luận văn thạc sĩ nông nghiệp-chuyên ngành trồng trọt-đánh giá tuyển chọn một số giống cà chua có khả năng chín chậm và kháng virus

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhậnđược sự quan tâm, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng như những ngườithân trong gia đình.Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người đãtận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện đề tài vàhoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Tống Văn Hải và toàn thể cánbộ, nhân viên bộ môn công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa công nghệ sinh học, ĐHNông nghiệp Hà Nội đã rất nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôitrong thời gian thực hiện đề tài tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầycô giáo trường ĐH nông nghiệp Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiếtđể có thể thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, anh em,bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

  

-LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP

“Đánh giá tuyển chọn một số giống cà chua có khả năng

chín chậm và kháng virus”

Chuyên ngành đào tạo: trồng trọt

Mã số:

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phan Hữu Tôn

Người thực hiện: Nguyễn Thị Hải Linh

Hà Nội 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận tốtnghiệp này là khách quan, trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vịnào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong khóa luận đều đã được chỉ rõ nguồngốc

Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Hải Linh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhậnđược sự quan tâm, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng như những ngườithân trong gia đình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người đãtận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện đề tài vàhoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn KS Tống Văn Hải và toàn thể cán

bộ, nhân viên bộ môn công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa công nghệ sinh học, ĐHNông nghiệp Hà Nội đã rất nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôitrong thời gian thực hiện đề tài tại bộ môn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy

cô giáo trường ĐH nông nghiệp Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết

để có thể thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, anh em,bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Hải Linh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 3

1.2.1 Mục đích 3

1.2.2 Yêu cầu 3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây cà chua 4

2.2 Các đặc điểm thực vật học cơ bản của cây cà chua 4

2.3 Yêu cầu của cây cà chua đối với điều kiện ngoại cảnh 5

2.3.1 Nhiệt độ 5

2.3.2 Ánh sáng 6

2.3.3 Nước và độ ẩm 6

2.3.4 Đất và dinh dưỡng 7

2.4 Một số thành tựu về chọn giống cà chua ở Việt Nam 7

2.5 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng virus xoăn vàng lá 9

2.5.1 Nghiên cứu về các nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá 9

2.5.2 Bản đồ phân tử và marker hỗ trợ chọn lọc (MAS) các gen kháng TYLCV 11

2.5.3 Đánh giá các nguồn gen kháng ở các vùng khác nhau 17

2.6 Nghiên cứu về các dạng đột biến liên quan đến sự chín của quả cà chua 19

2.6.1 Ethylene và cơ chế chín của quả 19

2.6.2 Các dạng đột biến liên quan đến sự chín của quả 22

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.1.1 Vật liệu 26

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Các thí nghiệm khảo sát đánh giá tập đoàn cà chua 27

3.3.2 Nghiên cứu phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá và gen chín chậm rin 32

3.3.3 Đánh giá đặc tính chín chậm của các mẫu giống mang gen chín chậm rin 34

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 35

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Khảo sát đánh giá các mẫu giống trong vụ đông xuân (2011) 36

4.1.1 Các giai đoạn sinh trưởng 36

Bảng 4.1 Các giai đoạn sinh trưởng của các mẫu giống vụ đông xuân 2011 36

4.1.2 Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc cây 38

Bảng 4.2 Một số đặc điểm cấu trúc cây của các mẫu giống vụ đông xuân 2011 38

4.1.3 Cấu trúc chùm hoa và đặc điểm nở hoa 41

Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái là, cấu trúc chùm hoa và đặc điểm hoa của các mẫu giống vụ đông xuân 2011 41

4.1.4 Đánh giá tình hình nhiễm bệnh một số bệnh hại chính trên đồng ruộng 43

Bảng 4.4 Tình hình nhiễm virus xoăn vàng lá trên đồng ruộng của các mẫu giống vụ đông

xuân 2011 45

4.1.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 46

Bảng 4.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống vụ đông xuân 2011 .47

4.1.6 Đặc điểm hình thái và chất lượng quả 48

Bảng 4.6.a Một số đặc điểm hình thái quả của các mẫu giống vụ đông xuân 2011 50

Bảng 4.6.b Một số đặc điểm về chất lượng quả vụ đông xuân 2011 52

4.2 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá và gen chín chậm rin 53

4.2.1 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá 53

4.2.2 Kết quả phát hiện gen chín chậm rin 55

4.3 Đánh giá đặc tính chín chậm của quả 55

Bảng 4.7 Đánh giá đặc tính chín chậm quả các giống cà chua mang gen rin 56

4.4 Khảo sát đánh giá một số mẫu giống tốt trong vụ xuân hè muộn (2011) 57

4.4.1 Các giai đoạn sinh trưởng 57

Bảng 4.8 Thời gian các giai đoạn sinh trưởng vụ xuân hè muộn 2011 57

4.4.2 Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc cây 58

Bảng 4.9 Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc cây vụ xuân hè muộn 2011 59

4.4.3 Cấu trúc chùm hoa và đặc điểm nở hoa 59

Bảng 4.10 Cấu trúc chùm hoa và đặc điểm hoa và nở hoa vụ xuân hè muộn 2011 60

4.4.4 Đánh giá khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá trên đồng ruộng 60

Bảng 4.11 Khả năng kháng virus trên đồng ruộng vụ xuân hè muộn 2011 60

4.4.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 61

Bảng 4.12 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống vụ xuân hè muộn 2011 62

4.4.6 Một số đặc điểm hình thái và chất lượng quả 63

Bảng 4.13.a Một số đặc điểm hình thái quả vụ xuân hè muộn 2011 63

Bảng 4.13.b Một số đặc điểm về chất lượng quả vụ xuân hè muộn 2011 64

4.5 Đề xuất một số mẫu giống cà chua triển vọng 65

Bảng 4.14 Các mẫu giống triển vọng trong vụ đông xuân 2011 66

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

4.1 Kết luận 67

4.2 Kiến Nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Các giai đoạn sinh trưởng của các mẫu giống trong vụ đông xuân (2011) .36

Bảng 4.2 Một số đặc điểm cấu trúc cây 38

Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái là, cấu trúc chùm hoa và đặc điểm hoa 41

Bảng 4.4 Tình hình nhiễm virus xoăn vàng lá trên đồng ruộng 45

Bảng 4.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 47

Bảng 4.6.a Một số đặc điểm hình thái quả 50

Bảng 4.6.b Một số đặc điểm về chất lượng quả 52

Bảng 4.7 Đánh giá đặc tính chín chậm quả các giống cà chua mang gen rin 56

Bảng 4.8 Thời gian các giai đoạn sinh trưởng vụ xuân hè muộn 2011 57

Bảng 4.9 Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc cây vụ xuân hè muộn 2011 58

Bảng 4.10 Cấu trúc chùm hoa và đặc điểm hoa và nở hoa vụ xuân hè muộn 2011 60

Bảng 4.11 Khả năng kháng virus trên đồng ruộng vụ xuân hè muộn 2011 60

Bảng 4.12 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống vụ xuân hè muộn 2011 61

Bảng 4.13.a Một số đặc điểm hình thái quả vụ xuân hè muộn 2011 63

Bảng 4.13.b Một số đặc điểm về chất lượng quả vụ xuân hè muộn 2011 64

Bảng 4.14 Các mẫu giống triển vọng trong vụ đông xuân 2011 65

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm sắc thể số 11 20

Hình 2.2 Bản đồ gen Ty-3 trên nhiễm sắc thể số 6 21

Hình 2.3 Bản đồ phân tử gen Ty-4 trên nhiễm sắc thể số 3 22

Hình 2.4 Bản đồ khoảng cách cM giữa các marker gen Ty-5 trên nhiễm sắc thể 4 24

Hình 2.10 Bản đồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua 27

Hình 2.11 Sơ đồ vị trí của các cặp mồi phát hiện gen rin và mc 28

Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen Ty-3 bằng cặp mồi P6-25F2/R5 59

PHẦN I MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Cây cà chua (Licopersicon esculentum Mill.) thuộc họ cà (Solanaceae) có

nguồn gốc từ Châu Mỹ, là một trong những loại rau phổ biến và được trồng rộng rãi ởrất nhiều nước trên thế giới Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, chứanhiều vitamin và chất khoáng có lợi cho sức khỏe con người Về chế biến, nó cũngchiếm tỷ lệ lớn nhất trong các loại rau quả Quả cà chua có thể sử dụng dưới nhiềuhình thức khác nhau như: sử dụng quả tươi, nấu canh, sốt cà chua, nước quả, bộtnhuyễn, tương, sấy khô, mứt, đóng hộp v v

Cà chua quả tươi và các sản phẩm chế biến không những là mặt hàng xuất khẩu

có giá trị mang lại hiệu quả kinh tế cao ma còn có giá trị quan trong về mặt y học trongviệc ngăn ngừa một số bệnh, được trồng với diện tích lớn

Sản xuất cà chua ở miền Bắc nước ta khá thuận lợi đặc biệt là vụ đông xuân nênloại rau này được trồng chủ yếu từ tháng 10 đến tháng 4 năm sau (chiếm 70% sảnlượng thu hoạch) Cà chua vụ đông xuân cho năng suất và chất lượng khá cao Tuynhiên do thu hoạch tập trung nên giá cả tương đối thấp ảnh hưởng đến thu nhập củangười sản xuất Trong khi đó, từ tháng 6 đến tháng 9 do thời tiết nóng bức mà nhu cầu

cà chua ăn tươi, làm nước giải khát hay phục vụ chế biến và công nghiệp đồ hộp lại rấtcao, thực tế cà chua ở thời điểm này rất khan hiếm, giá lúc này tăng gấp 2-3 lần so vớithời điểm chính vụ Vì thế, đã có nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ cà chua nhưtrồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới và dùng các giống chịu nóng, úng và sâubệnh, tuy nhiên chi phí cho sản xuất cao mà về năng suất và chất lượng không đạtChính vì thế, chọn tạo giống cà chua có đặc tính chín chậm là một giải pháp ưu việthơn cả Cà chua chứa gen chín chậm sẽ giúp quả cà chua có thời gian sử dụng lâu hơn

và có nhiều thuận lợi cho nhà sản xuất và người tiêu dùng, giúp giảm đáng kể thiệt hạisau thu hoạch Quả cà chua chuyển gen có độ cứng cao hơn cà chua thông thường do

đó nó không bị thối dập trong khi di chuyển, kéo dài được thời gian bảo quản cũngnhư thời gian sử dụng mà quả cà chua vẫn đảm bảo chất lượng như mong muốn

Chính vì thế, chọn tạo giống cà chua có đặc tính chín chậm là một giải pháp ưuviệt hơn cả Cà chua chứa gen chín chậm sẽ giúp quả cà chua có thời gian sử dụng lâuhơn và có nhiều thuận lợi cho nhà sản xuất và người tiêu dùng, giúp giảm đáng kể thiệthại sau thu hoạch Quả cà chua chuyển gen có độ cứng cao hơn cà chua thông thường

do đó nó không bị thối dập trong khi di chuyển, kéo dài được thời gian bảo quản cũngnhư thời gian sử dụng mà quả cà chua vẫn đảm bảo chất lượng

Hiện nay Việt Nam chưa có giống nào có đặc tính chín chậm của quả, vì thế vẫnchưa đáp ứng được nhu cầu của thị trường Trong đó, nhiều nước đã chọn tạo và pháttriển được một số giống cà chua có tính chín chậm hoặc không chín Những giống càchua có đặc tính này quả dù đạt kích thước và tích lũy đủ chất khô nhưng không chíntrên cây do mất hoặc giảm khả năng sinh tổng hợp ethylene – là hoocmon tín hiệu giúphoạt hóa nhiều enzyme xúc tiến cho quá trình làm quả chín của quả Tính chín chậm

hoặc không chín là do các gen Gr, rin, Nr – 2 và NR quy định, điều khiển quá trình

hình thành ethylene ở cà chua, hiện nay người ta đã tìm thấy một số chỉ thị phân tửDNA phát hiện và chọn lọc các gen chín chậm này

Một hiện trạng điển hình nữa về sản xuất cà chua nói chung hiện nay trongnước cũng như toàn thế giới, đó là việc đương đầu với sự hoành hành của virut gâyhại Đặc biệt là sự xuất hiện viirut xoăn vàng lá Cây cà chua bị nhiễm virut này sẽphát triển chậm chạp và còi cọc hoặc trở nên lùn hẳn Những lá non bị xoắn vào trong

và hướng lên trên Lá thường cúp xuống và cứng lại chứ không mềm rũ như khi cây bịkhô héo Cây bệnh hầu như sẽ không cho quả, làm thiệt hại 70 – 80% tổng sản lượng.Bệnh thường phát sinh và gây hại nặng vào mùa khô, khi trồng cà chua trái vụ, sớmhoặc muộn Bệnh lây lan rất nhanh, dự báo 1, 2 năm tới có nguy cơ thành dịch hạinguy hiểm Tuy nhiên, virut gây bệnh xoăn vàng lá không lây truyền qua hạt, đất, tiếpxúc cơ học… Chúng nằm ở trong cây nhiễm bệnh và được lây truyền bởi vector bọphấn trắng Hiện nay, người ta đã phát hiện và chọn tạo ra được một số gen khángvirut này bằng cách nghiên cứu được một số chỉ thị phân tử DNA nhằm phát hiện vàchọn lọccác gen gây nên tính kháng virut này

Dựa vào tính cấp thiết của các vấn đề trên, để đáp ứng được các yêu cầu cầnthiết, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Hữu Tôn, chúng tôi quyết định tiến hành

đề tài: “ Đánh giá, tuyển chọn một số giống cà chua có khả năng chín chậm và khángvirut xoăn vàng lá”

- Sử dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen rin (ripening inhibitor) quy định ức chế

sự chín của quả trong tập đoàn giống cà chua thu thập

- Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng virut xoăn vàng lá trong tậpđoàn giống cà chua thu thập

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây cà chua

Cà chua là nguồn cung cấp vitamin A và C rất quan trọng, là loại rau ăn quảđược sử dụng ở nhiều phương thức khác nhau Trong quả cà chua chín có nhiều dinhdưỡng như: đường, vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan trọng như Ca, Fe,

P, K, Mg… (Tạ Thu Cúc, 2002) Edward C Tigchelaar (1989) đã phân tích quả cà chuachín và xác định thành phần hóa học gồm: 94 - 95% nước, 5 - 6% chất khô Trong chấtkhô gồm có 55% đường (gluco, fructoza, sucroza), 21% chất không hòa tan trong rượu(protein, xenlulo, pectin, polysacarit), 12% axit hữu cơ (xitric, malic, galaturonic,pyrolidon –carboxylic), 7% chất vô cơ và 5% các chất khác (dẫn theo Tạ Thu Cúc, 2002)

Theo Võ Văn Chi (1997), cà chua có vị ngọt tính mát, giải nhiệt chống hạihuyết, kháng khuẩn, lọc máu, nhuận tràng, giúp tiêu hoá tốt tinh bột Nước ép càchua kích thích gan, tốt cho dạ dày (dẫn theo Nguyễn Thị Hồng Thuý, 2009) Mộtnghiên cứu của Mỹ cho thấy, lycopen trong quả cà chua giúp giảm nguy cơ mắc bệnhtim mạch Ngoài ra lycopen được được chứng minh là có thể ngăn ngừa bện ung thưtiện liệt tuyến (dẫn theo Trương Văn Nghiệp, 2006)

Sản suất cà chua ở đồng bằng sông Hồng cho thu nhập bình quân 42,0 đến 68,4triệu đồng/ha/vụ với mức lãi thuần 15 đến 26 triệu đồng/ha, cao gấp nhiều lần so vớitrồng lúa (Trương Văn Nghiệp, 2006) Ở Đài Loan hàng năm xuất khẩu cà chua tươivới tổng giá trị là 925.000 USD và 40.800 USD cà chua chế biến, mỗi hecta có thểđem lại thu nhập cho nông dân từ 4.000-5.000 USD Ở Mỹ hàng năm tổng giá trị xuấtkhẩu cà chua rất cao, chỉ tính riêng kim ngạch xuất khẩu năm 1997 đạt hơn 4 lần sovới lúa nước và 20 lần so với lúa mì (Tạ Thu Cúc, 2006)

2.2 Các đặc điểm thực vật học cơ bản của cây cà chua

Cà chua là cây trồng hàng năm, dạng thân bụi, phân nhánh mạnh, có lớp lôngdày bao phủ, trên thân có nhiều đốt và có khả năng ra rễ bất định Chiều cao và sốnhánh rất khác nhau phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt

Rễ cà chua thuộc hệ rễ chùm, trên đồng ruộng rễ cà chua có thể phát triển rộng

tới 1,3 m và sâu tới 1 m Với khối lượng rễ lớn như vậy, cà chua được xếp vào nhómcây chịu hạn.

Lá cà chua đa số thuộc dạng lá kép, các lá chét có răng cưa, có nhiều dạng khácnhau: dạng chân chim, lá khoai tây, lá ớt tuỳ thuộc vào giống mà lá cà chua có màusắc và kích thước khác nhau

Hoa cà chua được mọc thành chùm Có ba dạng chùm hoa là đơn giản, trunggian và phức tạp Số lượng hoa / chùm, số chùm hoa/cây rất khác nhau ở các giống Sốchùm hoa/ cây dao động từ 4- 20, số hoa /chùm dao động từ 2 - 26 hoa Hoa đơn tínhdưới bầu, đài hoa màu vàng, số đài và cánh hoa tương ứng nhau từ 5 đến 9 Hoa lưỡngtính, nhị đực liên kết nhau thành bao hình nón, bao quanh nhuỵ cái

Quả cà chua thuộc loại quả mọng, có 2, 3 đến nhiều ngăn hạt Hình dạng vàmàu sắc quả phụ thuộc vào từng giống Ngoài ra, màu sắc quả chín còn phụ thuộc vào

điều kiện nhiệt độ, phụ thuộc vào hàm lượng Caroten và Lycopen Khối lượng quả dao

động rất lớn tuỳ theo đặc điểm của giống, từ 3 đến 200g thậm chí 500g

2.3 Yêu cầu của cây cà chua đối với điều kiện ngoại cảnh

Quá trình sinh tổng hợp caroten rất mẫn cảm với nhiệt độ, do đó ảnh hưởng lớn

đến màu sắc quả Sự hình thành lycopen và caroten diễn ra rễ dàng ở 24-28oC làm choquả có màu đỏ hoặc da cam đậm Nhiệt độ 30-36oC làm quả có màu vàng do lycopen

không được hình thành Nhiệt độ trên 40oC làm cho quả giữ nguyên màu xanh vì cơ

chế phân huỷ chlorophyll không hoạt động, caroten và lycopen không được hình

thành Nhiệt độ cao trong quá trình phát triển quả cũng làm giảm sự hình thành pectinnên quả nhanh mềm hơn (dẫn theo Nguyễn Thị Hồng Thuý, 2009)

2.3.2 Ánh sáng

Cà chua là cây ưa ánh sáng, cây con trong vườn ươm nếu đủ ánh sáng (5000lux) sẽ cho chất lượng tốt, cứng cây, bộ lá to, khoẻ, sớm được trồng Điều kiện ánhsáng tốt làm cho cường độ quang hợp tăng, cây ra hoa đậu quả sớm hơn, chất lượngsản phẩm cao hơn Điểm bão hoà ánh sáng của cây cà chua là 70.000 lux, là cây trồngcần nhiều ánh sáng chỉ sau cây dưa hấu Cường độ ánh sáng thấp làm chậm quá trìnhsinh trưởng, cản trở quá trình ra hoa, làm vòi nhuỵ vươn dài và tạo nên những hạtphấn không có sức sống, thụ tinh kém Ánh sáng đầy đủ thì việc thụ tinh thuận lợi,dẫn đến sự phát triển bình thường của quả, quả đồng đều, năng suất tăng Khi cà chua

bị che bóng, năng suất thường giảm và quả bị dị hình Trong điều kiện thiếu ánh sángnăng suất cà chua thường giảm, do vậy việc trồng thưa làm tăng hiệu quả sử dụng ánhsáng kết hợp với ánh sáng bổ sung sẽ làm tăng tỷ lệ đậu quả, tăng số quả trên cây, tăngtrọng lượng quả và làm tăng năng suất Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cà chuakhông phản ứng với độ dài ngày, quang chu kỳ trong thời kỳ đậu quả có thể dao động

từ 7-19 giờ Tuy nhiên một số nghiên cứu khác cho rằng ánh sáng ngày dài và hàmlượng nitrat ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ đậu quả Chiếu sáng 7 giờ và tăng lượng đạm

sẽ làm cho tỷ lệ đậu quả giảm trong khi đó ánh sáng ngày dài làm tăng số quả/cây.Trong điều kiện ngày ngắn nếu không bón đạm thì chỉ cho quả ít, trong điều kiện ngàydài mà không bón đạm thì cây không ra hoa và không đậu quả (dẫn theo Nguyễn ThịHồng Thuý, 2009)

2.3.3 Nước và độ ẩm

Cà chua có yêu cầu về nước ở các giai đoạn sinh trưởng rất khác nhau, xu

chua cần nhiều nước nhất Thời kỳ này không đủ nước sẽ làm cho hoa rụng, ít hoa, ítquả, quả khô Cà chua sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở độ ẩm đất 70-80%, ẩm độkhông khí là 45-55% Cây cà chua chịu được hạn nhưng không chịu được úng, khichuyển từ chế độ ẩm thấp sang chế độ ẩm cao đột ngột như tưới nước nhiều hoặc mưa

to sau một thời gian dài thường gây nên hiện tượng nứt quả Độ ẩm không khí trên90% dễ làm cho hạt phấn bị trương nứt, hoa cà chua không thụ phấn được và sẽ rụng

Độ ẩm thấp làm giảm năng suất quả nhưng phần nào làm tăng phẩm chất quả vì hàmlượng đường và hàm lượng chất khô trong quả tăng lên Độ ẩm thấp cũng làm rútngắn thời gian chín của quả (dẫn theo Tạ Thu Cúc, 1983)

2.3.4 Đất và dinh dưỡng

Đất phù hợp với cây cà chua là đất thịt nhẹ, đất thịt trung bình, đất thịt pha cát,giàu mùn, tơi xốp, tưới tiêu thuận lợi, độ pH từ 5,5-7,5 Độ pH từ 6,0 - 6,5 thích hợpnhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Theo Kiều Thị Thư (1998) để có 1 tấn

cà chua cần 2,9 kg N; 0,4 kg P; 0,4 kg K và 0,45kg Mg Cà chua hút nhiều nhất làkali, tiếp đến là đạm và ít nhất là lân Cà chua sử dụng 60% lượng đạm, 59-60% K2O

và 15-20% P2O5 tổng lượng phân bón vào đất suốt vụ trồng Ngoài các yếu tố đalượng N, P, K cà chua cần các yếu tố vi lượng để sinh trưởng, phát triển như B, Mn,

Mg, Fe, Cu, S Khi thiếu các yếu tố vi lượng cây sinh trưởng chậm, dễ nhiễm bệnh,rụng hoa, quả non làm giảm năng suất (dẫn theo Nguyễn Thị Hồng Thuý, 2009)

2.4 Một số thành tựu về chọn giống cà chua ở Việt Nam

Nhìn chung, các nghiên cứu chọn tạo giống cà chua thường tập trung vào cácmục tiêu như: sinh trưởng khoẻ, năng suất cao, quả cứng, thịt quả dày, tính chịu nứtquả cao, chống chịu sâu bệnh tốt, chịu nhiệt, ngắn ngày, quả chắc, thời gian bảo quảndài, màu sắc chín đỏ đều, chất lượng đáp ứng được nhu cầu ăn tươi và chế biến Chođến nay, số lượng và chủng loại giống cà chua đã trở nên rất phong phú, đa dạng, phầnnào đáp ứng được nhu cầu của sản xuất và tiêu dùng Với những mục tiêu này, nhiềugiống cà chua ưu tú đã được tạo ra ở Việt Nam, đáp ứng được thực tiễn sản xuất nhưMV1, XH5, HT7, C95, CS1,…

Giống cà chua MV1 có đặc điểm sinh trưởng 90 đến 100 ngày, có khả năngchịu nóng tốt, ẩm độ cao, thấp khác nhau, năng suất trái vụ đạt 33 đến 46 tấn/ha,chính vụ trong điều kiện thâm canh có thể đạt 52 đến 60 tấn/ha, quả chắc, ít dập nát,màu đỏ tươi, chống chịu tốt với bệnh xoăn lá, cây cao trung bình 65 cm, được côngnhận giống quốc gia năm 1998 (Nguyễn Hồng Minh và Kiều Thị Thư, 1998)

Giống cà chua lai HT7 có khả năng chịu nóng cao, chủ yếu trồng vào các vụsớm và vụ xuân hè, thuộc dạng ngắn ngày, thấp cây, năng suất đạt 40 đến 56 tấn/ha,quả chắc, khối lượng 70 đến 85 g/quả, chịu vận chuyển, thời gian bảo quản lâu dài…

Giống cà chua C95 có năng suất cao, có các chỉ tiêu chất lượng đáp ứng yêucầu chế biến công nghiệp, được Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận giống Quốc gianăm 2004 Giống CS1 có thời gian sinh trưởng ngắn (120 ngày), ra hoa và chín tậptrung, quả nhỏ (40-50 g/quả), chất lượng tốt, vỏ dày, chắc, có khả năng chống chịuvirus, thích hợp trồng ở vụ đông xuân sớm và xuân hè muộn, năng suất đạt 35 đến 40tấn/ha, được công nhận là giống khu vực hóa năm 1995 (Trương Đích, 1999)

Giống cà chua XH5 có thời gian sinh trưởng từ 130-140 ngày, năng suất vụđông xuân đạt 44 đến 55 tấn/ha, vụ xuân hè đạt 30 đến 40 tấn/ha, khi chín có màu đỏtươi có khả năng chịu bệnh héo xanh vi khuẩn, đốm vi khuẩn và một số bệnh khác,thích hợp cho trồng trái vụ ở miền Bắc Việt Nam, được công nhận giống khu vực hóa

năm 2002 (Trần Văn Lài và cộng sự, 2005).

Hai giống XH1 và XH2 được Viện nghiên cứu rau quả chọn ra trong cácgiống nhập nội từ AVRDC năm 1999, là các giống cà chua ăn tươi, chịu nhiệt tốt,năng xuất ổn định Giống XH2 đã được công nhận là giống quốc gia (Bộ NN vàPTNT, 2005)

Giống PT18 được viện nghiên cứu rau quả chọn tạo từ nguồn vật liệu ban đầu

là các giống nhập nội từ AVRDC Giống sinh trưởng hữu hạn, chiều cao cây từ 80đến 110 cm, tỷ lệ đậu quả trung bình đạt 60 đến 75%, năng suất thực thu từ 25 đến

50 tấn/ha, được công nhận giống quốc gia năm 2005 (Dương Kim Thoa và TrầnKhắc Thi, 2006)

Giống cà chua DT 28 do Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo thuộc dạng hìnhsinh trưởng bán hữu hạn, thời gian sinh trưởng 120 - 130 ngày, thích hợp trồng vụđông sớm và chính vụ cho năng suất trên 50 tấn/ha; vụ xuân hè cho năng suất 30 đến

33 tấn/ha Giống được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giốngtạm thời và cho phép sản xuất thử nghiệm trên diện rộng từ tháng 10/2006

…

Mặc dù đã có những thành tựu đáng kể về chọn tạo các giống cà chua có năngsuất cao, chât lượng tốt, chống chịu được một số bệnh nhưng chọn tạo giống cà chuakháng virus xoăn vàng lá và chín chậm vẫn còn là một vấn đề lớn đối với các nhàchọn giống trong nước Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua năng suất cao, chất lượngtốt, chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá sẽ giúp tăng hiệu quả sản xuất, mang lạilợi ích thiết thực cho người nông dân

2.5 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng virus xoăn vàng lá

Nhìn chung, các nghiên cứu tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá đi theocác hướng chủ yếu: (1) tạo giống kháng vector bọ phấn; (2) tạo giống kháng virusxoăn vàng lá nhờ những nguồn kháng tự nhiên từ cà chua dại và (3) tạo giống khángbệnh nhờ nguồn kháng từ virus thông qua công nghệ RNAi Trong đó, tạo giống mang

tính kháng tự nhiên được cho là hiệu quả nhất để phòng chống bệnh (Pena và cộng sự,

2010)

2.5.1 Nghiên cứu về các nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá

Loài cà chua trồng (Solanum lycopersicum) cực kỳ mẫn cảm với virus xoăn

vàng lá (Tomato yellow leaf curl virus – TYLCV) Tuy nhiên, mức độ kháng cao với

TYLCV đã được tìm thấy trong các loài cà chua dại S pimpinellifolium, S peruvianum, S chilense, S habrochaites, và S cheesmaniae Một vài accession của

và S pimpinellifolium cũng biểu hiện mức độ chống chịu tốt với TYLCV (Ji và cộng

sự, 2007a; Pena và cộng sự, 2010) Trong các loài cà chua dại biểu hiện tính kháng với TYLCV, S chilense, S habrochaites, và S peruvianum cung cấp khả năng kháng tốt

và đã được sử dụng rộng rãi trong chương trình tạo giống để phát triển các giống cà

chua thương mại kháng TYLCV (Ji và cộng sự, 2007a; Pena và cộng sự, 2010).

Một số gen lặn liên quan đến tính kháng trong các cây có khả năng chống chịu

TYLCV từ accession PI26935 thuộc loài S peruvianum đã được phát hiện bởi

Pilowsky và Cohen Những nghiên cứu này dẫ đến sự ra đời của TY20, một giốngkháng vừa phải Tiếp đó, các dòng giống với khả năng kháng cao như TY172,

TY197… đã được phát triển tại Trung tâm Volcani ở Israel từ loài S peruvianum (Ji và cộng sự, 2007a) Tính kháng trong TY172 được điều khiển bởi một QLT (Quantitative

Trait Locus) lớn và bốn QLT nhỏ, QLT lớn được đặt tên là Ty-5, nằm trên nhiễm sắc

thể số 4 (Anbinder và cộng sự, 2009) Các accession LA372, LA452, LA462, LA1274, LA1333, LA1373, và CMV sel INRA (PI126926 × PI128648-6), cũng như S peruvianum var humifusum LA385 đã được phát hiện là có khả năng kháng cao với TYLCV Các gen từ S peruvianum đã nhanh chóng được đưa vào các giống lai thương mại tên tuổi và cung cấp khả năng kháng tốt với TYLCV (Ji và cộng sự, 2007a).

S chilense là nguồn gen kháng rất quan trọng trong nhiều chương trình tạo giống trên thế giới Năm 1991, Zakay và cộng sự đã báo cáo khả năng kháng cao với TYLCV trong các cá thể LA1969 (Ji và cộng sự, 2007a) Năm 1994, Zamir và cộng sự

đã lập bản đồ gen Ty-1 trên nhiễm sắc thể số 6 và hai gen bổ sung trên nhiễm sắc thể

số 3 và 7 (Ji và cộng sự, 2007a) Việc đưa gen kháng TYLCV từ LA1969 vào cà chua

trồng đã được tiến hành trong các chương trình tạo giống của nhiều nhóm nghiên cứu,

nó cũng đã được đưa vào cà chua trồng bởi một số công ty giống tư nhân (Ji và cộng

sự, 2007a) Hiện đã tìm ra ở S chilense các accession LA1932, LA1938, LA1959,

LA1960, LA1961, LA1963, LA1968, LA1969, LA2747, LA2774, và LA2779 có khảnăng kháng ToMoV ở Florida và đã được sử dụng để bắt đầu một chương trình tạogiống kháng bằng phương pháp lai khác loài Tiêp đó, LA1932, LA2779, và LA1938

đã được chứng minh là nguồn kháng hữu ích cho chương trình tạo giống cà chua ởFlorida Hiện nay, một số chương trình nhân giống thương mại đang sử dụng các gen

kháng từ S chilense và người trồng đã chấp nhận các giống này trên thị trường (Ji và cộng sự, 2007a) Các đánh giá tại trung tâm rau thế giới (The World Vegetable Center -

AVRDC) cũng cho thấy LA1932 kháng tốt tại tất cả 8 địa điểm thử nghiệm tại ĐôngNam Á (Green và Shanmugasundaram, 2007), gợi ý rằng LA1932 có thể là một nguồngen kháng tốt cho Việt Nam và cần được nghiên cứu thêm.

Năm 1982, Hassan và cộng sự đã đánh giá các accession LA0386, LA1252, LA1295, LA1352, LA1393, LA1624, và LA1691 thuộc loài S habrochaites và thấyrằng chúng có khả năng kháng cao với TYLCV, tính kháng từ các accession này là trội

(Ji và cộng sự, 2007a) Accession LA1777 đã được công bố có khả năng kháng

TYLCV, các cây kháng từ accession này được chọn để lai với các cây kháng từaccession LA0386 để tạo ra một quần thể F1 có khả năng kháng cao, quần thể này

được sử dụng để lai với S lycopersicum và đã tạo ra các cây có khả năng miễn dịch và

chịu bệnh, tính kháng được cho là do một gen trội chính và một số gen nhỏ điều khiển

(Ji và cộng sự, 2007a) Một dòng giống Ih902 đã được sử dụng để tạo ra các cây lai,

trong đó FAVI 9 là một nguồn kháng quan trọng cho các chương trình tạo giống ở

Guatemala và các nước Trung Đông khác (Ji và cộng sự, 2007a)

Tại Ấn Độ, S habrochaites f glabratum B6013 đã được chứng minh có hai gen lấn át (epistatic genes) kiểm soát tính kháng Tomato leaf curl virus (ToLCV) Sau đó,

các nhà nghiên cứu ở đây đã phát triển dòng giống H24 từ accession này "H24" đã

được chứng minh mang gen kháng Ty-2 "H24" tạo ra tính chịu bệnh rõ ràng với một

số chủng (strains) TYLCV/ToLCV nhưng không phải tất cả Ví dụ, H24 chịu được cácchủng TYLCV/ToLCV ở Đài Loan, miền Bắc Việt Nam, Nam Ấn Độ, và Israel nhưng

mẫn cảm với các chủng TYLCV phía bắc Ấn Độ, Thái Lan, và Philippines Ty-2 là

nguồn gen kháng được sử dụng sớm nhất trong chương trình tạo giống cà chua ởTrung tâm Nghiên cứu và Phát triển rau Châu Á (AVRDC) và đã được khai thác rộng

rãi bởi một số công ty giống cây trồng Châu Á (Ji và cộng sự, 2007a).

2.5.2 Bản đồ phân tử và marker hỗ trợ chọn lọc (MAS) các gen kháng TYLCV

Locus Ty-1 đã được lập bản đồ đầu tiên trên nhiễm sắc thể số 6 với các RFLP

marker TG297 và TG97 sử dụng các quần thể được tao ra từ phép lai giữa dòng mẹ

mẫn cảm cảm M82-1-8 S lycopersicum với accession kháng TYLCV S chilense LA1969 (Zamir và cộng sự, 1994) Các cây đồng hợp tử cho các alen từ S.chilense tại

TG297 và TG97 là kháng cao và không tạo ra triệu chứng bệnh Các marker dựa trên

locus TG97 liên kết chặt với gen Ty-1 đã được phát triển tại Hebrew University of Jerusalem, Israel Cùng với Ty-1, vài gen kháng khác đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 6 gần vùng Ty-1 Ví dụ như gen Mi-1 có nguồn gốc từ S peruvianum kháng tuyến trùng nốt sưng rễ, định vị trong pham vi khoảng 6cM gần locus Ty-1 Điều này cho phép sử dụng các marker phân tử liên kết với gen Mi-1 làm marker cho gen Ty-1 nếu các alen từ S peruvianum và S chilense khác nhau về các marker này Trường

hợp các alen từ 2 loài là giống nhau về các marker này, sử dụng chúng có thể dẫn đếnkết quả sai CAPS marker REX-1 liên kết với gen Mi-1 có thể được sử dụng làm

marker phát hiện locus Ty-1 (khoảng 5,5 cM) (Milo, 2001) Tiếp đó, CAPS marker JB-1 liên kết chặt với Ty-1 đã được xác định, nó cho phép chọn lọc Ty-1 mà không phụ thuộc vào Mi-1 (Castro và cộng sự, 2007) Marker Jb-1 có nguồn gốc từ RFLP

C21, nó tạo ra 3 alen khác nhau nhờ cắt hạn chế sản phẩm PCR bằng enzyme TaqI.Alen 1 có một band xấp xỉ 400bp, alen 2 gồm một band hơi lớn hơn 400 bp và alen 3

có một band 500bp Alen 2 và 3 là đồng trội và trội hơn alen 1 Alen 3 đã phát hiện

được các dòng mang gen Ty-1 mà không phụ thuộc vào sự có mặt của Mi-1 (Castro

và cộng sự, 2007).

Locus Ty-2 đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 11 với các RFLP marker TG393

và TG36 sử dụng dòng giống H24 có nguồn gốc từ S habrochaites như một nguồn kháng (Hanson và cộng sự, 2000) Hiện nay, một số marker dựa trên PCR cho vùng DNA chuyển vào từ S habrochaites đã được phát triển CAPS marker TG105A cho

thấy khả năng khuếch đại mạnh và cắt hạn chế sản phẩm PCR bằng enzyme TaqI đã

tạo ra các band đa hình cho S habrochaites và S lycopersicum Một marker dựa trên PCR khác là T0302 cũng được phát triển cho locus Ty-2 mà không phải dùng enzyme

giới hạn Phân tích liên kết cho thấy TG105A và T0302 liên kết chặt với nhau, khoảng

cách của các marker này với gen Ty-2 là xấp xỉ 10 cM (Ji và cộng sự, 2007a)

Hình 2.1 Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm sắc thể số 11

(Hanson và cộng sự, 2000)

Năm 2006, Agrama và Scott đã đưa ra một bản đồ QLT cho tính kháng TYLCV

và ToMoV (Tomato Mottle Virus) trong các accession S chilense LA2779 và LA1932

sử dụng các RAPD marker (Ji và cộng sự, 2007a; Pena và cộng sự, 2010) Nghiên cứu

này cho thấy rằng có 3 vùng trên nhiễm sắc thể số 6 góp phần tạo nên tính kháng cả

hai virus TYLCV và ToMoV Vùng thứ nhất bao gồm vùng Ty-1, trong khi hai vùng khác nằm hai bên sườn của các locus sp (self-pruning) và c (potato leaf) Các RAPD

marker liên kết với tính kháng trong các vùng này đã được xác định bằng cách sửdụng các dòng giống kháng có nguồn gốc từ các accession LA2779 và LA1932 Sau

đó, Ji và cộng sự (2007b) đã lập một bản đồ chi tiết cho tính kháng begomovirus và nhận ra một vùng DNA lớn được chuyển vào từ S chilense kéo dài từ marker

C2_A2g39690 đến T0834 trong các dòng giống tiên tiến có nguồn gốc từ LA2779

kháng cả hai virus TYLCV và ToMoV Một locus kháng begomovirus đã được lập bản

đồ ở khoảng giữa marker cLEG-31-P16 và T1079 trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số

6, và được xác định là Ty-3 Phía trên locus Ty-3, vùng DNA lớn được chuyển vào này cũng nối với vùng Ty-1 gần gen Mi, gợi ý rằng các alen tại cả hai locus Ty-1 và Ty-3

có khả năng cùng tồn tại và nối với nhau Trái lại, các dòng giống tiên tiến có nguồngốc từ LA1932 có một vùng DNA được chuyển vào ngắn hơn, từ cLEG-31-P16 đến

C2_At5g41480, vùng này cũng mang một locus kháng begomovirus mà có lẽ thuộc alen tại locus Ty-3 Ji và Scott (2006) đã xác định rằng các locus Ty-3 định vị trong

một khu vực bao gồm locus FER (25 cM, BAC clone 56B23, AY678298) Các trình

tự cho các gen G8 của BAC clone 56B23 là khác nhau đối với các dòng có nguồn gốc

từ S chilense LA2779 và LA1932 (Maxwell và cộng sự, 2007) Để phân biệt hai introgression này, một từ LA2779 được chỉ định là Ty-3 và một từ LA1932 được chỉ định là Ty-3a Một marker đồng trội FLUW25 (SCAR marker) đã được báo cáo (Ji và cộng sự, 2007a) phát hiện được các alen Ty-3 và Ty-3 (có nguồn gốc từ S lycopersicum), nhưng không phát hiện được alen Ty-3a (Ji và cộng sự, 2007c) Để

khắc phục vấn đề này, nhóm tác giả trên đã phát triển marker đồng trội P6-25 (SCAR

marker) phát hiện được các alen Ty-3, Ty-3, Ty-3a (Ji và cộng sự, 2007c) Khi sử dụng

cặp mồi P6-25F2/R5 này để sàng lọc một vài giống lai từ các công ty giống thươngmại, các tác giả đã nhận được mảnh PCR 660 bp từ 3 giống thương mại, các mảnh

này được giải trình tự và cho thấy 100% tương đồng với đoạn từ S chilense LA1969.

Introgression mới được phát hiện có nguồn gốc từ S.chilense LA1969 này được gọi là

Ty-3b (Ji và cộng sự, 2007c).

Ji và cộng sự (2008) đã phát hiện một introgression S chilense 14 cM trên

nhánh dài của nhiễm sắc thể số 3 trong một số dòng giống kháng có nguồn gốc từ

LA1932 Sau đó, một locus kháng begomovirus mới là Ty-4 đã được lập bản đồ với

các marker vào khoảng 2,3 cM giữa C2_At4g17300 và C2_At5g60160 trong vùng

introgression (Ji và cộng sự, 2009) Phân tích quần thể phân ly về locus Ty-3 và Ty-4

đã chứng minh rằng Ty-3 giải thích 59,6% biến dị kiểu hình kháng (phenotypic variation), trong khi Ty-4 chỉ giải thích cho 15,7%, điều này gợi ý rằng Ty-4 tạo ra một hiệu lực kháng TYLCV nhỏ hơn Các dòng tái tổ hợp mang cả Ty-3 và Ty-4 có mức kháng cao hơn với TYLCV (Ji và cộng sự, 2009).

Hình 2.2 Bản đồ gen Ty-3 trên nhiễm sắc thể số 6 (Ji và cộng sự, 2007b)

Bản đồ liên kết được xây dựng từ quần thể F2 lai giữa loài S lycopersicum mẫn cảm với dòng giống kháng tiên tiến có nguồn gốc từ LA1932 (bên phải, gắn nhãn LA1932-AL-F2), hoặc giữa loài S lycopersicum mẫn cảm với dòng giống kháng cao cấp có nguồn gốc từ LA2779 (ở giữa, gắn nhãn LA2779-F2-AL) Các vùng bôi đen biểu diễn các đoạn DNA được chuyển vào từ S chilense

Hình 2.3 Bản đồ phân tử gen Ty-4 trên nhiễm sắc thể số 3

(Ji và cộng sự, 2009) Anbinder và cộng sự (2009) đã lập bản đồ một QLT lớn và bốn QLT phụ nhỏ góp phần tạo nên tính kháng TYLCV trong dòng giống TY172 có nguồn gốc từ S peruvianum QLT lớn được đặt tên là Ty-5, được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 4

trong vùng lân cận của marker SINAC1 và chịu trách nhiệm 39.7 - 46.6% biến dị kiểuhình Các QLT nhỏ, bắt nguồn từ các cha mẹ kháng hoặc mẫn cảm, được lập bản đồtrên nhiễm sắc thể số 1, 7, 9 và 11, và chịu trách nhiệm 12% biến dị trong mức

nghiêm trọng triệu chứng, bổ sung cho gen Ty-5 (Anbinder và cộng sự, 2009).

Hình 2.4 Bản đồ khoảng cách cM giữa các marker gen Ty-5 trên nhiễm sắc thể 4

(Anbinder và cộng sự, 2009)

Đã có nhiều cố gắng trong việc nhận diện và lập bản đồ các gen qui định tính

kháng TYLCV trong S pimpinellifolium và S cheesmaniae nhưng không tạo ra được

các bản đồ tốt cũng như không tìm ra được các marker liên kết chặt phù hợp cho MAS

(Pena và cộng sự, 2010).

2.5.3 Đánh giá các nguồn gen kháng ở các vùng khác nhau

Một trong những vấn đề lớn khi lai tạo giống cà chua kháng begomovirus là khả năng kháng của các alen khác nhau trong các khu vực có mặt các begomovirus

khác nhau Vấn đề này đã được điều tra với một số dòng ở nhiều địa điểm thử nghiệm

Dòng giống TY52 (mang gen Ty-1) với tính kháng có nguồn gốc từ S chilense LA1969, được phát triển ở Israel, kháng vừa phải với TYLCV Khi đánh giá ở Guatemala, nơi có các Begomovirus genome kép với áp lực virus rất cao thì dòng này

lại mẫn cảm Khi đánh giá trong tám địa điểm ở Đông Nam Á và tại Florida, Mỹ,

TY52 mẫn cảm ở bảy địa điểm, kháng vừa ở một địa điểm (Ji và cộng sự, 2007a) Đối với dòng H24 mang gen Ty-2 ToLCV từ S habrochaites f glabratum, các thử nghiệm

cho thấy nó kháng được tại năm địa điểm và mẫn cảm hoặc kháng nhẹ ở bốn địa điểm

khác (Ji và cộng sự, 2007a)

Trong số chín nguồn gen được thử nghiệm tại AVRDC, chỉ có S chilense

LA1932 kháng được tại tất cả tám địa điểm ở Đông Nam Á (Green vàShanmugasundaram, 2007) LA1932 cũng kháng được tại các địa điểm khảo sát ở

Florida, Mỹ (Ji và cộng sự, 2007a) Accession này mang cả 3 gen kháng: Ty-1, Ty-3 và Ty-4 Trong đó, Ty-3 quyết định khoảng 60% biến dị kiểu hình kháng, điều này chứng

tỏ Ty-3 là gen chịu trách nhiệm chính đối với tính kháng TYLCV (Ji và cộng sự,

2007a)

Các đánh giá nguồn gen ở Bangalore, Ấn Độ và Rehovot, Israel nơi có các

begomovirus tương ứng là ToLCV và TYLCV cho thấy dòng giống Ih 902 với tính kháng có nguồn gốc từ S habrochaites kháng được ở cả hai địa điểm Trong khi đó, S pimpinellifolium LA121 kháng vừa phải ở Ấn Độ nhưng mẫn cảm ở Israel Các dòng giống có nguồn gốc từ Ih902 và Fla595 (mang gen Ty-3) với tính kháng bắt nguồn từ

S chilense LA2779 cũng được đánh giá là kháng ở Guatemala, nơi phát tán của ít nhất

7 loài begomovirus khác nhau (Ji và cộng sự, 2007a) Những dòng giống kháng cao

với TYLCV từ trung tâm Volcani, Israel, như TY172 và TY197 có gen kháng bắt

nguồn từ S peruvianum, cũng kháng cao ở Guatemala (Ji và cộng sự, 2007a).

Như vậy, tại các địa điểm khác nhau, nơi có sự phân bố khác nhau của các loài

begomovirus và có các điều kiện khí hậu khác nhau thì khả năng kháng của các dòng giống kháng là khác nhau Những nghiên cứu trên gợi ý rằng gen Ty-1 và Ty-2 chỉ tạo được tính kháng vừa và chịu được một số chủng virus Trong khi gen Ty-3 từ S chilense đã tạo nên tính kháng cao ở nhiều nơi, trong đó có Đông Nam Á Tất nhiên

hiệu quả kháng sẽ cao hơn và bền vững hơn khi quy tụ được nhiều gen kháng khácnhau vào cùng một nền di truyền chung, nhưng việc lai và quy tụ nhiều gen kháng làmột công việc rất khó khăn Ứng dụng marker phân tử sẽ giúp phát hiện các gen kháng

và chọn lọc các cây kháng trong các phép lai trở lên dễ dàng hơn Cho đến nay chỉ có

gen Ty-1, Ty-2 và Ty-3 là đã có marker dựa trên PCR được sử dụng phổ biến (Pena và cộng sự, 2010) Do đó, những nghiên cứu ban đầu với mục đích chọn tạo giống cà

chua kháng virus xoăn vàng lá cho miền bắc Việt Nam nên bắt đầu từ các gen này,

trong đó Ty-3 là gen nên được ưu tiên nhất.

2.6 Nghiên cứu về các dạng đột biến liên quan đến sự chín của quả cà chua

2.6.1 Ethylene và cơ chế chín của quả

Ethylene là một phytohormon quan trọng trong cây, điều chỉnh nhiều quá trìnhsinh trưởng và phát triển của cây Ethylene được tổng hợp trong tất cả các tế bào vàcác mô nhưng nhiều nhất là các mô già, đặc biệt là trong quả đang chín, được vậnchuyển bằng phương thức khuyếch tán Khi quả bắt đầu chín, sự tổng hợp ethylenetrong quả tăng lên rất nhanh, đạt cực đại lúc quả chín hoàn toàn sau đó giảm đi nhanhchóng Sự có mặt của ethylene làm biến đổi tính thấm của màng dẫn đến sự giải phóngcác enzyme gây nên những biến đổi sinh hóa có liên quan đến quá trình chín (các enzymebiến đổi hô hấp, biến đổi độ chua, độ mềm ) đồng thời kích thích hình thành các enzymemới trong quá trình hô hấp bột phát và gây nên những biến đổi sinh hóa gắn liền với sựchín Qua đó, ethylene làm tăng hoạt tính của các enzym liên quan đến sự chín của quả.Theo Barry và cộng sự (2005), sơ đồ con đường sinh tổng hợp ethylene gồm 2 bướcchính: tổng hợp SAM và oxy hóa ACC Nguyên liệu đầu tiên là acid amin methionine,methionine được hoạt hóa bằng ATP để hình thành nên SAM (S- adenosyl ethionine).Sau đó từ SAM tạo ra ethylene, acid fomic và CO2

Các thụ thể tiếp nhận ethylene (Ethylene Receptor)

Nghiên cứu trên Arabidopsis người ta đã phát hiện và nhân dòng được 5 gen mãhóa cho các receptor liên quan đến việc cảm ứng sinh ra ethylene trong quá trình chín

gồm: CTR1 (constitutive-tripe-respone) (Kieber và cộng sự, 1993), EIN2 insensitive) (Alonso và cộng sự, 1999), EIN3 (Chao và cộng sự, 1997), ERF1 (ethylene-response-factor) (Solano và cộng sự, 1998) và ETR1 (Chang và cộng sự,1993) mã hóa cho các loại recetor có tên tương ứng.

(ethylene-Nghiên cứu gen CTR1 (constitutive-tripe-espone) cho thấy gen này mã hóa choKinase, có sự tương đồng cao với gia đình Raf của serine/threonine kinase

(MAPKKK) (Kieber và cộng sự, 1993) [16] Gen CTR1 cũng đã được phân lập ở cà chua cho thấy có sự tương đồng vói ở Arabidopsis (Jones, 1999; Zegzouti và cộng sự, 1999; Leclercq và cộng sự, 2002; Adams-Phillips và cộng sự, 2004) Sản phẩm của

CTR1 hoạt động phía sau ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 và EIN4 trong đường hướng vận

chuyện tín hiệu và cảm ứng với ethylene, có liên quan tới genes EIN2, EIN3, ERF1(Giovannoni, 2004; Stepanova & Alonso, 2005)

Theo Bleecker & Kende (2000), Giovannoni (2004) và Stepanova and Alonso(2005) cơ chế điều hòa của ethylene như sau: Khi Ethylene gắn vào vùng cảm ứng củareceptor (gồm 1 hệ thống các receptor thuộc gia đình ETR) sẽ cảm ứng cho phản ứngxảy ra giữa vùng hisitdine kinase với vùng điều hòa của receptor CTR1 (Raf-likekinase) tạo ra thành phức hợp receptor Phức hợp receptor tác động lên protein màngEIN2 (là một kênh protein vận chuyển nguyên tố khoáng) Đầu C của EIN2 là tín hiệudương cảm ứng với yếu tố sao mã EIN3 nằm trong nhân Yếu tố sao mã này hoạt động

sẽ cảm ứng sao mã cho gen ERF1 sinh ra yếu tố phản ứng với ethylene

Hình 2.5 Sơ đồ thể hiện cơ chế điều hoà, tác động của Ethylene

(Bleecker và Kende,2000)Các nghiên cứu trên cà chua cho thấy có ít nhất 6 loại receptor: LeETR1,

leETR2 (Zhou và cộng sự, 1996; Lashbrook et al, 1998), NR (LeETR3) (Wilkinson et

al, 1995; Payton và cộng sự, 1996), LeETR5 (Tieman and Klee, 1999), và LeETR6

(Ciardi and Klee, 2001)[35], [36] Sự biểu hiện của các receptor này phụ thuộc vàotừng giai đoạn sinh trưởng, phát triển và phụ thuộc vào sự tác động từ môi trường [35]

+ LeETR1 và LeETR2: Biểu hiện ở tất cả các loại mô đã bước sang giai đoạnphát triển,

+ NR: Có liên quan đến giai đoạn trước hạt phấn,

+ NR và LeETR4: Liên quan đến giai đoạn trước chín, già hóa, sự rụng (Payton

et al, 1996), sự xâm nhiễm của nguồn bệnh (Ciardi et al, 2000),

+ LeETR5: Biểu hiện trong quả, hoa khi có sự xâm nhiễm của nguồn bệnh(Tienan & Klee, 1999)

Hình 2.6 Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylene ở cà chua (Tieman

và Klee, 1999) [32]

Ngoài ra theo nghiên cứu của Tieman & Klee và cộng sự (1999), đã sử dụng

nửa đầu 5’ của receptor ETR của Arabidopsis làm mẫu dò trong lai vói cDNA của càchua bình thường phát hiện ra NR gen Gen này có cDNA dài 2.4-kb và có trình tựtương đồng 81% với trình tự acid amn của receptor ETR1 nhưng bị mất 100 acid aminthuộc vùng nhận biết ở đầu C của ETR1 [30] Nghiên cứu của Wilkinson et al, 1997,

sử dụng antisense inhibition với NR gên dạng dại cho thấy nó không có ảnh hưởng gìtới quá trình chín Điều này đặt ra câu hỏi về vai trò của gen NR trong cây cà chuabình thường

Nghiên cứu về đặc điểm protein ceceptor đã chỉ ra rằng nó gồm có 3 phần Đặcđiểm protein receptor gồm có 3 phần chính: [30], [31]

+ Vùng sensor (ethylene binding) (aa1-aa313): là vùng cảm ứng tiếp nhậnethylene, là đầu N kị nước, có cầu S-S và được gắn trên màng mạng lưới nộichất ER

+ Vùng histidine Kinase (aa314-aa581)

+ Vùng respone (receiver): (aa582-aa738) Quyết định cảm ứng ở mức đội khácnhau với ethylene.

Theo nghiên cứu của Chang & Svewart, 1998, receptor của cà chua có sự tườngđồng lớn với receptor 2 thành phần ở vi khuẩn (2 vùng: vùng sensor và vùng respone,

sụ kết hợp 2 vùng này giúp vi khuẩn có khả năng phán ứng với sự thay đổi của cácđiều kiện môi trường) [23]

2.6.2 Các dạng đột biến liên quan đến sự chín của quả

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì các dạng đột biến liên quan đến sự chín ở

cà chua có thể chia thành 2 dạng chính: các đột biến liên quan đến sự tổng hợp tăngcường của ethylene trong quá trình chín và các đột biến liên quan đến khả năng phục

hồi biểu hiện của các gen liên quan đến sự chín của ethylene (Adams-Phillips và cộng

là do các locus đột biến này điều hòa biểu hiện của các yếu tố trong quá trìnhquả chín mà độc lập với ethylene và các yếu tố đó có thể ức chế sự chín hoàntoàn của quả (Giovannoni, 2004)

Đại diện cho nhóm thứ hai là các đột biến liên quan đến các thụ cảm tiếp nhận

ethylenen như Nr Với dạng đột biến này, ethylene vẫn tăng trong khi chín nhưng sự

biểu hiện của các gen liên quan đến sự chín bị giảm Chúng sẽ không chín ngay cả khi

xử lý với ethylene (Lanahan và cộng sự, 1994).

Dạng đột biến rin (ripening inhibitor)

Năm 1993, Picton và cộng sự đã nhân dòng các cDNA liên kết với dạng đột

biến này và phát hiện được một loạt các ERT: ERT1, ERT10, và ERT15 là các cDNA

có phản ứng sinh mARN trong quá trình chín của dạng đột biến này Khi xử lý dạng

đột biến này với ethylene thì 1 phần các gen này được sao mã, chứng tỏ dạng đột biếnnày vẫn có khả năng phản ứng với ethylene ngoại sinh (Lincoln & Fischer, 1988;

Knapp và cộng sự, 1989)

Hình 2.7 Bản đồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua

Ở thực vật, mỗi loài đều có hộp gene chứa các gene mã hóa cho các yếu tố sao

mã, điều khiển quá trình ra hoa và chín của quả được gọi là MADS-box transcription

factor Ví dụ như ở Arabidosis, hộp đen MADS-box có 47 gen (Rebekah và cộng sự,

2008) Trong khi đó ở cà chua, theo nghiên cứu của Vrebalov (2002) đã phát hiện ra

rằng gene rin là một gen nằm trong hộp gen này Cũng theo nghiên cứu này gene rin

nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và sự biểu hiện của rin là do tác động của 2 locus kiểmsoát sự chín và điều khiển sự phát triển của đài hoa

.

Hình 2.8 Sơ đồ vị trí của các cặp mồi phát hiện gen rin và mc

Nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng C34 và C43 đều là thành viên của gia đìnhMADS-box và được gọi là tên tương ứng LeMADS-RIN và LeMADS-MC Trong đóLeMADS-RIN mã hóa cho gene ức chế sự chín và LeMADS-MC có ảnh hưởng xácđịnh sự nở hoa và sự phát triển của đài hoa cà chua Từ đó thiết kế được các cặp mồiphát hiện các gene này dựa vào phương pháp PCR

Dạng đột biến Never ripe (Nr)

Dạng đột biến này được phát hiện từ rất sớm bởi Rick & Butler vào năm 1956.Đây là một dạng đột biến bán trội xảy ra tại 1 trong các receptor cảm ứng với ethylene

(Lanahan và cộng sự,1994; Wilkinson và cộng sự, 1995) Dạng đột biến Nr này được

sử dụng trong nhiều nghiên cứu về vai trò của ethylene trong các giai đoạn phát triển

khác nhau (Aloni và cộng sự, 1998; Hansen và Grossmann, 2000), nghiên cứu biểu hiện của gene (Nakatsuka và cộng sự, 1998; Rose và cộng sự, 1997) và khả năng kháng stress (Ciardi và cộng sự, 2000)

Khi gen NR ở cà chua bình thường bị đột biến DNA thay C bằng T làm thay đổiacid amin proline bằng acid amin leucine tại vị trí 411 trong vùng sensor của receptorETR1 sẽ dẫn đến sự xuất hiện của gen Nr có kiểu hình cà chua Nr Qủa cà chua bị độtbiến làm thay đổi quá trình tạo màu sắc, độ mềm cả quả

Dạng đột biến Never-ripe-2 (Nr-2) và Green ripe (Gr)

Đột biến Nr-2 có trình tự gen mã hóa không tương đồng với đột biến Nr Độtbiến Nr-2 được chỉ ra là do gen Nr-2, nằm trên nhánh dài của NST số 1 (Giovannoni

và cộng sự, 2005) Nghiên cứu sự di truyền của 2 dạng đột biến Gr và Nr-2 cho thấyđây là 2 dạng đột biến trội Khi lập bản đồ di truyền của 2 dạng đột biến cho thấy genquy định dạng đột biến này nằm trên 1 vùng 2cM giữa 2 chỉ thị TG260 và TG245 trên

nhánh dài của NST số 1 (Barry và cộng sự, 2005).

Hình 2.9 Bản đồ gene Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể số 1 của cà chua (Barry và

cộng sự, 2005)

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu gồm 50 mẫu giống cà chua được nhập nội từ: Mỹ, Pháp,Nhật Bản và Nga, đối chứng là giống HT7 Danh sách nguồn vật liệu nghiên cứu đượctrình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinhhọc ứng dụng và khu thí nghiệm đồng ruộng khoa Công nghệ sinh học - Trường Đạihọc nông nghiệp Hà Nội, Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội trong thời gian từ 22/09/2010đến tháng 07/2011

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Thí nghiệm 1: khảo sát một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượngquả, khả năng kháng virus trên đồng ruộng của các mẫu giống cà chua nhập nội trong

vụ đông xuân 2011

- Thí nghiệm 2: phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá trong tập đoàn

các mẫu giống bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi P6-25F2/R5

- Thí nghiệm 3: phát hiện gen chín chậm rin trong tập đoàn các mẫu giống

bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi C43F/R

- Thí nghiệm 4: đánh giá đặc tính chín chậm của quả của các mẫu giống mang

gen chín chậm rin (phát hiện nhờ PCR) và so sánh với một số mẫu giống không mang gen rin.

- Thí nghiệm 5: khảo sát một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượngquả, khả năng kháng virus trên đồng ruộng của một số mẫu giống tốt trong vụ xuân hèmuộn 2011

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Các thí nghiệm khảo sát đánh giá tập đoàn cà chua

+ Xuân hè muộn: gieo ngày 25/2/2011, trồng ngày 26/3/ 2011

Kỹ thuật trồng và chăm sóc: Áp dụng theo hướng dẫn trong tiêu chuẩn ngành

10TCN219: 2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT,2006)

- Giai đoạn vườn ươm: hạt giống được gieo trên giá thể gồm trấu hun và đấtbột theo tỷ lệ 1:1 Hạt được gieo trong khay bầu, tưới phun mù đủ ẩm, đặt trong nhà cómái che Hàng ngày chăm sóc, tưới nước và giữ ẩm cho cây Khi cây con được 5-6 láthì trồng

- Giai đoạn trồng ở ruộng sản xuất:

+ Chọn đất, lên luống: thí nghiệm được bố trí trên đất trồng lúa, lên luống cao

25 cm, mặt luống rộng 1 m, rãnh rộng 50 cm

+ Mật độ 2.67 vạn cây/ha, trồng 2 hàng/luống, cây x cây 50 cm, hàng x hàng

65 cm

+ Lượng phân bón cho 1 ha: 15-20 tấn phân hữu cơ, 80-100kg N, 80-100kg

P2O5, 100-120kg K2O Bón lót toàn bộ phân hữu cơ, toàn bộ phân lân, 1/3 phân đạm và1/3 kali Lượng đạm và kali còn lại chia đều bón thúc vào 3 lần xới vun

+ Tưới nước: sau khi trồng cần tưới nước giữ ẩm cho đất khoảng 75%

+ Vun xới, làm cỏ: vun xới kết hợp bón thúc lần 1 sau trồng 30 ngày, lần 2 khisau trồng 60 ngày, lần 3 sau trồng 80 ngày Thường xuyên nhổ bỏ cỏ dại

+ Làm giàn hình chữ A khi cây cao 30 - 40 cm

+ Tỉa cành: đối với giống vô hạn tỉa bỏ cành phụ, chỉ để lại 2 thân chính

+ Phòng trừ sâu bệnh hại: theo dõi và phòng trừ bệnh xoăn vàng lá, mốc sương,héo xanh vi khuẩn bằng thuốc Daconil, Zinep; phòng trừ sâu cắt lá, sâu xám, sâu vẽbùa, sâu xanh, sâu đục quả bằng thuốc Sherpa

+ Thu hoạch khi quả bắt đầu chuyển màu (bắt đầu chín), số lần thu căn cứ vàođặc điểm chín của giống

Các chỉ tiêu theo dõi: áp dụng theo hướng dẫn trong tiêu chuẩn ngành

10TCN219: 2006 (Bộ NN và PTNT, 2006) và 10TCN557-2002 (Bộ NN và PTNT,2002)

- Các giai đoạn sinh trưởng:

+ Thời gian từ trồng đến ra hoa: khi 50% số cây trong ô thí nghiệm có hoa đầutiên

+ Thời gian từ trồng đến thu quả đợt 1: khi 50% số cây theo dõi có quả chín.+ Thời gian từ trồng đến kết thúc thu hoạch: tính đến ngày thu hết quả thươngphẩm

- Một số chỉ tiêu về cấu trúc cây và hình thái lá:

+ Kiểu hình sinh trưởng: quan sát đặc tính ra hoa và sinh trưởng của cây vàogiai đoạn ra hoa: kiểu hữu hạn, khi cây ra hoa rộ thân chính ngừng sinh trưởng; kiểu

vô hạn, cây ra hoa thân chính vẫn tiếp tục sinh trưởng và kiểu bán hữu hạn, trung giangiữa hai kiểu trên

+ Mức độ xanh của lá: quan sát màu mặt trên phiến lá khi thu hoạch lứa quảthứ 2-3, các mức: xanh đậm, xanh, xanh sáng

+ Dạng lá: quan sát sự phân thùy của lá chét thời kỳ thu hoạch lứa quả thứ 2

-3, gồm dạng lá bình thường và dạng lá khoai tây

+ Số đốt từ gốc tới chùm hoa thứ nhất: theo dõi thời kỳ ra chùm hoa thứ 2 - 3.+ Chiều cao từ gốc tới chùm hoa thứ nhất: đo từ cổ rễ đến chùm hoa 1, theo dõithời kỳ ra chùm hoa 2 - 3

+ Chiều cao thân chính: đo từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng, giai đoạn kết thúc thuhoạch

- Cấu trúc chùm hoa và đặc điểm nở hoa

+ Kiểu chùm hoa: đơn giản - hoa ra trên một nhánh chính; trung gian - hoa ratrên 2 nhánh chính; phức tạp - chùm hoa chia thành nhiều nhánh

+ Số hoa/chùm: số hoa nở của 5 chùm đầu tiên trên 3 cây thời kỳ hoa rộ, lấytrung bình

+ Đặc điểm nở hoa: quan sát và phân ra nở hoa rộ tập trung hay nở hoa rải rác

- Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất:

+ Tỷ lệ đậu quả: đếm số quả đậu của 5 chùm hoa đầu tiên của 3 cây vào thời kỳkết thúc đâụ quả để xác định tỷ lệ đậu quả trên từng chùm và tỷ lệ đậu quả trung bình,gồm các mức: rất thấp (dưới 10%), thấp (10 - 20%), trung bình (21- 40%), cao (41 -60%) và rất cao (trên 60%).

+ Tổng số quả/cây: tổng số quả các lần thu/cây, theo dõi 5 cây, lấy trung bình.+ Khối lượng trung bình quả: tổng khối lượng của số quả điều tra/số quả + Năng suất cá thể (khối lượng quả/cây): tổng khối lượng quả thu được/cây,theo dõi 5 cây, tính trung bình

- Đặc điểm hình thái và chất lượng quả:

+ Đường kính quả (độ lớn quả): đo đường kính quả ở phần lớn nhất của 10 quảchín thuộc lứa quả thứ 2 hoặc 3 để xác định độ lớn của quả

+ Chiều cao quả (H): bổ dọc quả, đo chiều cao từ đỉnh đến đáy quả của 10 quảchín, chùm quả 2-3

+ Chỉ số hình dạng quả: I = H/ D, dựa vào chỉ số hình dạng quả để phân biệtcác dạng quả: dạng quả dẹt (I < 0.6), tròn dẹt (0.6 < I < 0.9), tròn (0.9 < I < 1.1), tròndài (1,3 > I >1,1) và dài (I > 1,3)

+ Số ngăn hạt/ quả: bổ ngang quả đếm số ngăn hạt của 5 quả, lấy trung bình.+ Độ chắc quả: dùng tay nắn khi quả chín hoàn toàn, chùm quả 2-3 Gồm cácmức: mềm, trung bình, cứng

+ Mức độ xanh của quả: quan sát màu phần đáy quả xanh của chùm quả 2 - 3,

mô tả mức độ: xanh nhạt, xanh, xanh đậm

+ Màu sắc vai quả xanh: quan sát sự khác nhau về màu xanh vai quả so vớiphần còn lại của quả trưởng thành lứa quả 2-3, mô tả mức độ: không đổi, xanh nhạt,trung bình, xanh đậm

+ Màu sắc quả chín: quan sát màu quả của chùm quả thứ 2 - 3 khi chín hoàntoàn

+ Đánh giá hương vị quả: có hay không hương vị thơm đặc trưng của cà chuahoặc có hương vị phụ khác (hăng, ngái)

+ Độ Brix%: đo khi quả chín hoàn toàn (dùng khúc xạ kế), lấy ngẫu nhiên quảcủa lứa 2-3 của 5 cây mẫu, phân tích chậm nhất sau thu hoạch 3 ngày, các mức: thấp(dưới 3,5%), trung bình (3,6-4,4%), cao (4,5 - 6,0%), rất cao (trên 6%).

+ Khẩu vị (*): đánh giá cảm quan theo các mức: chua, chua dịu, nhạt, ngọt dịu,ngọt, ngọt đậm

+ Độ ướt thịt quả (*): dùng dao sắc cắt ngang quả và phân biệt: ướt - mặt thịtquả ướt, không có dịch quả chảy ra; khô nhẹ - mặt thịt quả lấm tấm dịch quả; khô -mặt thịt quả ráo nước

(*): theo hướng dẫn của trung tâm nghiên cứu và phát triển giống rau chấtlượng cao, Đại học Nông nghiệp Hà Nội

- Đánh giá tình hình nhiễm một số sâu bệnh hại chính trên đồng ruộng: bệnhmốc sương và héo xanh được đánh giá theo tiêu chuẩn ngành 10TCN219: 2006 của BộNông nghiệp và phát triển nông thôn (bộ NN và PTNT), bệnh xoăn vàng lá được đánhgiá theo chỉ số mức độ nghiêm trọng bệnh (Lapidot và Friedmann, 2002)

+ Bệnh mốc sương (Phytophthora infestans): đánh giá sau trồng 30, 60 và 90

ngày theo thang điểm từ 0 đến 5:

[0] Không bệnh

[1] Dưới 20% diện tích thân lá nhiễm bệnh

[2] Từ 20-50% diện tích thân lá nhiễm bệnh

[3] Từ 50-75% diện tích thân lá nhiễm bệnh

[4] Từ 75-100% diện tích thân lá nhiễm bệnh

+ Bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacerum Smith): theo dõi từ trồng

đến thu hoạch, đếm số cây có triệu chứng bệnh, tính tỷ lệ% cây bệnh

+ Bệnh virus xoăn vàng lá: theo dõi từ trồng đến kết thúc thu hoạch, đánh giátheo chỉ số mức độ nghiêm trọng bệnh từ 0 đến 4:

[0] không thấy xuất hiện các triệu chứng bệnh;

[1] vàng rất nhẹ ở mép lá chét trên lá đỉnh;

[2] biến vàng nhẹ và đỉnh lá chét cuốn nhẹ;

[3] một loạt các lá vàng, xoăn, và cong hình thìa nhưng cây vẫn tiếp tục pháttriển;

[4] các cây cây còi cọc rất nặng, lá vàng, xoăn, và cong hình thìa rất rõ, câyngừng phát triển

3.3.2 Nghiên cứu phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá và gen chín chậm

rin

Chiết xuất DNA

DNA được chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle và Doyle, 1990), đượccải tiến bởi bộ môn CNSH ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nôngnghiệp Hà Nội

- Hóa chất và đệm:

+ DEB (DNA Extraction Buffer): 2% CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM HCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2%  - Mercaptoethanol Hòa tan CTAB và cáchóa chất khác trong nước cất 2 lần bằng cách ủ trong waterbath ở 65oC Thêm 2 % -Mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng

Tris-+ TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0

+ Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform:isoamyl alcohol (24:1), 100 % ethanol, 76 % ethanol

- Qui trình chiết xuất DNA:

+ Thu các lá non vào buổi sáng, đặt trên đá lạnh và đưa về phòng thí nghiệmcàng sớm càng tốt

+ Cắt khoảng 100 mg mô lá vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 400 µl DEB,tiếp tục thêm 400 µl DEB và trộn đều trước khi chuyển hỗn hợp vào tuble 1,5 ml Đưangay các tube vào ủ ở 65oC trước khi chuyển sang nghiền mẫu khác

+ Ủ mẫu ở 65ºC trong 1 giờ hoặc hơn Ủ lâu hơn kết quả năng suất DNA pelletcao hơn, sạch hơn, trắng hơn (Aldrich và Cullis, 1993)

+ Chiết xuất với cùng thể tích 25:24:1 (1:1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảongược các ống trong 5 phút, sau đó ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phòng, 12000 rpm để