Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn khử nitrat trong nước thải sau biogas của một số trang trại chăn nuôi heo tại huyện củ chi, thành phố hồ chí minh

UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƯỚC THẢI SAU BIOGA

UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƯỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA MỘT SỐ TRANG TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẠI HUYỆN CỦ CHI,

2 Trần Lê Đan Thi

3 Nguyễn Thái Anh Thư

Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Ngọc Thảo

UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƯỚC THẢI

SAU BIOGAS CỦA MỘT SỐ TRANG TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẠI HUYỆN CỦ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn khử Nitrat trong

nước thải sau khi qua hầm Biogas của một số trang trại chăn nuôi heo tại huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh” do nhóm tôi thực hiện và được sự hướng dẫn của ThS

Nguyễn Thị Ngọc Thảo Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực, những số liệu và dữ liệu trong báo cáo phục vụ cho việc phân tích, nhận xét và đánh giá được thu thập từ các nguồn gốc khác nhau và được ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

TPHCM, tháng 4 năm 2017 Chủ nhiệm đề tài

Lê Thị Thu Tâm

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu trường Đại học Sài Gòn, Ban Chủ nhiệm

khoa Khoa học Môi trường, em và nhóm em đã tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập

và tuyển chọn vi khuẩn khử Nitrat trong nước thải sau khi qua hầm Biogas của một

số trang trại chăn nuôi heo tại huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh” với sự hỗ trợ

kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

Để có thể hoàn thành bài nghiên cứu này, em xin thay mặt nhóm để bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS Nguyễn Thị Ngọc Thảo, khoa Khoa học Môi trường, trường Đại học Sài Gòn đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, hỗ trợ và chỉ bảo tận tình cho chúng em trong suốt thời gian nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, cán bộ khoa Khoa học môi trường, trường Đại học Sài Gòn đã giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu hữu ích trong quá trình nghiên cứu cho chúng em

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên em và nhóm em khi nhóm em gặp khó khăn trong quá trình nghiên cứu để chúng

em có đủ động lực và niềm tin để hoàn thành đề tài này

Tuy nhóm em đã cố gắng hết sức nhưng bài báo cáo nghiên cứu không thể tránh được những thiếu sót và hạn chế Kính mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý thầy cô cùng toàn thể các bạn để nhóm có thể hoàn thiện bài nghiên cứu

Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 4 năm 2017

Chủ nhiệm đề tài

Lê Thị Thu Tâm

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

MỞ ĐẦU 1

I Lý do chọn đề tài 1

II Tổng quan tình hình nghiên cứu 3

II.1 Trong nước 3

II.2 Nước ngoài 6

III Mục tiêu đề tài 8

IV Nhiệm vụ nghiên cứu 8

V Phương pháp nghiên cứu 8

VI Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 9

VI.1 Đối tượng nghiên cứu của đề tài 9

VI.2 Phạm vi nghiên cứu 10

VII Ý nghĩa của đề tài 10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Tổng quan về nước thải chăn nuôi heo sau biogas 11

1.2.1 Tình hình chăn nuôi heo 11

1.2.2 Tính chất nước thải chăn nuôi sau biogas: 12

1.2 Tổng quan về quá trình khử nitrat nhờ vi sinh vật 13

1.2.1 Tổng quan chu trình nitrogen trong tự nhiên 13

1.2.2 Tổng quan quá trình khử nitrate nhờ vi sinh vật 15

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ khử nitrat 16

1.2.4 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrat 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 19

2.2 Vật liệu 19

2.2.1 Nguyên vật liệu 19

2.2.2 Dụng cụ thiết bị 20

2.2.3 Hóa chất 20

2.2.3.1 Hóa chất sử dụng 20

2.2.3.2 Môi trường sử dụng 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phân lập vi khuẩn 23

2.3.2.1 Đặc điểm sinh trưởng của các dòng vi khuẩn 25

2.3.2.2 Phản ứng với thuốc thử diphenylamine 25

2.3.3.2 Phương pháp nhuộm Gram để xác định đặc điểm hình thái 27

2.3.3.3 Xác định đặc điểm sinh lý 28

2.3.4 Phương pháp định lượng vi sinh vật 30

2.3.4.1 Xác định bước sóng thích hợp của các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate 30

2.3.4.2 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào 30

2.3.4.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 33

2.3.5 Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu lên sự sinh trưởng và phát triển của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 33

2.3.5.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy 33

2.3.5.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 34

2.3.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả phân lập và làm thuần các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate 36

3.1.1 Phân lập các dòng vi khuẩn từ 3 mẫu nước thải 36

3.1.2 Làm thuần các dòng vi khuẩn được phân lập 38

3.1.3 Lưu trữ và bảo quản các dòng vi khuẩn đã được làm thuần 40

3.2 Xác định khả năng khử nitrate của các dòng vi khuẩn 41

3.2.1 Đặc điểm sinh trưởng của từng dòng vi khuẩn 41

3.2.2 Phản ứng với thuốc thử Diphenylamine 45

3.3 Kết quả định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn 50

3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50

3.3.2 Đặc điểm hình thái tế bào 52

3.3.3 Đặc điểm sinh lý 55

3.3.3.1 Khả năng sử dụng oxy 55

3.3.3.2 Khả năng di động 56

3.3.4 Kết quả định lượng các dòng vi khuẩn đã được tuyển chọn 58

3.3.4.1 Xác định bước sóng thích hợp của các dòng vi khuẩn 58

3.3.4.2 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào 61

3.3.4.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng của các dòng vi khuẩn 63

3.4 Kết quả khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng của các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate 66

3.4.1 Ảnh hưởng của các nguồn carbon 66

3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường 68

3.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường 69

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

4.1 Kết luận 72

4.2 Kiến nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

Phụ lục 1: Phổ hấp thụ của dịch tế bào của dòng vi khuẩn 82

Phụ lục 2: Hình ảnh kết quả của thí nghiệm về khả năng sinh trưởng của từng dòng vi khuẩn trên môi trường Giltay lỏng trong điều kiện kỵ khí 86

Phụ lục 3: Hình ảnh kết quả của thí nghiệm quan hệ với oxy của các dòng vi khuẩn 89

Phụ lục 4: Kết quả của thí nghiệm khả năng di chuyển của các dòng vi khuẩn 90

Phụ lục 5: Thông số mối liên hệ giữa mật độ vi khuẩn và độ hấp thụ 92

Phụ lục 6: Giá trị của độ hấp thụ của dịch huyền phù tế bào biểu diễn quá trình sinh trưởng và phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường Giltay lỏng 92

Phụ lục 8: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ của các dòng vi khuẩn ở các nguồn carbon khác nhau: Acid citric; Glucose; Pepton trong điều kiện thiếu khí, không sục khí 94

Phụ lục 9: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ của các dòng vi khuẩn ở các giá trị pH : 5; 6; 7; 8; 9 trong điều kiện thiếu khí, không sục khí 94 Phụ lục 10: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ của các dòng vi khuẩn ở các giá trị nhiệt độ :

25oC; 30oC; 35oC; 40oC; 45oC trong điều kiện thiếu khí, không sục khí 95

BẢN TÓM TẮT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƯỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA MỘT SỐ TRANG TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẠI HUYỆN CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Mã số đề tài: SV2016-33

1 Vấn đề nghiên cứu (vấn đề, tính cấp thiết)

Việc tận dụng nguồn vi sinh vật có ích sẵn có trong nguồn nước bị ô nhiễm để xử lý chính nguồn nước đó đang được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu, vi khuẩn

có khả năng khử nitrate là một trong những loài vi khuẩn có khả năng xử lý tốt nguồn nước thải giàu nitơ nên hiện nay cũng đã và đang có rất nhiều nghiên cứu và dã ứng dụng các chủng vi khuẩn này ở nhiều nơi Tuy nhiên để ứng dụng một cách hiệu quả các dòng vi khuẩn này trong việc xử lý chính nguồn nước thải sau biogas tại huyện Củ

Chi nên đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn khử nitrat trong nước thải sau khi

qua biogas của một số trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh” được thực hiện

2 Mục đích nghiên cứu/mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn và đánh giá đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng được các dòng

vi khuẩn có khả năng khử nitrate từ 3 mẫu nước thải sau hầm biogas của 3 trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

3 Nhiệm vụ/nội dung nghiên cứu/câu hỏi nghiên cứu

Phân lập và làm thuần các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrat

Đánh giá khả năng khử nitrat của các dòng vi khuẩn đã được thu nhận

Định danh các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrat tốt nhất bằng phương pháp sinh lý, sinh hóa

Đánh giá đặc tính sinh trưởng các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate tốt nhất

Đánh giá điều kiện sinh trưởng tối ưu của các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrat

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thu mẫu và phân tích mẫu; Phương pháp phân lập và tuyển chọn; Phương pháp định danh bằng sinh hóa; Phương pháp định tính; Phương pháp so sánh và đánh giá

5 Kết quả nghiên cứu (ý nghĩa của các kết quả) và các sản phẩm (Bài báo khoa học,

phần mềm máy tính, quy trình công nghệ, mẫu, sáng chế, …

Phân lập, làm thuần, lưu trữ và đánh giá khả năng khử nitrate của 55 dòng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc Giltay

Tuyển chọn và thu nhận được 21 dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate với đặc điểm của các dòng vi khuẩn gram âm, có khả năng di chuyển và đạt pha cân bằng trong khoảng thời gian từ 60h đến 120h

Đánh giá điều kiện nuôi cấy tối ưu trong phòng thí nghiệm của 2 dòng vi khuẩn A1 và A3

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 20

Bảng 2.2 Thành phần môi trường Giltay 21

Bảng 2.3 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn khử nitrate 26

Bảng 3.1 Số khuẩn lạc phân lập được từ mẫu nước thải A, B và C 36

Bảng 3.1 Số lượng dòng vi khuẩn được làm thuần bằng phương pháp cấy ria trên môi trường Giltay thạch 39

Bảng 3.2 Đặc điểm sinh trưởng của các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrat trên môi trường Giltay lỏng trong điều kiện kị khí tĩnh 41

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 50

Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 53

Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng của các dòng vi khuẩn trên môi trường 55

Bảng 3.6 Khả năng di động dựa vào tiên mao của các dòng vi khuẩn trong môi trường bán thạch 57

Bảng 3.7 Độ hấp thụ cực đại của các dòng vi khuẩn 58

Bảng 3.8 Giá trị OD của các dòng vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau 61

Bảng 3.9 Mật độ tế bào của các dịch huyền phù ở các nồng độ 61

Bảng 3.10 Giá trị độ hấp thụ của các dòng vi khuẩn theo thời gian (h) 63

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chu trình nitrogen trong tự nhiên 14

Hình 2 1 Mẫu nước thải thu nhận từ nguồn nước thải sau biogas của 3 trang trại chăn nuôi heo a: Mẫu nước thải từ trang trại chăn nuôi heo A; b: Mẫu nước thải từ trang

trại chăn nuôi heo B; c: Mẫu nước thải từ trang trại chăn nuôi heo C 19

Hình 2 2 Vị trí lấy mẫu nước thải sau biogas từ 3 trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ

Chi a: Vị trí lấy mẫu nước thải từ trang trại chăn nuôi heo A; b: Vị trí lấy mẫu nước

thải từ trang trại chăn nuôi heo B; c: Vị trí lấy mẫu nước thải từ trang trại chăn nuôi heo C 23

Hình 2.3 Quy trình phân lập các dòng vi khuẩn 24 Hình 3 1 Một số khuẩn lạc được phân lập trên môi trường Giltay a: Khuẩn lạc được phân lập từ mẫu nước thải A; b: Khuẩn lạc được phân lập từ mẫu nước thải B; c: Khuẩn lạc được phân lập từ mẫu nước thải C 37Hình 3.2 Số lượng tế bào của tổng các dòng có khả năng phát triển trên môi trường Giltay trong 3 mẫu nước thải 38Hình 3 3.Các khuẩn lạc được làm thuần bằng phương pháp cấy ria trên môi trường Giltay thạch: a: Khuẩn lạc được làm thuần từ các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thải A; b: Khuẩn lạc được làm thuần từ các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thải B; c: Khuẩn lạc được làm thuần từ các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thải C 39Hình 3.4 Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn được làm thuần 40Hình 3.5 Khuẩn lạc các dòng vi khuẩn được trữ trên môi trường Giltay thạch nghiêng a: Các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thải A; b: Các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thải B; c: Các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thải C 40Hình 3.6 Phản ứng của dịch nuôi cấy các dòng vi khuẩn ở mẫu nước thải B với thuốc thử Diphenylamine 46

49

Hình 3.8 Phản ứng của dịch nuôi cấy các dòng vi khuẩn ở mẫu nước thải C với thuốc thử Diphenylamine 49

52

Hình 3.9 Một số hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn 52

Hình 3.10 Hình thái tế bào một số dòng vi khuẩn A1 và A3 được quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40X 54

Hình 3.11 Phổ hấp thụ của dịch tế bào của dòng vi khuẩn A12 và C1 60

Hình 3.13 Đường cong tăng trưởng của 6 dòng vi khuẩn được tuyển chọn 64

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển của 2 dòng vi khuẩn A1 và A3 66

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển của 2 dòng vi khuẩn A1 và A3 67

Hình 3.16 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn A1 68

Hình 3.17 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn A3 69

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn A1 70

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn A3 71

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AOB: Ammonia oxidizing bacteria

Abs: Absorptance

COD:

OD: Optical Density (Mật độ quang)

NOB: Nitrite oxidizing bacteria

NXB: Nhà xuất bản giáo dục

ĐHQGHN: Đại học Quốc gia Hà Nội

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn khử nitrat trong nước thải sau

khi qua hầm biogas của một số trang trại chăn nuôi heo tại huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

- Sinh viên thực hiện: Lê Thị Thu Tâm

-Lớp: DCM1131 Khoa: Khoa học môi trường Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4,5

- Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Ngọc Thảo

2 Mục tiêu đề tài:

Phân lập, tuyển chọn và đánh giá đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng được các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate từ 3 mẫu nước thải sau hầm biogas của 3 trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

+Bước đầu định danh được một số chủng vi khuẩn có khả năng khử nitrate dựa vào phương pháp truyền thống

Nghiên cứu đã phân lập và xác định khả năng khử nitrate của một số loài vi khuẩn hữu ích trong việc xử lý nitơ từ 3 nguồn nước thải sau biogas của 3 trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi

Nghiên cứu đã đi sâu vào tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho các dòng vi khuẩn đã được đánh giá có khả năng khử nitrate

21 dòng vi khuẩn đã được tuyển chọn có khả năng ứng dụng vào việc xử lý nước thải giàu nitơ bằng vi sinh vật

4 Kết quả nghiên cứu:

Đã phân lập và làm thuần được 55 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường chọn lọc Giltay và 21/55 dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate, trong đó,

9 dòng có đặc điểm giống với chi vi khuẩn Paracoccus và 12 dòng có đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa giống với chi vi khuẩn Pseudomonas từ 3 mẫu nước thải sau biogas

của 3 trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh

- Đặc điểm sinh, lý sinh hóa của chi vi khuẩn Paracoccus: là vi khuẩn Gram âm

và không có khả năng di động Cầu khuẩn có thể là hình bầu dục, là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, sinh trưởng mạnh trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí

- Đặc điểm sinh, lý sinh hóa của chi vi khuẩn Pseudomonas: là những trực

khuẩn gram (-), chuyển động do có tiên mao mọc ở một đầu Trực khuẩn có thể là hình que thẳng hoặc hơi cong, không tạo thành bào tử và phát triển ở điều kiện hiếu khí

Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu cho 2 dòng A1 và A3 thì cả 2 dòng đều sinh trưởng trên cả 3 nguồn Carbon và sinh trưởng tốt nhất ở nguồn carbon acid citric Phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 25-45oC; trong đó, khoảng nhiệt độ thích hợp nhất

là từ 30-35oC Sinh trưởng tốt ở dải pH rộng từ pH=6 đến pH=9 và sinh trưởng tốt nhất

ở khoảng giá trị pH từ 7 đến 8

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài

Các dòng vi khuẩn sau khi được tuyển chọn có thể ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học dùng để xử lý nước thải sau biogas của các hộ gia đình có quy mô chăn nuôi vừa và nhỏ Góp phần vào việc cải thiện môi trường tại khu vực huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ

tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên

cứu (nếu có):

Ngày 26 tháng 4 năm 2017

thực hiện đề tài

Lê Thị Thu Tâm

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực

hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

MỞ ĐẦU

I Lý do chọn đề tài

Bên cạnh những lợi ích to lớn về mặt kinh tế mà ngành chăn nuôi mang lại thì vấn đề ô nhiễm nguồn nước do lượng nước thải từ các trang trại chăn nuôi ngày càng nghiêm trọng Các nguồn nước ao, hồ, sông suối…bị ô nhiễm bởi các loại chất thải rắn, lỏng và khí phát sinh từ hoạt động chăn nuôi chưa được xử lý hoặc không được xử lý triệt để [34] Chất thải từ các hệ thống chăn nuôi chứa một lượng đạm dưới dạng nitrate

và ammonium đáng kể từ phân, nước tiểu gia súc và chất thải từ phân các và thức ăn thừa Và các chất này đi vào môi trường sẽ làm ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và một số chất như NO2-, NO3- có thể gây ung thư [17] Từ ngày 22/06/2011 nhà nước đã ban hành quyết định 3178/QĐ-UBND của Ủy ban nhân dân thành phố Hồ Chí Minh về Quyết định phê duyệt Quy hoạch phát triển chăn nuôi gia súc, gia cầm trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh đến năm 2020 và định hướng đến năm 2025 để có thể quản lý

và xử lý được khối lượng lớn chất thải được thải ra hàng ngày từ các trang trại chăn nuôi Do đó các cơ sở chăn nuôi đang giảm dần các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, từng bước hình thành các trang trại chăn nuôi tập trung, theo hướng an toàn sinh học, công nghiệp hóa, hiện đại hóa Tuy nhiên, cho đến nay mô hình này vẫn chưa được triển khai mạnh

ở các vùng nông thôn ở huyện Củ Chi, Hóc Môn…

Ngành chăn nuôi ngày càng phát triển và là đối tượng được nhà nước chú trọng quan tâm đầu tư Song song với trình độ phát triển của ngành là vấn đề ô nhiễm môi trường do việc phát sinh các chất cặn bã từ các trang trại chăn nuôi rất được quan tâm ở

cả hệ thống quản lý doanh nghiệp và nhà nghiên cứu Đến nay, người ta đã kết hợp nhiều biện pháp để xử lý hiệu quả nước thải chăn nuôi như biện pháp cơ học, hóa lý, sinh học [53] Một trong những biện pháp xử lý nước thải chăn nuôi cũng như một số loại nước thải khác đã và đang áp dụng nhiều nhất là biện pháp xử lý sinh học nhờ vi sinh vật, là một trong những biện pháp đang được chú ý đến nhiều nhất do hiệu quả xử

lý cao và ít tốn chi phí, đồng thời thân thiện với môi trường hơn các biện pháp khác [2] Nhưng đối với các trang chăn nuôi nhỏ lẻ hoặc các hộ gia đình ở các vùng nông thôn thì nguồn nước thải vẫn chưa được xử lý hoặc xử lý chưa đạt tiêu chuẩn trước khi thải

ra nguồn thải do điều kiện kinh tế không cho phép Một trong những biện pháp xử lý nước thải đang được áp dụng rộng rãi ở các hộ gia đình và trang trại chăn nuôi heo đó

là hầm biogas, đây một biện pháp khá đơn giản và áp dụng được hầu hết ở các quy mô, đặc biệt nó mang lại hiệu quả kinh tế cao [13] Tuy nhiên hầm biogas vẫn chưa giải quyết triệt để hàm lượng các chất ô nhiễm cao trong nước thải, đặc biệt là amoni, nitrite, nitrate, COD, BOD … là những chất thường ở dạng hòa tan nên rất khó tách ra khỏi nước thải, có khả năng gây ung thư [22], [13]

Mặt khác, trong nước thải chăn nuôi sau hầm biogas có rất nhiều loài vi sinh vật

có khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ dạng hữu cơ và vô cơ [32], các hợp chất nitơ này chủ yếu là các axit amin và NH3 dư không được dùng hết cho việc xây dựng tế bào

sẽ được vi khuẩn Nitrosomonas chuyển thành nitrite (NO2-) và được chuyển hóa thành nitrate (NO3-) nhờ vi khuẩn Nitrozobacter sau đó nhờ các vi khuẩn phản nitrat chuyển

thành nitơ phân tử bay vào không khí [24] Quá trình này xảy ra chủ yếu nhờ các hoạt động của các nhóm vi khuẩn khác nhau, đặc biệt là nhóm vi khuẩn khử nitrat như:

Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus…là những vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc và có

khả năng khử nitrat thành N2 và giúp giảm bớt hàm lượng nitrat có trong nước thải [27]

Do đó việc tận dụng lợi ích từ các vi sinh vật có lợi trong nguồn nước thải để xử lý là một vấn đề đang được các nhà khoa học quan tâm nên đã có rất nhiều nghiên cứu về loài vi khuẩn khử nitrat trong và ngoài nước [33] Nhưng để ứng dụng các chủng vi khuẩn một cách hiệu quả trong việc xử lý nước thải tại địa phương thì việc phân lập, định danh và khảo sát những điều kiện sinh trưởng tốt nhất của chúng trong môi trường nước thải tại địa phương là vấn đề rất thiết thực

Ở nước ta đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng các dòng vi khuẩn có khả năng xử lý các hợp chất hữu cơ và nitơ trong nước thải nhưng chủ yếu là các dòng vi khuẩn nitrat hóa, nhưng trong nước thải các hợp chất chứa nitơ được chuyển hóa nhờ vào sự kết hợp của các dòng vi khuẩn nitrate hóa và khử nitrate Mặt khác, quá trình khử nitrate có khả năng ứng dụng rất cao trong việc loại bỏ các hợp chất chứa nitrogen

có trong nước thải chăn nuôi [48] Các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước

như Nguyễn Văn Cách, Cao Trường Sơn, Seabloom và Buchanan đã xác định được và

ưu tiên cho giải pháp phân lập các nhóm vi sinh vật này từ chính môi trường nước thải bản địa, để khai thác khả năng thích ứng cao, thân thiện với hệ sinh thái cục bộ, có hoạt tính mạnh và ổn định để ứng dụng xử lý ô nhiễm Do đó để ứng dụng một cách hiệu quả các dòng vi khuẩn này trong xử lý nước thải bằng các phương pháp vi sinh thì đề

tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn khử Nitrat trong nước thải sau khi qua biogas

của một số trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh” là

một đề tài rất quan trọng và có ý nghĩa khoa học mang tính chất rất thiết thực

II Tổng quan tình hình nghiên cứu

II.1 Trong nước

Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng nitrate hóa và khử nitrate trong quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học và các nghiên cứu này đã cho thấy được tính đa dạng trong các môi trường nước bị ô nhiễm và hiệu quả xử lý cao của các chủng này trong quá trình

xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học

Trịnh Hoài Vũ (2009) tiến hành phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas

stutzeri trong nước thải chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản ở tỉnh Sóc Trăng đã phân lập

được 54 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường Minimal chuyên dùng cho vi khuẩn khử đạm từ các ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heo ở Sóc Trăng và nhận

diện được 28/54 chủng Pseudomonas stutzeri có khả năng triển tốt trên môi trường

Minimal khi bổ sung hàm lượng của NH4+, NO2-, NO3- [37]

Nguyễn Thị Tuyền và cộng sự (2009) đã tiến hành nghiên cứu sự đa dạng vi khuẩn khử nitrat trong một số môi trường sinh thái ở Việt Nam và các chủng đại diện”

từ các mẫu nước thải ở bùn đáy tại một số dạng thủy vực, bao gồm hồ Ba Mau (Hà Nội), đầm nuôi tôm (Quảng Ninh) và bể xử lý nước thải (Thanh Hóa) Kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng chủng vi khuẩn khử nitrat cao nhất trong thủy vực nước ngọt và thấp nhất trong mẫu nước thải từ bể xử lý nước thải Nghiên cứu đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn khử nitrat từ các môi trường sinh thái khác nhau thể hiện tính đa dạng cao của các dòng vi khuẩn khử nitrate và hai chủng thể hiện khả năng ứng dụng trong việc loại bỏ nitrat cao [31]

Năm 2011, Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Diệp tiến hành phân lập

và nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất thải sữa và ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy sản xuất sữa, thu được 47 dòng vi khuẩn từ 13 mẫu chất thải từ trại nuôi bò sữa, nhà máy sữa Trong đó có 2 dòng vi khuẩn có khả năng oxy hóa ammonium và khử nitrat tốt nhất ở nồng độ 700 mM và ứng dụng 2 dòng này vào xử lý nước thải nhà máy sữa, chúng làm giảm ammonium từ nồng độ ban đầu 20mg/l xuống dưới 5 mg/l, cho thấy được hiệu quả xử lý ammonium và nitrat của các dòng vi khuẩn được phân lập trong nước thải [36]

Năm 2012, Ngô Thị Kim Toán nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật ứng dụng xử lý nước thải giàu nitơ, photpho, đã phân lập được 65 chủng vi sinh vật trên môi trường Winogradsky và 21 chủng vi khuẩn từ các mẫu nước thải ở Thanh Hóa và Hà Nội Sau đó tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học và có khả năng xử lý nitơ và photpho tốt nhất [30]

Cao Ngọc Diệp và Nguyễn Thị Hoàng Nam (2012) đã thực hiện đề tài “Ứng

dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và Acinetobcter lwoffii loại bỏ amoni trong nước

thải từ rác hữu cơ” Nhằm đánh giá khả năng oxy hóa amoni ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện có và không có sục khí trong quy mô phòng thí nghiệm [4]

Đặc trưng của nước thải sinh hoạt là chứa nhiều tạp chất khác nhau, trong đó có khoảng 50% là các chất hữu cơ, 48% là các chất vô cơ và một lượng lớn vi sinh vật, do

đó hàm lượng nitơ trong nước thải rất cao, khi đổ ra sông suối, ao hồ, kênh mương sẽ tác động tiêu cực đến hệ sinh thái trong nước cũng như gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nguồn nước ngầm [23] Mặt khác, Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên có diện tích lớn, có nhiều người dân, sinh viên, nghiên cứu sinh học tập và nghiên cứu sinh sinh sống học tập, do đó các hoạt động sinh hoạt và làm việc trong trường Nông Lâm thường xuyên phát sinh một lượng lớn nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý thải ra môi trường gây ảnh hưởng trực tiếp tới những người đang sinh sống và làm việc tại trường nên Hoàng Văn Trình (2016) tiến hành phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn phản nitrate hóa trong mẫu nước thải tại trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên, kết quả đã phân lập được 4 dòng vi khuẩn dị dưỡng trên môi trường Giltay và tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn có hoạt tính phản nitrate hóa có trong nước thải sinh hoạt tại trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên, từ đó xác định điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của 2 dòng vi khuẩn là: pH khoảng 8, nhiệt độ tối ưu khoảng

35oC Sinh trưởng tối ưu trên nguồn carbon acid citric [35]

Trịnh Hoài Vũ (2014) tiến hành phân lập và xác định khả năng khử đạm của vi

khuẩn Pseudomonas stutzeri trong nước thải ao nuôi cá tra, đã phân lập được 21 dòng

vi khuẩn khử đạm từ nước thải và bùn đáy ao nuôi cá tra ở tỉnh An Giang Kết quả thí nghiệm với môi trường nuôi cấy có bổ sung NH4+, NO2- và NO3- cho thấy dòng vi

khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả năng ứng dụng cao trong việc loại bỏ đạm trong

nước thải ao nuôi cá tra [38]

II.2 Nước ngoài

Nghiên cứu về quá trình chuyển hóa nitơ có một lịch sử lâu đời, bắt đầu từ những năm cuối thế kỷ 18 Vào năm 1882, khi tiến hành nghiên cứu về quá trình khử nitơ, Deherain và Maquenne, Gayon và Dupeptit đã thiết lập nền tảng sinh học cho qua trình này Gayon nhận thấy sự suy giảm của hàm lượng nitrate trong quá trình phân hủy nước thải và ông cũng là người đầu tiên phân lập được vi khuẩn khử nitrate Cho đến nay, có rất nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu, phân lập và định danh các dòng vi khuẩn có khả năng phản nitrate, đưa ra các nhận định về điều kiện ảnh hưởng tới các chủng vi khuẩn phản nitrate

Vào năm 1983, Carlson, C A and J L Ingraham đã tiến hành nghiên cứu so

sánh khả năng khử nitrate của ba loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas

aeruginosa, Paracoccus denitrificans, mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate

tạo ra nitơ, nhưng tốc độ tích lũy số lượng các chất trung gian của chúng khác nhau Sản phẩm sinh ra của quá trình khử nitrate của 3 loài vi khuẩn này có sự khác biệt rõ

rệt: vi khuẩn Pseudomonas stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N2, vi

khuẩn Pseudomonas aeruginosa và Pseudomonas paracoccus sản phẩm khí sinh ra là

khí NO2 Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và Pseudomonas paracoccus khử nitrate làm

giảm nhanh nồng độ NO3-, NO2- và vi khuẩn này có thể tăng trưởng trong môi trường

kị khí khi có sự hiện diện của NO2 trong môi trường [45]

Paracoccus được phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên bởi Beijerinck và

Minkman vào 1910 trên môi trường chứa canh thịt, sau đó tiến hành đánh giá khả năng khử nitrate bằng cách bổ sung các hợp chất chứa ion nitrare Kết quả thu được cho thấy chủng vi khuẩn này phát triển mạnh và làm chuyển hóa NO3- thành NO2- và có khả năng tạo bọt khí N2 trong điều kiện kị khí [42]

Năm 2001, Su và cộng sự đã phân lập các chủng vi khuẩn khử nitrate trong điều kiện thiếu khí từ bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thải chăn nuôi ở Đài Loan và

đánh giá khả năng xử lý nitrate của 2 chủng vi khuẩn NS-2 và SM-3 Sau 20 giờ nuôi cấy ở 30oC, trong điều kiện kị khí có chứa 92% oxy của khí quyển, cả hai chủng này đều làm giảm nồng độ nitrate rất nhanh và thu được một chủng được định danh thuộc

chủng Pseudomonas stutzeri có khả năng khử nitrate trong điều kiện kị khí và hiếu khí

tạo thành N2 hiệu quả nhất mà không có sản phẩm trung gian là nitrite [61]

Năm 2003, Takaya và cộng sự đã phân lập và xác định đặc điểm của các dòng vi khuẩn khử nitrate tạo ra sản phẩm N2O ở nồng độ thấp trong điều kiện hiếu khí, sau đó

đã đánh giá khả năng khử nitrate của hai dòng TR2 và K50 phân lập được thì cả hai dòng này đều có khả năng khử nitrate tạo thành N2 với tốc độ 0,9 và 0,03 μmol/phút ở nồng độ O2 là 39 and 38 µmol/l [62]

Năm 2005, Sarioglu và cộng sự đã nghiên cứu chủng Pseudomonas aeruginosa

trong hệ thống xử lý nước thải có thể làm giảm hàm lượng phospho trong nước thải với hiệu suất khoảng 20% [57]

Năm 2013, Ikeda-Ohtsubo và cộng sự đã nghiên cứu chủng vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri TR2 đã cho thấy chủng này có khả năng sống tốt trong điều kiện

có hàm lượng nitrite cao và giảm sự phát thải của khí N2O ở mức cao [47]

Qua các nghiên cứu trong và ngoài nước về các chủng vi khuẩn có khả năng xử

lý các hợp chất nitơ trong nước thải rất đa dạng và phong phú, chúng tồn tại hầu hết trong tất cả các nguồn đất, nước ô nhiễm các hợp chất nitơ Trong đó, phổ biến nhất là

các chủng vi khuẩn thuộc các chi như Pseudomonas, Paracoccus có không chỉ có khả

năng khử nitrat mà còn cả nitrit tạo thành khí nitơ, giảm được nồng độ của N2O ở mức tối đa trong quá trình khử

Các loài vi khuẩn thuộc chủng Pseudomonas có khả năng làm giảm chỉ số COD

của nước thải bằng cách phân hủy các hợp chất hữu cơ, benzen, naphtalen, pyridin,

thậm chí loại bỏ được kim loại nặng [56] Pseudomonas stutzeri có thể hoạt động

trong cả điều kiện hiếm khí và hiếu khí, chúng có thể phân hủy được các hợp chất khó phân hủy trong tự nhiên đặc biệt là khả năng khử nitrate của chúng rất cao [65]

III Mục tiêu đề tài

- Mục tiêu chung: Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate từ 3 nước thải sau hầm biogas của 3 trang trại chăn nuôi heo tại huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

+ Bước đầu định danh được một số dòng vi khuẩn có khả năng khử nitra dựa vào phương pháp truyền thống

IV Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập và làm thuần các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate từ nước thải chăn nuôi sau biogas của một số trang trại chăn nuôi heo tại huyện Củ Chi, thành phố

Hồ Chí Minh trên môi trường đặc trưng của các loài vi khuẩn có khả năng khử nitrat

- Xác định khả năng khử nitrate của các dòng vi khuẩn đã được phân lập bằng phương pháp thử với thuốc thử dephinylamine

- Định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrat bằng phương pháp sinh hóa

V Phương pháp nghiên cứu

(a) Phương pháp thu thập thông tin:

- Thu thập tài liệu tổng quan về hiện trạng xử lý nước thải chăn nuôi sau khi qua hầm biogas ở thành phố Hồ Chí Minh và những ảnh hưởng đến môi trường và con người

- Thu thập các thông tin và tài liệu về phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn khử nitrate ở các loại nước thải

- Thu thập các thông tin về quy mô chăn nuôi và hiện trạng xử lý nước thải của một số trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

(b) Phương pháp kế thừa: Dựa trên các tài liệu đã thu thập và tổng hợp để chọn

ra chỉ tiêu cần xử lý và phương pháp xử lý nào hiệu quả và phù hợp kinh tế nhất

(c) Phương pháp khảo sát và thu thập: những thông tin thực tế từ các trang trại (d) Phương pháp thu mẫu và phân tích mẫu: tiến hành lấy mẫu tại các trang trại bằng chai thủy tinh đã được khử trùng, sau đó đem về xử lý và phân tích để kiểm tra tính chất nước thải ở các trang trại đó

(e) Phương pháp phân lập và tuyển chọn: tách khuẩn lạc đơn, cấy chuyền các khuẩn lạc đơn

(f) Phương pháp định danh (phương pháp truyền thống): Nhuộm gram và quan sát hình thái, xác định hoạt tính và mật độ tế bào

(g) Phương pháp định tính: Đếm số khuẩn lạc và đo độ hấp thụ để xây dựng đường tương quan tuyến tính và đường cong tăng trưởng của các dòng vi khuẩn

(h) Phương pháp so sánh và đánh giá: dựa trên các kết quả khảo sát và đo đạc…, thực hiện việc so sánh với các kết quả đã được nghiên cứu từ những đề tài đã được thực hiện trước đó

VI Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

VI.1 Đối tượng nghiên cứu của đề tài

Các dòng vi khuẩn có khả khử nitrate có trong 3 mẫu nước thải chăn nuôi sau khi qua biogas của 3 trang trại chăn nuôi heo ở huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

VI.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường Giltay từ 3 mẫu nước thải Đồng thời thực hiện các thí nghiệm sinh lý, sinh hóa để tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrate

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Khoa học Môi trường, trường Đại học Sài Gòn

VII Ý nghĩa của đề tài

VII.1.Ý nghĩa khoa học

-Kết quả của đề tài có thể làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu về ứng dụng kết hợp các chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitơ trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas

-Khảo sát điều kiện tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn khử nitrat

VII.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Ứng dụng các dòng vi khuẩn các khả khử nitrat được phân lập và tuyển chọn vào việc xử lý hàm lượng nitrat cao có trong nước thải đầu ra của các hầm biogas

- Giảm nguy cơ ô nhiễm nước ngầm (ô nhiễm nitrat) ở huyện Củ Chi, thành phố

Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về nước thải chăn nuôi heo sau biogas

1.2.1 Tình hình chăn nuôi heo

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta phát triển rất mạnh, chăn nuôi Việt Nam ngày nay đạt mức tăng trưởng cao không những đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn hướng tới xuất khẩu đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn [12]

Xu hướng chuyển từ chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán theo quy mô hộ gia đình đang dần chuyển sang chăn nuôi tập trung theo hướng sản xuất hàng hóa diễn ra mạnh ở nước ta, nhất là khi Chính phủ ban hành Nghị quyết 03/2000/NQ-CP ngày 02/02/2000 về Phát triển kinh tế trang trại [3] [27]

Việc hình thành và phát triển mạnh các trang trại, các hộ chăn nuôi ở nước ta đã đem lại hiệu quả kinh tế cao, tăng năng suất lao động và thu nhập của người nông dân Tuy nhiên, việc quản lý không hợp lý các loại chất thải rắn, lỏng, khí phát sinh từ các trang trại, các hộ chăn nuôi cũng ảnh hưởng xấu đến chất lượng môi trường xung quanh Đặc biệt, đối với các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ ở các vùng nông thôn thì phần lớn lượng chất thải hàng ngày không được xử lý mà đổ trực tiếp vào hệ thống thoát nước, kênh mương trong vùng làm nhiều hộ dân không có nước sinh hoạt, gây ảnh hưởng nặng tới môi trường nước, đặc biệt là nguồn mặt và nước ngầm [3]

Với sự hỗ trợ của các tổ chức quốc tế, các chương trình quốc gia, chương trình khí sinh học (Biogas) cho ngành chăn nuôi đã và đang được triển khai rộng rãi trên toàn quốc, đây là phương pháp xử lý kỵ khí khá đơn giản, được áp dụng ở hầu hết các cơ sở chăn nuôi quy mô trang trại, kể cả quy mô hộ gia đình Hầm biogas có khả năng tạo ra nguồn năng lượng khí sinh học để thay thế được một phần các nguồn năng lượng khác Trong hầm biogas, các chất hữu cơ được phân hủy một phần, do đó sau biogas nước thải có hàm lượng chất hữu cơ thấp hơn và ít mùi hơn Bùn cặn trong hầm biogas có

thể sử dụng để cải tạo đất nông nghiệp Ở các nước châu Âu và Mỹ, nhất là ở Anh, nước thải và chất thải chăn nuôi được coi là nguồn nguyên liệu khá lớn để sản xuất khí sinh học và thu hồi năng lượng [12]

Theo Cục Chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn), mỗi năm, ngành chăn nuôi gia súc gia cầm thải ra khoảng 75 - 85 triệu tấn chất thải Các chất thải này thường xuyên không được xử lý ổn định, nước thải không qua xử lý xả trực tiếp ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng Hiện cả nước có trên 8,5 triệu hộ chăn nuôi quy

mô gia đình và gần 20 nghìn trang trại chăn nuôi tập trung, nhưng mới chỉ có 8,7% số

hộ xây dựng công trình khí sinh học (hầm biogas) [16]

1.2.2 Tính chất nước thải chăn nuôi sau biogas:

Hiệu quả tích cực về môi trường mà mô hình Biogas mang lại là không thể phủ nhận Tuy nhiên, hầm Biogas không giải quyết được hoàn toàn vấn đề ô nhiễm, nhất là chất lượng nước thải ra sau hầm biogas Tại đây, hàm lượng chất hữu cơ, N, P vẫn ở ngưỡng cao, đòi hỏi thêm quá trình hiếu khí kèm theo để xử lý triệt để các chất hữu cơ [10] [13] [26] Theo như kết quả nghiên cứu của Trần Thị Quỳnh về đánh giá hiện trạng chất lượng nước thải sau biogas tại xã Lê Hồ, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam và nghiên cứu của Trịnh Quang Tuyên về thực trạng ô nhiễm môi trường và xử lý chất thải trong chăn nuôi lợn trang trại tập trung ở tỉnh Hà Nội, Hà Tây, Thái Bình và Ninh Bình cho thấy chỉ tiêu COD của nước thải sau biogas vượt chỉ tiêu nước thải cho phép loại B từ 2,5 đến 3,3 lần, Các chỉ tiêu NO3 -, tổng P, Coliform tại các tỉnh điều tra đều vượt mức cho phép nhiều lần [7] [26]

Nồng độ chất ô nhiễm trong nước thải đầu ra của hầm biogas còn khá cao, một trong các chỉ tiêu cần quan tâm nhất là NO3- Nitrat được xem là một ion tiêu cực, không giữ lại bởi các phản ứng trao đổi nhưng vẫn còn ở dạng dung dịch và được chuyển hóa trong quá trình thấm Nếu chúng không được loại bỏ bởi quá trình đồng

hóa thực vật hoặc khử nitrat, nitrat sẽ đi sâu và thấm vào trong lớp nước ngầm và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người

Mặt khác, nitrat hoặc nitrite oxy hóa Fe(II) trong hemoglobin thành Fe(III) là nguyên nhân khiến hemolobin chuyển thành dạng methemoglobin, ở dạng này hồng cầu không thể liên kết và vận chuyển oxy [13] [27] Tác hại của nitrat đối với sức khỏe con người không phải do bản thân ion nitrat mà do nồng độ nitrat tăng lên nó sẽ chuyển thành nitrite nhờ xúc tác của enzyme vi khuẩn và chính nitrite là nguyên nhân gây độc [27] Quá trình chuyển hóa giữa nitrat và nitrite có thể hình thành N-nitrosamines là một chất gây ung thư phổ biến

1.2 Tổng quan về quá trình khử nitrat nhờ vi sinh vật

1.2.1 Tổng quan chu trình nitrogen trong tự nhiên

Trong môi trường tự nhiên, Nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau, từ nitơ phân tử ở dạng khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động vật, thực vật và con người [40] Các hợp chất này sẽ chuyển hóa nhờ các vi sinh vật tạo thành một chu trình gọi là chu trình nitrogen

Hình 1.1 Chu trình nitrogen trong tự nhiên

Nitơ trong không khí được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật, sau đó được chuyển hóa thành nitơ dưới dạng ammonium, đây là quá trình tiêu tốn nhiều năng lượng [26] Trong tự nhiên chỉ có một số loài vi khuẩn và tảo lam có khả

năng thực hiện phản ứng này nhờ sản sinh ra enzyme nitrogenase Các loài vi khuẩn cố

định nitơ được chia làm hai nhóm (1) các loài sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ của

thực vật (Rhizobium) và (2) các loài sống tự do trong đất, tập trung quanh vùng rễ thực vật (Azobacter) [12]

Sau đó, ammonium được chuyển hóa thành nitrat nhờ hai nhóm vi khuẩn, nhóm

thứ nhất là các vi khuẩn oxy hóa ammonium (AOB), thuộc chi Nitrosomonas và một số

chi như Nitrospira, Nitrosoccus, Nitrosolobus và Nitrosovibrio, là các loài vi khuẩn tự

dưỡng oxy hóa ammonium thành nitrite [32] Nhóm thứ hai là các loài vi khuẩn thuộc

nhóm oxy hóa nitrite, chủ yếu thuộc chi Nitrobacte tiếp tục oxy hóa nitrite thành nitrat

Và quá trình cuối cùng trong chu trình là quá trình khử nitrat thành khí nitơ, diễn ra trong điều kiện không có oxy, trong đó nitrat được vi sinh vật sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng khép kín chuỗi hô hấp trong tế bào [3] [12]

1.2.2 Tổng quan quá trình khử nitrate nhờ vi sinh vật

Trong tự nhiên, vi khuẩn có khả năng khử nitrate sinh trưởng bằng cách khử nitrat tương đối đa dạng, thuộc nhiều nhóm phân loại khác nhau Nguồn điện tử cho nhóm này sử dụng cũng rất phong phú, bao gồm các acid hữu cơ, cacbuahydro mạch thẳng hay mạch vòng, kể cả một số chất khó phân hủy [12]

Quá trình chuyển hóa nitrat nhờ vi sinh vật được thực hiện theo hai cơ chế: đồng hóa và dị hóa [16]

+ Đồng hóa nitrate: Nitrate được hấp thu và được chuyển đổi thành nitrite và sau thành ammonium bởi cây trồng và các vi sinh vật [8]

+ Dị hóa nitrat (sự khử nitrat-denitrification): Đây là sự hô hấp hiếm khí trong

đó NO3- hay NO2- được biến đổi thành nitrite oxide (NO), nitrous oxide (N2O) và cuối cùng thành khí nitrogen (N2) Sự phóng thích N2 chiếm ưu thế ở đầu ra của sự khử nitrat [54]

Khử nitrat diễn ra qua một số bước trung gian, mỗi bước do một loại enzyme làm chất xúc tác: NO3-  NO2-  NO  N2O  N2 [3] [4] Nhóm vi khuẩn thực hiện quá trình khử nitrat rất phong phú, đa số là vi khuẩn dị dưỡng, có tên chung là

Denitrifier như: Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas, Paracoccus,… [26] [43] Các

nghiên cứu về đa dạng và sinh thái cho thấy phổ biến nhất trong các môi trường đất,

nước và nước thải là các loài thuộc chi Pseudomonas (P fluorescens, P aeruginosa

P.denitrificans) và Acaligenes

Quá trình khử nitrat thường được nhận dạng là khử nitrat yếm khí, tuy nhiên diễn biến quá trình sinh hóa không phải là quá trình lên men yếm khí mà nó giống quá trình hô hấp hiếu khí nhưng thay vì sử dụng oxy, vi sinh vật sử dụng nitrat, nitrite khi môi trường không có oxy cho chúng Vì vậy, quá trình khử nitrat xảy ra chỉ trong điều kiện thiếu khí oxy (anoxic) Sự khác biệt giữa quá trình hiếu khí và thiếu khí là loại enzyme tham gia vào giai đoạn vận chuyển điện tử cho hợp chất nitơ ở bước cuối cùng

trong cả chuỗi phản ứng (reductase enzyme) [50]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ khử nitrat

(a) Nhiệt độ

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình khử nitrat tương tự như đối với quá trình

xử lý hiếu khí của vi sinh vật tự dưỡng: tốc độ tăng gấp đôi khi tăng thêm 10oC trong khoảng nhiệt độ 5 - 25oC Quá trình khử nitrat cũng có thể xảy ra trong vùng nhiệt độ

50 - 60oC Trong điều kiện nhiệt độ cao, tốc độ khử nitrat cao hơn khoảng 50% so với tại 35oC [2]

(b) pH

Khoảng pH tối ưu cho quá trình khử nitrat nằm trong một khoảng khá rộng: từ 7

- 9, ngoài vùng tối ưu tốc độ khử nitrat giảm nhanh

Tại pH >10 và pH < 6 tốc độ khử nitrat chỉ còn lại vài phần trăm so với vùng tối

ưu Vi sinh vật Denitrifier có khả năng thích nghi với môi trường pH với nhịp độ chậm

NO 2

Nitric oxide

reductas

Nitrate reductase

Nitrite reductase

Nitrous oxide reductase

Nếu pH thấp có khả năng xuất hiện các khí có độc tính cao đối với vi sinh vật từ quá trình khử nitrat như N2O, NO Chúng có khả năng đầu độc vi sinh vật với nồng độ thấp [2]

(c) Lượng oxy hòa tan

Quá trình khử nitrat xảy ra khi NO3- được vi sinh vật sử dụng làm chất điện tử cuối cùng trong phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ thu năng lượng trong điều kiện

không có oxy Oxy có khả năng làm ức chế enzym khử nitrite (nitrit redutase) và vì

vậy làm giảm tốc độ khử nitrite Oxy cũng là tác nhân ức chế enzym khử nitrat với mức độ mạnh hơn so với enzym khử nitrite [2] Nếu môi trường có oxy, vi khuẩn sẽ ưu tiên sử dụng oxy làm chất nhận điện tử khi đó quá trình khử nitrat bị cản trở

1.2.4 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn có khả năng khử nitrat

Vi khuẩn có khả năng khử nitrat phân bố rộng rãi trong đất, trong phân chuồng, trong nước, nhất là ở những nơi có độ ẩm cao và có nhiều chất hữu cơ chưa phân giải

Vi khuẩn khử nitrat là những vi khuẩn dị dưỡng có khả năng khử nitrat thành nitrite, thành NH3 hoặc thậm chí thành N2 bay vào khí quyển Đây là nhóm vi khuẩn làm hao hụt đạm trong đất, trong phân bón và trong nước, gây nên nhiều ảnh hưởng xấu đối với nông nghiệp và thủy sản Vi khuẩn phản nitrat hóa bao gồm nhiều loài trong các giống

Pseudomonas, Bacterium, Micrococcus (ví dụ Bact Denitrificans, Ps Pyocyanea,…)

Một số vi khuẩn lưu huỳnh cũng có khả năng thực hiện quá trình khử nitrate (ví dụ vi

khuẩn Thiobacterium denitrificans, Sulomonas denitrificans,…) [7]

- Đặc điểm của vi khuẩn Pseudomonas

Giống Pseudomonas là những trực khuẩn gram âm , chuyển động do có tiên

mao mọc ở một đầu Trực khuẩn có thể là hình que thẳng hoặc hơi cong, không tạo thành bào tử và phát triển ở điều kiện hiếu khí Nhiều loài của giống này ưa lạnh, nhiệt

độ tối thiểu là -2 đến 50

C, thích hợp nhất từ 20 - 250C Tất cả Pseudomonas đều có hoạt

tính amilaza và proteaza, đồng thời lên men được được nhiều loại đường và tạo màng

nhầy pH môi trường dưới 5,5 sẽ kìm hãm vi khuẩn Pseudomonas phát triển và kìm

hãm sinh tổng hợp proteaza Nồng độ muối trong nước tới 5 - 6% thì sinh trưởng của vi khuẩn này bị ngừng trệ [24] [51]

- Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên (ở đất, nước và trên

các loại thực vật, như cỏ khô, khoai tay, rau quả,…), là vi khuẩn gram dương Hay gặp

nhất là Bacillus subtilis (trực khuẩn khoai tây) và trực khuẩn cỏ khô (Bacillus

mesentericus)

Chúng có hình que, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc thành sợi Đặc điểm của giống này là sinh bào tử, sống hiếu khí (hoặc kị khí tùy tiện), thường sinh

enzim proteaza và amilaza (chủ yếu là α - amilaza) Hai loài Bacillus này có nhiệt độ

sinh trưởng thích hợp là 35 - 450C (thường nuôi cấy ở 370

C), tối đa tới 600C Phát triển tốt nhất ở môi trường có pH 4,5-7, pH dưới 4,5 chúng ngừng phát triển [24]

- Đặc điểm của vi khuẩn Paracoccus

Vi khuẩn Paracoccus là cầu là vi khuẩn gram âm và không có khả năng di động,

được phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên bởi Beijerinck và Minkman vào năm1910, chúng được phân lập trong điều kiện kị khí [51] Là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, sinh trưởng mạnh trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, chúng có thể sử dụng oxy tự do

và nitrate làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp Vi khuẩn

Paracoccus có thể sinh trưởng trên dải nhiệt độ rộng, từ khoảng 5-40oC, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 25-37oC, pH tối ưu nằm trong khoảng pH từ 6,5-8,5 [41] [51] [60]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian thực hiện đề tài từ từ tháng 9/2016 đến tháng 4/2017

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm của khoa Khoa học môi trường, trường Đại học Sài Gòn

2.2.2 Dụng cụ thiết bị

Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy thẳng, que cấy vòng, que gạt thủy tinh,

bình tam giác, lam, lamen, bọc nylon và chai đựng mẫu nước thải và một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm

Thiết bị: Kính hiển vi, Cân phân tích 4 số Denver, Máy đo pH, Tủ cấy vi sinh

vật Esco AHC-4D1, Tủ ẩm memmert INB 500, Tủ lạnh giữ mẫu, Nồi hấp tiệt trùng Tomy ES-31501, Lò vi sóng Panasonic

(C4H8N2O3) Trung Quốc Pepton Trung Quốc

Cách pha môi trường:

- Chuẩn bị các dụng cụ pha môi trường đã được hấp khử trùng

- Cân chính xác khối lượng các thành phần của môi trường

- Hòa tan 0,25l dung dịch A và 0,25l dung dịch B Sau đó, điều chỉnh pH của môi trường bằng 7 bằng NaOH 10% (đo pH bằng máy đo pH và quỳ tím làm chất chỉ thị)

- Cho 2% agar (20g) vào 400ml nước cất, cho vào lò vi sóng khuấy đều cho đến khi agar sôi và tan hoàn toàn

- Trộn dung dịch agar vừa được hòa tan với hổn hợp dung dịch trên, thêm nước cất đến 1 lít khuấy đều ta được dung dịch môi trường Giltay Sử dụng phễu thủy tinh rót vào chai thủy tinh (hoặc bình tam giác), đậy nút, đem chưng cách thủy môi trường

để đuổi hết oxy có trong môi trường trong 30 phút [14]

Làm thạch đĩa (đối với môi trường phân lập):

Phân phối nhanh môi trường thạch vào đĩa (đã được hấp khử trùng ở 121oC /1atm/20 phút) trong tủ cấy vô trùng

Nắp đĩa petri chỉ được mở một phần khi cho môi trường vào đĩa, đậy nắp lại, xoay đĩa theo đường tròn cho môi trường phân bố đều

Đợi cho môi trường nguội và đông lại, nếu chưa dùng thì tiến hành bảo quản trong tủ lạnh (khoảng 4oC) cho đến lúc dùng [18]

Làm thạch nghiêng (đối với môi trường giữ giống):

Phân phối môi trường có chứa thạch vào 1/3 ống nghiệm có nút bông hay nắp đậy, đem chưng cách thủy môi trường để đuổi hết oxy có trong môi trường trong 30 phút

Sau đó, các ống môi trường được lấy ra để nghiêng trên một vật có độ cao vừa phải để tạo độ nghiêng sao cho chiều dài của môi trường không quá 2/3 chiều cao ống nghiệm [14] [18]

Làm thạch đứng: phân phối môi trường như đối với thạch nghiêng nhưng làm

nguội ống nghiệm ở tư thế đứng Cho môi trường thạch vào khoảng ¾ thể tích ống

nghiệm [18]

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp thu mẫu [28] [29]

Chuẩn bị dụng cụ lấy và chứa mẫu: chai thủy tinh vô trùng (được hấp khử trùng

ở 121oC trong 20 phút) có thể tích 250 ml, bình cồn để khử trùng sau khi lấy mẫu, thùng chứa mẫu (có đá để bao quản mẫu mang mẫu về phòng thí nghiệm)

Điểm lấy mẫu nước thải phải đại diện cho chất lượng nước tại địa điểm nên ta sẽ lấy mẫu tại vòi nước chính từ bể biogas ra nguồn xả Mẫu nước thải được lấy bằng chai nhựa đã được khử trùng bằng dung dịch cồn 70oC, sau đó đổ vào chai thủy tinh đã