Nghiên cứu nhân giống cây hương thảo (rosmarinus officinalis l ) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng đến hiệu quả phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi Hương thảo trong ống nghiệm .... Kết quả nghiên cứu ảnh h

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO

(Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên, tháng 12 - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO

(Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, tháng 12 - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng

dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của chị Trần Thị Hồng - Kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Trong thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ tại Trung tâm Thực nghiệm thực hành và chuyển giao khoa học công nghệ - Đại học Tân Trào, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Trung tâm, các kỹ thuật viên tại phòng Nuôi cấy mô đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện các thí nghiệm của luận văn thạc sĩ

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy

cô giáo, cán bộ khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khoa học

Tác giả

Phạm Thùy Dung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cây Hương thảo 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo 4

1.1.2 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo 4

1.1.3 Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo 7

1.1.4 Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam 7

1.2 Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro 8

1.2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.2.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.3 Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào 10

1.3 Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu và cây Hương thảo 11

1.3.1 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước 12

1.3.2 Nghiên cứ u nhân giống in vitro cây Hương thảo bằng phương pháp

nuôi cấy mô thực vật 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 15

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 15

2.1.3 Đi ̣a điểm và thời gian nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp khử trùng mẫu 16

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro 16

2.2.3 Đưa cây ra môi trường tự nhiên 19

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 20

2.2.5 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu 21

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Kết quả khử trùng hạt tạo mẫu sạch 22

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng đến hiệu quả phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi Hương thảo trong ống nghiệm 24

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên cây Hương thảo 24

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo 27

3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo 29

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương thảo in vitro 32

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh

trưởng của cây con in vitro ngoài vườn ươm 34

3.5 Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo 36

3.5.1 Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân mang mắt chồi bên 38

3.5.2 Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ nách lá mầm 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

1 Kết luận 40

2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT

BA: 6-Benzyladenine BAP: 6-Benzylaminopurine Cs: Cộng sự

CT: Công thức

DNA: Deoxyribonucleic acid

ĐC: Đối chứng IAA: Indole-3-acetic acid IBA: Indole-3-butyric acid Kinetin: 6-furfurylaminopurine MS: Murashige và Skoog, 1962 NAA: Naphthalene acetic acid 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid PLBs: Protocorm like bodies (thể tiền củ) SH: Schenk và Hildebrandt, 1972

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo sau 20 ngày 22 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên của cây Hương thảo 25 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo 30 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương thảo sau 4 tuần 32 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây

con in vitro ngoài vườn ươm sau 60 ngày 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Hương thảo ngoài tự nhiên 5

Hình 2.1 Hạt Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) có nguồn gốc từ Nga 15

Hình 3.1 Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo trong 5 giờ 23Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng nảy mầm hạt Hương thảo 24Hình 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần 26Hình 3.4 Ảnh hưởng của BAP 1,5 mg/l đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo 29Hình 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần 31Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương thảo 33

Hình 3.7 Cây Hương thảo in vitro trồng trong các giá thể khác nhau sau 60 ngày36 Hình 3.8: Sơ đồ Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân và từ

nách lá mầm 37

Hình 3.9 Hình ảnh quy trình nhân giống in vitro cây Hương Thảo 39

từ đoạn thân mang mắt chồi bên 39

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây Hương thảo có tên khoa học là Rosmarinus officinalis L., là một

loài thực vật có hoa thuộc họ Hoa môi Hương thảo là cây bản địa vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi Tại Việt Nam cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền Trung và miền Nam [26] Hương thảo được sử dụng để làm gia vị, đuổi muỗi, trị liệu bằng xoa bóp, sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm Các hợp chất trong cây Hương thảo được bổ sung vào kem dưỡng da, xà phòng thơm…[25]

Hương thảo tỏa mùi hương nồng ngào ngạt, lá tươi hay lá khô đều thơm Lá và ngọn cây Hương thảo được sử dụng là chủ yếu Lá tươi hay lá khô đều được dùng làm gia vị trong ẩm thực và chiết xuất tinh dầu, ứng dụng trong y tế, mỹ phẩm Hương thảo có vị chát, nóng, mùi thơm nồng, giúp loại

bỏ căng thẳng, tăng cường trí nhớ, giúp tinh thần sảng khoái [26] Tinh dầu Hương thảo hỗ trợ việc tuần hoàn máu, giúp máu lưu thông tốt hơn, giúp cải thiện trí nhớ, giúp tinh thần thư giãn, giảm stress Mặc dù tinh dầu Hương thảo có nhiều công dụng tốt, nhưng hiện nay nước ta chưa cung cấp đủ nguyên liệu nên phải nhập hoàn toàn từ nước ngoài [25]

Các thành phần quan trọng nhất của Hương thảo là axit caffeic và các dẫn xuất như axit rosmarinic và axit carnosic Những hợp chất này có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn, làm trẻ hóa làn da bằng cách cải thiện lưu thông máu, chống viêm và kích ứng da và rất hữu ích trong điều trị mụn trứng

cá, viêm da, eczema và các bệnh ngoài da khác…[23],[25]

Hiện nay, cây Hương thảo đã được nhập trồng ở Việt Nam, cây sinh trưởng phát triển tốt, thích hợp được với điều kiện khí hậu nhiệt đới, cây thường được nhân giống bằng cách gieo hạt hoặc giâm cành [25] Tuy nhiên

trồng bằng hạt tỉ lệ nảy mầm thấp, hạt giống phải nhập khẩu nên giá thành cao Nhân giống bằng giâm cành cho hệ số nhân thấp, tỉ lệ thành công cũng không cao

Xuất phát từ giá trị to lớn của cây Hương thảo và thực trạng nhu cầu về giống cây Hương thảo ở nước ta, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm tạo ra được một số lượng lớn giống cây sạch bệnh, đáp ứng nhu cầu phát triển sản xuất ở nước ta là hết sức cần thiết, do vậy chúng tôi xây

dựng đề tài luâ ̣n văn tha ̣c sĩ là: “Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo

(Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pha ́ p nuôi cấy mô thực vật”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng đươ ̣c quy trình tái sinh in vitro cây Hương thảo bằng kĩ thuật

nuôi cấy mô tế bào thực vật

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu điều kiê ̣n khử trùng hạt để ta ̣o mẫu sạch trong ống nghiệm;

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và sự kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ

nách lá mầm;

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro;

3.4 Nghiên cứu giá thể thích hơ ̣p đưa cây ra môi trường tự nhiên

3.5 Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, đánh giá được tác động của các giá thể đến sinh trưởng của cây con trong giai đoạn vườn ươm, là

cơ sở bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây dược liệu khác

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra được các cây con có chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh không phụ thuộc vào mùa vụ, là cơ sở cung cấp nguồn cây giống theo nhu cầu thực tiễn

Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo có thể sử dụng cho các

phòng thí nghiệm công nghệ tế bào để nhân giống phục vụ phát triển Hương thảo đáp ứng nhu cầu thực tiễn

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây Hương thảo

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo

Cây Hương thảo còn có tên gọi khác là cây Mê điệt, tên tiếng Anh là Rosemary Cây Hương thảo thuộc chi Rosmarinus, họ Hoa môi (Lamiaceae),

bộ Hoa môi (Lamiales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), ngành Hạt kín (Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae) [26]

Hương thảo da ̣ng cây bụi nhỏ, thẳng cứng, cao từ 80 đến 150 cm, lá và hoa có mùi thơm Thân cây thẳng đứng có nhiều nhánh dài Hương thảo có lá đơn, mọc đối, lá dày, có mép gập xuống, không cuống, mặt trên lá có màu xanh đậm và bóng, mặt dưới lá có màu trắng và có lông tơ Những bông hoa mọc ra từ nách lá Hoa hình môi, có màu xanh dương dài dưới 1 cm, đài hoa hình chuông, có lông mịn, tràng hoa 2 môi, môi dưới chẻ sâu như môi của một số hoa lan Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 5 Quả Hương thảo giống như hầu hết quả thuộc họ Lamiaceae, quả là một chùm gồm 4 quả khô hợp lại, màu nâu Toàn cây có mùi rất thơm Bộ phận sử dụng được là ngọn cây có hoa và lá [26]

1.1.2 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo

Cây Hương thảo có chứa một số hoạt chất sinh học bao gồm chất chống oxy hóa như axit carnosic và axit rosmarinic Các hợp chất hoạt tính sinh học khác bao gồm long não (lên đến 20% trong lá Hương thảo khô), axit caffeic, axit ursolic, axit betulinic, rosmaridiphenol, và rosmanol [25],[26],[23]

Axit rosmarinic là este của axit caffeic và axit dihydroxyphenyllactic và được xác định rộng rãi trong các loài thực vật khác nhau Axit rosmarinic là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng

3,4-kháng khuẩn, chống viêm, 3,4-kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer Trong công nghiệp thực phẩm, axit rosmarinic

là thành phần có vai trò ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là chất bảo quản tự nhiên, chất chống oxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quản hải sản tươi sống, một số sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều món ăn [12], [23] Hoạt động chống oxy hóa của axit rosmarinic mạnh hơn so với vitamin E

Hình 1.1 Cây Hương thảo ngoài tự nhiên

Axit carnosic là một chất chống oxy hóa tự nhiên, được sử dụng rộng rãi thực phẩm, y sinh học ngành công nghiệp, ngành công nghiệp mỹ phẩm

Là một phụ gia thực phẩm, chất tạo màu tự nhiên tạo ra màu xanh lá cây

Lipton S A và Cs thuộc Viện Nghiên cứu Y học Sanford-Burnham cho rằng axit carnosic - một thành phần có trong cây Hương thảo - axit

carnosic có thể có những ứng dụng lâm sàng cho bệnh ảnh hưởng đến võng mạc, bao gồm thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi, các bệnh về mắt Axit carnosic bảo vệ võng mạc khỏi thoái hóa và tổn thương ánh sáng gây ra trong nuôi cấy tế bào và trong các mô hình động vật gặm nhấm Trong vài năm, nhóm của Lipton đã phát hiện axit carnosic chống tổn thương các gốc tự do trong não Lipton và các đồng nghiệp đã thử nghiệm axit carnosic trong một

mô hình động vật bị tổn thương thụ thể cảm nhận ánh sáng - là phần mắt chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện tử, cho phép nhìn mọi vật Nghiên cứu cho thấy rằng loài gặm nhấm được điều trị trước bằng axit carnosic đã lưu giữ lớp võng mạc của mắt dày hơn, chứng tỏ các thụ thể cảm nhận ánh sáng đã được bảo vệ [28]

Axit ursolic là triterpenoid pentacyclic, có trong các loại trái cây và rau quả khác nhau Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng axit ursolic có tác động chống ung thư, tác dụng chống viêm, và cảm ứng apoptosis trong một số

tế bào ung thư ở người Đặc biệt, axit ursolic ức chế sự phát triển ung thư vú bằng cách gây di động G1/G2 bắt giữ và điều chỉnh sự biểu hiện của protein quan trọng trong con đường truyền tín hiệu [20]

Hương thảo có thể sử dụng theo các bài thuốc dân gian ở nước ta [29]

Bài thuốc số 1: Dùng 200g lá Hương thảo khô ngâm với 1 lít rượu trắng trên 40 độ, bảo quản trong chai thủy tinh đã được khử trùng, cất nơi khô ráo tránh ánh nắng Ngày uống 2 lần, mỗi lần 2ml rượu thuốc pha với nước sôi để nguội, giúp tăng cường sức khỏe, chữa căng thẳng thần kinh, tiêu hóa kém

Bài thuốc số 2: Dùng 2-3 lá Hương thảo khô hãm trong một tách nước sôi làm một liều Ngày uống 4-5 liều Hoặc dùng 20g lá khô (30g lá tươi) hãm với 500ml nước sôi, chia 4-5 lần để uống trong ngày Xoa nhẹ nước hãm thuốc này lên da đầu để tăng cường sự mọc tóc, hoặc dùng để rửa các vết

thương nhiễm trùng và lâu khô, rửa mắt 3-4 ngày lần trong ngày khi bị viêm giác mạc nhẹ

Bài thuốc số 3: Tinh dầu Hương thảo pha vào nước tắm 3-4 giọt giúp tinh thần sảng khoái, thư giãn cơ thể, giảm stress

1.1.3 Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo

Cây Hương thảo phát triển tốt nhất ở Địa Trung Hải hay ở những nơi

có khí hậu tương tự Hương thảo chịu hạn tốt, thích hợp với đất mùn bở ẩm, không thích hợp với đất sét Cây Hương thảo cũng cần thoát nước tốt, nên trồng ở môi trường không có sương giá có ánh nắng mặt trời chiếu 6-8 giờ để cây phát triển tốt Nếu trồng bằng hạt nên trồng vào mùa xuân Các hạt giống

sẽ bắt đầu nảy mầm khoảng 14-21 ngày sau khi trồng Đối với nhân giống bằng giâm hom, chọn những nhánh khỏe mạnh trên cây mẹ, cắt mỗi hom dài 5-10cm, tỉa lá sát gốc Có một số loài sâu bệnh có thể ảnh hưởng đến cây Hương thảo Nó là rất dễ bị bệnh phấn trắng Cây dễ mắc bệnh khi được trồng

ở trong môi trường có không khí ẩm Nhện, ruồi trắng và một số loài côn trùng có thể sử dụng Hương thảo làm thức ăn [27]

1.1.4 Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam

Hương thảo mới được du nhập về Việt Nam thời gian ngắn nhưng đã nhận được sự quan tâm của nhiều người Đặc biệt là những người yêu thiên nhiên, thích khám phá Do cây Hương thảo có mùi thơm nên những người ngửi qua mùi hương của nó khó có thể quên được, chỉ cần chạm nhẹ tay vào cây là có thể cảm nhận được mùi hương này Cây được ưu chuộng và tìm mua rất nhiều, người ta mua về làm cảnh, trang trí trong nhà, giúp xua đuổi muỗi Gần đây, Hương thảo còn trở thành một gia vị mới mẻ đối với người nội trợ

Nó không hề bị mất đi hương thơm trong khi nấu nướng Trong nấu ăn, lá Hương thảo thường được sử dụng tươi, nhưng cũng có thể được sấy khô, nó

có vị đắng nhẹ rất quyến rũ, mùi của Hương thảo có thế át mùi tanh của thịt

cá, tạo thêm vị đặc biệt khi làm các món nướng như pizza, gà nướng, tôm nướng Hương thảo chứa nhiều canxi, sắt ,vitamin A và C [23]

1.2 Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro 1.2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [9]

Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Trong tế bào chứa hệ gen, gồm tất cả các gen mã hóa cho các protein liên quan đến các đặc tính, tính trạng và chức năng sinh học của thực vật Hiện nay, người ta đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [5]

Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9] tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào hợp tử Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử sẽ phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh sau đó sẽ biến đổi thành các tế bào chuyên hóa

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau Mặc dù các tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng riêng nhưng chúng vẫn không mất đi khả năng biến đổi của mình Trong điều kiện thích hợp, các tế bào này lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào

phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào

1.2.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho

sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9], nuôi cấy in vitro là nuôi cấy

trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng

có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn Vô trùng ban đầu

là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn 70º, clorox,…để khử trùng Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cây [5]

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng

và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây

là 12 – 18 giờ/ngày Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [5]

Theo Dương Tấn Nhựt (2011) ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy Quá trình tạo rễ chỉ cần cường độ ánh sáng thấp, cường độ ánh sáng cao quá ngăn cản quá trình tạo rễ Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự ra rễ, ánh sáng đỏ cam thích hợp cho

sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời [2] Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người

ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang [7]

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhiệt độ của buồng nuôi cây cần đảm bảo nhiệt độ ổn định trong khoảng 25ºC [7]

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS (Murashige & Skoog, 1962), là môi trường thích hợp cho cả thực vật một lá mầm, hai lá mầm Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [3]: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn cacbon, các vitamin và aminoaxit, chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường, các chất điều hòa sinh trưởng

1.2.3 Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào

Theo Ngô Xuân Bình và Cs [7], nuôi cấy mô tế bào thực vật được thực hiện theo 5 giai đoạn sau: (1) Giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo được nguyên liệu thực vật sạch để đưa vào nuôi cấy (2) Tái sinh mẫu nuôi cấy được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy (3) Giai đoạn nhân nhanh chồi thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin …), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm

mem…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các

chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính (4) Tạo cây

hoàn chỉnh, khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra rễ Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA và 2,4D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo

rễ cho chồi (5) Đưa cây ra đất là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó

quyết định khả năng ứng dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực

tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất

1.3 Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu và cây Hương thảo

1.3.1 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy

mô tế bào thực vật ở trong nước

Trong những năm gần đây công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ở

nước ta dần phát triển và được áp dụng thành công trên nhiều loại cây trồng khác nhau như dứa, cà phê, các cây thuốc quý, các loài lan, cây cảnh, cây ăn quả Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào bảo tồn nguồn gen cây dược liệu đã được nhiều tác giả quan tâm có thể kể đến như: Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh và Cs đã tiến hành nghiên cứu nhân giống thành công cây Lô hội bằng phương pháp nuôi

cấy in vitro Nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng môi trường MS bổ sung

2,5mg/l BAP là môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi, môi trường MS bổ sung than hoạt tính 1,5 - 2,0 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất Giá thể ra cây

Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển

tốt [10]

Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Ba kích, tác giả Võ Châu Tuấn và

Cs (2010) đã cho thấy môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro cây

Ba kích là môi trường MS có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar, 3,5 mg/l BA

và 0,2 mg/l IBA, môi trường thích hợp cho tạo rễ in vitro là môi trường MS

có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar , IBA từ 0,2 - 0,25 mg/l Cây in vitro có

khả năng sống sót cao và sinh trưởng tốt trên cơ chất đất cát pha [16]

Tác giả Hoàng Thị Kim Hồng (2011) đã đưa ra môi trường MS có bổ

sung BAP 4mg/l và NAA 0,1 mg/l kích thích đoạn thân của chồi in vitro cây

Hà thủ ô đỏ tái sinh cụm chồi tốt nhất và môi trường MS có bổ sung NAA 0,5

mg/l là môi trường có khả năng tạo rễ tốt nhất cho chồi in vitro [3]

Nhóm nghiên cứu của Mai Trường (2014) đã tiến hành tạo và nhân phôi soma sâm Ngọc linh trong môi trường lỏng và thu được kết quả: từ mô

sẹo lá cây in vitro đã tạo và nuôi nhân huyền phù phôi soma dạng cầu trong

môi trường B5 có bổ sung IBA 3 mg/l, để tạo mô sẹo sinh phôi và phôi thứ cấp đem nuôi cấy mảnh lá mầm và phôi soma con trên môi trường SH bổ sung 10% nước dừa, có hoặc không có IBA 0,2 mg/l [5]

Trần Thị Hồng Thúy và Cs (2015) đã đề xuất môi trường thích hợp nhất để cảm ứng tạo PLBs của lan Kim tuyến là môi trường Knudson + Kinetin 0,5 mg/l + saccarose 10 g/l + nước dừa 10% Môi trường tái sinh chồi

từ PLBs là môi trường Knudson + nước dừa 10% + dịch chiết khoai tây 10% + saccarose 30 g/l + BAP 0,5 mg/l + GA3 0,3 mg/l + Kinetin 0,3 mg/l + NAA 0,1 mg/l + geltrite 2,7 g/l Môi trường sinh trưởng và tạo rễ cho chồi tốt nhất là môi trường Knudson + nước dừa 10% + dịch chiết khoai tây 10% +

saccarose 30 g/l + geltrite 2,7 g/l Giá thể xơ dừa phù hợp cho giai đoạn thích ứng cây trong vườn ươm [13]

Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro cây Xáo tam phân tác giả Trương Thị

Bích Phượng và Cs (2015) cho thấy môi trường tốt nhất cho tạo chồi Xáo tam phân là môi trường MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l Môi trường MS có bổ sung TDZ 0,1 mg/l mẫu vật nuôi cấy tạo chồi cùng với tạo callus [15]

Bùi Đình Lãm và Cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu khả năng nhân

giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro cho thấy môi trường MS bổ

sung kinetin 0,4mg/l và BA 0,5mg/l cho hệ số nhân nhanh chồi cao, chồi nhỏ, xanh đậm Ở giai đoạn ra rễ môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỷ

lệ ra rễ của cây Giảo cổ lam đạt 100% [1]

Nhóm nghiên cứu của Trương Thị Bích Phượng (2015) tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Đảng sâm thu được kết quả: môi trường thích hợp để tạo callus là môi trường MS kết hợp 0,2 mg/l TDZ và 2,0 mg/l 2,4D Môi trường tái sinh chồi tối ưu là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l kinetin kết hợp với 0,2 mg/l

NAA Môi trường thích hợp cho nhân chồi từ đoạn thân mang chồi nách in vitro

là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin kết hợp 0,2 mg/l NAA Môi trường tối ưu để ra rễ là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA [14]

Tác giả Ong Xuân Phong (2016) nghiên cứu trên đối tượng cây Xạ đen thấy rằng môi trường thích hợp nhất cho nhân chồi Xạ đen là môi trường MS có bổ sung BAP 0,6 mg/l hệ số nhân chồi đạt 3,84 lần sau 4 tuần Môi trường thích hợp để cảm ứng ra rễ là môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l

α- NAA Giá thể thích hợp để tiếp nhận cây in vitro là giá thể 50% tro trấu

và 50 % xơ dừa [11]

1.3.2 Nghiên cư ́ u nhân giống cây Hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy

mô thực vật

Năm 2012, Yumei và Cs đã nghiên cứu cảm ứng mô sẹo và tái sinh chồi từ lá Hương thảo trong môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, và 50 g/l đường cho kết quả tốt nhất, với tỉ lệ cảm ứng là 88,8% Khi mô sẹo phát triển tái sinh thành chồi, môi trường MS có chứa 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l kinetin và 0,5 mg/l NAA cho kết quả tương đối tốt với 50% tỷ

lệ tái sinh và cho số lượng chồi tốt nhất Môi trường MS có 0,1 mg/l NAA cho thấy kết quả tốt trong việc tạo rễ với tỷ lệ ra rễ đạt 65% Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy, vô trùng các mẫu cấy bằng dung dịch chứa 75% ethanol

có thể dẫn đến sự chết hàng loạt mẫu cấy [21] Theo Yesil-Celiktas và Cs 2007), khi nghiên cứu nuôi cấy chồi non trong môi trường MS có bổ sung 7 g/l agar, 30g/l đường, 1 và 3 mg/l NAA để tạo mô sẹo Môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA được chứng minh là môi trường tốt nhất cho việc tạo ra các

mô sẹo (65,0%) [19]

Cây Hương thảo là một loài cây mới được nhập khẩu vào nước ta, nên hiện nay các tài liệu nghiên cứu còn rất hạn chế Việc nghiên cứu phát triển cây Hương thảo và các loại cây dược liệu đáp ứng nhu cầu thực tiễn là việc rất cần thiết Tuy nhiên hạt giống nhập từ nước ngoài về có khả năng nảy mầm kém ở điều kiện Việt Nam, do vậy nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo – một loài cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đáp

ứng nguồn cây giống cung cấp cho thực tiễn phát triển loại cây dược liệu này

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng hạt giống cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) mua tại

cửa hàng phân phối hạt giống, xuất xứ hạt giống tại Nga Hạt Hương thảo có kích thước nhỏ, có màu đen

Hình 2.1 Hạt Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) có nguồn gốc từ Nga

2.1.2 Hoá chất, thiết bị

Hoá chất

Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường MS

cơ bản gồm khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962) Hóa chất khử trùng gồm HCl và Javen; chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng BAP, NAA, IBA (Sigma, Đức); các hóa chất khác bao gồm đường saccarose, agar…

Thiết bị

Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm Bộ đồ

cấy gồm dao cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng, nồi khử trùng, tủ sấy, máy đo

pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện

2.1.3 Đi ̣a điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài luâ ̣n văn được thực hiê ̣n ta ̣i Phòng thí nghiê ̣m Công nghê ̣ tế bào thực vâ ̣t, khoa Sinh học, trường Đa ̣i ho ̣c Sư pha ̣m – Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên và Phòng Nuôi cấy mô, Trung tâm Thực nghiệm, Thực hành và Chuyển giao khoa học công nghệ, Trường Đại học Tân Trào, Tuyên Quang

Thời gian thực hiện đề tài luận văn từ tháng 9/2015 đến tháng 8/2016

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp khử trùng mẫu

Hạt Hương thảo được chọn là những hạt giống nhẵn, chắc, không dập nát Hạt giống được cho vào giấy không thấm, bỏ vào chuông thủy tinh và được khử trùng bằng khí clo với thời gian khử trùng khác nhau từ 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ và 7 giờ Sau đó hạt giống thu được đưa vào box cấy để cấy lên môi trường vào mẫu là môi trường MS + saccarose 30 g/l + agar 6 g/l Đánh giá kết quả sau 20 ngày nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm, tỷ lệ hạt nhiễm, tỷ lệ hạt chết, hình thái của mầm

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro

Sau khi vào mẫu hạt nảy mầm, thu được các cây con nảy mầm từ hạt Các lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên của các cây con nói trên được sử dụng làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ Hương thảo, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường MS (Murashine và Skoog,1962) cơ bản có

bổ sung saccarose 30 g/l + agar 6 g/l, pH = 5,8 và chất kích thích sinh trưởng

có nồng độ thay đổi Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin (IBA, NAA) và cytokinin (BAP) bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm

lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm Tất cả các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ, cường độ chiếu sáng

2000 lux

(1) Môi trường nhân chồi

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, tổ hợp BAP + IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi Hương thảo

Các đoạn thân mang mắt chồi bên và nách lá mầm được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l

Nồng độ BAP thích hợp nhất trong thí nghiệm trên sẽ được kết hợp với IBA với nồng độ 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 1 mg/l

Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, cấy 5 chồi/bình

Kết quả được đánh giá sau 4, 8 tuần nuôi cấy, theo dõi các chỉ tiêu như khả năng bật chồi (số chồi/ mẫu), chiều cao chồi, chất lượng chồi (chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh; chồi sinh trưởng trung bình: chồi hơi gầy, lá

xanh; chồi sinh trưởng kém: chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng)

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sinh

trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên của cây Hương thảo được tiến thành theo các công thức của thí nghiệm sau:

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh

trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo được tiến thành theo các công thức của thí nghiệm sau:

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát

sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo

Sau khi đã xác định được nồng độ BAP tối ưu cho sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên, ta sử dụng nồng độ BAP tối ưu này kết hợp với IBA để đánh giá ảnh hưởng của chúng đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo được tiến thành theo các công thức của thí nghiệm sau:

Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l)

(2) Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường tạo rễ)

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có từ 4 - 5 lá được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA với

nồng độ 0,3 mg; 0,5 mg; 0,7 mg; 1 mg trong 1 lít môi trường Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi, lặp lại 3 lần

Kết quả được đánh giá sau 30 ngày, theo dõi các chỉ số như: tỷ lệ chồi

ra rễ, số rễ/chồi, chất lượng rễ (rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng; rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu trắng; rễ kém: Bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu trắng)

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

của cây Hương thảo được tiến thành theo các công thức của thí nghiệm sau:

2.2.3 Đưa cây ra môi trường tự nhiên

Cây Hương thảo in vitro được nuôi trong điều kiện ổn định về nguồn

dinh dưỡng, ánh sánh, nhiệt độ… Khi chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên hoàn toàn khác cây con dễ bị chết do mất nước, nhiệt độ cao… Vì thế ta phải tiến hành làm cho cây con thích nghi dần với điều kiện ngoài tự nhiên bằng cách đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây Thời gian này kéo dài khoảng 7 ngày, tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây Sau đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát Rửa sạch phần thạch và đường bám vào vì chúng thường là môi

trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công Sau đó, ngâm cây trong chậu nước sạch để tránh hiện tượng mất nước rồi đem trồng vào giá thể Chọn những cây con có bộ rễ dài, khỏe, lá xanh, đang thời kì sung sức để tiến hành trồng vào các loại giá thể Các bầu này được cho vào các khay và được phủ kín bằng túi nilon trong 1 tuần đầu tiên, đặt nơi có ánh sáng khuyếch tán, thoáng mát, tưới đủ ẩm mỗi ngày để cây con dần thích nghi với điều kiện bên ngoài

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh

trưởng của cây con trong vườn ươm được tiến thành theo các công thức của thí nghiệm sau:

CT1-ĐC Đất thịt trung bình

CT2 Đất thịt trung bình + cát (2:1) CT33 Đất thịt trung bình + trấu hun (2:1) CT4 Đất thịt trung bình + cát + trấu hun (2:1:1)

Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: Trong 2 – 3 ngày đầu tưới nước sạch bằng cách phun sương 4 lần/ngày (giữ độ ẩm giá thể khoảng 75% - 80%) Trời rét phải che nilon tránh rét và tránh thoát nước nhanh Nilon phải đục lỗ thoáng khí Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, để cây nơi đủ ánh sáng, thoáng khí, tránh nắng, mưa trực tiếp Tưới nước bằng bình phun 2 - 3 lần/ngày Sau khi cây sống, ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra đồng ruộng

Đánh giá kết quả sau khi ra cây 60 ngày, theo dõi các chỉ tiêu, như tỷ lệ cây sống, chiều cao cây

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các

yếu tố vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định Nhiệt

độ từ 25 – 27oC và các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 – 12 giờ/ngày

Môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng sinh trưởng (BAP, IBA, NAA); pH môi trường 5,6 - 5,8 Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, ở áp suất 1atm

2.2.5 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu

Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05 Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [7] Các phương pháp được sử dụng là phương pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis, phương pháp phân tích phương sai một nhân tố