Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, pH và nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo

TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH-KTNN  NGUYỄN THỊ MAI DUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON, pH VÀ NHIỆT ĐỘ TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌ

TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN



NGUYỄN THỊ MAI DUNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA

NGUỒN CACBON, pH VÀ NHIỆT ĐỘ

TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân còn

có sự tạo điều kiện của nhà trường, của khoa và sự hướng dẫn tận tình củathầy, cô giáo Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô giáo

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong

thời gian qua Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trongkhoa Sinh-KTNN đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

Sinh viên Nguyễn Thị Mai Dung

Khóa luận tốt

Khóa luận tốt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, pH và nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo” là do tôi thực hiện, không

trùng với đề tài khác

Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình Ảnh

Hình 3.1 Mẫu nấm men phân lập trên môi trường thạch đĩa 16Hình 3.2 Mẫu nấm men phân lập trên môi trường thạch nghiêng 16Hình 3.3 Mẫu tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi quang học độ

Biểu đồ

Biểu đồ 3.1 SLTB trung bình sau 24h nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau 20Biểu đồ 3.2 SLTB trung bình sau 24h nuôi cấy ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 21Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men vang táo mèo 25Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang táo mèo 27Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo 28

Đồ thị

Đồ thị 3.1 Động thái lên men vang táo mèo 24

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của T3

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sự sinh trưởng, phát triểncủa T3 trong quá trình nhân giống 22Bảng 3.7 Khả năng lên men của T3 trên môi trường có nồng độ đường

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Khái quát chung về rượu vang 3 1.2 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang 4

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, phát triển của nấm men 7 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang 8 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Đối tượng, thiết bị và hóa chất 10 2.2 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3 Phạm vi nghiên cứu 14

2.4 Địa điểm thực hiện đề tài 14

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 15 3.1 Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men 15

3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng, phát triển của T3 trong quá trình nhân giống 19 3.3 Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo 23

3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men vang táo mèo 25 3.5 Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm 29

3.6 Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

Ở Việt Nam sản xuất vang nho bắt đầu xuất phát từ một số cơ sở nhỏ

lẻ Sau đó phát triển thành các nhà máy vang Thăng Long, Gia Lâm, ThanhBa… Trong sản xuất rượu vang tùy từng phương thức sản xuất và loại quảchế biến mà cho ra các loại rượu khác nhau Trên thế giới có hàng trăm loạirượu vang có chất lượng cao như Chianti, Rhine…

Nước ta có khí hậu nhiệt đới nên các loại cây hoa quả phong phú, trong

đó có nhiều loại quả có thể là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất rượu vang.Miền núi phía Tây Bắc nước ta có cây táo mèo cho quả có hương vị thơmngon và đặc trưng Hiện nay quả táo mèo chủ yếu là ăn tươi, ngâm rượu,ngâm dịch siro Tổng diện tích trồng táo mèo khoảng 40.000 ha [9], [10] Nơi

có diện tích cây táo mèo nhiều nhất là các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Điện Biên,Lai Châu Tuy nhiên số lượng mang đi tiêu thụ hàng năm không đáng kể(khoảng 35%), số còn lại thường bị bỏ phí do không có nguồn tiêu thụ tại chỗ,vận chuyển khó khăn, hoặc giá thành rẻ Hầu hết người trồng quả táo mèo cóthu nhập thấp, đời sống gặp nhiều khó khăn

Ngành sản xuất rượu vang ở nước ta đang phát triển, có nhiều sản phẩmbán trên thị trường Nhưng ứng dụng công nghệ vi sinh vào sản xuất vangchưa được phổ biến, việc nghiên cứu một số chủng vi khuẩn áp dụng lên menvang đã được đề cập đến nhưng còn ít

Vì vậy việc nghiên cứu, sử dụng quả táo mèo để sản xuất rượu vang làcần thiết và phù hợp với thực tiễn Việt Nam Chúng tôi đã chọn và tiến hành

14

công trình nghiên cứu “Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, pH

và nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo”.

*Mục tiêu của đề tài

- Phân lâp, tuyển chọn được chủng nấm men lên men vang từ dịch táomèo

mèo

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang táo

- Lên men rượu vang táo mèo trên quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng

quy trình lên men vang

*Nội dung của đề tài

- Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng nấm men trong quá trình nhân giống

- Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men vang táo mèo

- Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm

- Xây dựng quy trình công nghệ lên men vang táo mèo

*Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài

Đề tài của chúng tôi nhằm đáp ứng các yêu cầu khoa học về ý nghĩa líluận và thực tiễn như sau:

- Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của

chủng T3 có khả năng lên men vang táo mèo.

- Đề tài mang ý nghĩa thực tiễn đó là tạo nguồn tiêu thụ quả táo mèo nhằm nâng cao thu nhập cho bà con các dân tộc vùng cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về rượu vang

1.1.1 Các loại rượu vang

Rượu vang theo đúng nghĩa là nước ép nho lên men (không qua chưngcất) Ngày nay người ta mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ các loại rượu lênmen từ các loại quả khác nhau như táo, dâu, vải…

Rượu vang có thể chia làm 2 loại chính:

- Vang không ga (vang bàn ăn)

- Vang có ga (vang bọt sâm banh)

+ Loại không ngọt

+ Loại rất ít đường

+ Loại ngọt [5], [7]

1.1.2 Nguyên liệu sản xuất rượu vang

Nước ta là nước nhiệt đới gió mùa không thích hợp cho cây nho pháttriển tốt Tuy nhiên nước ta lại có hoa quả phong phú, đây là nguồn nguyênliệu phục vụ cho ngành nông nghiệp chế biến rượu vang (mơ, táo, dứa,vải,…) Thành phần hóa học của quả, điều kiện chăm sóc, khí hậu,… có ảnhhưởng lớn đến chất lượng rượu vang

Thành phần hóa học của một số loại quả được dẫn ra ở bảng 1.1 [11]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học một số loại

quả

Tên quả Thành phần hóa học cơ bản (%)

Nước Đường Acid Pectin TaninNho 73,1 9,88 0,56 0,092 0,07Vải 84,28 16,1 5,16 0,249 0,83Dứa 54,3 3,9 0,6 0,249 0,83

Mơ 73,8 9,0 1,1 0,249 0,83Dâu 84,74 9,19 0,49 0,31 0,035Táo mèo 84 4,8 1,45 0,249 0,83

1.1.3 Tàng trữ rượu vang

Vang được tàng trữ 1-5 năm, có thể tàng trữ hàng trăm năm Trong thờigian này xảy ra quá trình oxi hóa-khử màu tím sang màu đỏ tía, vang trắngchuyển sang vàng, thậm chí đỏ, nâu Thành phần acid tăng, độ cồn giảm, este

và hương vị tăng lên [6]

1.1.4 Thành phần của rượu

Thành phần chủ yếu của vang gồm:

- Cồn ethanol, do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn vớialdehyt, este Độ cồn của rượu 10- 120

- Chất bổ sung: Đường trong rượu vang từ 6,2% – 13,2% chủ yếu làfructose, glucose, một ít galactose

- Acid vô cơ và acid hữu cơ: Acid oxalic, acid malic…

- Một lượng phong phú các muối với hàm lượng thấp nhưng giữ vai tròquan trọng, làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh dưỡng củarượu

- Rượu vang giàu vitamin: Vitamin có trong nước quả không bị quátrình lên men phân hủy mà nó chỉ điều chỉnh điều chỉnh lại thànhphần

1.2 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang

1.2.1 Nấm men

1.2.1.1.Sơ lược, cấu tạo, hình thái tế bào nấm men

- Sơ lược về nấm men: Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạođơn bào, sinh sản bằng lối nảy chồi Nấm men phân bố khá rộng rãi trong tựnhiên (trong đất, nước, không khí, thực phẩm, hoa quả), nhiều loại nấmmen có khả năng lên men rượu, vì vậy từ lâu con người đã biết sử dụng nấmmen để sản xuất rượu bia

Tuy nhiên một số nấm men độc hại, làm nhiễm các quy trình công nghệ

và gây hư hỏng sản phẩm

- Cấu tạo chủ yếu của tế bào là hemicellulose chiếm 70% trọng lượng khô(trong đó 31% manman, 29% glucan) Ngoài ra còn chứa 1-3% kitin, 6-10% protein, 8-8,5% lipid, 7% khoáng Thành phần nội bào quan trọng củanấm men là ti thể, không bào và nhân Số lượng ti thể khoảng 10-20/tế bào.Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, sinh sản của nấmmen Không bào được hình thành từ thể Golgi hay mạng lưới nội chất Khôngbào chứa hệ thống keo bao gồm : Enzyme, protein, hydrocarbon, muối canxi,kali, phenolflavin, riboflavin, acid nucleic, và các chất dự trữ khác Nhân

có hình ovan, tròn nằm gần không bào trung tâm với kích thước khoảng 2,4

µm Nhân chứa toàn bộ hệ men tham gia điều khiển quá trình sinh tổnghợp của tế bào nấm men

- Hình thái tế bào: Đa số có hình trứng, cầu hay ovan Kích thước từ

(3-10) x (5-12)

µm. Hình dạng kích thước tế bào điển hình chỉ được tạo ratrong điều kiện môi trường phù hợp Khi điều kiện bất lợi thì hình dạng, kíchthước tế bào sẽ bị biến dạng (khi môi trường nghèo dinh dưỡng nấm men cóhình đế giày)

1.2.1.2.Sinh sản của tế bào nấm men

Trong điều kiện bình thường tế bào nấm men sinh sản bằng lối nảychồi Trong điều kiện không thuận lợi một số có thể chuyển sang sinh sảnbằng bào tử

Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất Khi tế bàophát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồinhỏ gọi là mầm (chồi) Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên mộtđầu của tế bào mẹ Sau khi nảy mầm, tế bào con phát triển trên cơ thể mẹhoặc tách khỏi cơ thể mẹ để phát triển độc lập

Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử, bào tử túi

được sinh ra trong các túi nhỏ gọi là túi nang, mỗi túi chứa 1-8 bào tử Nấm

men Saccharomyces được hình thành theo lối sinh sản vô tính Đó là quá trình

hình thành bào tử từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp Bào tử túi saukhi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào nấm men.Tiếp theo tế bào nấm men lại sinh sản theo lối nảy chồi

*Nấm men được dùng trong lên men rượu vang là Saccharomyces

crevisiae Nấm men chứa trung bình 75% nước, 25% chất khô.

Theo quan điểm kinh tế người ta chia nấm men thành các chủng:

- Chủng lên men với hiệu suất cao, ở thời gian tối ưu sản sinh tới 20%Vcồn

- Chủng lên men ở thời gian ngắn, lên men tạo 8-10%V cồn

- Chủng chịu nồng độ cồn cao, lên men trong rượu vang dưới 30%,đường tạo 10-13%V cồn

1.2.2 Vi khuẩn

Trong nước quả và rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn lànguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong rượu vang về vị chua, mùi,

có loài còn gây đục vang Đó thường là các loài vi khuẩn Acetobacter

xylnium, Acetobacter aceti Pasteur đã tìm ra cơ chế làm hỏng vang khi rượu

vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus [10].

Do vậy để bảo quản rượu vang người ta có thể dùng thanh trùngPasteur nhưng nó lại làm giảm chất lượng rượu vang Ngoài ra, người ta còn dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO 2 (75-120 mg/l)

1.2.3 Nấm mốc

Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa

thiết bị hoặc do bụi không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus,

Aspergillus [6], [10].

1.2.4 Bệnh vang

Bệnh vang luôn là vấn đề phải quan tâm của các nhà sản xuất rượuvang Vấn đề bệnh vang được khám phá đầu tiên bởi Pasteur Bệnh vang làmcho rượu bị chua, mùi khó chịu và phẩm chất rượu giảm rất nhanh [5], [9]

Các vi sinh vật kị khí: vi khuẩn Lb brevia, Lb pasteurianus, Lb plantarum

đã làm cho vang bị vẩn đục, làm chuyển hóa acid c itric, tạo ra lượng lớn acidlactic, acid acetic và 2,3-butanediol

Các vi khuẩn hiếu khí: Một số loại nấm men tạo màng trên bề mặt vang

như: Candida, Zygopichia, Pichia… phân giải đường thành các acid hữu cơ:

- Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men Saccharomyces cerevisiae

được lấy chủ yếu từ các nguồn đường: glucose, saccharose, fructose

- Nguồn cacbon đáp ứng được 3 nhu cầu cơ bản của nấm men

+ Sản sinh năng lượng thông qua quá trình oxi hóa khử

+ Tạo thành những tiền chất

+ Tham gia vào các quá trình oxi hóa khử

1.3.2 Nguồn nitơ và khoáng chất

Nitơ là thành phần quan trọng trong tế bào vi sinh vật, nó là một trongnhững nguyên tố cấu thành nên acid nucleic Nitơ cung cấp cho vi sinh vậtchủ yếu từ 2 nguồn: nguồn vô cơ và nguồn hữu cơ Các nguyên tố khoáng

như S, P đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của tế bào nấm men Ion

Fe+3 ,

Mg+2

nằm trong tế bào của enzyme hoạt động

1.3.3 Ảnh hưởng của oxy

Quá trình tăng sinh của nấm men là quá trình hiếu khí vì vậy oxy lànguồn quan trọng để nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn nhân giống

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang

1.4.1 Hàm lượng cồn và pH

Nấm men lên men luôn sản sinh một lượng cồn Nồng độ cồn thích hợpcho nấm men phát triển tốt là 9-14%V Khả năng chịu cồn và lên men tốttrong môi trường có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọnchủng nấm men cho quá trình sản xuất rượu

Trong quá trình lên men pH môi trường luôn biến đổi Ở giai đoạn cuối

pH hơi tăng do nấm men tự phân hủy giải phóng ra NH3 Ở pH =2,3 quá trìnhlên men yếu, pH > 6,5-7,5 khả năng lên men không còn pH thích hợp là 4-5[10]

1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến quá trình lên men Mỗi loại nấmmen có khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển:

- Nhiệt độ <200C: Sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp

- Nhiệt độ <100C: Không diễn ra quá trình lên men

- Nhiệt độ ở 350C: Nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không chếtnhưng mất tác dụng

- Nhiệt độ >350C: Quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao, vi khuẩnhoạt động đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hóa đường thành acid acetic gâychua, giảm chất lượng vang

Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-280C

1.4.3 Hàm lượng đường và hàm lượng men giống

Đường và các chất hòa tan tạo nên áp suất thẩm thấu ảnh hưởng đếnquá trình vận chuyển các chất ra vào tế bào Hàm lượng đường thích hợp choquá trình lên men là 12-25% Hàm lượng đường 30%V sẽ ức chế quá trình lênmen Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng đường trong dịch lênmen tăng thì hàm lượng acid acetic trong vang cũng cao Mặt khác tỉ lệ cácloại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ đến tốc độ và hiệusuất lên men Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy: glucose là loạiđường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển chủng nấm men cũng nhưquá trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructose và saccharose… Vì vậy quả cóchứa hàm lượng đường khử càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men vàchất lượng vang thành phẩm [10].

Hàm lượng men giống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinhtrưởng cũng như quá trình lên men của nấm men Hàm lượng tế bào nấm men

có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men càng kéo dài hơn, dễ bịnhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao thìthời gian lên men ngắn hơn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự ápđảo của của tế bào nấm men Nhưng hàm lượng men giống quá cao sẽ làmthay đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lênmen và chất lượng rượu vang Nhìn chung hàm lượng men giống thích hợpcho quá trình lên men khoảng 10%

Thạc agarNước : 20g:1000ml

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thiết bị và hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La

- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có vị tríphân loại theo Yelinov N.P (1996) sau đây:

2.1.3 Các loại môi trường

2.1.3.1.Môi trường Hansen (môi trường 1) g/l

2.1.3.2.Môi trường nhân giống (môi trường 2) g/l

1 Đường glucose : 50g

2 Pepton :5g

3 MgSO 4 : 0,5g

4 KH 2 PO 4 : 1g 5 (NH 4 ) 2 SO 4: 1g

6 Nước : 1000ml

2.1.3.3.Môi trường lên men (môi trường 3) g/l

1 Dịch siro hoa quả: Pha với nước cất để được hàm lượng đường 22% Tổng thể tích là 1000ml

2.2.1.1.Phương pháp chọn khuẩn lạc nấm men

Chúng tôi tiến hành phân lập trên hộp lồng petri nhằm tuyển chọn mộttập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có hình thái, kích thước, khả nănglên men như nhau

Môi trường phân lập là môi trường 1 được khử trùng và phân vào cáchộp petri vô trùng để nguội Dịch hoa quả đã được pha loãng 10 −1 -

10−9

bằng

nước cất Nhỏ 1-2 giọt huyền phù với độ pha loãng 10 −9 lên mặt thạch, trangđều bằng bàn trang Gói kín và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 3-4