Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn đất vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật ở cây tiêu sẻ (piper nigrum l ) trồng ở huyện chơn thành và huyện lộc ninh tỉnh bình phước

UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN ĐẤT VÙNG RỄ KÍCH THÍCH TĂ

UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN ĐẤT VÙNG RỄ KÍCH

THÍCH TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT Ở CÂY TIÊU SẺ (Piper nigrum L.) TRỒNG

Ở HUYỆN CHƠN THÀNH VÀ HUYỆN LỘC NINH TỈNH BÌNH PHƯỚC

MÃ SỐ: SV2016-06

Thuộc nhóm ngành khoa học: TỰ NHIÊN Chủ nhiệm đề tài: ĐỖ THỊ THÙY TRÂM

Thành viên tham gia:

1 CHÂU KIM XUYẾN

2 HÀ BẢO SƠN

Giáo viên hướng dẫn: ThS ĐẶNG THỊ NGỌC THANH

UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN ĐẤT VÙNG RỄ KÍCH

THÍCH TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT Ở CÂY TIÊU SẺ (Piper nigrum L.) TRỒNG

Ở HUYỆN CHƠN THÀNH VÀ HUYỆN LỘC NINH TỈNH BÌNH PHƯỚC

Mã số đề tài: SV2016-06

Xác nhận của Chủ tịch

Hội đồng nghiệm thu

TS Nguyễn Xuân Dũ ThS Đặng Thị Ngọc Thanh Đỗ Thị Thùy Trâm

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, em đã nhận được sự giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo tận tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

- Ban Chủ nhiệm khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên, các thầy cô bộ môn ngành Sư phạm Sinh học trường Đại học Sài Gòn đã dạy dỗ, truyền đạt cho em nhiều kiến thức học tập hay

- Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Đặng Thị Ngọc Thanh, cô đã tận tâm chỉ dẫn, dìu dắt, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cũng như trong quá trình làm thí nghiệm và viết đề tài

- TS Nguyễn Đức Hưng, TS Nguyễn Thanh Tuấn, thầy đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu khoa học

- ThS Lê Minh Đức, ThS Phạm Thị Thu Ly và ThS Nguyễn Văn Tú đã nhiệt tình giúp đỡ em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học

- Cảm ơn chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - trường Đại học Cần Thơ, chị Nguyễn Thị Thu Hằng - trường Đại học Sài Gòn khóa 11, các chị đã tận tình truyền đạt, giúp đỡ em, động viên em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học

- Em gửi lời cảm ơn đến Bố Mẹ, gia đình, người thân, tập thể lớp DSI1131 đặc biệt

là bạn Nguyễn Văn Duy và tất cả bạn bè – những người đã ủng hộ, động viên, giúp

đỡ em vượt qua khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Cuối lời kính chúc Bố Mẹ, Thầy Cô, các anh chị, các em và tất cả các bạn dồi dào sức khỏe, thành công trong cuộc sống

TP Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2017

Đỗ Thị Thùy Trâm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN III

MỤC LỤC 4

DANH MỤC HÌNH ẢNH 7

DANH MỤC BẢNG BIỂU 8

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 9

MỞ ĐẦU 10

1 Tính cấp thiết của đề tài 10

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 11

2.1 Mục đích nghiên cứu 11

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 11

2.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 11

2.4 Thời gian nghiên cứu 11

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên ở huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh 12

1.2 Tổng quan về cây Hồ tiêu 13

1.2.1 Vị trí, phân loại của cây Hồ tiêu 13

1.2.2 Thành phần dinh dưỡng 14

1.2.3 Đặc điểm sinh lý - sinh thái 14

1.2.4 Giá trị của cây Hồ tiêu 16

1.3 Khái quát khu hệ sinh vật đất và vi sinh vật đất vùng rễ 17

1.3.1 Khái niệm vùng rễ 17

1.3.2 Khu hệ vi sinh vật trong đất vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ 17

1.3.3 Một số đặc tính của vi khuẩn vùng rễ 19

1.4 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn đất vùng rễ cây tiêu Sẻ 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 27

2.2 Vật liệu 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Thu thập, xử lý và chuẩn bị mẫu 27

2.3.2 Phân lập vi khuẩn đất vùng rễ 29

2.3.3 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn 31

2.3.4 Định lượng khả năng cố định đạm, hòa tan lân khoáng và tổng hợp IAA của các dòng thu được 33

2.3.5 Định danh vi khuẩn 36

2.3.6 Xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn đất vùng rễ cây tiêu Sẻ ở huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước 38

3.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc 38

3.1.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn 44

3.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk’s đặc và NBRIP đặc 49

3.3 Kết quả định lượng khả năng cố định đạm NH4+ , lân và sinh tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phát triển mạnh trên môi trường Burk’s đặc và NBRIP đặc 56

3.3.1 Xây dựng các đường chuẩn đo đạm, đo lân, và đường chuẩn IAA 56

3.3.2 Kết quả định lượng 58

3.3.3 Thảo luận chung về khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA

của các dòng vi khuẩn vùng đất rễ cây tiêu Sẻ ở tỉnh Bình Phước 70

3.4 Kết quả định danh vi khuẩn 73

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 75

4.1 Kết luận 75

4.2 Đề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

PHỤ LỤC 1: ĐỊA ĐIỂM THU MẪU CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC 81

PHỤ LỤC 2: KÍ HIỆU CÁC DÒNG VI KHUẨN 85

PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH MÀU SẮC ĐƯỜNG CHUẨN ĐẠM, LÂN, IAA 86

PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA 87

PHỤ LỤC 5: HOMOGENEOUS SUBSETS 103

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Hình thái giải phẫu cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) 13

Hình 2 Azosprillum brasilense 20

Hình 3 Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên 21

Hình 4 Các dạng lân trao đổi trong đất 22

Hình 5 Bacillus megaterium và Escherichia coli 23

Hình 6 Bản đồ thu mẫu 28

Hình 7 Biểu đồ đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn thu được 43

Hình 8 Hình thái một số khuẩn lạc 43

Hình 9 Biểu đồ biểu diễn hình dạng tế bào của các vi khuẩn phân lập được 47

Hình 10 Tỉ lệ gram âm so với gram dương của các vi khuẩn phân lập được 48

Hình 11 “Kéo sợi KOH”và kết quả hình nhuộm Gram của một số dòng vi khuẩn 48

Hình 12 Đồ thị đường và phương trình đường chuẩn đạm 57

Hình 13 Đồ thị và phương trình đường chuẩn lân 57

Hình 14 Đồ thị và phương trình đường chuẩn IAA 58

Hình 15 Hàm lượng NH4+ trung bình qua các lần đo của một số dòng vi khuẩn 61

Hình 16 Lượng NH4+ trung bình của 5 dòng vi khuẩn có khả năng cố định tốt nhất 61 Hình 17 Phản ứng màu với thuốc thử đạm của một số dòng vi khuẩn ở ngày 2 62

Hình 18 Hàm lượng lân trung bình của một số dòng vi khuẩn qua các lần đo 65

Hình 19 Lượng lân hòa tan trung bình của 5 dòng vi khuẩn hòa tan tốt nhất 66

Hình 20 Phản ứng màu với thuốc thử lân của một số dòng vi khuẩn ở ngày 5 67

Hình 21 Hàm lượng IAA trung bình qua các ngày của một số dòng vi khuẩn 69

Hình 22 Lượng IAA sinh tổng hợp được của 5 dòng vi khuẩn tổng hợp tốt nhất 69

Hình 23 Phản ứng màu với thuốc thử IAA của một số dòng vi khuẩn 70 Hình 24 Kết quả định lượng trung bình của 3 dòng vi khuẩn được chọn định danh 73

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Thành phần môi trường Burk 29

Bảng 2 Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) 30

Bảng 3 Hóa chất nhuộm Gram 32

Bảng 4 Đặc điểm khuẩn lạc của 90 dòng vi khuẩn đã phân lập được 38

Bảng 5 Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được 44

Bảng 6 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường Burk’s 49

Bảng 7 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP 52

Bảng 8 Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/L) qua các ngày của 43 dòng vi khuẩn 59

Bảng 9 Khả năng hòa tan lân qua các ngày của 43 dòng vi khuẩn phân 62

Bảng 10 Lượng IAA tổng hợp được qua các ngày của 43 dòng 67

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Từ 40 mẫu đất vùng rễ của cây tiêu Sẻ trồng tại huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước đã phân lập được 90 dòng vi khuẩn đất vùng rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân Về đặc điểm tế bào vi khuẩn, phần lớn có dạng hình cầu (41,1%), ngoài ra còn có dạng que ngắn (31,1%), que dài (20%) và hình que cầu (7,8%) Phần lớn các dòng vi khuẩn thu được có khuẩn lạc dạng tròn (80%), bìa nguyên (61,1%) và độ nổi

mô (74,44%) Trong số 90 dòng có 43 dòng phát triển tốt trên cả 2 môi trường Burk’s và NBRIP đã được phân tích khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA Năm dòng có khả năng cố định đạm cao nhất là: LĐ11, LĐ5, LĐ8, TT2, LĐ6 với lượng NH4+

đo được từ 3,61 mg/L đến 5,20 mg/L; 5 dòng có khả năng hòa tan lân cao nhất là: LĐ8, ML42, LĐ3, ML63, LĐ5 với lượng P2O5 đo được từ 23,25 mg/L đến 35,14 mg/L; 5 dòng sinh tổng hợp IAA tốt nhất là: CT1, CT2, LT4, LT2, TT6 với lượng IAA đo được từ 2,86 mg/L đến 3,22 mg/L Căn cứ kết quả định lượng đã tuyển chọn được 3 dòng có khả năng

cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA tốt và hài hòa về cả 3 tiêu chí để định danh theo phương pháp khối phổ Bruker Daltonik MALDI Kết cho thấy dòng CT6 tương đồng

với Bacillus weihenstephannensis, dòng ML42 tương đồng với Bacillus megaterium, dòng LĐ8 tương đồng với Acinetobacter baylyi Đây là 3 dòng vi khuẩn đất vùng rễ đã

được phân lập từ một số cây trồng trên thế giới và có nhiều tiềm năng thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hồ tiêu vừa là loại gia vị được sử dụng phổ biến trong ẩm thực vừa được dùng làm thuốc chữa bệnh như cứu trợ hô hấp, ho, cảm lạnh, khó tiêu, thiếu máu, bệnh răng miệng, v.v… Hồ tiêu có chứa sắt, kali, calci, mangan, kẽm, chrom, vitamin A, C và nhiều dưỡng chất khác mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.Từ năm 2000 đến nay, Việt Nam liên tục chiếm lĩnh thị trường khi là quốc gia sản xuất và xuất khẩu Hồ tiêu lớn nhất thế giới.Riêng năm 2014, Hồ tiêu Việt Nam chiếm khoảng 58% thị trường Hồ tiêu thế giới Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu Hồ tiêu đến hơn 100 quốc gia khác nhau Có thể nói,

Hồ tiêu Việt Nam đang nắm quyền chi phối ngành hàng nông sản này trên toàn cầu, giúp đời sống người dân được cải thiện đáng kể

Hồ tiêu, cũng như mọi cây trồng khác, muốn sinh trưởng và phát triển tốt phải hấp thu các chất dinh dưỡng trong đó có dinh dưỡng khoáng Lượng phân NPK được bón cho cây chủ yếu là phân hóa học Lạm dụng phân bón hóa học gây ra nhiều bất lợi, bón thiếu hoặc thừa đều ảnh hưởng đến cây trồng Ngoài ra, lượng phân bón dư thừa còn góp phần gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến hệ sinh thái và sức khỏe con người, khiến chi phí sản xuất nông nghiệp tăng cao v.v Do vậy, ngày nay việc sản xuất và sử dụng phân bón sinh học nhằm bổ sung hoặc thay thế phân bón hóa học là một biện pháp được chú trọng

ở nhiều quốc gia Các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm và ứng dụng các chủng vi khuẩn có lợi liên hiệp với thực vật, trong đó có các vi khuẩn vùng rễ, để làm các chế phẩm sinh học để bón cho cây trồng Ngoài khả năng cố định đạm, hòa tan lân và các khoáng chất khác góp phần bổ sung dinh dưỡng cho cây, nhiều chủng vi khuẩn còn có khả năng sinh tổng hợp IAA hay các chất thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác Người ta cũng đã phát hiện nhiều hoạt chất có nguồn gốc từ các vi khuẩn có ích này đã giúp cây gia tăng sức đề kháng với các tác nhân gây bệnh

Trong xu thế hướng tới sự phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững, đề tài

“Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật ở cây

tiêu Sẻ (Piper nigrum L.) trồng tại huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình

Phước” được triển khai nhằm tìm kiếm những dòng vi khuẩn có lợi làm tiền đề cho việc

ứng dụng vào sản xuất phân bón vi sinh chức năng cho Hồ tiêu Các chế phẩm phân bón

có nguồn gốc từ các dòng vi khuẩn này vừa góp phần giảm lượng phân bón hóa học, giảm

chi phí canh tác Hồ tiêu, vừa thân thiện hơn với môi trường

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn được các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây tiêu Sẻ có khả năng

cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA tốt

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu cơ sở lí luận về phân lập tuyển chọn vi khuẩn đất vùng rễ có khả năng

cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA trong cây Hồ tiêu

- Phân lập, tuyển chọn được các dòng vi khuẩn đất vùng rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA tốt trong cây Hồ tiêu được trồng ở các huyện

Chơn Thành và huyện Lộc Ninh thuộc tỉnh Bình Phước

- Kết luận, đề xuất ứng dụng

2.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân,

sinh tổng hợp IAA, giới hạn trong các vi khuẩn đất vùng rễ của các cây Hồ tiêu được

trồng ở huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước

2.4 Thời gian nghiên cứu

- Thu thập tài liệu và viết tổng quan vấn đề nghiên cứu: từ tháng 8/2016 đến tháng 10/ 2016

- Tiến hành các nội dung nghiên cứu: từ tháng 8/2016 đến tháng 3/2017

- Hoàn tất báo cáo và nghiệm thu đề tài Nghiên cứu khoa học: từ tháng 3/2017 đến tháng 4/2017

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên ở huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh

Bình Phước là một tỉnh miền núi ở phía Tây của vùng Đông Nam Bộ, phía Đông giáp tỉnh Lâm Đồng và Đồng Nai, phía Tây giáp tỉnh Tây Ninh và Campuchia, phía Nam giáp tỉnh Bình Dương và phía Bắc tỉnh Đắk Nông và Campuchia Hiện nay, tỉnh Bình Phước có 7 huyện, 3 thị xã

Địa hình vùng lãnh thổ Bình Phước là cao nguyên ở phía Bắc và Đông Bắc, dạng địa hình đồi núi, thấp dần về phía Tây và Tây Nam Bình Phước nằm trong vùng mang đặc trưng khí hậu nhiệt đới cận xích đạo gió mùa, có 2 mùa rõ rệt: mùa mưa và mùa khô Nhiệt độ bình quân trong năm cao đều và ổn định từ 25,80C - 26,20C Lượng mưa bình quân hàng năm biến động từ 2045 - 2325 mm Do chế độ mưa theo mùa nên biên độdao động về độ ẩm không khí giữa mùa mưa và mùa khô khá lớn Độ ẩm trung bình hàng năm

từ 80,8 - 81,4%

Tỉnh Bình Phước có tổng diện tích tự nhiên là 6.855,99 km2, có 7 nhóm đất chính với 13 loại đất Đất có chất lượng cao trở lên (đất đen, đất đỏ bazan, đất phù sa) chiếm 61,13% tổng diện tích tự nhiên của tỉnh, đất chất lượng trung bình chiếm 36,90% Là một trong những tỉnh có chất lượng đất khá tốt so với cả nước và là điều kiện hết sức quan trọng trong việc phát triển sản xuất nông nghiệp của tỉnh (Trang tin điện tử Sở Ngoại Vụ Tỉnh Bình Phước - 2017)

1.2 Tổng quan về cây Hồ tiêu

Hình 1 Hình thái giải phẫu cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.)

(Nguồn: Howell và Raven, 2009)

1 Rễ; 2-6 Gié; 3 Hạt; 4 Hoa, 5 Lát cắt dọc của hoa

Vị trí phân loại cây Hồ tiêu theo Hoàng Thị Sản (2006) Giới: Plantae

Hồ tiêu từ 2,2 – 4,6 %

Hồ tiêu dùng liều nhỏ tăng dịch vị, dịch tụy, kích thích tiêu hóa, làm ăn ngon cơm nhưng liều lớn, kích thích niêm mạc dạ dày, gây sung huyết và viêm cục bộ, gây sốt, viêm đường tiểu tiện, đi đái ra máu Hồ tiêu còn có tác dụng sát trùng, diệt ký sinh trùng, gây hắt hơi Mùi Hồ tiêu đuổi các sâu bọ được dùng bảo vệ quần áo len khỏi bị nhậy cắn

Ngoài công dụng làm gia vị, Hồ tiêu được dùng làm thuốc kích thích tiêu hóa, giảm đau (chữa đau răng), đau bụng (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Hệ thống rễ: Ở dưới mặt đất, hệ thống rễ Hồ tiêu thường gồm từ 3 - 6 rễ cái và các

chùm rễ phụ Ngoài ra trên các đốt của dây Hồ tiêu cũng phát sinh rất nhiều rễ nhỏ bám chặt vào trụ tiêu giúp dây tiêu vươn lên

+ Rễ cái: Các rễ này làm nhiệm vụ chính là hút nước

+ Rễ phụ: Các rễ phụ mọc thành chùm, phát triển theo chiều ngang, rất dày, phân

bố nhiều nhất ở độ sâu 15 - 40cm, làm nhiệm vụ hút nước và hút chất dinh dưỡng trong đất để nuôi cây

+ Rễ bám:Rễ mọc ra từ các đốt trên thân ở trên không, làm nhiệm vụ chính là giúp cây Hồ tiêu bám vào choái, vách tường, v.v để vưon lên cao Khả năng hút nước và hút chất dinh dưỡng cùa rễ bám rất hạn chế, gần như không đáng kể

Rễ cây Hồ tiêu thuộc loại háo khí, không chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng thì phải thường xuyên có biện pháp cải tạo làm cho đất được tươi xốp, tăng hàm lượng mùn Nếu bị úng nước 2-4 giờ thì bộ rễ cây tiêu bị tổn thương đáng kể, có thể dẫn tới việc hư thối và dây tiêu có thể bị chết dần

Hồ tiêu ra hoa dưới dạng hoa tự hình gié, dài 7 – 12cm tùy giống tiêu và tùy điều kiện chăm sóc Trên hoa tự có bình quân 20 - 60 hoa xếp thành hình xoắn ốc, hoa tiêu lưỡng tính hay đơn tính.Các giống tiêu cho năng suất cao thường có tỷ lệ hoa lưỡng tính nhiều hơn.Quả tiêu thuộc loại quả hạch, không có cuống, mang một hạt hình cầu Từ khi hoa xuất hiện đầy đủ cho đến khi quả chín kéo dài từ 7- 10 tháng chia làm các giai đoạn sau:

+ Hoa tự xuất hiện đầy đủ đến khi hoa nở thụ phấn: 1 – 1,5 tháng

+ Thụ phấn và phát triển trái: khoảng 4 – 5,5 tháng, giai đoạn này Hồ tiêu lớn nhanh

về kích thước và đạt độ lớn tối đa của quả Đây là giai đoạn Hồ tiêu cần nước và dinh dưỡngnhất

+ Trái chín: 2 – 3 tháng, giai đoạn này hạt bắt đầu phát triển, đạt đường kính tối đa Cây Hồ tiêu ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên nước ta thường ra hoa tháng

5, 6 và chín tập trung vào các tháng 2, 3 trong năm, đôi khi kéo dài đến tháng 4,5 do các lứa hoa trễ và cũng tùy theo giống

Đất đai: Hồ tiêu có thể mọc trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng để sinh trưởng phát triển tốt và lâu dài, đất trồng tiêu cần phải đảm bảo các yếu tố:

+ Đất dễ thoát nước, không bị úng, ngập

+ Tầng đất phải sâu, tốt nhất là 1m trở lên

+ Mạch nước ngầm phải sâu, ít nhất là 70 cm

+ Đất có thành phần cơ giới nhẹ đến trung bình, tơi xốp, giàu mùn, không chua Nhiệt độ thích hợp 22 – 28 0C, sinh trưởng bình thường từ 18 - 350C

Lượng mưa hằng năm từ 1250 – 2500 mm/năm trở lên, tốt nhất được phân bố đều trong năm do hệ thống rễ ăn cạn, không chịu nổi với điều kiện khô hạn kéo dài Cần có một khoảng thời gian khô hạn ngắn để phân hóa mầm hoa (20– 30 ngày)

Ánh sáng: ưa ánh sáng tán xạ, do đó trong thời kỳ đầu, nhất là lúc mới trồng cần che bóng cẩn thận Giai đoạn ra hoa nuôi quả cây cần nhiều ánh sáng hơn, có thể che bóng ít hoặc không che do cây trưởng thành có khả năng tự che bóng cho nhau

Gió: cây Hồ tiêu yếu chịu gió, cần có hàng cây chắn gió (hotieu.net, 09/3/2017)

Hồ tiêu là cây lâu năm có giá tri kinh tế cao giữ vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp nói chung và trong cơ cấu kinh tế VAC nói riêng Việt Nam là một trong những nước đứng đầu thế giới về sản xuất hạt tiêu, với sản lượng hàng trăm ngàn tấn hàng năm

Ngành Hồ tiêu nước ta đang có những bước tiến ngoạn mục, không những đóng góp vào tăng trưởng kinh tế của quốc gia với con số năm sau luôn cao hơn năm trước mà còn góp phần quan trọng trong công cuộc xóa đói, giảm nghèo, tăng thu nhập cho người dân khu vực nông thôn, đặc biệt là các vùng còn nhiều khó khăn như Tây Nguyên, Đông Nam bộ, các tỉnh miền Trung… Vị thế Hồ tiêu Việt Nam đã được khẳng định bằng việc giữ vững kỷ lục sản xuất và xuất khẩu số một thế giới suốt 14 năm liền Nếu như năm

2001, xuất khẩu Hồ tiêu mới chỉ trên 50.000 tấn, đạt khoảng 90 triệu USD thì đến năm

2014 đạt trên 150.000 tấn, trị giá trên 1,2 tỷ USD Từ năm 2008, tốc độ tăng hàng năm đạt 15% – 20%/năm, vượt xa nhiều nước vốn có truyền thống sản xuất, xuất khẩu Hồ tiêu lâu

đời Từ năng suất dưới 1 tấn/ha, đến nay năng suất Hồ tiêu Việt Nam đạt bình quân từ 2,3 – 2,5 tấn/ha, số diện tích đạt năng suất 5-6 tấn/ha tăng hàng năm, là ngành hàng có hiệu quả cao nhất trong số 5 loại cây công nghiệp lâu năm của Việt Nam Tuy diện tích chỉ chiếm 2,5% trong tổng số 2 triệu ha trồng cây công nghiệp lâu năm nhưng giá trị xuất khẩu đạt khoảng 20.000 USD/ha Hồ tiêu kinh doanh, gấp nhiều lần cây cà phê, chè, điều, cao su Thị phần nhập khẩu Hồ tiêu Việt Nam vào châu Âu hiện chiếm 34%, châu Á 36%, châu Mỹ 20% và châu Phi 10% (http://agro.gov.vn – Báo Đại Đoàn Kết, 09/3/2017)

1.3 Khái quát khu hệ sinh vật đất và vi sinh vật đất vùng rễ

vật được kích thích bởi hoạt động của rễ (Hartmann et al., 2008) Khái niệm ban

đầu này đã được mở rộng, bao gồm vùng đất xung quanh rễ nơi mà các đặc tính vật lý, hóa học và sinh học đã được thay đổi bởi sự phát triển và hoạt động của rễ (McCully, 2005 trích dẫn của Saharan and Nehra, 2011) Tùy thuộc vào hoạt động đang xét như là sự tiết các hợp chất cảm ứng, hoạt động hô hấp hay sự hấp thụ nước và các dưỡng chất di động mà phạm vi của vùng rễ có thể dao động từ dưới

đơn vị µm cho đến trên cm (Hinsinger et al., 2005) Lớp đất bao quanh rễ thường

được kết dính bởi mạng sợi của nấm rễ, hệ thống lông hút, các chất nhày do rễ và các vi sinh vật vùng rễ tiết ra tạo nên một cấu trúc gọi là vỏ rễ (rhizosheath) (Watt et al.,

1993; Hinsinger et al., 2009)

Hệ sinh thái đất bao gồm môi trường đất xung quang rễ và toàn bộ sinh vật sống trong đất, trong đó hệ vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng, phong phú hơn các loài khác

về số lượng, thành phần Vi sinh vật phân bố trong đất được gọi là khu hệ vi sinh vật trong đất vùng rễ, chúng bao gồm nhiều loài khác nhau có đặc tính lý, hóa, sinh khác nhau, trong đó đáng chú ý nhất là vi khuẩn vùng rễ (Saharan and Nehra, 2011)

Vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sự tằng trưởng của thực vật PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) là những sinh vật có khả năng sống quanh vùng rễ thực vật và bám vào hạt giống, sau đó giúp cho sự tăng trường của thực vật (Kloepper and Schroth, 1978) Nhiều loài vi khuẩn vùng rễ khác nhau đã được nghiên cứu và đánh giá

như Bacillus, Flavobacterium, Acetobacter, Azospirillum, v.v (Tang and Yang, 1997)

Kinh nghiệm thực tế của nông dân trong việc trồng luân canh với cây họ Đậu giúp tăng năng suất cây trồng Cuối thế kỷ XIX, việc trộn hạt giống với vi khuẩn có ích đã được khuyến cáo áp dụng rộng rãi ở Hoa Kỳ Sau đó, chế phẩm Nitragin ra đời, là sự ứng dụng

khả năng cố định đạm của Rhizobium sp (Bashan, 1998) Vào những năm 1950, ở Liên

Xô (cũ), hơn 10 triệu ha đất nông nghiệp được xử lý với hỗn hợp vi khuẩn cố định đạm và

hòa tan lân là Azotobacter chroococcum và Bacillus megaterium.Trong những thí nghiệm

này, khoảng 60% số lần thí nghiệm cho thấy năng suất của các loại cây trồng khác nhau

đã tăng khoảng 10 – 20% Những năm 1970, Azospirillum được phát hiện có khả năng tác

động tích cực đến sự sinh trưởng của các cây không thuộc họ Đậu thông qua quá trình hô hấp của thực vật (Bashan and Holguin, 1997)

Số lượng và thành phần ví sinh vật trong đất thay đổi phụ thuộc vào đặc điểm thổ nhưỡng, loại cây trồng, điều kiện canh tác và thời kì của cây trồng Số lượng vi sinh vật quanh rễ đạt cực đại trong giai đoạn cây trồng phát triển mạnh nhất và đạt cực tiểu khi cây trồng vào thời kỳ thu hoạch

Khi phân tích vùng đầu rễ, thấy có các chất như đường, acid hữu cơ, amino acid, vitamin,…do rễ và vi sinh vật ở đó tiết ra Như vậy, càng ở gần rễ mật số vi khuẩn càng cao, càng ra xa càng giảm, bên cạnh đó những vùng đất có thực vật phát triển thì số lượng

vi sinh vật tập trung trong đất cũng nhiều hơn nơi không có thực vật sinh sống

Do đó chúng có ảnh hưởng lớn đến sinh lý học thực vật và có khả năng cạnh tranh cao trong tiến trình dòng hóa rễ (Saharan and Nehra, 2011) Sau khi tập trung ở vùng rễ (rhizophere), chúng di chuyển đến bề mặt rễ (rhizoplane) và tại đó thể hiện các lợi ích đối với cây chủ Một số chủng, loài còn có khả năng xâm nhập vào rễ

(endorhizophere), thậm chí là vào các bộ phận khác của cây (Compant et al.,

2010)

71.2.1 1.3.3 Một số đặc tính của vi khuẩn vùng rễ

Vi khuẩn vùng rễ có những đặc tính như: có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan thành dễ tan, sinh tổng hợp chất kích thích tố tăng trưởng thực vật Indole-3-acetic acid (IAA), đối kháng sinh học (biocontrol), phân hủy sinh học (phytoremediation), v.v Tuy nhiên đề tài tập trung giới thiệu 03 đặc tính sau:

1.3.3.1 Khả năng cố định đạm

Sự cố định đạm sinh học đóng góp 180.106 tấn N/năm trên toàn cầu, trong đó có các hiệp hội cộng sinh giữa vi sinh vật và thực vật chịu trách nhiệm sản xuất khoảng 80% và phần còn lại đến từ các hệ thống vi sinh vật sống tự do hoặc kết hợp (Saharan and Nehra, 2011)

Quá trình cố định đạm sinh học là một quá trình được thực hiện bởi vi khuẩn Trong

đó nitơ phân tử được biến đổi thành dạng nguyên tử, sau đó thành dạng đạm vô cơ phân

tử ammonia, tiếp đó vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp một phần thành dạng hữu cơ acid amin

để sử dụng cho bản thân vi khuẩn

Hàng năm trên toàn thế giới lượng nitơ khí quyển đã được cố định và chuyển hóa thành nguồn phân đạm rất lớn Lượng đạm này ước tính gấp khoảng 2 lần lượng phân bón sản xuất ra hàng năm trên toàn thế giới.Đạm là chất dinh dưỡng cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực vật Trong không khí N2 khoảng 78% nhưng cây trồng không thể hấp thu trực tiếp được mà phải nhờ vào sự hoạt động của các vi sinh vật Trong đó, vi khuẩn nội sinh có khả năng biến nitơ phân tử trong không khí thành dạng đạm mà cây trồng có thể hấp thụ được Quá trình này là nhờ vào sự xúc tác của enzyme nitrogenase Quá trình khử Nitơ phân tử dưới sự xúc tác của enzyme nitrogenase được tóm tắt như:

N2 + 6e- +12ATP +12 H2O → 3NH4+ + 12 ADP + 12Pi + 4H+

Quá trình khử này bao gồm nhiều phản ứng khử kế tiếp nhau:

- Việc chủng Rhizobium sp giúp gia tăng đáng kể số lượng nốt rễ cũng như năng

suất so với đối chứng trong điều kiện ngoài đồng Thử nghiệm được tiến hành ở Ấn Độ cho thấy tùy thuộc vào cây họ Đậu, điều kiện đất đai và khí hậu, thông qua việc chủng các rhizobium, có thể bổ sung khoảng 50% nhu cầu về đạm, dẫn đến sự gia tăng năng suất đáng kể (Saharan and Nehra, 2011)

- Azospirillum có thể cố định đạm khoảng 20 – 40 kg/ha (tương đương 20 – 40 N/ malate trong phòng thí nghiệm) Khi kết hợp với rễ cây, Azosprillum là vi khuẩn cố định

đạm nitơ có hình xoắn ốc Chúng kị khí, là vi khuẩn Gram âm, hình que cong, phân bố

khắp nơi trong đất và rễ của các loại cây, đặc biệt cây lúa Azosprillum in vitro có thể sản

xuất các hormone thực vật như IAA, cytokinine, ethylene (Bashan and Levanony, 1990)

Hình 2 Azosprillum brasilense

Nguồn:”https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=Azosprillum#imgdii=eB avuaM8Ut0nTM:&imgrc=eyaiYxWmWg2X7M:” (09/4/2017)

- Bên cạnh đó, một số vi khuẩn cố định đạm tốt đã được nghiên cứu và phân lập,

như: Vi khuẩn lam, Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter diazotrophicus, Azoarcus,

v.v…

Hình 3 Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên

"Nguồn:

http://dayhocblog.wordpress.com/2013/03/16/chu-trinh-sinh-dia-hoa-va-sinh-quyen/ "(09/4/2017)

1.3.3.2 Khả năng hòa tan lân khó tan

Lân là nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây

trồng nói riêng và sinh vật nói chung Lân tham gia tích cực trong quá trình trao đổi chất,

kích thích cây ra rễ mạnh, tạo điều kiện cho thân lá phát triển mạnh, vững chắc, ra hoa, tạo hạt tốt, hạt chắc Lân còn góp phần tạo nên bộ rễ cây khỏe mạnh tăng khả năng chống chịu giúp tăng năng suất Lượng lân trong tự nhiên rất lớn nhưng phần lớn cây trồng không hấp thụ được Cây trồng chỉ có thể sử dụng lân dưới dạng hòa tan trong dung dịch đất Tế bào có thể hút được nhiều loại lân nhưng lượng lớn nhất được hấp thụ là dạng HPO42- hoặc H2PO4-

Trong đất, lân có trong các hợp chất hữu cơ và vô cơ Mà dạng phổ biến của lân hiện diện trong đất là dạng vô cơ như: apatite, hydroxyapatite và oxyapatite Đây là dạng lân khó tan cây trồng không thể hấp thu được Tuy nhiên, chúng chính là nguồn lân lớn nhất trong đất vì dưới điều kiện thích hợp chúng được hòa tan và trở thành dạng hữu ích

cho cây và vi sinh vật

Thành phần chính thứ hai của lân trong đất là dạng hữu cơ.Trong hầu hết các loại đất, lân hữu cơ có thể chiếm đến 30 – 50% tổng số lân Lân hữu cơ trong đất chủ yếu ở

dạng inositol phosphate (phytate đất) Các dạng lân hữu cơ khác gồm: phosphomonoester,

phosphodiester, phosphotriester

Sự chuyển hóa lân xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của quá trình hóa học và sinh học Quá trình chuyển hóa lân khó tan trong đất có phần đóng góp quan trọng của các loại visinh vật Cơ chế hòa tan lân là thông qua các hoạt động trao đổi chất có tiết các acid hữu

cơ hòa tan phosphate trong đá hoặc tiết các ion calcium chelate giúp giải phóng lân hòa tan (Saharan and Nehra, 2011) Ngoài ra, các hợp chất mùn với thành phần chứa acid humic và acid fulvic, các enzyme loại esterase, các siderophore, H2S, CO2, và cơ chế tiết proton đều có liên quan đến sự hòa tan phosphate của các vi sinh vật hòa tan lân (Kumar and Pathak, 2000) Sự khoáng hóa các hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphahydrolase), được phân nhóm thành phosphatase acid đặc hiệu và không đặc hiệu Phosphatase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm: 3´-nucleotidase, 5´-nuclotidase, hexose phosphotase và phytase Một nhóm đặc hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ

(Rossosilini et al., 1998)

Hình 4 Các dạng lân trao đổi trong đất

"Nguồn: Otake et al., 1996"

Một số vi khuẩn vùng rễ có khả năng hòa tan lân khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như:

- Các loài thuộc giống Bacillus Gram dương có khả năng hòa tan lân tốt, như: B

megaterium, B subtilis, B.malabenrensis, B weihenstephanensic; trong đó, B.megaterium

Không những có khả năng phân giải hợp chất lân vô cơ mà còn có khả năng phân giải hợp

chất lân hữu cơ và đã được sử dụng làm phân vi sinh B megaterium cũng giúp cải thiện các hiệu suất rễ, chiều dài và hàm lượng chất khô của rễ bạc hà (Kaymak et al., 2008) Natarajan và Subramainan (1995) cho rằng chủng kết hợp Rhizobium (chủng Tt 9) với B

megaterium var phosphaticum có thể đáp ứng với khoảng 50% nhu cầu phân bón có chứa

phosphate của đậu phộng; làm gia tăng nốt rễ, tăng chiều dài rễ và chồi cũng như tăng

năng suất quả (trích dẫn của Kumar et al., 2011)

Hình 5 Bacillus megaterium và Escherichia coli

A: Bacillus megaterium, B: Escherichia coli

Nguồn: Vary et al.,2007

- Nghiên cứu in vitro cho thấy chủng phối hợp Azotobacter vinelandii và Bacillus

cereus làm gia tăng khả năng hòa tan phosphate Một nghiên cứu của Algawadi và Gaur

(1988) trong điều kiện nhà kính nhằm tìm hiểu hiệu quả của việc chủng phối hợp

Rhizobium và vi khuẩn hòa tan phosphate bao gồm Pseudomonas striata hoặc Bacillus polymyxa lên sản lượng và hàm lượng dinh dưỡng của đậu xanh với sự bổ sung hoặc

không bổ sung phân bón (Kumar et al., 2011)

- Các dòng vi khuẩn Pseudomonas sp và Azospirillum sp phân lập được từ đất vùng rễ và rễ của Piper nigrum L thể hiện khả năng hòa tan phosphate in vitro cao (Ramachandran et al., 2007)

- Bên cạnh vi khuẩn thì nấm cũng có tác dụng trong quá trình hòa tan hợp chất lân

khó tan, như: Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, v.v… hoặc xạ khuẩn Streptomyces (Richardson et al., 2009)

1.3.3.3 Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)

Ngoài việc tăng cường nguồn dinh dưỡng cho cây thông qua sự cố định đạm và tạo

ra nguồn khoáng hữu dụng cho cây từ dạng khó tan, khó hấp thụ, các vi khuẩn vùng rễ còn có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật thông qua việc sản xuất ra các phytohormone như: auxin, các cytokinin và các gibberellin Trong đó auxin được sản xuất nhiều nhất và quan trọng nhất là IAA

IAA hay còn gọi là auxin là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng (Theogogis và Ray, 1982; Ray,

2001).Vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất L-tryptophan

Có 3 lộ trình tiêu biểu cho sự biến đổi L-tryptophan thành IAA (Koga et al., 1991):

 Lộ trình indole -3- pyruvic acid

Tryptophan → indole -3- pyruvic acid → indole -3- acetaldehyde → IAA

 Lộ trình tryptamine

Tryptophan → tryptamine → indole -3- acetaldehyde → IAA

 Lộ trình indole -3- acetamine

Tryptophan → indole -3- acetamine → IAA

Bên cạnh đó cũng có một số nhóm không cần tiền chất này mà chuyển từ indole 3- glycerol phosphate sang acid indole -3- pyrivic rồi chuyển sang indole -3- acetaldehyde

-và cuối cùng thành IAA

Một số vi sinh vật sinh tổng hợp IAA đã được phân lập và nghiên cứu:

- Azobacter sp là vi khuẩn đất gram âm, di động và hô hấp hiếu khí, bên cạnh cố

định được nito, chúng còn sinh tổng hợp được chất kích thích tăng trưởng thực vật, như IAA với hàm lượng cao (Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thị Thúy, 2015)

- Hai chủng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus và Gluconacetobacter

tan lân trong hợp chất vô cơ, chúng đã được phân lập và nghiên cứu trên cây Mía ở hai tỉnh Bến Tre và Long An (Hoàng Minh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2011)

1.4 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn đất vùng rễ cây tiêu Sẻ

Do sự phổ biến của phân bón hóa học nên người dân sử dụng ngày càng rộng rãi dẫn đến ô nhiễm môi trường, từ đó những nghiên cứu về vi khuẩn ứng dụng trong sản xuất phân bón ngày càng nhận được sự quan tâm trong và ngoài nước Phân bón vi sinh không những giúp nâng cao năng suất, chất lượng nông phẩm mà còn hạn chế ô nhiễm môi trường và giảm chi phí đầu tư cho người dân Ngày nay các nhà khoa học đã có nhiều công trình nghiên cứu và đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn đất vùng rễ trong cây tiêu và các loài cây khác như:

Rokhbakhsh-Zamin và cộng sự (2012) đã phân lập được 31 dòng Acinetobacter từ đất vùng rễ của cây kê Pennisetum glaucum Các Acinetobacter có khả năng hòa tan lân,

tổng hợp IAA, sản sinh ra siderophore và hòa tan oxit kẽm, có khả năng sản sinh ra cả

hai loại phân tử hydroxamate và catechol Ngoài ra, Acinetobacter ức chế sự tăng

trưởng của nấm và ứng dụng trong nghiên cứu lai ghép DNA

Rajkumar at el (2008) đặc trưng của sự phát triển của cây trồng tăng trưởng kim loại thúc đẩy Bacillus weihenstephanensis phân lập từ đất serpentine ở Bồ Đào Nha Một

chủng vi khuẩn SM3 phân lập từ đất serpentine ở đông bắc Bồ Đào Nha được xác định

như Bacillus weihenstephanensis dựa trên các đặc điểm hình thái học và sinh hóa và về

phân tích so sánh trình tự DNA ribosome của một phần 16S Dòng SM3 cũng đã thể hiện khả năng hòa tan phosphate và sản xuất axit indolo-3-acetic (IAA) cả khi không có và có mặt của kim loại (Ni, Cu và Zn) Sự hòa tan kim loại bởi dòng vi khuẩn này có thể là một quá trình quan trọng để thúc đẩy việc hấp thụ các kim loại nặng bằng thực vật Nghiên cứu này đã làm sáng tỏ vai trò đa dạng của chủng SM3 trong việc thúc đẩy tăng trưởng

cây trồng và tiềm năng huy động kim loại (B Soufiane at el, 2012) Bacillus

weihenstephanensis thuộc Bacillus cereus, Bacillus weihenstephanensis được phân biệt

dựa trên khả năng phát triển của nó ở 7°C nhưng không quá 43°C và sự có mặt của các

chuỗi chữ ký đặc trưng trong 16S rRNA và gen cspA và trong một số gen khác: glpF,

gmK, purH, và Tpi Chu trình ký hiệu đặc biệt của Bacillus weihenstephanensis được tìm

J.Ding at el (2005) nghiên cứu này cho thấy rằng gen nifH có thể được phát hiện trong cả hai chi Bacillus và Paenibacillus.Những mồi thoái hóa cho đoạn gen nifH được

sử dụng trong nghiên cứu này đã được chứng minh là hữu ích cho việc xác định trực khuẩn cố định đạm.Đây là bằng chứng đầu tiên rằng nitơ cố định tồn tại trong B

Marisflavi và P massiliensis và báo cáo đầu tiên của chuỗi nifH gen từ B megaterium

và B.cereus.Các trực khuẩn cố định đạm thu được trong nghiên cứu này sẽ được sử dụng

trong nghiên cứu tương lai của chúng tôi để điều tra các cơ chế cố định đạm ở trực khuẩn

Yap Chin Ann (2012) đã nghiên cứu về tính kháng nấm của vi khuẩn đất vùng rễ ở

cây Hồ tiêu.Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và lựa chọn vi khuẩn Bacillus

trong đất có khả năng phát triển nhiều cơ chế hoạt động liên quan đến việc kiểm soát

sinh học của nấm gây bệnh trên cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) Quy trình sàng lọc bao

gồm các bài kiểm tra đối kháng chống lại một loại nấm gây bệnh nấm bệnh, phát hiện

trong ống nghiệm các sản phẩm chống nấm Bốn chủng được xác định là Bacillus

amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis và Bacillus vallismortis đã

được chọn để nghiên cứu thêm Tất cả các chủng vi khuẩn thu được kiểm soát in vitro có hiệu quả sự phát triển của nấm gây bệnh liên quan đến sự tiết của enzym protease và cellulase chịu trách nhiệm cho thủy phân nấm Mặt khác, tất cả vi khuẩn đều phát triển tốt trong điều kiện tương tự như các vi khuẩn có thể tìm thấy ở thực địa (xem xét độ pH,

độ mặn và nhiệt độ) Những kết quả này cho thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩn được nghiên cứu có một tiềm năng tuyệt vời để được sử dụng như là các tác nhân kiểm soát sinh học để kiểm soát các loại nấm gây bệnh nấm thực vật ở cấp độ thực địa

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

 Thiết bị thí nghiệm:

- Cân điện tử Sartorius (Đức)

- Kính hiển vi Accu-Scope (Hoa Kỳ)

- Tủ sấy Binder (Đức), máy lắc mẫu Hoefer (Đức)

 Dụng cụ: Bình tam giác 250 ml, bình tam giác 500 ml, ống đong, ca nhựa, micropipet, đèn cồn, cốc thủy tinh, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que trang, lame, lammenle, eppendorf, cá từ

2.2 Vật liệu

Bốn mươi mẫu đất vùng rễ cây tiêu Sẻ thu nhập từ huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh tỉnh Bình Phước (xem mục 6.3.1.1)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Thu mẫu và chuẩn bị mẫu là khâu quan trọng quyết định độ chính xác của việc phân tích Mẫu phải có tính đại diện, điển hình, phản ánh đúng thực trạng cây trồng tại hiện trường Trong quá trình xử lý mẫu và bảo quản mẫu phải đảm bảo giữ được các thành phần và tính chất quan trọng của mẫu (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

2.3.1.1 Thu thập mẫu

Việc thu mẫu được tiến hành làm 4 đợt từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2016, có tổng cộng 40 địa điểm thu mẫu tương ứng với 40 vườn tiêu thuộc xã Minh Long, Minh Hưng, Thành Tâm, Chơn Thành huyện Chơn Thành, xã Lộc Điền, Lộc Thái huyện Lộc Ninh tỉnh Bình Phước

Tại mỗi địa điểm thu mẫu (vườn), thu lấy 5 mẫu ( 5 cây) theo quy tắc đường zig zag

Sử dụng xẻng sạch để hớt bỏ lớp đất trên mặt (1 – 3 cm) quanh gốc, sau đó xén và thu toàn bộ khối đất bao quanh rễ của cây tiêu cho vào túi nylon Ghi và dán nhãn lên túi, bao gồm ký hiệu mẫu, thời gian, địa điểm, người lấy mẫu Sau khi thu, mẫu được đem về phòng thí nghiệm để xử lý trong vòng 24 giờ (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

2.3.1.2 Xử lý mẫu đất

Mỗi mẫu đất bao quanh bộ rễ được xử lý theo phương pháp “Lắc” (Shaking) (Luster and Finlay, 2006) Mỗi lần là một “mẫu đơn” sau đó sẽ được gộp chung tạo thành “mẫu tổ hợp” theo từng vườn (TCVN 7528-2:2005) Có tổng cộng 40 mẫu, mỗi mẫu được bảo quản trong lọ thủy tinh sạch ở 5oC và được dùng để tiến hành phân lập vi khuẩn trong vòng 10 ngày

2.3.2.1 Chuẩn bị dịch huyền phù

Cân 1 g đất vùng rễ tiêu Sẻ đã qua xử lý (mục 6.3.1.2) và nghiền mịn bằng chày và cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác chứa 99 mL nước vô trùng Đậy nút bông và đặt trên máy lắc trong 12 giờ với tốc độ 200 rpm giúp cho các hạt đất rời ra và vi khuẩn phân tán đều trong nước Sau khi lắc, để lắng trong khoảng 3 giờ rồi thu lấy phần dịch trong cho vào ống nghiệm vô trùng và bảo quản lạnh để sử dụng trong ngày

2.3.2.2 Chọn lọc và làm thuần các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân

- Lấy 30 L dịch huyền phù trang đều trên môi trường thạch đĩa Burk không N hoặc môi trường NBRIP Sau 24 – 48 giờ, tiến hành quan sát Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc, dùng que cấy đã khử trùng cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường thạch đĩa tương ứng theo phương pháp cấy ria (Trần Linh Thước, 2001)

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Môi trường Burk:

Bảng 1 Thành phần môi trường Burk

Môi trường NBRIP:

Bảng 2 Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)

Agar Môi trường đặc 18 g/L

2.3.3 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn

2.3.3.1 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc

Mô tả hình thái khuẩn lạc, bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi, dạng bìa khuẩn lạc

Kết quả cần ghi nhận vào bảng sau:

vi, quan sát với vật kính X10, X40 và X100 (Trần Linh Thước, 2001)

Nhuộm Gram

Theo phương pháp nhuộm Gram, vết bôi vi khuẩn được tạo ra, làm khô và hơ nóng nhẹ để tế bào vi khuẩn dính chắc vào bề mặt phiến kính Sau đó vết bôi được nhuộm với crytal violet, thuốc dư được rửa trôi thêm dung dịch iodine vào vết bôi Iodine làm nhiệm

vụ gắn chất màu vào tế bào Tiếp theo, vết bôi được khử màu bởi cồn và được nhuộm lại với safarin Ở tế bào vi khuẩn Gram dương, màu tím của crystal violet được gắn chắc vào lớp vỏ tế bào nhờ iodine, không bị khử bởi cồn và vì thế tế bào vi khuẩn này vẫn mang màu tím Trái lại, màu tím ở tế bào vi khuẩn Gram âm bị khử bởi cồn và tế bào không màu lại bắt với màu hồng của safranin (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Bảng 3: Hóa chất nhuộm Gram

Tím Crystal (tím tinh thể)

Crystal violet Rượu ethylic 96oPhenol đã tinh chế Nước cất

10 mL 0,3 g

5 g

95 mL

* Sử dụng phương pháp “KOH String Test” với KOH 3% như là một phương pháp

bổ trợ để xác định Gram(von Graevenitz và Bucher, 1983)

Kết quả cần ghi nhận vào bảng sau:

động

1

Hòa tan 10 gram phenol và etanol 95% cho đủ thể tích 100 mL

- Nitroprusside Na2Fe(CN)5NO(2H2O)

Hòa tan 1 gram sodium Nitroprusside trong DI H2O cho đủ 200 mL

- Dung dịch oxide hóa

(1) Trisodium citrate-sodium hydroxide

Hòa tan 100 g trisodium citrate và 5 g sodium hydroxide trong DI H2O (nước khử ion) cho đủ 500 mL

chuẩn (ppm)

Chuẩn bị mẫu: Chủng 1 mL vi khuẩn gốc vào các bình tam giác 50 mL có chứa 20 mL

môi trường Burk’s không N lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Xử lý mẫu dịch nuôi cấy và tiến hành định lượng:

- Thời điểm tiến hành thu dịch nuôi cấy để định lượng ammonium sinh ra là ngày 2, 4, 6

và 8

- Rút 2 mL dịch nuôi cấy cho vào ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút, trong 5 phút

- Hút 0,5 mL dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 3,5 mL nước khử khoáng, thêm 0,16

mL dung dịch phenol-etanol, 0,16 mL sodium nitroprusside và 0,40 mL dung dịch có tính oxi hóa mạnh vào mỗi ống, trộn đều bằng máy khuấy

- Để ổn định 15 - 20 phút tại nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp so màu ở bước sóng 640 nm (OD 640 nm)

2.3.4.2 Định lượng phosphate hòa tan (Murphy và Riley, 1962)

Hóa chất

+ Dung dịch A

(1) Đong 140 mL H2SO4 đậm đặc và thêm H2O vào từ từ cho đủ 1 lít

(2) 20 gram (NH4)6MoO24.4H2O (amonium molybdate) trong DI H2O cho đủ 500mL (3) 0,2743 gram KsbOC4H2O6 (potassium antimonyl tartrate) trong DI H2O cho đủ 100mL

(4) Cho (1) và (2) vào (3) theo tỉ lệ 125 mL: 37,5 mL: 12,5 mL

Chuẩn bị mẫu: Chủng 1 mL vi khuẩn gốc vào các bình tam giác 50 mL có chứa 20 mL

môi trường NBRIP lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Xử lý mẫu dịch nuôi cấy và tiến hành định lượng

- Thời điểm tiến hành thu dịch nuôi cấy để định lượng phosphate hòa tan là ngày 5, 10, 15

và 20

- Rút 2 mL dịch nuôi cấy cho vào ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút, trong 5 phút

- Hút 0,5 mL dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 1,5 mL nước khử khoáng, thêm 0,28

mL dung dịch A, 0,12 mL dung dịch B, trộn đều bằng máy khuấy

- Để ổn định 10 - 15 phút tại nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo lượng lân hòa tan được bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880 nm (OD 880nm)

2.3.4.3 Xác định khả năng tổng hợp IAA và định lượng IAA sinh ra trong điều kiện không bổ sung tryptophan

Các dòng có khả năng sinh IAA được tiếp tục khảo sát định lượng để đánh giá và tuyển chọn dòng tốt hơn

Chuẩn bị mẫu: Chủng 1 mL vi khuẩn gốc vào các bình tam giác 50 mL có chứa 20 mL

môi trường Burk’s không N lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở điều kiện tối Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Xử lý mẫu dịch nuôi cấy và tiến hành định lượng

- Thời điểm tiến hành thu dịch nuôi cấy để định lượng IAA sinh ra là ngày 2, 4, 6 và 8

- Rút 2 mL dịch nuôi cấy cho vào ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút, trong 5 phút

- Hút 0,5 mL dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 1,5 mL nước khử khoáng, thêm 4 mL dung dịch Fe-H2SO4, trộn đều bằng máy khuấy

- Để ổn định 15 phút tại nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo lượng IAA bằng phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm (OD 530nm)

2.3.5 Định danh vi khuẩn

Chọn 3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA tốt nhất Gửi các mẫu để định danh bằng phương pháp khối phổ Bruker Datonik MALDI tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn đất vùng rễ cây tiêu Sẻ ở huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước

Có tổng cộng 90 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây tiêu Sẻ có cả 2 khả năng cố định đạm và hòa tan lân được phân lập từ 40 mẫu (Phụ lục 1)

ĐỘ NỔI ĐƯỜNG

KÍNH (cm)

đều