KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ BIẾN DỊ TRÊN HOA VẠN THỌ (Tagetes spp.) SAU KHI CHIẾU XẠ BẰNG TIA GAMMA (Co60)

Thực hiện thí nghiệm qua hai thế hệ M1 và M2, với hạt trồng ở M2 được lấy từ cây mẹ mang biến dị và cây mẹ bình thường ở đời M1 với mục đích khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý phóng xạ l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

…W X…

TRƯƠNG LÊ BẠCH LIÊN

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ BIẾN DỊ

TRÊN HOA VẠN THỌ (Tagetes spp.)

SAU KHI CHIẾU XẠ BẰNG TIA

GAMMA (Co 60 )

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

(Ngành TRỒNG TRỌT)

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 03/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

…W X…

TRƯƠNG LÊ BẠCH LIÊN

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ BIẾN DỊ

TRÊN HOA VẠN THỌ (Tagetes spp.)

SAU KHI CHIẾU XẠ BẰNG TIA

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ BIẾN DỊ TRÊN HOA

VẠN THỌ (TAGETES SPP.) SAU KHI CHIẾU XẠ

BẰNG TIA GAMMA (Co60)

TRƯƠNG LÊ BẠCH LIÊN

Hội đồng chấm luận văn:

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên Trương Lê Bạch Liên sinh ngày 30 tháng 07 năm 1983 tại thành phố Qui Nhơn, tỉnh Bình Định Con Ông Trương Văn Có và Bà Lê Thị Bạch Tuyết

Tốt nghiệp Tú Tài tại trường THPT Quốc Học, tỉnh Bình Định năm 2001

Tốt nghiệp đại học ngành Nông Học hệ Chính qui, tại Đại Học Nông Lâm, Hồ Chí Minh Sau đó làm việc tại Phòng Nghiên Cứu Hệ Thống Nông Nghiệp, Viện KHKTNN Miền Nam từ tháng 2/2006 đến tháng 10/2006, chức vụ: cán bộ nghiên cứu

Từ tháng 8/2008 đến nay làm việc tại Trung Tâm Giống Cây Trồng Bình Định, chức vụ: cán bộ kỹ thuật

Tháng 9 năm 2006 theo học Cao Học tại Đại Học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Tình trạng hôn nhân: độc thân

Địa chỉ liên lạc: 121 Lê Hồng Phong, TP Qui Nhơn, tỉnh Bình Định

Điện thoại: 0905 329339

Email: lien.bach30@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Trương Lê Bạch Liên

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Toàn thể thầy cô giáo Khoa Nông Học đã giảng dạy tôi trong quá trình học tập tại trường

TS Bùi Minh Trí, Viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, ĐH Nông Lâm TP

Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ

Ban giám Đốc Trung Tâm Giống Cây Trồng Bình Định đã hỗ trợ, tạo điều kiện trong công tác để tôi triển khai đề tài và hoàn thành khóa học tốt nhất

Bạn bè và đồng nghiệp luôn quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học Cao Học và làm việc tại cơ quan

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát sự sinh trưởng, phát triển và biến dị của hoa vạn thọ (Tagetes spp.)

sau khi chiếu xạ bằng tia gamma (Co60 )” được tiến hành tại vườn ươm Trung Tâm Giống Cây Trồng Bình Định, huyện Tuy Phước, tỉnh Bình Định, thời gian từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 7 năm 2009

Thí nghiệm được thực hiện trên hai giống vạn thọ A1 và A2 thu thập tại huyện Tuy Phước, tỉnh bình Định Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) trên mỗi giống, gồm 2 yếu tố và 3 lần lặp lại Yếu tố thứ nhất: chiếu xạ hạt giống ở 2 dạng khác nhau là hạt khô và hạt ướt Yếu tố thứ hai: chiếu xạ với 6 liều chiếu khác nhau từ 0Gy (đối chứng), 20Gy, 50Gy, 100Gy, 150Gy và 200Gy

Thực hiện thí nghiệm qua hai thế hệ M1 và M2, với hạt trồng ở M2 được lấy từ cây

mẹ mang biến dị và cây mẹ bình thường ở đời M1 với mục đích khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý phóng xạ lên sự sinh trưởng, phát triển của cây vạn thọ, khả năng tạo biến dị và duy trì biến dị qua đời con

Kết quả thu được như sau:

1 Khả năng nảy mầm và sống sót của hạt vạn thọ giống A1 và A2 ở thế hệ M1 có xu hướng giảm dần khi chiếu xạ hạt ở liều tăng dần

2 Chiếu xạ hạt vạn thọ giống A1 dạng ướt ở liều 150Gy và 200Gy làm chết toàn bộ cây mầm ở giai đoạn sau 10 ngày gieo

3 Khi chiếu xạ hạt vạn thọ dạng khô, cây sinh trưởng tốt hơn và xuất hiện nhiều biến dị hơn chiếu xạ dạng hạt ướt

4 Với liều chiếu xạ 50Gy dạng hạt khô ở cả hai giống A1 và A2 thì cây vạn thọ sống sót

và sinh trưởng tốt nhất đồng thời xuất hiện nhiều biến dị có giá trị thực tiễn

5 Sau hai thế hệ M1 và M2, thí nghiệm thu được 2 dạng biến dị có giá trị là

- Dạng biến dị cây thấp, không đổ ngã, sinh trưởng khoẻ, ra hoa có kích thước lớn ở nghiệm thức M2T3 (tần số 100%), có thể được sử dụng để khảo sát khả năng duy trì đặc tính tốt ở các thế hệ sau

- Dạng biến dị có cấu trúc hoa đầu gồm những hoa đơn hình lưỡi xếp thành lớp, màu cam sậm kiểu hình đẹp, ở nghiệm thức M2T15 (tần số1,8%) được sử dụng để khảo sát khả năng tạo thành giống mới

ABSTRACT RESEARCHING IMPACT OF RADIATION BY GAMMA RAYS (Co60) ON THE

GROWTH, DEVELOPMENT AND VARIABILITIES OF

MARIGOLD (Tagetes spp.)

Seeds of two cultivars of marigold (Tagetes spp.) that collected at Tuy Phuoc district,

Binh Dinh province were irradiated with gamma rays (Co60)

The treated seeds were grown in experimental pots with Completely Randomized Design (CRD), two factors and three replications The first factor is types of seed: wet and dry seed; the second is intensity of radiation: 0Gy (the control), 20Gy, 50Gy, 100Gy, 150Gy and 200Gy

Results were:

- Germination and survival of marigold were decreased at increasing intensity of radiation All seeds at treatments of wet type with 150Gy and 200Gy died after germinating about 20 days for A1 varietiy

- The strong intesity (>100Gy) could inhibit the growth and development of marigold and resulted in marigolds be shorter and dwarfer

- Marigolds grew, developed best and had much positive variabilities when they were irradiated at dry seed

- Marigolds grew, developed best and had much positive variabilities at level of 50Gy

- In A1 cultivar, marigolds are shorter, grew better and created bigger flowers than the control with frequency of 100 percent in the treatment of dry seed-50Gy

- At the treatment of dry seed-50Gy of A2 cultivar, one individual appeared variability

of color of trunk, leaves and structure of flower head The frequency of this variability is 1,8 percent

2.1 Giới thiệu chung về cúc vạn thọ 3

2.1.3 Đặc điểm nông học của Tagetes L 4

2.2 Phương pháp gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân phóng xạ 10

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp gây đột biến 10

2.2.2 Tác nhân phóng xạ gây đột biến 10

2.2.2.2 Cơ chế gây đột biến của tia phóng xạ ion hoá 11

2.2.3 Tác dụng của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền 13

2.2.3.1 Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở

2.2.3.2 Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở

2.2.4 Một số nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây đột

2.3 Nghiên cứu về đột biến phóng xạ ở một số loài thuộc

3.2.5 Phương pháp nhân giống ở thế hệ M2 27

3.2.6 Phương pháp theo dõi, thu thập và xử lý số liệu 28

3.2.6.3 Tính toán và xử lý số liệu 30

4.1 Kết quả điều tra hiện trạng trồng, mua bán 31

4.3.1 Khả năng nảy mầm, sống sót của hạt vạn thọ 35

qua các giai đoạn sinh trưởng

4.3.2 Các chỉ tiêu về sinh trưởng của cây vạn thọ 40

4.3.2.1 Các chỉ tiêu về sinh trưởng trên giống vạn thọ A1 40

4.3.2.2 Các chỉ tiêu về sinh trưởng trên giống vạn thọ A2 42

4.3.3 Các chỉ tiêu về thời gian ra hoa, đặc điểm hoa trên

của cây vạn thọ thế hệ M2 qua các giai đoạn sinh trưởng 48

4.4.3 Sự xuất hiện biến dị trên cây vạn thọ ở thế hệ M2 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.3 Kiểu hình đột biến thu được trên Chrysanthemum morifolium 19

Hình 3.3 Sơ đồ mã hóa nghiệm thức 25 Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong vườn ươm 25

Hình 3.5 Sơ đồ nhân giống trong thí nghiệm chiếu xạ trên cây vạn thọ 28

Hình 4.1 Hoa vạn thọ trồng quanh vườn 34 Hình 4.2 Mua bán hoa vạn thọ tại chợ Sân Bay, Qui Nhơn 34

Hình 4.3 Hiện tượng chết cây mầm 54

Hình 4.6 Hình dạng hoa đơn của cây vạn thọ 55

Hình 4.7 Dạng biến dị kiểu 1 trên giống vạn thọ A1 đời M1 55

Hình 4.8 Dạng biến dị kiểu 2 trên giống vạn thọ A2 đời M1 56

Hình 4.11 Kiểu hình cây biến dị ở nghiệm thức M2T15 57

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số loài trong họ Asteraceae được xử lý đột biến 20

Bảng 4.1 Kết quả thử tỉ lệ nảy mầm trên hai giống vạn thọ A1 và A2 35

Bảng 4.2 Khả năng nảy mầm của hai giống vạn thọ ở 7NSG 36

Bảng 4.3 Số lượng cây con sống sót và phát triển đến 30NSG 37

Bảng 4.4 Khả năng sống sót của hai giống vạn thọ đến giai đoạn ra hoa 39

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên chiều cao cây, số lá

kép/thân chính và chiều cao phân cành trên cây vạn thọ giống A1 40

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên sự phân cành, chiều dài

đốt và đường kính gốc thân trên cây vạn thọ giống A1 41

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên chiều cao cây, số lá

kép/thân chính và chiều cao phân cành trên cây vạn thọ giống A2 42

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên sự phân cành, chiều dài

đốt và đường kính gốc thân trên cây vạn thọ giống A2 43

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên quá trình ra hoa giống A1 44

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên đặc điểm hoa giống A1 45

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên quá trình ra hoa giống A2 46

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của chiếu xạ lên đặc điểm hoa giống A2 46

Bảng 4.13 Tần số các loại biến dị trên hai giống cúc vạn thọ A1 và A2 48

Bảng 4.14 Khả năng nảy mầm và sống sót của cây vạn thọ giống A1

qua các giai đoạn sinh trưởng 49

Bảng 4.15 Khả năng nảy mầm và sống sót của cây vạn thọ giống A2

qua các giai đoạn sinh trưởng 50

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của sâu bệnh hại lên hai giống vạn thọ 51

Chương 1

MỞ ĐẦU

Cúc vạn thọ (Tagetes spp.) là loại hoa được ưa chuộng và trồng khắp nơi trên thế giới

nhờ đặc tính sắc hoa tươi thắm, lâu tàn, phù hợp trồng làm hoa cắt cành trang trí trong gia đình, đền chùa hoặc tô điểm trong công viên, nơi công cộng Ngoài ra, vạn thọ còn được dùng trong ngành công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, y học và nông nghiệp

Tuy nhiên hiện nay ở nước ta các giống vạn thọ địa phương đang dần thoái hóa, chỉ được trồng ở qui mô hộ gia đình với chủng loại giống nghèo nàn và không mang lại hiệu quả kinh tế cao

Từ hiện trạng trên, công tác cải tạo, chọn lọc giống vạn thọ từ nguồn vật liệu địa phương là rất cần thiết, góp phần làm phong phú chủng loại hoa để đáp ứng thị hiếu của người dân và đảm bảo chủ động nguồn giống cho việc phát triển loại hoa này

Một trong những phương pháp tạo giống mới trên cây trồng nói chung và hoa cảnh nói riêng là gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân vật lí hoặc hóa học lên cơ quan dinh dưỡng hoặc sinh sản của cây để tạo ra các đặc tính mới phù hợp làm nguồn vật liệu khởi đầu cho quá trình chọn tạo tiếp theo

Nhận thấy được tiềm năng của loại hoa này cùng với nhu cầu tiêu thụ hoa tại tỉnh Bình Định đang ngày một tăng cao, việc khảo sát tạo ra những giống vạn thọ có hoa đẹp, có giá trị thương mại để xử lý đột biến làm nguồn vật liệu ban đầu cho công tác chọn tạo giống

là rất có ý nghĩa

Chính vì vậy đề tài “Khảo sát sự sinh trưởng, phát triển và biến dị trên hoa vạn

thọ (Tagetes spp.) sau khi chiếu xạ bằng tia gamma (Co60 )” đã được thực hiện

™ Mục tiêu nghiên cứu

9 Xác định liều chiếu xạ và kiểu chiếu xạ thích hợp lên hạt giống hoa vạn thọ để cây sinh trưởng, phát triển tốt đồng thời xuất hiện biến dị có lợi

9 So sánh, đánh giá các kiểu biến dị tốt có khả năng làm vật liệu cho quá trình chọn tạo giống

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cúc vạn thọ

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại

2.1.1.1Nguồn gốc

Cúc vạn thọ (Tagetes L.) là một chi gồm khoảng 60 loài cây thân thảo một năm và lâu năm trong họ cúc (Asteraceae), có nguồn gốc tại khu vực Tây Nam Hoa Kỳ kéo dài qua

Mexico về phía nam tới khắp Nam Mỹ

Các loài thuộc chi này gọi chung là cúc vạn thọ, cúc vạn thọ châu Phi hay cúc vạn thọ

Pháp Một loài ít được biết đến nữa là T tenuifolia có lá và hoa nhỏ hơn các loài vạn thọ

Chi (genus): Tagetes L

Loài (species): một số loài như T.erecta, T.filifolia, T.lacera, T.lucida, T.minuta, T.patula, T tenuifolia và nhiều giống lai ghép khác

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Vạn thọ có nhiều loài với chiều cao, màu sắc và hình dạng hoa khác nhau nhưng nhìn chung có 3 loài phổ biến

™ Vạn thọ Châu Phi (T.erecta) thường là loài có thân cây cao nhất và hoa to nhất, chiều

cao từ 1-3feet, rộng từ 0,5-1feet, cây thân thảo mọc thẳng đứng và chia nhiều cành

™ Vạn thọ Pháp (T.patula) là loài có thân thấp lùn, hoa nhỏ hơn vạn thọ Phi Châu nhưng

đủ màu, đủ hình dạng Đây là loài thường được dùng để cắm cành và chơi chậu do hoa lâu tàn, nhiều màu sắc

™ Loài vạn thọ lai: là giống phối hợp giữa cây vạn thọ Pháp và Phi Châu

™ Một số đặc điểm hình thái của chi Tagetes L có thể tóm tắt như sau:

- Thân: dạng thân bụi nhỏ đến lớn, thẳng đứng, phân cành nhiều và bất định

- Lá: mọc đối (đôi khi mọc cách), lá kép chia thùy hình lông chim lẻ, mép lá có nhiều tuyến dầu và có hình răng cưa, thơm Lá hình thuôn dài có dạng hình mác hay mác ngược với chiều dài phiến lá nhỏ hơn 2 inches

- Hoa mọc đơn độc hoặc tụ họp, cụm hoa đầu lớn, màu sắc đa dạng, cánh hoa nhỏ mỏng Theo Hoàng Thị Sản (1999) có một số kiểu cụm hoa hình đầu trong họ Cúc nói

chung và chi Tagetes nói riêng gồm: đầu với tất cả các hoa đều hình ống; đầu với hoa ở

giữa hình ống, hoa ở ngoài hình lưỡi; đầu với tất cả các hoa đều hình lưỡi Phía ngoài đầu

có các lá bắc xếp xít nhau làm thành tổng bao Tổng bao có thể xếp thành một hàng hoặc nhiều hàng, màu lục hoặc màu khác, hình dạng rất khác nhau

- Quả cây vạn thọ là dạng quả bế hình thuôn dài, kích thước nhỏ khoảng 2mm, có 2 vây ngắn, màu nâu đen đến đen

2.1.3 Đặc điểm sinh học, nông học của loài Tagetes L

Hoa vạn thọ có thể trồng quanh năm nhưng vụ chính là vào dịp Tết Đối với giống vạn thọ lùn gieo trễ nhất vào khoảng 5/11 âm lịch, vạn thọ cao là 25/10 âm lịch Ở một số nước nếu thu hoạch hoa vào mùa đông thì gieo hạt vào tháng tám, chín; nếu thu hoạch hoa vào mùa xuân thì gieo vào tháng giêng

Hoa vạn thọ không kén đất trồng, có thể trồng trên đất cát pha, sét pha, đất có lẫn sỏi

đá nhưng thích hợp nhất là đất thịt nhẹ Điều cần thiết là đất trồng vạn thọ phải cao ráo, đủ

ẩm, thoát nước tốt, không úng thủy và không nhiễm phèn hay mặn (Việt Chung, 2006) Người ta có thể trồng hoa vạn thọ từ hạt hoặc giâm cành hay tách chồi, tuy nhiên phương pháp nhân giống vô tính thường có nhược điểm như cây quá thấp, cho hoa nhỏ và

Hình 2.1: Các kiểu cụm hoa đầu của họ Cúc

Hình 2.2: Cấu tạo hoa ở cây họ Cúc

(Nguồn: Phân loại học thực vật, Hoàng Thị Sản, 1999)

nhanh tàn (Việt Chung, 2006) nên chỉ thích hợp trồng chậu nhỏ Đối với việc nhân giống

từ hạt, cần một số điều kiện ẩm độ, nhiệt độ nhất định để hạt nảy mầm tối ưu Đa số hạt hoa vạn thọ sau khi hút ẩm sẽ nảy mầm tối ưu ở 250C từ 3-5 ngày đến một tuần Nếu nhiệt

độ tăng cao hơn 360C thì quả vạn thọ bị ức chế và không nảy mầm được, nhưng khi nhiệt

độ giảm xuống trong vòng 24 giờ thì hạt có khả năng nảy mầm trở lại Hạt bị ức chế nảy mầm ở nhiệt độ cao là do có 10 polypeptides chuyên biệt xuất hiện ngăn cản rễ mầm phát triển và chúng dần biến mất khi nhiệt độ trở lại mức phù hợp (Astorga và cvt, 2000; Taylor và ctv, 2007; Taylor và ctv, 2005; Hills và ctv, 2001)

Ở loài Tagetes micrantha có sự liên quan giữa thời gian nảy mầm thành cây con với

khả năng sống sót và sinh sản sau này Nếu hạt nảy mầm vào đầu mùa (nảy mầm sớm) thường có khả năng sống sót thấp hơn những hạt nảy mầm vào cuối mùa (nảy mầm trễ) Tuy nhiên những cây nảy mầm sớm thường ra hoa và tạo hạt tốt hơn những cây nảy mầm trễ (Astorga và cộng sự, 2000)

Vạn thọ sinh trưởng phát triển tốt ở nơi thông thoáng, mát mẻ và cần có ít nhất 6 giờ chiếu sáng/ngày (Gilman E.F và cộng sự), quang hợp trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời hoàn toàn sau khi qua giai đoạn cây con Thời gian sinh trưởng của vạn thọ khá ngắn, từ lúc gieo hạt đến lúc nở hoa hoàn toàn là 60-65 ngày (đối với vạn thọ lùn), 65-70 ngày (đối với vạn thọ cao)

Các loài trong chi Tagetes L được xem là cây ngày ngắn vì chúng có nguồn gốc phân

bố ở vùng cận nhiệt đới Mexico (Tsukamoto Y và ctv), tuy nhiên phản ứng quang kỳ lại phụ thuộc vào từng chủng loại hay giống vạn thọ khác nhau Nghiên cứu của nhóm tác

giả trường đại học Kyoto, Nhật Bản trên ba nhóm vạn thọ làm cảnh T.erecta, T.patula và T.tenuifolia cho thấy nhu cầu ánh sáng để kích thích sự nở hoa ở các loài này là khác

nhau Các nhóm vạn thọ này đều có khả năng hình thành mầm hoa ở cả điều kiện ngày ngắn và ngày dài nhưng quang kỳ dài làm chậm quá trình phát triển của mầm hoa Nhóm

vạn thọ Châu Phi (T.erecta) có nhu cầu quang kỳ yếu nhất, vạn thọ Pháp (T.patula) trung bình và vạn thọ Signet (T.tenuifolia) phản ứng quang kỳ mạnh nhất

Hoa vạn thọ là dạng hữu tính, phần lớn thụ phấn nhờ côn trùng vì cấu trúc và sự phát triển của hoa làm cho nhị và nhuỵ không chín đồng thời Trong cụm hoa đầu, hoa ngoài

cùng nở trước thường là hoa đơn tính hoặc vô tính có màu sắc đẹp hấp dẫn côn trùng, hoa

ở giữa nhỏ, nở sau, hình ống là hoa lưỡng tính, có nhiệm vụ sinh sản Nhờ đặc tính thụ phấn chéo này, trong tự nhiên rất nhiều loài vạn thọ lai được hình thành từ phép lai trong cùng một loài hoặc giữa các quần thể với nhau Các nghiên cứu về di truyền tế bào trong

chi Tagetes cho thấy có nhiều mức độ dị bội khác nhau, đa số các quần thể vạn thọ trồng như T.erecta và T.tenuifolia có dạng nhị bội 2x, với x=12, còn T.patula có dạng tứ bội 4x

Con lai giữa quần thể nhị bội và tứ bội có bộ nhiễm sắc thể tam bội 3x Ngoài những kiểu

dị bội quen thuộc, một số phép lai khác có hiện tượng như: giao tử không phân ly, apomixis, đơn bội và kiểu hình khảm (Miguel và ctv, 2000)

2.1.4 Sâu hại và bệnh hại

2.1.4.1 Sâu hại

- Trên cây vạn thọ, nhện gây hại thường xuyên nhất, đặc biệt trong mùa hè, làm mất màu xanh của lá, nếu bị hại nặng, toàn cây bị mạng nhện bao phủ

- Một đối tượng nghiêm trọng khác là rầy các loại, làm mép lá cuốn tròn lại, lá bị xoắn

và mặt dưới lá bị hại chuyển sang màu hơi đỏ tía như khi bị chiếu dưới nắng Đỉnh cành

và lá chét héo rủ chuyển sang vàng và khô, hiện tượng này bị lặp lại nhiều lần làm trì hoãn

sự ra hoa Các giống vạn thọ lùn thường bị hại nặng hơn giống vạn thọ cao Nhện săn mồi

và ong kí sinh được dùng để kiểm soát các loại côn trùng gây hại (Gilman E.F và Howe T.)

- Ngoài ra vạn thọ còn thường bị sâu vẽ bùa và các loại sâu ăn lá gây hại [3] làm hư hại hoa và mất vẻ đẹp của cây

2.1.4.2 Bệnh hại

- Bệnh mốc đen (Botrytis blight) làm lá chuyển thành màu nâu và thối mục đặc biệt

trong mùa mưa Bệnh mốc xám do nấm Botrytis, Sclerotinia làm hoa bị héo vì vậy cần

nhổ bỏ và tiêu huỷ các hoa bị hại

- Bệnh héo rủ gây hại trên vạn thọ làm cây héo rồi chết đi, đặc biệt trên giống vạn thọ Pháp và các loài vạn thọ lùn, cần loại bỏ hay tiêu huỷ chúng

- Bệnh đốm lá tạo ra các đốm hình oval hoặc bất định, màu xám tới đen trên lá chét Bệnh bắt đầu xuất hiện ở các lá bên dưới và lan dần lên phía trên, giống vạn thọ Châu Phi mẫn cảm với bệnh nhất

- Bệnh héo tươi do nấm, quăn đọt do bọ trĩ truyền virus, bệnh thường xuất hiện khi độ

ẩm cao, không cân đối dinh dưỡng, khi mưa lớn hoặc khi tưới mạnh gây xây xát cho cây

2.1.5 Những nghiên cứu về hoa vạn thọ

Hiện nay việc nghiên cứu trên hoa vạn thọ thường tập trung vào các hợp chất diệt tuyến trùng, các chất tạo màu, một số hợp chất chữa bệnh, các đặc tính sinh lý của cây Công tác lai tạo, chọn giống đặc biệt là phương pháp tạo giống đột biến ít được chú ý Đối với hoa vạn thọ, nhiều nghiên cứu đã quan tâm tìm hiểu, phân tích và khai thác sắc tố hoa để có thể ứng dụng ở nhiều mức độ khác nhau Cánh hoa vạn thọ là nguồn sắc

tố lutein tự nhiên được dùng trong thực phẩm gia cầm để nhuộm màu lòng đỏ trứng Ở

một số giống T.erecta, năng suất sắc tố tạo ra khá cao, khoảng 20,7–22 kg/ha khi thu

hoạch hoa bằng tay và khoảng 10,6kg/ha nếu thu hoạch bằng máy

Nghiên cứu của Martínez và cộng sự, 2005 nhận định giống vạn thọ T.erecta là nguồn

carotenoids tốt, có thể sử dụng cho việc nghiên cứu sắc tố trong quá trình phát triển hoa Hoa biểu hiện nhiều mức sắc tố khác nhau được tạo ra bởi lutein Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp carotenoid cho thấy có các gen phytoene synthase (Psy); phyto-ene desaturase (Pds); lycopene β-cyclase (Lcy-b) và lycopene ε-cyclase (Lcy-e) tham gia quá trình này Để kiểm chứng, các cDNA được phân lập từ hoa vạn thọ có chiều dài từ 1376-1916 bp, dự đoán trình tự amino acid và sau đó kiểm tra với chuỗi mã di truyền trong ngân hàng gen NCBI, kết quả cho thấy có sự đồng dạng đến 66-100% Thêm vào

đó, phân tích Northern Blot cho thấy hầu như quá trình truyền mã các gen tổng hợp sắc tố trên diễn ra trong quá trình phát triển hoa Một số thí nghiệm khác về sự thay đổi cấu trúc

ở gen tạo hình thái hoa; về sự tích lũy sắc tố giữa các giống; sự lắng tụ sắc tố trong những cấu trúc đặc biệt đã chứng minh rằng toàn bộ các quá trình này đều diễn ra trong quá trình

phát triển hoa Một nghiên cứu khác cho thấy ở cánh hoa vạn thọ (T.erecta) sự tổng hợp

và tích lũy carotenoids cao gấp 20 lần ở lá Các giống hoa vạn thọ có màu sắc đa dạng từ

trắng đến cam đậm là do sự khác biệt về mức độ carotenoid >100-fold (Moehs C.P và ctv, 2001)

Một hướng nghiên cứu khác liên quan đến đặc tính sinh lý nảy mầm của hạt hoa vạn thọ cho thấy các nhân tố nội sinh trong phôi, hoạt động chủ yếu ở rễ mầm làm cản trở sự

nảy mầm của hạt T.minuta ở nhiệt độ cao Những nhân tố này ngăn cản sự kéo dài tế bào,

cụ thể là hiện tượng nhú rễ mầm ở điều kiện tối thích Tuy nhiên sự nảy mầm có thể được kích thích ở nhiệt độ cao nhờ fusicoccin (kích thích sự kéo dài tế bào nhanh chóng) Thêm vào đó, hạt giống được mồi nước ở 250C trong polyethylene glycol(PEG)6000 và mannitol cũng có thể kích thích hạt nảy mầm trong nước 360C (Taylor N.J và ctv, 2007)

Nhóm tác giả này chứng minh thêm sự nảy mầm ở nhiệt độ cao của quả vạn tho T.minuta

hầu như chỉ được điều tiết riêng bởi phôi, còn phần vỏ có vai trò không đáng kể Hills và cộng sự, 2001 giải thích hiện tượng ức chế nảy mầm này là do có 10 polypeptides chuyên biệt xuất hiện khi có nhiệt độ cao, làm cản trở rễ mầm phát triển và do vậy hạt không nảy mầm Ở quả vạn thọ có hiện tượng ức chế nhiệt và hiện tượng này không thể giảm đi dù

sử dụng bất kỳ chất điều hoà sinh trưởng nào Nhưng nếu kết hợp giảm nồng độ ABA và tăng nồng độ ethylene đồng thời thì có thể khôi phục được sự nảy mầm ở nhiệt độ trên mức tối hảo (Taylor và ctv, 2003)

Nghiên cứu về tác dụng xua đuổi côn trùng, tuyến trùng của một số loài vạn thọ cũng được quan tâm rất nhiều Krishna và các cộng sự, 2005 đã khảo sát độc tính diệt côn trùng

trên một số kiểu gen của loài Tagetes Kết quả cho thấy 3 kiểu gen trong loài T.minuta, 6 kiểu gen trong loài T.patula và 15 kiểu gen của loài T.erecte có chứa loại tinh dầu được

dùng như thuốc xông hơi và tiếp xúc diệt 3 loại côn trùng ở sản phẩm bảo quản:

Callosobruchus maculatus (Fabricius), Sitophilus oryae (Linnaeus) và Tribolium castaneum (Herbst)

Các gen này tác động lên thành trùng cản trở sự đẻ trứng và làm giảm quần thể côn trùng Thiophene (một hợp chất thơm chứa lưu huỳnh) có nhiều trong rễ cây vạn thọ được xem là chất dẫn dụ và diệt tuyến trùng, côn trùng hiệu quả khi trồng xen hay luân canh với các cây trồng nông nghiệp khác (Kenry và ctv) Chính vì vậy việc tạo ra các loài vạn thọ chứa hàm lượng Thiophen cao được chú trọng nghiên cứu Nhóm tác giả Jacobs và cộng

sự, 1995 đã gây đột biến bằng EMS (Ethyl Methanesulfonate) lên hạt giống hoa vạn thọ

T.erecta Kết quả là 2 đột biến biểu hiện thành phần cấu tạo Thiophene khác thường được

tìm thấy sau khi kiểm tra hơn 300 cây từ quần thể đột biến M2 nhờ phân tích sắc ký lỏng HPLC (high-performance liquid chromatography) đối với dịch chiết xuất từ rễ Hai đột biến có nguồn gốc từ cùng một cây mang đột biến, chứa C13monothiophene2-(but-3-en-1-

ynyl)-5-(penta-1,3-diynyl)-thiophene mà trước đó không có ở cây T.erecta và chứa 2C12

bithienyls với liều lượng cao mà không có (hay với nồng độ thấp) ở loài hoang dại Kiểu

hình đột biến cũng biểu hiện ở 21 dòng Agrobacterium rhizogenes thu được từ rễ 2 cây

đột biến Thí nghiệm thực hiện nuôi cấy rễ thu từ một giống đột biến và một giống hoang dại cho thấy sự tích luỹ monothiophene là bước ban đầu cho sự tích luỹ bithienyl thiophene ở cả 2 giống thí nghiệm này nhưng một giống đột biến còn lại thì thiếu quá trình biến đổi monothiophene (Jacob J.J và ctv, 1995)

Từ một số nghiên cứu trên và nhiều tài liệu tham khảo khác có thể nói hướng nghiên

cứu chủ đạo trên Tagetes L vẫn là về các hợp chất sinh hoá và tác dụng bảo vệ cây trồng

của loài cây này Việc lai tạo, tuyển chọn các giống vạn thọ mới bằng phương pháp truyền thống và hiện đại, cụ thể là tạo giống bằng đột biến thực nghiệm còn rất hạn chế Do đó công tác nghiên cứu theo hướng này cần được đầu tư nhiều hơn

2.2 Phương pháp gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân phóng xạ

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp gây đột biến

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy tần số đột biến và đặc điểm đột biến phụ thuộc vào tính chất của tác nhân gây đột biến được dùng để xử lý cũng như một số đặc tính của đối tượng xử lý: đặc điểm di truyền của giống, tính sinh lý, thời kỳ sinh trưởng, bộ phận

xử lý, ngoài ra còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường lúc xử lý (Trần Thượng Tuấn)

Bộ phận xử lý đột biến có thể là giao tử, phôi hạt, mầm chồi, căn hành, củ Nhìn chung

xử lý đột biến lúc hạt nảy mầm và cây con cho kết quả cao hơn so với xử lý lúc hạt ở trạng thái ngủ nghỉ và cây trưởng thành Xử lý tế bào ở thời kỳ phân bào giảm nhiễm dễ phát sinh đột biến hơn các thời kỳ khác Xử lý giai đoạn tiền phôi cho tần số đột biến cao nên được phổ biến rộng

2.2.2 Tác nhân phóng xạ gây đột biến

2.2.2.1 Phân loại

Dựa vào khả năng ion hóa vật chất bị nhiễm phóng xạ có thể chia ra các nhóm sau:

™ Nhóm phóng xạ ion hoá: là loại phóng xạ gây ra phản ứng ion hóa phóng xạ, tạo ra các cặp ion hoá trong môi trường mà chúng thâm nhập hoặc gây ra sự kích động phân tử Nhóm này đươc chia ra thành 2 nhóm phụ:

o Bức xạ hạt: đặc trưng bởi khối lượng và điện tích khác nhau, gồm các hạt sơ cấp và dòng nguyên tử có vận tốc không đổi, gồm 3 phân nhóm:

ƒ Nhóm hạt nhẹ mang điện tích: gồm điện tử và positron sinh ra do phản ứng hạt nhân

ƒ Nhóm hạt nặng mang điện: gồm proton, hạt α và các hạt khác

ƒ Nhóm trung tử (nơtron): hạt không mang điện nên có thể xâm nhập vào mọi hạt nhân nguyên tử

o Bức xạ sóng điện từ: nhóm này đặc trưng với vận tốc lớn, độ dài bước sóng và được biểu thị bằng công thức: C = T * λ

Với C: vận tốc T: tần số λ: bước sóng

Tia gamma (γ), tia Rơnghen (tia X) thuộc nhóm này, do bước song rất ngắn (10-12đến 10-9) và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không bị lệch trong điện trường nên có sức xuyên thấu rất lớn, không có khả năng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng gián tiếp Năng lượng của tia γ tuỳ thuộc vào tần số sóng và được biểu thị bằng công thức:

Nguồn xạ thường được dùng để tạo tia gamma là Co60

™ Nhóm phóng xạ không gây ion hoá: đại diện cho nhóm này là tia tử ngoại (λ = 10-7 đến

10-5A0), khi xuyên qua các mô của cơ thể sinh vật, nhóm này không gây ion hoá mà chỉ kích động phân tử, sức xuyên thấu yếu nên thường dùng để xử lý hạt phấn và bào tử

2.2.2.2 Cơ chế gây đột biến của tia phóng xạ ion hoá

Theo Khuất Hữu Thanh (2006), hiện nay có nhiều giả thuyết khác nhau giải thích cơ chế gây đột biến của tia phóng xạ ion hóa:

™ Thuyết bia: cho rằng các tế bào, các cơ thể sinh vật có những trung tâm nhạy cảm phản

xạ được xem như những đơn vị cảm ứng, như một cái bia Khi các lượng tử hoặc các hạt

cơ bản va chạm vào các đơn vị cảm ứng, gây ra biến đổi tạo đột biến Khi tăng liều lượng phóng xạ quá ngưỡng, hiệu ứng phóng xạ giảm do có sự va chạm tiếp theo của các lượng

tử với các nhân tố vật chất đã chết

™ Thuyết độc tố: cho rằng dưới tác động của tia xạ làm thay đổi hoạt tính của các enzyme Do tác động của tia phóng xạ ion hoá làm cho các enzyme trong lyzoxome được giải phóng vào tế bào chất gây rối loạn sự trao đổi chất của tế bào

™ Thuyết cơ chế tác dụng gián tiếp (hay thuyết các gốc tự do): phân tử nước trong tế bào

có vai trò trong sự hình thành các đột biến Trong các tổ chức sống, nước chiếm 85%, khi các tia phóng xạ tác động vào tế bào hoặc cơ thể, các phân tử nước trong tế bào hấp thụ năng lượng, bị mất 1 điện tử (e) trở thành ion (+)

H2O H2O+ + e-

e mới phóng ra được 1 phân tử nước khác đã bị phóng xạ kích động hấp thu thành ion (-)

H2O + e- H2O-

Các ion H2O+ và H2O- không bền do đó nhanh chóng bị phân huỷ tạo ra các gốc tự do H

và OH và 2 ion bền vững H+ và OH- Các gốc tự do không bền nên tác dụng với nhau sau đó: H + H = H2 hoặc khi có O2 thì H + O2 = HO2

Các gốc tự do có thể kết hợp với các chất trong tế bào tạo thành peroxide, tác dụng lên DNA làm mất nhóm NH2 của gốc dị vòng chứa Nitơ, mất nguyên tử H hoặc làm đứt liên kết giữa đường pentose và gốc dị vòng chứa nitơ, hoặc có thể làm đứt vòng pirimidin gây đứt mạch DNA tạo ra đột biến gen

™ Thuyết hiện đại: giải thích bằng nồng độ và trạng thái của các chất hữu cơ trong tế bào Khi tế bào có nồng độ các chất hữu cơ cao, sự va chạm của các lượng tử vào các phân tử nhiều hơn, dẫn đến hiệu quả trực tiếp lớn hơn Nếu nồng độ thấp, các lượng tử của tia phóng xạ phân huỷ nước tạo thành các gốc tự do (H và OH), hình thành các peroxyt vô

cơ và hữu cơ làm biến đổi cấu trúc DNA từ đó gây đột biến

2.2.3 Tác dụng của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền

Nguồn xạ thường dùng để tạo tia γ là Co60 Nghiên cứu cơ chế tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử và tế bào góp phần làm sáng tỏ cơ chế gây phát sinh đột biến

2.2.3.1Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử

Theo Oganhexian (1969), tính đặc thù của sự phát sinh đột biến có liên quan đến đặc điểm của quá trình từ thời điểm bắt đầu xâm nhập của tác nhân phóng xạ vào tế bào, vận động đến một thời điểm nào đó trên nhiễm sắc thể rồi gây ra biến đổi cấu trúc phân tử của gen cho đến lúc trở thành đột biến thực sự (theo Đỗ Hữu Ất, 1996)

Khi chiếu xạ bằng tia gamma vào dung dịch DNA sẽ gây ra những biến đổi chủ yếu sau:

o Gây đứt đơn: đứt 1 mạch đơn DNA, làm phân tử DNA bị biến dạng, tạo cuộn làm giảm thể tích phân tử

o Gây đứt kép (đứt tương đồng) phân tử DNA bị giảm chiều dài, giảm độ nhớt của dung dịch

o Tạo cầu giữa các phân tử: làm tăng khối lượng phân tử, tăng độ nhớt, giảm độ hòa tan và tạo các búi không tan

o Tạo các phân tử phân nhánh: do sự gắn kết một số đoạn phân tử bị đứt và phân tử khác còn nguyên vẹn

o Tạo liên kết protein – DNA làm cho protein bị biến tính hay liên kết giữa base Pirimidin biến tính với các acid amin

o Phá hủy cấu trúc không gian của DNA (biến tính DNA)

o Gây hiện tượng nhị trùng phân thiamin

o Phá hủy gốc dị vòng chứa nitơ

o Gây hiện tượng hỗ biến: tia gamma làm thay đổi vị trí của nguyên tử H dẫn tới sự hình thành gốc lactim hay imin, hậu quả là sự sao chép sai của DNA tạo DNA đột biến ở các thế hệ sau (Phạm Quang Lộc, 1986)

2.2.3.2 Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ tế bào

Ở cấp độ tế bào, tia γ có thể làm biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) và huỷ hoại

quá trình phân chia tế bào

™ Tác động lên cấu trúc NST: từ tài liệu của Đỗ Hữu Ất (1996), Xvenson cho rằng bức

xạ ion hoá gây nên sự phân đoạn của NST Có 2 kiểu phân đoạn:

™ Tác động lên quá trình phân chia tế bào:

o Đối với nguyên phân

ƒ Làm kìm hãm hay dừng tạm thời quá trình nguyên phân

ƒ Làm dừng hoàn toàn quá trình nguyên phân nhưng không gây chết tế bào mà làm mất khả năng phân chia tế bào

ƒ Làm tăng độ nhớt và kết dính NST dẫn đến sự chết tế bào

ƒ Gây hiện tượng hậu kỳ đa cực, hậu quả là sai hình NST một cách phức tạp

ƒ Đôi khi bức xạ liều thấp lại kích thích sự phân bào

o Đối với giảm phân: năm 1958 khi dùng tia X gây bức xạ ion hoá ở Longiflorum,

Mitra đã thu được kết quả (theo Nguyễn Minh Công, Phạm Quang Lộc, 1987)

ƒ Gây sai hình ở diplonem: các bivalent có thể kết dính với nhau tạo vòng NST lớn, phần lớn các vòng này đều do chuyển đoạn phức tạp tạo nên

ƒ Gây sai hình NST ở hậu kỳ I hoặc II, các kiểu sai hình NST thường thấy trong giảm phân là đứt NST, tạo 1 hoặc 2 đoạn NST và cầu NST, đứt cromatit, tạo nên cầu cromatit, vòng cromatit ở trạng thái kép, tạo NST có 2 tâm và 2 đoạn, hình thành các đoạn riêng rẽ và cầu cromatit ở kỳ sau I

™ Tác động của phóng xạ đối với thực vật

Theo Kaidln và Linser (dẫn liệu từ Đỗ Hữu Ất, 1996), xử lý thực vật bằng tác nhân phóng xạ có thể tiến hành theo các phương pháp sau:

o Chiếu xạ hạt khô hoặc ướt

o Ngâm hạt trong dung dịch đơn vị phóng xạ

o Trồng cây trên đất có bón đồng vị phóng xạ

o Đưa chất đồng vị phóng xạ vào cây

o Phóng xạ thực vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển

o Ngày nay người ta còn chiếu xạ lên các cơ quan, bộ phận riêng rẽ của cây như: chồi, nụ hoa, bao phấn, bầu nhuỵ, hoặc xử lý cây đang trồng trong từng thời kỳ bằng trường gamma hoặc thiết bị chiếu xạ chuyên dụng của các trung tâm chiếu xạ

Hiệu quả của chiếu xạ thực vật ở thế hệ đầu biểu hiện ở những biến đổi dương tính, đó

là những biến đổi về cấu trúc, hình thái, sinh lý, sinh trưởng, sinh sản và gây chết

Người ta phân biệt tác dụng ngay sau khi xử lý phóng xạ (hiệu quả tức thời) với những biến đổi sau khi xử lý phóng xạ (hiệu quả chậm hay kéo dài) như sau:

o Hiệu quả tức thời có thể kể ra một số hình thức sau:

ƒ Biến đổi hóa sinh và lý hóa sinh

ƒ Biến đổi sinh lý giới hạn ở một số cấu trúc trong vật liệu bị chiếu xạ

ƒ Biến đổi vật chất di truyền

o Hiệu quả chậm: chiếu xạ gây ra những biến đổi nêu trên nhưng diễn ra trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật Đối với các loài thực vật, liều lượng thấp có tác dụng kích thích sinh trưởng còn liều lượng cao lại kìm hãm, cao quá giới hạn chịu đựng sẽ gây chết tế bào và cơ thể Trên lúa khi xử lý hạt khô bằng tia gamma ở các liều lượng 5 Kr, 10 Kr nhiều khi kích thích quá trình sinh trưởng, phát triển (Đỗ Hữu Ất, 1996)

Cơ chế của sự kích thích sinh trưởng do xử lý phóng xạ lên hạt khô được Kuzin (1963) giải thích như sau (Phạm Quang Lộc, 1986): ở liều lượng thấp, bức xạ gây ra sự hình thành các nhóm gốc hữu cơ tự do ở những khu vực nhất định trong tế bào Các gốc tự do này có thể tồn tại trong một thời gian nhất định, thường là khá dài trong điều kiện yếm

khí, thiếu nước và không bị tác dụng của điều kiện tối thích Theo tác giả, có thể là gốc tự

do được bảo tồn trong cấu trúc của lipoprotein, dạng cấu trúc là thành phần chủ yếu của màng tế bào và ít tan trong nước, nhất là trong cấu trúc của lớp aleuron và các lớp màng của vỏ quả Để hạt nảy mầm cần có đủ các điều kiện: nhiệt độ, nước, không khí Một lượng nước và O2 sẽ thấm vào màng hạt và tác dụng với các polymer tự do tạo nên một dây chuyền phản ứng như sau:

o Tác dụng của phóng xạ vào hạt có thể gây hiệu quả ở mọi giai đoạn trong quá trình phát triển cá thể:

ƒ Tác dụng trực tiếp đến chiều hướng và tốc độ của các phản ứng sinh hoá, chi phối

2.2.4 Một số nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây đột biến của tia gamma

Việc nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây đột biến của tia gamma rất

quan trọng trong việc định hướng sự phát sinh đột biến, đặc biệt là các đột biến có ý nghĩa

cải tiến giống cũ hoặc tạo giống mới (Đỗ Hữu Ất, 1996) Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến

hiệu quả gây đột biến: kiểu gen của giống, loại tác nhân phóng xạ, ẩm độ hạt, nồng độ oxy, nhiệt độ khi tiếp xúc phóng xạ, nhân tố kháng đột biến, các giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển cá thể, các pha khác nhau của chu kỳ phát triển tế bào và điều kiện

gieo trồng nhưng có thể đưa ra một số nhân tố chính sau:

™ Ảnh hưởng của ẩm độ hạt: thông thường xử lý hạt khô hay ướt để gây đột biến cảm ứng Độ ẩm của hạt có liên quan chặt chẽ tới sự phát sinh hàng loạt các biến dị và đột biến Khi chiếu xạ bằng tia gamma lên hạt lúa khô và ướt, nhiều tác giả đã kết luận: tần số sai hình NST, đột biến diệp lục và các đột biến nhìn thấy ở M2 trong trường hợp xử lý hạt ướt là cao hơn nhiều so với việc xử lý hạt khô (Đỗ Hữu Ất, 1996)

™ Ảnh hưởng của các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát triển cá thể: nghiên cứu hiệu quả của các giai đoạn khác nhau khi xử lý đột biến là một hướng được nhiều tác giả chú ý Trần Duy Quý cho rằng hạt non mẫn cảm với các tác nhân đột biến hơn hạt đã già, tần số và phổ đột biến cũng khác nhau ở các ở các hạt có độ chín khác nhau [4] Một số nghiên cứu cho thấy giai đoạn giao tử có độ nhảy cảm với tác nhân đột biến cao hơn giai đoạn hợp tử và tiền phôi, giai đoạn nhú mầm và giai đoạn cây con thì mẫn cảm với phóng

xạ hơn hạt khô và cây trưởng thành Như vậy có thể nói ở giai đoạn càng sớm của quá trình phát triển cá thể thì độ cảm ứng với các tác nhân gây đột biến càng cao

™ Ảnh hưởng của các pha khác nhau của chu kỳ tế bào: NST biến đổi hình thái, cấu trúc của các pha khác nhau của quá trình phân bào nên mức độ cảm ứng của từng kiểu hình thái cấu trúc đó với phóng xạ cũng rất khác nhau Theo một số tác giả, ở 25 0C kể từ khi ngâm hạt khô cho hút nước bão hoà rồi cho nảy mầm đến 57g30’ kết thúc pha G1, tiếp đó

là pha S từ 57g30’ đến 60g, pha G2 từ 60g đến 71g30’, quá trình nguyên phân từ 71g30’ đến 77g [4] Ảnh hưởng của tia gamma gây biến đổi kéo dài sang cả pha S hay G2 là biểu hiện bằng các kiểu cấu trúc lại của NST Nhiều tác giả cho rằng hiệu quả di truyền sẽ khác nhau tuỳ thuộc vào sự chiếu xạ vào pha nào của chu kỳ tế bào Chiếu xạ vào pha G1 sẽ gây sai hình NST, vào pha S gây sai hình NST hoặc chromatide (vì một số NST đã nhân đôi) và chiếu xạ vào pha G2 gây sai hình chromatide Nếu chiếu xạ vào kỳ trước gây sai hình dưới mức chromatide vì lúc đó đơn vị đứt là ½ chromatide Như vậy có quan hệ giữa các pha của chu kỳ tế bào với sự xuất hiện các biến đổi tiềm tàng và chuyển chúng thành

các đột biến thực sự Theo một số tác giả, sự cảm ứng phóng xạ của NST tuỳ thuộc vào các pha khác nhau của chu kỳ tế bào và sắp xếp theo thứ tự sau: G2>M>S>G1

2.3 Nghiên cứu về đột biến phóng xạ ở một số loài thuộc họ cúc (Asteraceae)

2.3.1 Nghiên cứu nước ngoài

Hoa cúc là một trong những loại hoa cắt cành và trồng chậu quan trọng trên khắp thế giới Các giống thương mại thường được trồng bởi đoạn cành vô tính hay mầm rễ Tuy nhiên việc lai tạo giống truyền thống có những giới hạn như: ngân hàng gen hạn chế, tính không tiếp hợp do sự khác biệt về nhiễm sắc thể của bố mẹ, hơn nữa sự sinh trưởng và ra hoa là đặc tính đa gen (Kumar S và ctv, 2006) Do vậy nhiều kỹ thuật di truyền và phân

tử đã ra đời, tập trung vào việc gia tăng đặc tính tốt về giá trị làm cảnh của cây trồng thông qua việc cải thiện màu sắc, kích thước, hình dạng hoa, chiều cao sinh trưởng, dạng sinh trưởng và tính nhạy cảm với chất lượng ánh sáng hay liều lượng ánh sáng Một trong những kỹ thuật sinh học hiện đại để thực hiện điều này là xử lý đột biến trên các bộ phận sinh dưỡng hay sinh thực của cây

Trong họ cúc (Asteraceae) tuy có nhiều chủng loại có giá trị làm cảnh và thương mại

nhưng hầu như chỉ có chi Chrysanthemum sp với sự đa dạng về màu sắc, hình dạng hoa

nên được chọn làm vật liệu xử lý đột biến nhân tạo nhiều nhất Theo thống kê từ cơ sở dữ liệu của tổ chức FAO/IAEA cho đến gần cuối năm 2000 có 232 giống đột biến mới thuộc

chi Chrysanthemum sp được giới thiệu chính thức (Maluszynski M và cộng sự, 2000)

Trong số các quốc gia công bố giống hoa cúc đột biến thì Hà Lan có đến 80 giống mới được phóng thích, chiếm vị trí hàng đầu, kế đến là Ấn Độ với 46 giống và Đức tạo ra 34 giống Hầu hết các giống hoa cúc đột biến được tạo ra từ việc chiếu xạ bằng tia gamma hoặc tia Rơngen (tia X) và một số ít kết hợp việc nuôi cấy in vitro với chiếu xạ tia gamma Nhóm tác giả Misra và cộng sự thuộc Viện nghiên cứu thực vật quốc gia, Ấn Độ đã

tiến hành thí nghiệm gây đột biến trên hoa cúc Chrysanthemum morifolium Ramat cv

Lalima có màu đỏ và hoa đơn có dạng hình muỗng phẳng Các hoa đơn sau đó được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,07μM α-napthaleneacetic acid và 8,87μM benzyladenin, sau đó được chiếu xạ với tia gamma (0,5Gy và 1Gy) Toàn bộ chồi tái sinh của nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức chiếu xạ được phân lập, xử lý ra rễ và đưa ra vườn ươm

sau khi cây cứng cáp Kết quả tạo được hai đột biến từ những cây hoa được chiếu xạ với tia gamma (0,5Gy), cả hai đột biến đều có màu vàng, trong đó một đột biến có hoa đơn hình muỗng phẳng như giống ban đầu, đột biến còn lại có hoa đơn hình cuộn tròn

Hình 2.3: Kiểu hình đột biến thu được trên Chrysanthemum morifolium

Từ trái qua phải: đối chứng; ĐB 1: hoa vàng với hoa đơn hình muỗng phẳng; ĐB 2: hoa

vàng với hoa đơn hình cuộn tròn (Nguồn: P.Misra, S.K.Datta and D.Chakrabarty, 2003)

Việc chiếu xạ tia gamma lên một cơ quan của cây trồng có thể xử lý tập trung trong thời gian ngắn với liều xạ thấp hoặc thực hiện kéo dài có định kỳ với liều xạ cao Một nghiên cứu của nhóm tác giả gồm Lamseejan S., Jompuk P và Deeseepan S ở đại học Bangkok, Thailand thực hiện nuôi cấy in vitro giống hoa cúc “Regan Dark Slendid” từ

mô ở chồi nách và cánh hoa Các chồi con hình thành được chiếu xạ tập trung với tia gamma liều lượng 30 Gy, các chồi con khác được chiếu xạ kéo dài với tia gamma liều lượng 112 Gy và 140 Gy Kết quả từ thí nghiệm cho thấy tần suất đột biến màu hoa trong số các cây được chiếu xạ với liều xạ 30, 112 và 140 Gy là 8,2; 9,3 và 15,3% và số giống đột biến được chọn lọc là 11; 9 và 16, màu sắc hoa của các giống được chọn khác nhau từ màu đỏ, đỏ hồng và vàng Như vậy, khi chiếu xạ tia gamma với liều chiếu cao

và thời gian kéo dài cho kết quả đột biến cao hơn chiếu xạ tập trung với liều thấp Điều này cũng được khẳng định trong nghiên cứu của S.Nagatomi, E.Miyahira và K.Degi, khi các tác giả này cho rằng phương pháp chiếu xạ theo chu kỳ bằng tia gamma với nuôi cấy

cơ quan của hoa đã chứng tỏ là cách sử dụng rất thực tế trong lai tạo đột biến nhiều loài hoa và mở rộng phổ đột biến ở cây trồng sinh trưởng bằng cơ quan sinh dưỡng

Ngoài việc tạo đột biến trên các giống thuộc chi Chrysanthemum sp., một số loại hoa

khác như thược dược, cúc đồng tiền, hướng dương cũng được làm thử nghiệm chiếu xạ với các tác nhân ion hoá, nhưng số lượng giống dược xử lý là không đáng kể

Bảng 2.1: Một số loài trong họ Asteraceae được xử lý đột biến

Tên khoa học Tên thông

thường

Số giống đột biến

Liều chiếu Tia gamma Đặc tính cải tiến

20Gy, 25Gy 30Gy, 40Gy

Màu sắc hoa Hình dạng hoa Quang kỳ Kích thước hoa

46,5Gy

Ngắn ngày Màu sắc hoa Cấu trúc cây

Nguồn: Tổng hợp từ The FAO/IAEA Mutant Varieties Database, 2000

Từ bảng 1 cho thấy, màu sắc và hình dạng hoa là 2 đặc tính được quan tâm nhất trong quá trình chọn tạo giống đột biến ở một số loài thuộc nhóm Cúc Như vậy nhu cầu làm đa dạng và phong phú chủng loại giống cây hoa cảnh nói chung và cây thuộc họ Asteraceae

nói riêng là hướng đi đang được nhiều nhà lai tạo giống lựa chọn Trong tương lai có thể

nhu cầu này sẽ được ứng dụng trên nhiều đối tượng cây trồng làm cảnh hơn

2.3.2 Nghiên cứu trong nước

Qua một số tài liệu tham khảo được, hiện nay nước ta hầu như có rất ít công trình nghiên cứu về chọn tạo giống hoa cảnh qua xử lý đột biến nhân tạo Điều này có thể là do thời gian trung bình để tạo ra một giống cây có những tính trạng mong muốn bằng phương pháp đột biến gen ngẫu nhiên là khá dài (khoảng 10 năm) Nguyên nhân là chiếu xạ

(nguồn bức xạ chủ yếu là Co60) sẽ tạo ra vô vàn đột biến và các nhà khoa học phải chọn lọc những đột biến có lợi, phù hợp với mong muốn

Tuy nhiên hiện nay ở nước ta đã có một số nhà khoa học đặt vấn đề nghiên cứu tạo các giống hoa cúc đột biến nhiều màu, cúc dã quỳ màu tím nhưng vẫn chưa có những công bố khoa học cụ thể Do vậy trước mắt rất nhiều nghiên cứu trong nước đang tập trung vào việc lai tạo, nhân giống bằng các phương pháp truyền thống hoặc nhân giống vô tính in vitro và đã đạt được nhiều thành tựu to lớn Nhiều giống hoa cúc nhập nội như Grand pink, Bijoux lilax, Rocky (có nguồn gốc từ Hà Lan), CN97 (nhập từ Nhật Bản) có nhiều đặc tính tốt: thân to, khoẻ, lá dày, hoa dạng kép, xếp chặt thích hợp với thời tiết nước ta đã được nhân nhanh bằng công nghệ invitro giúp chủ động nguồn giống trong nước (Lưu Văn Cường và ctv, 2005; Trần Thị Thu Hiền và ctv, 2007, Vũ hồng Liên vfa ctv, 2002) Qua nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước tham khảo được, vấn đề chọn tạo giống đột biến bằng kích thích hoá học và vật lý đã và đang mang lại nhiều kết quả khả quan dù vẫn còn rất khiêm tốn Với việc đẩy mạnh công tác tạo giống đột biến sẽ góp phần làm phong phú về số lượng, nâng cao về chất lượng các loài cây trồng trong tự nhiên Đây rõ ràng là một hướng đi đúng cần được đầu tư, quan tâm hơn trong tương lai

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Xử lý chiếu xạ và bố trí thí nghiệm vào cuối tháng 8/2008

Hạt giống hoa vạn thọ được thu thập tại huyện Tuy Phước, tỉnh Bình Định

Chiếu xạ hạt giống với tia gamma (Co60) tại Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt

Bố trí thí nghiệm tại vườn ươm Trung Tâm Giống Cây Trồng Bình Định, huyện Tuy Phước, tỉnh Bình Định

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Điều tra, thu thập mẫu hạt giống

3.2.1.1 Điều tra

- Điều tra sơ bộ theo hình thức phỏng vấn tại chỗ tình hình mua bán hoa vạn thọ ở một

số chợ tại thành phố Quy Nhơn, tỉnh Bình Định trong dịp Tết 2008, các ngày 15, 30 âm lịch

- Điều tra hiện trạng trồng hoa vạn thọ ở một số hộ gia đình tại xã Phước Hiệp, Mỹ Cang, Phước Lộc, Thị Trấn Tuy Phước, huyện Tuy Phước, tỉnh Bình Định

3.2.1.2 Thu thập mẫu

Sau khi điều tra hiện trạng trồng cúc vạn thọ tại huyện Tuy Phước, chọn và thu thập hai giống hoa vạn thọ được trồng phổ biến nhất tại nơi điều tra

- Giống A1: hoa màu vàng tươi, cụm hoa đầu với các hoa đơn hình phễu, đường

kính hoa 5-8cm Lá kép lông chim lẻ màu xanh nhạt, lá chét thuôn dài có răng cưa, mùi hăng Thân phân cành nhiều, cây cao 70-100cm hoặc hơn Thời gian sinh trưởng khoảng 4-4,5 tháng, cây được trồng trong sân nhà làm cảnh Giống hoa này thường được trồng vào vụ Tết (Hình 3.1)

- Giống A2: hoa màu vàng sậm đến cam, cụm hoa đầu với một lớp hoa đơn bên

ngoài hình lưỡi, những hoa đơn ở giữa hình ống, đường kính hoa 2-4cm Lá kép lông chim lẻ màu xanh đậm, lá chét to ngắn có răng cưa, mùi thơm nhẹ Thân thấp lùn phân

cành khá, cây cao 20-30cm Thời gian sinh trưởng khoảng 2-2,5 tháng, thường được trồng làm hoa cắm bình Giống vạn thọ này được trồng quanh năm (Hình 3.2)

Chọn những cây vạn thọ sinh trưởng tốt, đánh dấu 3-4 hoa to, đẹp trên cây Mỗi giống lấy từ 7-10 cây, chờ đến khi hoa chín và khô tự nhiên Hái hoa đã được đánh dấu, phơi dưới nắng nhẹ cho khô Sau đó tách hạt để riêng từng giống trong túi nilon có hạt silica gel hút ẩm, ghi nhãn cẩn thận, bảo quản nơi khô thoáng chờ đến khi xử lý chiếu xạ

Hình 3.1: Hoa và hạt vạn thọ Giống A1

Hình 3.2: Hoa và hạt vạn thọ Giống A2

3.2.2 Thử tỉ lệ nảy mầm hạt giống vạn thọ

Chọn hạt chín, chắc có màu đen nhánh Hạt cùng giống được trộn lẫn với nhau để kiểm tra tỉ lệ nảy mầm

Lấy ngẫu nhiên 100 hạt từ mỗi giống, rải đều trên đĩa Petri có lót giấy thấm, chia thành

4 lần lặp lại, mỗi lần 25 hạt

Nhỏ vào đĩa khoảng 5ml nước sạch, đậy nắp và đặt đĩa ở nhiệt độ phòng

Quan sát ghi nhận thời gian hạt bắt đầu nảy mầm

Đếm số hạt nảy mầm trên đĩa Petri, 2 ngày kiểm tra 1 lần

Theo dõi tổng thời gian hạt nảy mầm

3.2.3 Nội dung thí nghiệm

3.2.3.1 Công thức thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên 2 giống A1 và A2, mỗi giống được xử lý chiếu xạ theo

2 kiểu chiếu và 6 liều chiếu khác nhau

- Công thức kiểu chiếu xạ (B) gồm 2 dạng: B1 (hạt khô); B2 (hạt ướt)

- Công thức liều chiếu (C) gồm 6 mức: C0 = 0Gy (không chiếu xạ); C1=20Gy; C2=50Gy; C3=100Gy; C4=150Gy; C5=200Gy Với 1Gy = 100 Rad

Toàn bộ hạt giống được ghi nhãn cẩn thận và chiếu xạ bằng tia gamma nguồn Co60máy hiệu Icledovachel (Liên Xô cũ sản xuất), thể tích buồng chiếu mẫu 4lít, liều dịch chuyển 342 rad, xuất liều 17rad/giây vào ngày 26/8/2008 tại Viện Hạt Nhân Đà Lạt

Hình 3.3: Sơ đồ mã hoá nghiệm thức

Giống A1

Giống A2 Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong vườn ươm

NT2 NT5 NT6 NT2 NT8 NT1 NT12 NT9 NT4 NT11 NT12 NT7 NT4 NT5 NT8 NT3 NT5 NT11 NT9 NT1 NT3 NT10 NT11 NT3 NT7 NT10 NT9 NT6 NT7 NT12 NT2 NT6 NT10 NT8 NT1 NT4

NT13 NT23 NT16 NT20 NT18 NT15 NT19 NT21 NT22 NT21 NT14 NT24 NT15 NT14 NT20 NT17 NT24 NT17 NT20 NT22 NT19 NT13 NT23 NT22 NT18 NT17 NT15 NT23 NT16 NT19 NT14 NT21 NT13 NT18 NT24 NT16