 10ml môi trường) Khử trùng và đợi nguội đến 45oC Dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy vào từng ống trộn đều rồi để cho đông và nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp Sau 3 ngày, lấy

ra quan sát sự phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn thuộc nhóm 1 chỉ phát triển trong lớp thạch trên cùng, nhóm 2 chỉ phát triển trong nhóm thạch dưới đáy sâu, nhóm 3 phát triển khắp môi trường, còn nhóm 4 chỉ phát triển ở lớp thạch cách bề mặt một quãng

c Thử nghiệm oxydase

™ Nguyên tắc

Thử nghiệm này nhằm phát hiện oxydase, một sản phẩm nội bào của vi sinh vật Phản ứng oxydase xảy ra do sự có mặt của hệ thống cytochrom oxydase có khả năng oxy hóa các cytochrom dạng khử bởi oxy phân tử

Tất cả các vi sinh vật nhận năng lượng từ các nguồn vật chất bằng cơ chế hô hấp, đây

là quá trình oxy hóa Hệ thống hô hấp là một chuỗi các enzyme và các chất chịu trách nhiệm cho sự vận chuyển điện tử từ các cơ chất đến oxy phân tử Oxy là chất nhận proton hydro cuối cùng trong chuỗi hô hấp để tạo thành nước hay hydro peroxyde, sản phẩm cuối cùng được hình thành phụ thuộc từng loài vi sinh vật và hệ thống enzyme của chúng

Hệ thống cytochrome thường hiện diện chỉ trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí không bắt buộc Các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc không có hệ thống này Có nhiều loại

hệ thống cytochrome oxydase khác nhau tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật, một số loài chỉ có một oxydase trong khi một số loài khác có hai hay ba oxydase Cytochrom oxydase

là hệ enzyme cuối cùng trong toàn bộ hệ thống cytochrom, ngoài ra còn có các cytochrom khác như b, c1,c

Phát hiện hệ thống cytochrom oxydase nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, đây là một dẫn xuất từ hợp chất phenol amin Cytochrom oxydase không phản ứng trực tiếp với thuốc thử mà phải qua trung gian oxy hóa cytochrom c Quá trình này như sau:

Hợp chất có màu xanh này là một indolphenol blue, đây là một loại thuốc nhuộm có nhân quinon

™ Thực hiện

Lấy một ít sinh khối vi sinh vật đặt lên giấy lọc màu trắng, đánh dấu vị trí đặt sinh khối vi sinh vật Nhỏ lên vị trí đánh dấu 1 giọt thuốc thử N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD), quan sát sau vài phút Phản ứng oxydase dương tính khi sinh khối vi sinh vật chuyển qua màu xanh dương đậm Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng chuyển màu

d Thí nghiệm xác định khả năng tạo thành indol

tỏ có sự xuất hiện của indol (phản ứng dương tính)

2 cytochrom c oxy hóa + H2O

2 cytochrom c oxy hóa + thuốc thử Hợp chất có màu xanh

e Thử nghiệm tính di động trong môi trường thạch mềm

™ Nguyên tắc

Nhằm xác định vi sinh vật có di động hay không di động Vi sinh vật di động thường

là các vi sinh vật có tiêm mao Tiêm mao thường được tìm thấy tại các vi sinh vật hình que Tuy nhiên có một số vi sinh vật hình cầu cũng có khả năng di động Vi sinh vật di động có thể có một hay nhiều lông roi phân bố tại các vị trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật Một số vi sinh vật có thể chuyển từ trạng thái di động sang trạng thái không di động nhưng đa số không có khả năng chuyển từ trạng thái không di động sang trạng thái di động Thông thường các vi sinh vật từ di động thành không di động là do mất lông roi

™ Thực hiện

Cấy đâm sâu vi sinh vật vào trong môi trường thạch mềm chứa 0,5 % agar Ủ qua đêm

ở nhiệt độ thích hợp với tính di động của từng vi sinh vật Quan sát hiện tượng sau khi nuôi cấy Nếu vi sinh vật di động sẽ làm đục môi trường, vi sinh phát triển lan ra khỏi vết cấy Ngược lại vi sinh vật không di động sẽ phát triển xung quanh đường cấy, môi trường không bị đục bởi sinh khối vi khuẩn

3.3.7 Thí nghiệm 4: khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và khả năng cố định đạm

™ Mục đích

Xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng sinh của các chủng chọn lọc

và biết được sự ảnh hưởng của một vài yếu tố: nguồn carbon, nồng độ carbon, giá trị pH

và thời gian nuôi cấy lên khả năng cố định đạm

a Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon

Tiến hành tăng sinh tương tự mục 3.3.6.2a với mật độ tế bào ban đầu khoảng 106 tế bào/ml Sau 5 ngày nuôi cấy, thu canh trường tiến hành xác định mật độ tế bào (mục 3.3.2) và hàm lượng nitơ tổng số (mục 3.3.3) Từ đó, chọn ra được carbon thích hợp nhất cho sự phát triển và cố định nitơ của chủng chọn lọc

b Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ carbon

Tăng sinh các chủng chọn lọc với mật độ tế bào ban đầu khoảng 106 tế bào/ml trên môi trường tương ứng (Fedorow hoặc NFb) chứa nguồn carbon thích hợp nhất vừa được