NGHIÊN CỨU NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY DÂU TÂY TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ LẠT TỈNH LÂM ĐỒNG

Kết quả thu được: Phân lập được 13 mẫu Colletotrichum chia làm 3 nhóm Colletotrichum trắng xám, Colletotrichum trắng sáng và Colletotrichum nâu sậm dựa theo màu sắc tản nấm khi phát tr

NGHIÊN CỨU NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH

THÁN THƯ TRÊN CÂY DÂU TÂY TẠI THÀNH

PHỐ ĐÀ LẠT TỈNH LÂM ĐỒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 05/2008

NGHIÊN CỨU NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH

THÁN THƯ TRÊN CÂY DÂU TÂY TẠI THÀNH

NGHIÊN CỨU NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ

TRÊN CÂY DÂU TÂY TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ LẠT TỈNH LÂM ĐỒNG

TRƯƠNG CÔNG LỰC

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: TS TRẦN THỊ THU THỦY

Trường Đại học Cần Thơ

2 Thư ký: TS NGUYỄN THỊ THU NGA

Trường Đại học Cần Thơ

3 Phản biện 1: GS.TS NGUYỄN THƠ

Hội KHKT Bảo vệ thực vật Việt Nam

4 Phản biện 2: TS TỪ THỊ MỸ THUẬN

Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM

5 Ủy viên: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

Tình trạng gia đình: Vợ: Lê Thị An, kết hôn năm 2008

Địa chỉ liên lạc: 215 Lô H4 C/c Chu Văn An, P.26, Q Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh

Điện thoại di động: 0903 149 060

Điện thoại nhà riêng: 08 38994431

Email: truongcongluc@yahoo.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

Trương Công Lực

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ này, tôi xin được trân trọng ghi ơn và cảm tạ: Ban giám hiệu, Khoa Nông học, Phòng sau Đại học Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi tham gia khóa học

Các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã truyền đạt những kiến thức cũng như những kinh nghiệm quý báu cho tôi

Thầy TS Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Các kỹ sư phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Bảo vệ thực vật Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Bố mẹ, vợ, anh, chị, em, bạn bè đã động viên tôi trong suốt quá trình học tập

và hoàn thành luận văn này

Trương Công Lực

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây

dâu tây tại TP Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng” Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng

thí nghiệm bệnh cây thuộc Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học – Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng 05/2008 đến tháng 05/2009

Kết quả thu được:

Phân lập được 13 mẫu Colletotrichum chia làm 3 nhóm Colletotrichum trắng xám, Colletotrichum trắng sáng và Colletotrichum nâu sậm dựa theo màu sắc tản

nấm khi phát triển trên môi trường PGA Trong 13 mẫu có 12 mẫu đã định danh được đến loài đó là mẫu C2F608, C3F608, C1F708, C3F708, C2F708, C3F808, C1F808, C2F808, C3TP08, C2TP08, C1TP08 được phân lập tại Phường 6, 7, 8 và

Thái Phiên thuộc loài Colletotrichum acutatum, 1 mẫu C1F608 phân lập tại phường

6 thuộc loài Colletotrichum fragariae Mẫu C4F708 phân lập tại phường 7 chưa xác định được tên loài là Colletotrichum sp nov

Loài Colletotrichum acutatum là loài gây hại chính trên các vườn trồng dâu

tại TP Đà Lạt Bào tử có dạng hình trụ 1 đầu nhọn 1 đầu tròn, sợi nấm có màu màu trắng xám, mặt dưới thạch có màu cam hồng Giác bám màu nâu có dạng hình chùy,

hình tròn và hình trứng ngược Loài Colletotrichum fragariae có bào tử hình trụ, 1

đầu nhọn 1 đầu tròn, sợi nấm màu trắng sáng Giác bám màu nâu hình chùy, hình

trứng ngược, viền phẳng Loài Colletotrichum sp nov có bào tử đơn bào hình lưỡi

liềm nhọn 2 đầu, sợi nấm màu nâu nhạt, mặt dưới có màu nâu sậm, không hình thành giác bám

Thí nghiệm chủng ở các mức nồng độ khác nhau của 3 loài nấm lên cây dâu cho kết quả ở nồng độ chủng 105-107 bào tử/ml có tỷ lệ bệnh cao nhất Đối với loài

Colletotrichum acutatum khi chủng trên bộ phận hoa và trái cho mức độ bệnh cao hơn khi chủng trên lá Nấm Colletotrichum fargariae xâm nhiễm trên lá, hoa và trái non gây chết toàn bộ cuống hoa Đối với nhóm nấm nâu sậm (Colletotrichum sp

nov.) gây hại mạnh trên lá và cuống lá

SUMMARY

The thesis: “Research on Collectotrichum spp Fungi infecting

Anthrax disease to Strawberries grown in Dalat town area, Lam Dong Province” Experiments are carried out in plant diseases laboratories of Plant

protection Department – Faculty of agronomy of Nong Lam University from May 2008 to May 2009

Results obtained:

13 samples of Colletotrichum have been successfully classified which can

be separated into 3 groups: Greyish white Colletotrichum, Brilliant white

Colletotrichum and Dark Brown Colletotrichum if we base on color pigmentation

distribution on fungi when it develops in PGA environment Among the 13 Samples, 12 were already specifically named as species such as C2F608, C3F608, C1F708, C3F708, C2F708, C3F808, C1F808, C2F808, C3TP08, C2TP08, C1TP08

to be subdivided into sub-groups as 6, 7, 8 and intermediaries (Thái Phiên)

belonging to species Colletotrichum acutatum, 1 sample as C1F608 to be

subdivided into 7 th sub-group which has not been determined specifically and

named as belonging as specie of the 6th sub-group Colletotrichum fragariae

Sample C4F708 to be subdivided into sub-group 7th which has not specifically but

named as specie Colletotrichum sp nov

The Colletotrichum acutatum specie is the one which has mainly caused

great damages to strawberry farms in Da Lat City area Conidia has a cylindric shape with one sharp head and one round head, fugi filaments are of grayish white color on the upper side but on the down side it is getanous of pink orange color The

appressoria is of brown color in drum stick shape, with cylindric and upside down egg form The Colletotrichum fragariae specie has cylindric spore with one sharp

is of brown color in drum stick shape and upside down egg form, flat fringes,

(plane edges) The Colletotrichum sp nov has single spore of a crescent shape

with two sharp ends, fungi filaments are of light brown color, and downside is of dark brown, but the appressoria has not any form and defined shape

If experiments are carried out on innoculation at different concentration levels for 3 species into fungi infecting the strawberry plants and frpm results obtained with innoculation concentration 105-107 spore/ml, there is the highest

infection of disease As for Colletotrichum acutatum specie if innoculation is on

vegetative organs: on flowers and fruit results obtained are with the higher

infectiom degree than if innoculation is on leaves Colletotrichum fargariae fungi

which is affecting and infecting on leaves, flowers and immature fruit, causes total death to peduncles

As for fungi groups of dark brown color (Colletotrichum sp nov.), they

generate great damages on leaves and peduncles , but if they deeply infect into the stem of the plant

2.1 Sơ lược về nguồn gốc, đặc điểm sinh học và sinh thái cây dâu tây 3

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dâu tây trên thế giới và ở Việt Nam 7

2.2.1 Tình hình sản xuất dâu tây trên thế giới 7

2.4 Tổng quan về nấm Colletotrichum 15 2.5 Sự phân bố và tác hại của bệnh do nấm Colletotrichum gây ra 17

trên cây dâu tây

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

3.4.1 Phân lập, đặt tên mẫu và khảo sát một số đặc tính sinh học của các 22

mẫu nấm Colletotrichum spp trên cây dâu tây

3.4.1.1 Phân lập và đặt tên các mẫu nấm Colletotrichum spp đã phân lập được 22

3.4.1.2 Khảo sát sự phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum spp trên 23

các loại môi trường khác nhau

3.4.1.3 Khảo sát sự phát triển của các mẫu nấm colletotrichum spp ở 23 các mức nhiệt độ trên môi trường PGA

3.4.1.4 Khảo sát sự tác động của thuốc Benomyl đối với các mẫu nấm 24

Colletotrichum spp khi nuôi cấy trên môi trường PGA

3.4.1.5 Mô tả hình thái bào tử, giác bám và xác định tên loài 24

Colletotrichum đã phân lập được

3.4.2 Khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum spp 25 trên giống dâu Mỹ đá đang được trồng phổ biến tại TP Đà Lạt

4.1 Các mẫu nấm colletotrichum phân lập được trên cây dâu tây 27

4.2 Sự phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum spp trên môi trường 28 PGA, CO và giá đậu

4.3 Khảo sát sự phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum spp ở các 36 mức nhiệt độ khi nuôi cấy trên môi trường PGA

4.4 Khảo sát sự tác động của thuốc Benomyl đối với các mẫu nấm 44

Colletotrichum spp khi nuôi cấy trên môi trường PGA

4.5 Mô tả hình thái bào tử, giác bám và xác định tên loài 46

Colletotrichum đã phân lập được

4.6 Khảo sát khả năng gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum spp 53 trên giống dâu Mỹ đá đang được trồng phổ biến tại TP Đà Lạt

PGA Potato glucose agar

CACD County Agricultural Commissioners' Data

FAO Food and Agricultural Organization of the United Nations USDA United States Department of Agriculture

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Phần trăm về sản lượng dâu tây của 11 quốc dẫn đầu trên 8

thế giới và tổng sản lượng dâu tây trên thế giới năm 2005

Hình 2.2 Phần trăm xuất khẩu dâu tây trên thế giới và tổng sản lượng 9

dâu tây xuất khẩu năm 2004

Hình 2.3 Cấu trúc cụm cuống bào tử của một vài loại nấm 15

Hình 2.4 Vết bệnh của nấm Colletotrichum gây ra trên các bộ phận 18

của cây dâu tây

Hình 4.1 Màu sắc tản nấm Colletotrichum spp trên môi trường PGA 28

Hình 4.2 Biểu đồ tốc độ phát triển ở giai đoạn 6-8 ngày của 3 nhóm nấm 35

Colletotrichum trên môi trường PGA, CO và GA

Hình 4.3 Đường kính tản nấm Colletotrichum trên môi trường PGA, 36

CO, GA sau 10 ngày nuôi cấy

Hình 4.4 Đường kính tản nấm trung bình của các nhóm 37

Colletotrichum spp ở các mức nhiệt độ ở 10 ngày sau cấy

Hình 4.5 Sự phát triển của nấm Colletotrichum ở các mức nhiệt độ 43

sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA

Hình 4.6 Đường kính tản nấm của 3 nhóm Colletotrichum trên môi 45

trường PGA 10 ngày sau cấy ở nồng độ Benomyl 1000ppm

Hình 4.7 Đặc điểm hình thái học nhóm nấm Colletotrichum trắng hồng 47

Hình 4.8 Đặc điểm hình thái học nhóm nấm trắng sáng 47

Hình 4.9 Đặc điểm hình thái học nhóm nấm nâu sậm 48

Hình 4.10 Bào tử nấm colletotrichum nẩy mầm và hình thành giác bám 51

Hình 4.11 Triệu chứng bệnh do nấm Colletotrichum gây ra trên giống 56

dâu Mỹ đá

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 các giống dâu tây với số lượng nhiễm sắc thể khác nhau 6

Bảng 2.3 Sản lượng dâu tây đông lạnh trên thế giới 10

Bảng 2.4 Sản lượng dâu tây đông lạnh xuất khẩu trên thế giới 10

Bảng 2.5 Diện tích các quốc gia trồng dâu tây lớn trên thế giới 11

Bảng 2.6 Triệu chứng bệnh tương ứng với các loài nấm Colletotrichum 17

Bảng 3.1: Cách pha môi trường CO, PGA và giá đậu 21 Bảng 4.1 Sự phát triển của 13 mẫu nấm trên mội trường PGA 29

Bảng 4.2 Sự phát triển của 13 mẫu nấm trên mội trường CO 31

Bảng 4.3 Sự phát triển của 13 mẫu nấm trên mội trường giá đậu (GA) 33

Bảng 4.4 Mức phát triển của các loài Colletotrichum được phân lập trên 41

cây dâu tây tại Tp Đà Lạt ở các mức nhiệt độ

Bảng 4.5 Tốc độ phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum phân lập 42

trên cây dâu tây tại Tp Đà Lạt ở các mức nhiệt độ

Bảng 4.6 Sự phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum ở nồng độ 44

Benomyl 1000ppm khi nuôi cấy trên môi trường PGA

Bảng 4.7 Tỷ lệ % hình dạng bào tử của 13 mẫu nấm Colletotrichum 46

Bảng 4.8 Tỷ lệ bào tử nẩy mầm và hình thành giác bám của 3 loài nấm 50

phân lập được sau 4, 8 và 12 giờ ở nhiệt độ phòng 270C

Bảng 4.9 Mô tả hình thái học các mẫu nấm colletotrichum phân lập được 52

trên cây dâu tây tại TP Đà Lạt

Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh của giống dâu Mỹ đá khi chủng các loài nấm 53

Colletotrichum khác nhau

Chương 1

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Cây dâu tây (Fragaria vesca) thuộc họ Rosaceae có nguồn gốc từ châu Mỹ

Đây là một loại trái cây được sử dụng phổ biến trên thế giới và được nhiều người ưa thích Hiện nay dâu tây được trồng như một loại trái cây mang lại nguồn lợi cao cho nhiều quốc gia như Tây Ban Nha, Mỹ, Bỉ và Mexico Bên cạnh công dụng như một loại trái cây tươi ngành công nghiệp chế biến dâu tây cũng đã phát triển mạnh mẽ

đã tạo ra nhiều chủng loại sản phẩm khác nhau như bánh mứt, mỹ phẩm hay nước uống giải khát

Tại Việt Nam dâu tây được du nhập và trồng đầu tiên tại Đà Lạt vào đầu những năm 30 của thế kỷ XX sau khi người Pháp khám phá ra cao nguyên Lang Bian (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2002) Hiện nay dâu tây được trồng phổ biến tại thành phố Đà Lạt và một số tỉnh của Việt Nam như khu vực Đồng bằng Sông Hồng (xã Minh Tân, Phù Cừ, Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La) đang trồng thí điểm cây dâu tây và cho thấy hiệu quả cao do cây dâu đem lại Tuy còn là một loại cây khá mới nhưng dâu tây mang lại hiệu quả kinh tế cao, thị trường tiêu thụ ổn định nên đã được đưa vào cơ cấu cây trồng của nhiều địa phương

Dâu tây là một loài cây dễ trồng, dễ chăm sóc, tuy vốn đầu tư ban đầu cao hơn các giống rau màu khác nhưng mức doanh thu và lợi nhuận thực tế sẽ rất cao,

có thể lên tới hàng trăm triệu đồng/ha Nhu cầu đầu ra hiện nay của dâu tây rất lớn ngoài việc góp phần đa dạng hóa cây trồng của tỉnh, dâu tây còn gắn liền với công nghệ chế biến giải quyết công ăn việc làm cho một số bà con nhân dân trong tỉnh và tăng thu nhập cho người trồng dâu Trong vụ Đông Xuân của các tỉnh phía Bắc (đặc

Nam cũng chưa được nghiên cứu nhiều nên tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nấm

Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây dâu tây tại thành phố Đà Lạt

tỉnh Lâm Đồng” nhằm:

Mục tiêu

- Xác định tác nhân gây bệnh thán thư trên trái dâu tây ở mức độ loài

- Đánh giá tỷ lệ bệnh ở các mức nồng độ bào tử chủng khác nhau lên cây dâu tây

Yêu cầu

- Thu thập và phân lập mẫu bệnh nấm Colletotrichum spp trên cây dâu tây

tại TP Đà lạt tỉnh Lâm Đồng

- Định danh và khảo sát một số đặc tính sinh học của các loài

Colletotrichum gây bệnh thán thư trên dâu cây dâu tây

Đối tượng khảo sát

Nấm Colletotrichum spp và giống dâu Mỹ đá đang được trồng phổ biến tại

Tp Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về nguồn gốc, đặc điểm sinh học và sinh thái cây dâu tây

2.1.1 Nguồn gốc cây dâu tây

Dâu tây (Fragaria vesca) hay còn gọi là dâu đất là một chi cây thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) cho quả được nhiều người ưa chuộng Dâu tây xuất xứ từ châu Mỹ

và được các nhà làm vườn châu Âu cho lai tạo vào thế kỷ 18 để tạo nên giống dâu tây được trồng rộng rãi hiện nay

Lịch sử của cây dâu tây đã có từ hơn 2200 năm trước Dâu tây dại mọc ở Italy khoảng 234 năm trước công nguyên và được phát hiện ở Virginia năm 1588 bởi những người châu Âu đầu tiên khi họ neo đậu thuyền tại vùng đất này

Cho đến giữa thế kỉ XVI, các loại dâu trồng tại các nhà vườn Anh quốc đều xuất phát từ loài dâu dại của vùng Tây Âu Trong khi đó bên kia Đại Dương, thổ dân trên đất Bắc Mỹ cũng rất thích dâu hoang dại Người Cherokee xem quả dâu như tượng trưng cho quả tim người; người Dakota lấy Tháng Sáu làm tháng của Dâu Những người Pilgrims khi đặt chân đến đất Mỹ đã được thổ dân chỉ cách làm bánh bằng bột bắp và dâu tây

Dâu tây có lẽ là cây thông dụng nhất trong nhóm các cây berries Chỉ riêng tại Hoa Kỳ đã có đến khoảng 75 loài dâu tây hoang, tất cả đều cho quả ăn được Quả được bán trên thị trường hiện nay là kết quả của lai tạo vào năm 1835 giữa một giống dâu tây hoang cho quả nhỏ, gốc từ Âu Châu và Bắc Mỹ, cùng với một giống dâu cho quả to ở Chile Một gián điệp người Pháp khi đi hoạt động tại Chile đã lén đưa cây dâu cho quả lớn của Chile về Pháp, và tại nhà vườn Vua Louis XV ở

Versailles, cây được cho lai giống với loại dâu F virginiana Sự lai giống này tạo ra

một giống dâu cho quả to và vị ngon đặc biệt mà các giống dâu cũ không sánh bằng

Loại dâu vùng Alps của Âu châu: F vesca, một dạng dâu thân gỗ, là loại dâu

hoang từ thời cổ xưa Dâu được khám phá cách nay khoảng 300 năm tại vùng phía Đông Grenoble, vùng chân núi Alps Do ở đó quả to và cây cho nhiều quả, giống dâu này đã trở thành thông dụng

Loại dâu "hương" F moschata, mùi thơm nhất, chỉ mọc tại các khu vực rừng

mát ở Trung Âu, phía Bắc tới Thụy điển và phía Đông đến Nga

Ngày nay, dâu tây được trồng hầu như tại mọi nơi trên thế giới: suốt vùng Bắc Mỹ từ Alaska sang đến Florida, tại Trung và Nam Mỹ, Âu Châu, Đông và Nam Phi Châu, Úc, Tân tây Lan, Nhật

Theo thống kê của CACD năm 2002, hơn 28.000 ha dâu tây đã được trồng hằng năm ở California và bang này sản xuất ra hơn 20% sản lượng dâu của thế giới Trung bình, mỗi một ha dâu tây sản xuất ra được khoảng 27 tấn và bang này trung bình sản xuất ra khoảng 767.500 tấn dâu một năm

Các dạng dâu tây hiện đại của chi Fragaria, có nguồn gốc từ châu Mỹ, và là

loại cây lai ghép giữa các dạng của Bắc và Nam Mỹ Các nhà làm vườn châu Âu chỉ đem về các cây cái từ Nam Mỹ, và họ buộc phải tạp giao chúng với các dạng Bắc

Mỹ nhằm mục đích cho cây lai ra quả và hạt

Fragaria có nghĩa là "thơm", nghĩa là có mùi thơm, để chỉ phần cùi thịt có

hương thơm của quả

Ðà Lạt nằm ở độ cao 1.500m so với mặt nước biển, trong vùng nhiệt đới nhưng mang tính chất của vùng bán ôn đới Vào đầu những năm 30 của thế kỷ XX, sau khi khám phá ra cao nguyên Lang Bian theo chân người Pháp, dâu tây được đưa vào trồng thử nghiệm tại Ðà Lạt (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2002)

Cây dâu tây đang trồng có tên khoa học là Fragaria vesca L., kết quả của sự lai ghép giống F chiloensis Duch và F cirginiana Duch Người Anh gọi là

"Strawberry", người Pháp gọi là "Fraisier", khi đem qua Việt Nam vì có nguồn gốc

từ Pháp nên được gọi là "dâu tây"

Dâu tây do người Pháp mang sang đầu tiên trái nhỏ, màu sắc nhạt nhưng có mùi đặc trưng Ðến năm 1963, một số giống mới được du nhập từ Mỹ sang, trái có màu

đậm cho năng suất cao, mùi vị không thơm bằng giống dâu Pháp, để đáp ứng khẩu vị

và nhu cầu của thị trường, trong quá trình mở rộng diện tích hai giống dâu này phát triển song song với nhau Sau đó 30 năm, vào tháng 3.1994, Phân viện sinh học Ðà Lạt nhân giống thành công giống HO của Nhật và tiếp sau đó các công ty nghiên cứu giống tại Lâm Ðồng đã cho du nhập vào nhiều giống như Xuân Hương, Mỹ đá Càng về sau, chất lượng và sản lượng dâu càng được nâng cao, đặc biệt các giống này có thể vận chuyển đi xa nhờ thịt quả cứng và chắc (Vũ Thị Hiền, 2005)

2.1.2 Đặc điểm thực vật học cây dâu tây

Quả dâu tây là một loại quả giả; nghĩa là phần cùi thịt không phải bắt nguồn

từ các bầu nhụy (là các "hạt" thông thường nhìn thấy trên bề mặt trái, thực tế đây là một dạng quả bế) Từ quan điểm của thực vật học, các hạt là quả thật sự của thực vật, và phần cùi thịt mọng nước của dâu tây là các mô đế hoa bị biến đổi Phần này

có màu xanh lục ánh trắng khi còn non và trở thành màu đỏ (ở phần lớn các loài) khi chín

2.1.3 Phân loại thực vật học

Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

Ngành (division): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Họ (familia): Rosaceae

Phân họ (subfamilia): Rosoideae

Loài (species) Fragaria vesca

Có trên 20 loài dâu tây khác nhau trên khắp thế giới Khóa để phân loại các loài dâu tây dựa trên số lượng nhiễm sắc thể của chúng Có 7 kiểu nhiễm sắc thể cơ bản mà tất cả đều có nòi chung Tuy nhiên, mức độ thể hiện tính đa bội khác nhau Một số loài là lưỡng bội, có 2 tập hợp chứa 7 nhiễm sắc thể (2n=14) Các loài khác

là tứ bội (4 tập hợp, 4n=28), lục bội (6 tập hợp, 6n=42), bát bội (8 tập hợp, 8n=56) hay thập bội (10 tập hợp, 10n=70)

Theo quy tắc đơn giản (với một số ngoại lệ), loài dâu tây với nhiều nhiễm sắc thể hơn sẽ có xu hướng tạo ra cây to hơn, mạnh khỏe hơn với quả mọng to hơn (Darrow, 1966)

Bảng 2.1: Các giống dâu tây với số lượng nhiễm sắc thể khác nhau (Lê Huy Kiên, 2007)

Số lượng nhiễm sắc thể Tên khoa học

Lưỡng bội

Fragaria daltoniana Fragaria inumae Fragaria nilgerrensis Fragaria nipponica Fragaria nubicola Fragaria vesca (Dâu tây dại) Fragaria viridis

Fragaria yezoensis

Tứ bội

Fragaria moupinensis Fragaria orientalis

Lục bội Fragaria moschata (Dâu tây xạ)

Bát bội và lai ghép

Fragaria x ananassa (Dâu tây vườn)

Fragaria chiloensis (Dâu tây Chile) Fragaria iturupensis (Dâu tây Iturup) Fragaria virginiana (Dâu tây Virginia)

Thập bội và lai ghép Lai ghép Fragaria × Potentilla

Fragaria × vescana

100C Giai đoạn quả chín cần nhiệt độ giao động trong khoảng 15-200C

Cây dâu đòi hỏi ánh sáng dồi dào để sinh trưởng phát triển tốt, thiếu ánh sáng thường ảnh hưởng đến khả năng ra hoa và kết quả Ẩm độ không khí cao và mưa kéo dài là điều kiện thích hợp để nấm bệnh xâm nhiễm và gây hại (Lê Huy Kiên, 2007)

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dâu tây trên thế giới và ở Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất dâu tây trên thế giới

Dâu tây là một loại cây kinh tế quan trọng và sản lượng dâu tây trên thế giới tăng liên tục hằng năm Mỹ là quốc gia có sản lượng dâu tây nhiều nhất trên thế giới (29,1% năm 2005) tăng 22.1% so với năm 2000 tuy nhiên sản lượng phần lớn được

sử dụng cho tiêu thụ nội địa

Bảng 2.2: Sản lượng dâu tây trên thế giới (Tấn)

Quốc gia 2000 2005 % thay đổi % trên thế giới

Nguồn: FAS, USDA 2005

Hình 2.1: Phần trăm về sản lượng dâu tây của 11 quốc dẫn đầu trên thế giới

và tổng sản lượng dâu tây trên thế giới năm 2005 là 3,616 triệu tấn (FAO, 2005)

Nhật Bản 5,5%

Ba Lan 5,0%

Thổ Nhỉ Kỳ 4,4%

Trong năm 2004 Tây Ban Nha là quốc gia xuất khẩu dâu tây lớn nhất trên thế giới (45%) so với Mỹ đứng thứ 2 chiếm khoảng 17% Bỉ, Mexico, Pháp, Ai Len, Ba Lan và Ý theo sau trong nhóm các quốc gia xuất khẩu dâu tây lớn nhất trên thế giới

Hình 2.2: Phần trăm xuất khẩu dâu tây trên thế giới và tổng sản lượng dâu

tây xuất khẩu năm 2004 là 535 ngàn tấn (FAO, 2004)

Ba Lan là quốc gia xuất khẩu dẫn đầu về sản lượng dâu tây đông lạnh với khoảng 60-70% sản lượng được sử dụng làm dâu đông lạnh Tuy nhiên, năm 2003 xuất khẩu của Trung Quốc về sản lượng dâu đông lạnh tăng một cách đột ngột, đạt gần bằng sản lượng xuất khẩu của Ba Lan (FAS 2004)

Sản lượng dâu đông lạnh tại Mỹ chiếm tỷ lệ cao nhất trên thê giới nhưng phần lớn chỉ dùng cho tiêu thụ nội địa Sản lượng dâu tây đông lạnh xuất khẩu của

Mỹ trong giai đoạn 2005 - 2006 chỉ chiếm khoảng 10.530 tấn so với lượng dâu đông lạnh của nước này là 240.000 tấn

Tây Ban Nha 45%

Bảng 2.3: Sản lượng dâu tây đông lạnh trên thế giới (tấn)

Quốc gia 2002 2003 2004 2005 2006 % thay đổi từ

2002 - 2006

Mỹ 216.908 229.209 230.950 232.048 240.000 + 10,6 Trung Quốc 67.500 72.000 90.720 82.500 + 22,2

Ba Lan 125.800 90.000 130.500 80.000 75.000 - 40,1

Mexico 51.000 53.200 50.320 52.000 52.200 + 2,4 Tây Ban Nha 35.250 30.400 25.036 38.000 40.000 + 13,5

Nguồn: FAS, USDA 2006

Bảng 2.4: Sản lượng dâu tây đông lạnh xuất khẩu trên thế giới (tấn)

Quốc gia 2002 2003 2004 2005 2006 % thay đổi từ

Nguồn: FAS, USDA 206

Dâu tây ở Mỹ chủ yếu được các nhà xuất khẩu ở Bắc Mỹ bán cho thị trường

Canada và và các nhà nhập khẩu của Mỹ nhập dâu tây từ Mexico Nước Mỹ là một nhà

xuất khẩu dâu tây tươi và đông lạnh lớn trên thế giới Tổng giá trị xuất khẩu dâu tây

của Mỹ tăng từ 90 triệu đô năm 1990 đến 218,7 triệu đô năm 2004 Thị trường xuất

khẩu chính năm 2004 của Mỹ là Canada, Nhật Bản và Mexico Xuất khẩu dâu tây tươi

chiếm khoảng 88% trong tổng số lượng dâu tây xuất khẩu, còn 12% còn lại lại là xuất

khẩu dâu tây đông lạnh

Lượng xuất khẩu dâu tây tăng vào thế kỷ 21, hầu hết đều do sự gia tăng xuất

khẩu sang thị trường Canada Năm 1996 Cananda chiếm khoảng 47% trong tổng số

xuất khẩu của Mỹ thì Nhật Bản chiếm 38% và Mexico 3% Năm 2004, Canada

chiếm 71% trong tổng số dâu tây xuất khẩu từ Mỹ, Nhật Bản chiếm 18% và Mexico

chiếm 5%

Bảng 2.5: Diện tích các quốc gia trồng dâu tây lớn trên thế giới (Ha)

Quốc gia 2000 2005 % thay đổi % trên thế giới

2.2.2 Tình hình sản xuất dâu tây ở Việt Nam

Thời vụ trồng dâu tại Lâm Ðồng trước đây vào khoảng tháng 8, 9 Nếu trồng đúng kỹ thuật, chăm sóc tốt, đặc biệt là ứng dụng công nghệ sinh học trong canh tác, áp dụng kỹ thuật che phủ nilon mặt luống và làm vòm che nilon trong những ngày có nhiệt độ thấp để chống rét cho dâu tây, thì chỉ sau 2 tháng cây đã bắt đầu cho thu hoạch lứa quả đầu tiên Thời gian thu hoạch có thể kéo dài khoảng 4 tháng,

từ tháng 12 năm trước đến tháng 3 năm sau, cho năng suất trung bình 20-25 tấn/ha, nếu chăm sóc tốt có thể cho thu hoạch 30 tấn/ha

Vì sản lượng dâu của nước ta chưa nhiều, chưa phổ biến nên đa số quả dùng ở dạng tươi, làm rượu vang dâu, các loại kem cao cấp, sữa tươi dâu tiệt trùng, tạo hương cho một số loại bánh mứt Trong tương lai khi công nghệ đóng khô dâu tây được áp dụng, ngành dâu tây có thể phát triển đạt những thành tựu đáng kể Quả dâu tây đóng khô là sản phẩm mới rất tiện lợi cho người tiêu dùng vì giá trị sử dụng của nó đa dạng, hạn chế mức thấp nhất tỷ lệ hư hỏng và tiện lợi trong việc vận chuyển đến nơi tiêu thụ

Theo địa chí Đà Lạt năm 2008 cho thấy dâu tây vườn (Fragaria ananassa)

thích nghi nhiều loại sinh thái khác nhau như ôn đới, Ðịa Trung Hải, cận nhiệt đới và

á ôn đới Tại Lâm Ðồng, dâu tây có thể canh tác từ độ cao 600m đến 1.500m so với mặt nước biển

Các giống trồng trước 1975 tại TP Đà Lạt có nguồn gốc từ Pháp gồm: Fraisiers de quatre saisons, Vicomtesse Héricart de Thurty

Madame Moutot: Quả rất lớn, màu đỏ tươi, thịt quả đỏ hồng, ít chua, vị ngọt, mùi thơm, năng suất khá cao

Docteur Morère: Cây tốt, sinh trưởng và phát triển khá mạnh, quả lớn, tròn, màu đỏ đẹp, có kẻ giữa quả, thịt quả cứng và ngọt, có thể vận chuyển đi xa được

Ngoài ra còn có các giống nhập từ Mỹ như Cambridge Latepine, Cambridge Favorite, Wiltgourd, Lolano, Shasta, Rival, Vigora, Fresno, Tahara và Lassen

Các giống trồng sau 1975 được du nhập từ nhiều nguồn khác nhau như Đài Loan, Mỹ, Pháp Các giống mới có chất lượng cao, trái to, màu sắc đẹp, thơm: Selva, Caliso, Sequoita, Fan, Allstars, Ozare, Quinault

Năm 1996, Công ty PAC Việt Nam đã liên doanh với Pháp, đưa vào thử nghiệm nhiều giống dâu tây mới như Angelique, Belrubi, Gorella, Selva, Tarma, Aliso

Trong những năm 2000 - 2001, các hộ chuyên canh dâu tây tại Đà Lạt vẫn trồng các loại dâu có xuất xứ không rõ ràng về nguồn gốc, được gọi chung

là “Dâu Pháp” hay “Dâu Xuân Hương” Các giống này được nhân giống bằng thân bò Năm 2001, Trung tâm Nghiên cứu cây thực phẩm Đà Lạt đã nghiên cứu lai tạo chọn lọc và nhân giống 30 dòng dâu tây mới trên cơ sở các giống dâu tây đã trồng tại Đà Lạt

Diện tích sản xuất dâu tây tại Đà Lạt năm 2005 đạt 110ha, với sản lượng thu hoạch trên 1.300 tấn Trong tương lai, tỉnh Lâm Ðồng đang phấn đấu mở rộng diện tích canh tác nhằm nâng cao sản lượng dâu tây cho người tiêu dùng quả tươi và phục vụ cho công nghệ đóng khô cung cấp cho các công ty chế biến sữa như Vinamilk, Foremost, công ty rượu, nhà máy sản xuất bánh kẹo hay có thể xuất khẩu Tiềm năng phát triển cây dâu tại Lâm Ðồng còn rất lớn, ngoài việc góp phần

đa dạng hóa cây trồng của tỉnh, dâu tây còn gắn liền với công nghệ chế biến giải quyết công ăn việc làm cho một số bà con nhân dân trong tỉnh và tăng thu nhập cho người trồng dâu (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2002)

2.3 Tình hình sâu bệnh hại trên cây dâu tây

2.3.1 Bệnh hại

a Bệnh đốm lá: Thường do 2 loại nấm bệnh gây ra

• Bệnh đốm lá trắng (Mycosphaerella fragariae): Đốm bệnh màu trắng ở phần

trung tâm và viền đậm bao quanh Bệnh gây tổn thương ở thân, lá, cuống hoa, cuống quả gây chết hoa và trái non, bệnh làm giảm năng suất và sức sống của cây

• Bệnh đốm lá đỏ (Phomopsis obsscuans): Đốm bệnh có hình quả trứng hay hình

tam giác có màu nâu sáng chuyển sang màu đỏ ở các mô bào giữa các gân lá

Bệnh thối trái do nấm Botrytis Cinerea: Biểu hiện đầu tiên là những đốm nâu

sáng sau đó lan rộng cả trái có phủ một lớp mốc xám, sau đó trái khô dần Bệnh này xâm nhiễm từ giai đoạn quả xanh đến chín

Bệnh thối trái do nấm Rhizoctonia: Vết bệnh ban đầu có màu nâu đậm, sau

đó chuyển sang thối đen trái Bệnh lây nhiễm khi trái chín tiếp xúc với đất trồng Bệnh này xuất hiện chủ yếu ở giai đoạn quả chín

e Bệnh virus trên cây dâu tây

Cả cây đều có thể phát sinh bệnh virus, thường biểu hiện hoa lá, mép vàng, lá nhăn, đốm loang lổ Cây bị bệnh thấp lùn, mọc không tốt, kết trái ít, phẩm chất kém

c Sâu ăn tạp, sâu cuốn lá

Sâu ăn tạp ký sinh trong phần gốc phá hoại chủ yếu vào ban đêm, ăn lá và phần thân non của cây

Sâu cuốn lá làm tổ ngay cuống lá làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây

(Lê Huy Kiên, 2007)

2.4 Tổng quan về nấm Colletotrichum

Colletotrichum được mô tả gồm có 11 loài (Von Arx,1957; Sutton, 1973)

Alexopoulos và Mims (1979) thì đề xuất trên 1000 loài hình thức trong giống này

đã được mô tả trước đây và phần lớn đều trùng tên Theo ý kiến gần nhất của Baxter

và cộng sự (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 21 loài trong đó C coccodes,

C dematium, C gloeosporioides, C graminicola, C falcatum và C capsici là

những loài thường gây bệnh thán thư (anthracnose) (Theo tài liệu tổng hợp của Sharma, 1989)

Nấm Colletotrichum có sợi nấm nội sinh, mảnh, phân nhánh, không màu, có

vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào; Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi

tế bào của hệ sợi nấm; Khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng

Hình 2.3: Cấu trúc cụm cuống bào tử của một vài loại nấm Colletotrichum gây hại cây

trồng A: Cụm bào tử của Colletotrichum lindemuthianum; B, cụm bào tử của C faltacum; C, cuống bào tử và bào tử đính của C graminicola; D, bào tử nảy mầm

Colletotrichum sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển trên

cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử: Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu

trúc như tơ cứng và Frost (1964) mô tả một vài loài của Colletotrichum có hoặc không có

lông cứng có thể được kiểm soát bởi sự thay đổi độ ẩm

Sự hình thành một số lớn của bào tử gây nứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử mọc từ một đến nhiều ống mầm để hình thành hệ sợi nấm; Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử (Chlamydospores), có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm

để tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới

Theo von Arx (1957) ‘Sclerotia’ cũng là một dạng đặc biệt của

Colletotrichum, Glomerella tucumanensis là một nấm túi (Ascomyceteous) được coi như giai đoạn hoàn chỉnh của Colletotrichum falcatum

Loài Colletotrichum acutatum có bào tử trong suốt nhọn 2 đầu, đơn bào, kích

thước 8,5 – 16,5 x 2,5 – 4 µm Giác bám màu nâu, dạng hình trứng ngược đến hình chùy, thường nhẵn ở cạnh và có kích thước 8,5 – 10 x 4,5 – 6 µm Loài

Colletotrichum gloeosporioides có bào tử đơn bào trong suốt 1 đầu tròn 1 đầu nhọn

hoặc 2 đầu tròn, kích thước 9 – 24 x 3 – 4,5 µm Giác bám màu nâu, hình chùy đến hình dạng không đều, không có hình dạng xác định, kích thước 6 – 20 x 4 – 12 µm

(Yoshida, 2002) Tản nấm Colletotrichum acutatum có màu hồng da cam và đặc trưng bào tử hình thoi Tản nấm Colletotrichum gloeosporioides màu xám có

bào tử hình trụ dạng 2 đầu tròn (Jayasinghe và ctv, 1997)

2.5 Sự phân bố và tác hại của bệnh do nấm Colletotrichum gây ra trên cây dâu tây

Theo tài liệu hướng dẫn về sâu bệnh và các vấn đề dinh dưỡng thường gặp

trên dâu tây tại Đà Lạt (TS Westergard và ctv, 2005) bệnh Colletotrichum trên dâu

tây được nghi nhận là bệnh đốm đen, triệu chứng bệnh khi trái chín thường xuất hiện những đốm tròn có màu nâu Những đốm tròn sậm màu và sau đó biến thành màu đen hoàn toàn Nếu trái bị nhiễm bệnh trước khi chín thì toàn bộ trái sẽ bị đen

và héo Trong quá trình vận chuyển, tích trữ, nguồn bệnh vẫn tiếp tục lây lan làm

cho trái bị hư hỏng nặng hơn Bệnh được nghiên cứu là do nấm Colletotrichum acutatum gây ra Bệnh có thể lây lan do sự bắn tóe nước khi tưới hoặc do trời mưa

nặng hạt hoặc do quá trình chăm sóc, cắt tỉa và thu hái Cây bóm quá nhiều đạm cũng rất dễ nhiễm bệnh

Trên thế giới, bệnh thán thư do nấm colletotrichum gây ra trên cây dây tây là

một bệnh khá phổ biến Loại nấm này gây bệnh ở nhiều bộ phận khác nhau của cây như trên trái, chồi non, hoa, cuống lá, ngó, thân chính và lá

Bảng 2.6: Triệu chứng bệnh tương ứng với các loài nấm Colletotrichum khác nhau

đó vết bệnh lớn dần có màu sậm hơn, khô, trũng xuống và thường bao lấy thân hay cuống lá Khi cuống lá hay ngó bị vết bệnh bao bọc xung quanh thì lá hay cây con sinh ra từ ngó sẽ bị héo và chết

Thán thư trên lá thường gây ra bởi C fragariae hay C gloeosporioides Vết hoại

trên lá thường nhỏ (ít hơn 0,6mm), tròn và có màu đen (đôi khi màu nâu sáng) và thường

ra chết lá và thường xuất hiện đầu tiên ở những lá lớn của cây sinh ra từ ngó Thông

thường đốm lá do nấm Colletotrichum acutatum gây ra thường có màu nâu sậm đến đen

xuất hiện ở bìa lá hay đầu lá và phát triển dọc theo rìa lá Những vết bệnh này không tiếp tục phát triển toàn bộ lá và những lá bệnh vẫn có thể tồn tại trên cây từ 2-3 tháng

Hoa sẽ tàn lụi ngay sau khi bị nấm xâm nhiễm Toàn bộ các bộ phận của hoa như chồi hoa, lá đài, cuống hoa đang nở sẽ bị nhiễm bệnh Hoa bị nhiễm sẽ nhanh chóng bị khô; vết bệnh sẫm màu sẽ lan dần xuống dưới cuống hoa

Trên trái: triệu chứng xuất hiện ban đầu có màu trắng nhạt sau đó thối nhũng Khi bệnh phát triển nặng (sau 2 tới 3 ngày) sẽ chuyển sang màu nâu sậm và trũng xuống Vài ngày sau đó vết bệnh sẽ được bao phủ với những khối bào tử có màu hồng đến cam Trái bị nhiễm bệnh sẽ khô cứng lại, màu đen Trên trái bệnh có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn Cả giai đoạn trái non hay chín đều có thể nhiễm bệnh Hạt bị nhiễm bệnh sẽ có màu đen và khô dần

Trên thân: nấm di chuyển vào trong thân cây từ bệnh ở cuống lá, thân bò hay có thể

do bào tử nấm nẩy mầm và xâm nhập trực tiếp vào thân do mưa hay việc tưới từ ngọn Khi

mô thân bị nhiễm cây chỉ phát triển được trong 1 thời gian ngắn sau đó héo và chết Phần

mô thân bị nhiễm bệnh thường khô và có màu nâu đỏ Mô bệnh thường không đồng nhất

về màu sắc hay có những vệt màu nâu, và thường tạo ra khối bào tử có màu nâu đỏ (Turechek và ctv, 2003)

Hình 2.4 Vết bệnh của nấm Colletotrichum gây ra trên các bộ phận của cây dâu tây

A: Vết bệnh trên cuống lá và thân bò; B: vết bệnh trên lá; C: vết bệnh trên hoa; D: vết bệnh trên trái ở các giai đoạn; E: vết bệnh trên thân

B

A

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 02 năm 2008 đến tháng 06 năm 2009

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phân lập và định danh nấm được tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

Thí nghiệm chủng bệnh được thực hiện tại Đà Lạt

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Phân lập và khảo sát một số đặc tính sinh học của các mẫu nấm Colletotrichum

spp trên cây dâu tây

- Phân lập và đặt tên các mẫu nấm Colletotrichum đã phân lập được

- Khảo sát sự phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum spp trên môi

trường PGA, CO và giá đậu

- Khảo sát sự phát triển của các mẫu Colletotrichum spp ở các mức nhiệt

độ 150C, 200C, 250C, 300C, 350C khi nuôi cấy trên môi trường PGA

- Khảo sát sự tác động của thuốc Benomyl đối với các mẫu nấm

Colletotrichum spp khi nuôi cấy trên môi trường PGA

- Mô tả hình thái bào tử, giác bám và định danh đến loài các mẫu nấm

Colletotrichum spp thu thập được

3.2.2 Khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum spp trên giống dâu Mỹ đá (Fragaria ananassa) đang được trồng phổ biến tại thành

phố Đà Lạt

- Xác định nồng độ bào tử chủng và thời gian xuất hiện triệu chứng bệnh

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Nguồn mẫu để phân lập và nghiên cứu

Mẫu dâu tây bệnh được thu thập ở các điểm lấy mẫu tại các phường trồng dâu chính thuộc thành phố Đà Lạt như Phường 6, phường 7, phường 8, phường Thái Phiên

Những mẫu trái bệnh thu thập được để riêng từng trái trong hộp giấy, bảo quản trong bọc thoáng khí và vận chuyển các mẫu đến phòng thí nghiệm trong thời gian ngắn nhất Mẫu thu thập được ghi rõ họ tên địa điểm lấy mẫu, ngày lấy mẫu, giống dâu đang canh tác

Đối với các mẫu quả mọng nước, thịt quả nhiều chọn những mẫu mới xuất hiện triệu chứng hay triệu chứng đang ở giai đoạn giữa của sự phát triển Các vi sinh vật gây thối thứ yếu và hoại sinh thường xâm nhập quả ở giai đoạn cuối của sự phát triển bệnh, gây cản trở cho việc giám định vi sinh vật gây bệnh

Giống dâu Mỹ đá sạch bệnh dùng để thực hiện thí nghiệm chủng bệnh được trồng từ các cây nuôi cấy mô mua tại viện sinh học TP Đà Lạt

3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm

Các trang thiết bị gồm: nồi hấp khử trùng, cân, tủ sấy, tủ định ôn, buồng cấy,… đảm bảo được những yêu cầu kỹ thuật, tạo điều kiện thuận lợi và độ chính xác cao cho công tác nghiên cứu

Một số dụng cụ thí nghiệm trong phòng gồm: bình tam giác, ống đong, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, dao mổ, kính lúp, kính hiển vi quang học

Các dụng cụ khác như túi polyetylen, xô, chậu, dao, kéo, bình phun nước…

3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm

Có nhiều môi trường khác nhau dùng để phân lập, nuôi trồng nấm gồm các môi trường sau:

Bảng 3.1: Thành phần của môi trường CO, PGA và giá đậu

Môi trường CO Môi trường PGA Môi trường giá đậu

Thành phần Liều

lượng Thành phần

Liều lượng Thành phần

Liều lượng

KH2PO4 0,5g Agar 16g Nước cất cho tới 1000 ml MgSO4 0,5g Nước cất cho tới 1000 ml

Agar 16g

Nước cất cho tới 1000 ml

* Cách chuẩn bị môi trường

Môi trường PGA: Khoai tây được rửa sạch, gọt vỏ và cắt thành từng lát mỏng,

cho khoai tây vào 1000 ml nước cất đun sôi trong khoảng thời gian 30 phút sau đó

nước được lọc qua vải màn xô, thêm agar đã được hòa tan trong nước cất cho đủ

1000 ml và đun sôi sau đó đổ ra bình tam giác hay ống nghiệm Môi trường sau đó

được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút Sau khi hấp xong môi trường

lắc đều và đổ môi trường ra đĩa petri (10ml/đĩa) Đối với ống nghiệm thì lắc nhẹ sau

đó để nghiêng tạo môi trường thạch nghiêng Đĩa petri và ống nghiệm này sẽ được

cất giữ để chuẩn bị cho việc định danh nấm

Môi trường CO: Cho đủ liều lượng các hóa chất vào cốc nước cất khuấy đều

cho hỗn hợp hòa tan, thêm nước cất vào đủ 1000 ml, sau đó hấp khử trùng ở 1210C

trong 20 phút

Môi trường giá đậu: giá đậu đun sôi với nước cất khoảng 20 phút, lọc lấy nước, cho agar vào khuấy đều, thêm nước cất vào đủ 1000 ml, sau đó hấp khử trùng

ở 1210C trong 20 phút

Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, giấy thấm được sấy khử trùng ở nhiệt độ

108oC trong 20 phút Vùng không gian làm việc được khử trùng bằng cồn 960C, tay được khử trùng bằng cồn 700C

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phân lập, đặt tên mẫu và khảo sát một số đặc tính sinh học của các loài nấm

Colletotrichum spp trên cây dâu tây

3.4.1.1 Phân lập và đặt tên các loài nấm Colletotrichum spp đã phân lập được

Phương pháp phân lập: mẫu trái non, cuống lá, thân được khử trùng bằng dung dịch cồn 70% trong 30 giây sau đó rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 3-4 lần Mẫu bệnh được cắt nhỏ trong tủ cấy để trên giấy thấm vô trùng cho khô mẫu Đối với mẫu bệnh trên trái chín có thể dùng phương pháp trích khối nấm trực tiếp từ ổ bệnh Sau đó, mẫu sẽ được cấy riêng vào các đĩa petri chứa sẵng môi trường agar nước (WA) Mẫu cấy phát triển sau 1-2 ngày sẽ được phân loại và cấy riêng sang các đĩa môi trường PGA

Dựa vào kết quả phân lập nấm Colletotrichum từ các mẫu bệnh và vùng địa

lý ta tiến hành đặt tên cho các mẫu nấm:

C1F608: C: Nấm Colletotrichum phân lập được

1 (2,3,4): Cuống hoa - vị trí phân lập được trên cây

F6 (F7, F8, TP): Phường 6 TP Đà Lạt - địa điểm lấy mẫu

08: Năm 2008

Nghĩa là nấm Colletotrichum được phân lập từ cuống hoa tại Phường 6 TP

Đà Lạt năm 2008

C3TP08: C: Nấm Colletotrichum phân lập được

3: Vị trí phân lập được trên trái

TP: Địa điểm lấy mẫu tại Thái Phiên TP Đà Lạt

08: Năm 2008

Nghĩa là nấm Colletotrichum được phân lập từ trái tại Thái Phiên TP Đà

Lạt năm 2008

3.4.1.2 Khảo sát sự phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum spp trên

các loại môi trường khác nhau

Phương pháp tiến hành: Các môi trường nuôi cấy sau khi được hấp khử trùng, đổ

ra đĩa petri 20ml/đĩa Cấy 1 khoanh nấm có đường kính 4 mm cùng độ tuổi (lấy từ mép tản nấm 4 – 6 ngày tuổi) vào trung tâm của đĩa petri ở vị trí úp ngược cho nấm tiếp xúc với môi trường Các đĩa petri được đặt ở nhiệt độ phòng Thí nghiệm gồm 13 mẫu, mỗi mẫu được cấy trên 3 đĩa petri có đường kính 90mm

Đo đường kính tản nấm: 48 giờ đo một lần cho đến khi tản nấm mọc chạm thành đĩa và đường kính được tính theo công thức: d = (d1+d2)/2 Trong đó d1 và d2

là độ dài 2 đường chéo phần tản nấm phân bố

Mô tả hình thái, màu sắc và sự phân bố tản nấm trên các môi trường nuôi cấy 2 ngày/ lần

3.4.1.3 Khảo sát sự phát triển của các mẫu nấm Colletotrichum spp ở các mức

nhiệt độ trên môi trường PGA

Phương pháp tiến hành: cấy 1 khoanh nấm có đường kính 4 mm cùng độ tuổi (lấy từ mép tản nấm 4 – 6 ngày tuổi) vào trung tâm của đĩa petri ở vị trí úp ngược cho nấm tiếp xúc với môi trường Các đĩa thí nghiệm được dặt trong tủ định ôn Memmerl ở các mức nhiệt độ 100C, 150C, 200C, 250C, 300C, 350C Thí nghiệm gồm

13 mẫu, mỗi mẫu được cấy trên 3 đĩa petri có đường kính 90mm

Đo đường kính tản nấm: 48 giờ đo một lần cho đến khi tản nấm mọc chạm thành đĩa Mô tả hình thái, màu sắc và sự phân bố tản nấm trên các mức nhiệt

độ 2 ngày 1 lần

3.4.1.4 Khảo sát sự tác động của thuốc Benomyl đối với các mẫu nấm

Colletotrichum spp khi nuôi cấy trên môi trường PGA

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Mỗi lần lặp lại tương ứng với một đĩa petri có đường kính 90mm

Sử dụng môi trường PGA làm thí nghiệm Nồng độ Benomyl sử dụng

1000 µg/ml (Benomyl hoạt tính 50% WP của cty Forward International Ltd ) Phương pháp tiến hành: môi trường PGA được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút Sau đó để môi trường giảm bớt nhiệt độ cho thuốc vào lắc thật đều rồi đổ ra đĩa petri (20ml/đĩa) Cấy một khoanh nấm có đường kính 4 mm cùng độ tuổi (lấy từ mép tản nấm 4 – 6 ngày tuổi) vào trung tâm của đĩa petri ở

vị trí úp ngược cho nấm tiếp xúc với môi trường Các đĩa petri sau khi cấy được

ủ trong tối 5 ngày, đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng

Đo đường kính tản nấm: 48 giờ đo một lần cho đến khi tản nấm mọc chạm thành đĩa Mô tả hình thái, màu sắc và sự phân bố tản nấm trên các mức nhiệt độ 2 ngày 1 lần

3.4.1.5 Mô tả hình thái bào tử, giác bám và xác định tên loài nấm

Colletotrichum đã phân lập được

Phương pháp: nhỏ dung dịch bào tử lên lam kính và đặt vào trong đĩa petri

có lót giấy thấm giữ ẩm, quan sát sự nẩy mầm và sự hình thành giác bám của bào tử sau 4, 8, 12 giờ, dưới kính hiển vi (40X) và tính giá trị trung bình

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Màu sắc và hình dạng bào tử, đo chiều dài và chiều ngang bào tử dưới kính hiển vi (40X) (đo 20 bào tử)

- Dựa vào hình dạng bào tử, tính tỷ lệ hình dạng bào tử trong 100 bào tử

- Màu sắc và hình dạng giác bám, đo chiều dài và chiều ngang giác bám dưới kính hiển vi (40X) (đo 20 giác bám)

3.4.2 Khảo sát tính khả năng gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum spp

trên giống dâu Mỹ đá đang được trồng tại thành phố Đà Lạt

Vật liệu chủng bệnh: Giống dâu Mỹ đá được chọn làm giống dâu thí nghiệm do đây là giống dâu được trồng phổ biến tại TP Đà Lạt Cây dùng cho thí nghiệm chủng bệnh

là cây con nuôi cây cấy mô mua tại viện sinh học Đà Lạt và được trồng 4 tháng trong vườn ươm trước khi chủng bệnh Các cây được trồng trong chậu nhựa đường kính 10cm, giá thể tro trấu xơ dừa và đất sạch Phân bón sử dụng là NPK 15-5-20 và phun phòng bằng thuốc Toppsin 70 WP

D/C: cây đối chứng không phun nấm, 1-10 là số cây cho mỗi lô thí nghiệm

10 3 , 10 5 , 10 7 : tương ứng với số bào tử /ml