NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

*********************************

VÕ THỊ THU OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM

Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN

CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Mã số: 62 62 10 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

TP Hồ Chí Minh, năm 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

*********************************

VÕ THỊ THU OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM

Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN

CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Mã số : 62 62 10 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học

1 PGS TS Bùi Cách Tuyến

2 TS Lê Đình Đôn

TP Hồ Chí Minh, năm 2010

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

PGS.TS Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn xây dựng các nội dung nghiên cứu và phương pháp lý luận khoa học

TS Lê Đình Đôn đã luôn quan tâm hướng dẫn phương pháp thực hiện, gợi ý cho thảo luận và đúc kết kết quả của luận án

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và nguồn kinh phí trong quá trình thực hiện đề tài

PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân, PGS.TS Phạm Văn Hiền và tập thể cán bộ phòng Sau Đại Học Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành luận án này

Phòng Sinh học phân tử Thực vật và Bảo vệ Thực vật - Viện Nghiên Cứu CNSH và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều kiện và giúp

đỡ thực hiện thí nghiệm liên quan đến luận án

Xin trân trọng cám ơn Ban chủ nhiệm Khoa Nông Học, Bộ môn Bảo vệ Thực vật - Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi nghiên cứu và thực hiện luận án này

Các em sinh viên Khoa Nông Học, Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM cộng tác triển khai và thu thập kết quả thí nghiệm

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn bạn bè đồng nghiệp gần xa và gia đình đã động viên khuyến khích, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tác giả luận án

Võ Thị Thu Oanh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Cách Tuyến và TS Lê Đình Đôn tại Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực đã được công bố trong các tạp chí, hội nghị khoa học bởi tác giả, nhóm tác giả, cộng tác viên và chưa được ai công bố

Tác giả luận án

Võ Thị Thu Oanh

TÓM TẮT

VÕ THỊ THU OANH – “Nghiên cứu đặc tính sinh học và đánh giá độc tính của

các mẫu phân lập nấm Beauveria và Metarhizium ký sinh trên côn trùng gây hại”

Chuyên ngành: Bảo vệ Thực vật Mã số: 62.62.10.01

Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, 2003 – 2007

Luận án nghiên cứu xác định tên loài từ chi nấm Beauveria và Metarhizium ký

sinh côn trùng bằng phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái học, và

kỹ thuật sinh học dựa trên trình tự DNA vùng ITS-rDNA Nghiên cứu một số đặc điểm

sinh học, khả năng gây bệnh của các mẫu Beauveria và Metarhizium đến một số côn trùng gây hại qua các thí nghiệm in vitro, nhà lưới và đồng ruộng nhằm thiết lập cơ sở

dữ liệu cho các mẫu nấm bản địa, cung cấp những đặc điểm cơ bản để chọn mẫu nấm

có độc tính cao sử dụng trong phòng trừ dịch hại cây trồng

Mười ba mẫu nấm Beauveria được phân lập và sử dụng trong nghiên cứu là loài bassiana và 16 mẫu Metarhizium đều thuộc loài anisopliae Trình tự vùng ITS-rDNA

của tất cả các mẫu phân lập đã được đăng ký và so sánh với dữ liệu cơ sở trên

GenBank cho thấy có ít nhất 3 nhóm di truyền của B bassiana và 6 nhóm của M anisopliae hiện diện trong quần thể mỗi loài, và tách biệt với mẫu nấm của các quốc gia khác Sử dụng nested-PCR với các primer chuyên biệt trên vùng gen Pr1, gen liên quan đến tính độc của nấm Metarhizium là phương pháp tuyển chọn nhanh mẫu nấm Metarhizium gây bệnh cho côn trùng với độ tin cậy cao

Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học cho thấy nhiệt độ 25 - 280C thích hợp

cho sự phát triển của B bassiana, của M anisopliae là 28 - 300C Trên môi trường dinh dưỡng, cả hai nấm đều có số lượng bào tử hình thành đạt tối đa vào 14 ngày sau nuôi

cấy Tuy nhiên, trong cùng điều kiện thí nghiệm, nấm M anisopliae hình thành nhiều bào tử, bào tử nảy mầm sớm và kháng nhiệt hơn B bassiana Môi trường SDAY+K rất

thích hợp cho nghiên cứu sinh học về nấm ký sinh côn trùng tương tự như môi trường

SB+KC, đã ghi nhận 8 mẫu B bassiana và 9 mẫu M anisopliae có thể phát triển được

ở 350C sau 24 giờ nuôi cấy

Hiệu quả phòng trừ côn trùng gây hại của các mẫu B bassiana và M anisopliae

bị ảnh hưởng khi dùng chung với các loại thuốc trừ nấm gốc mancozeb, zineb, carbendazim, benomyl và không bị ảnh hưởng khi dùng với thuốc trừ sâu thiamethoxam, triazophos, deltamethrin và azadirachtins ở nồng độ khuyến cáo Thuốc trừ nấm thí nghiệm đã hạn chế sự nảy mầm của bào tử và ngăn cản sự phát triển của sợi

nấm in vitro, ngay cả khi thuốc được sử dụng ở nồng độ thấp

Cả hai nấm B bassiana và M anisopliae đều có hiệu lực diệt trừ rầy nâu và sâu xanh da láng trong in vitro, nhà lưới và ngoài đồng ruộng khi sử dụng ở nồng độ 107 và

108 bào tử/ml Đối với nấm B bassiana, các mẫu Bb(RN-LA), Bb(RN-BTh) và Bb(BXĐ-Q9) và các mẫu Ma(RN-LA), Ma(BXĐ-Q9), Ma(BXĐ-BT) của M anisopliae có khả năng ký sinh rất cao cho ấu trùng (85,5% - 91,8%) và thành trùng

(80,3% - 86,7%) của rầy nâu Các mẫu nấm Bb(SXĐP-TN) và Bb(SXN-PT) ký sinh từ 74,7% - 78,0% sâu xanh da láng trên cây hành lá, nhưng Ma(SXH-BD) và Ma(SXĐP-TN) có khả năng ký sinh tới 90,4% - 94,1% ở 10 ngày sau phun xử lý Riêng các mẫu B.b(RN-LA), B.b(RSM-Q2), B.b(RSM-BC) và Ma(RN-LA), Ma(RS-Q9) phân lập từ nhiều vật chủ khác nhau nhưng ký sinh rất cao trên sâu xanh da láng cho thấy có sự hiện diện các cá thể nấm trong tự nhiên với độc tính không chọn lọc loại ký chủ hoặc phát triển tính thích nghi theo hướng phổ ký chủ rộng

Sử dụng nấm B bassiana Bb(RN-LA) và M anisopliae Ma(RN-LA),

Ma(SXH-BD) đã khống chế được mật số rầy nâu ở mức thấp 945-1011 con/m2 ở 75 ngày sau sạ (đối chứng là 2140con/m2) và 35-36 con/20 bụi hành đối với sâu xanh da láng (đối chứng 204con/m2), năng suất thu được ở ruộng phun nấm tương đương hoặc cao hơn

ruộng phun thuốc trừ sâu của nông dân Đặc biệt các mẫu nấm B bassiana và M anisopliae thử nghiệm không tác động bất lợi cho nhện bắt mồi ăn thịt (Lycosa sp.) và

bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) trong hệ sinh thái ruộng lúa, khi so sánh với

thuốc hóa học Actara 25WG (thiamethoxam) Do vậy, bảo tồn và khai thác quần thể nấm ký sinh côn trùng bản địa trên đồng ruộng nên được xem là ưu tiên hàng đầu cho chương trình phòng trừ sinh học hiện nay

SUMMARY

VO THI THU OANH - “Studies on biological characteristics and virulence of

Beauveria and Metarhizium isolates parasite on harmful insects”

Major: Plant Protection Code: 62 62 10 01

Nong Lam University Hochiminh City, 2003 - 2007

The thesis objectives were species identification of Beauveria and Metarhizium

isolates, the entomopathogenic fungi, by using a traditional method based on morphological characteristics and a molecular method based on ITS-rDNA sequences; biological characteristics and pathogenicity ability of isolates to harmful based on tests

in vitro, net house, and field condition Results of the research were to establish biological database of indigenous Beauveria and Metarhizium isolates and to provide

basic characters in order to select high virulent isolates using in plant pest control

All of thirteen isolates of Beauveria and 16 isolates of Metarhizium were identified as bassiana and anisopliae species, respectively ITS-rDNA sequences of all

isolates were submitted into and comparion with ITS-rDNA database in GenBank

Results indicated that there were three genetic groups of B bassiana and six of M anisopliae presenting in population of each species, and distiguishing with isolates from other countries Using nested-PCR with specific primers on Pr1 gene, a gene relating to pathogenesis, could be a good selective method of M anisopliae isolates

parasiting on harmful insects with high confidence

Results obtained from biological experiments showed that the optimum

temperature for development of B bassiana isolates was 25 - 280C and 28 - 300C for

M anisopliae Beside that, the SDAY+K was a good medium for entomopathogenic

fungal researches, it is similar with SB+KC medium In this condition, the spore

number was produced in maximun at 14 days after incubation Interestingly, M anisopliae produced more spores, spore germinated quickly, and temperature tolerance better than B bassiana There were eight isolates of B bassiana and nine of M anisopliae to be able to grow in high temperature 35ºC after 24 hours on SDAY+K

cultures

Based on in vitro and field experiments, the insecticides as thiamethoxam,

triazophos, deltamethrin and azadirachtin used at recommendated doses were not

effective on survive and parasitism of M anisopliae or B bassiana isolates, while the

fungicides, mancozeb, zineb, carbendazim and benomyl were strong effective even at low dose used The fungicides effected negatively on spore germination and mycelium growing

Pathogenicity tests conducted in labs, a net house and a field condition on two

harmful insects, beet armyworm (Spodoptera exigua) and brown planthopper (Nilaparvata lugens) resulted that isolates of B bassiana and M anisopliae were high

efficacy when used at 107 and 108 spores/ml Isolates Bb(RN-BTh), Bb(RN-LA), Bb(BXĐ-Q9), and Ma(RN-LA), Ma(BXĐ-Q9), Ma(BXĐ-BT) were high effective on larva and adult of brown planthopper, with 85,5 - 91,8% larva killed and 80,3 - 86,7% adult colonized The control efficacy of Bb(SXĐP-TN), Bb(SXN-PT) isolates on beet armyworm was from 74,7% to 78,0%, and that of Ma(SXH-BD) and Ma(SXĐP-TN) was from 90,4% to 94,1%, after ten days sprayed However, a few isolates as B.b(RN-LA), B.b(RSM-Q2), B.b(RSM-BC) and Ma(RN-LA), Ma(RS-Q9) collected from other host insects were also high virulence on beet armyworm, suggesting that there were particular isolates with non-host specific virulence and towards to wide host spectrum

Based on results, the using of B bassiana Bb(RN-LA) and M anisopliae

Ma(RN-LA) for controlling of beet armyworm and brown planthopper was high efficacy to keep the pest density at low number as 945 – 1.011 brown planthoppers/m2

at 75 days after sowing, while control treatment (no insecticide used) was 2140 individuals and as 35 – 36 beet armyworms per 20 onion bushes while control treatment was 284 individuals The productivity on the fields treated with the isolates was higher or similar with that on the fields treated with pesticides from farmers

Results indicated that many isolates of M anisopliae and B bassiana were not attacked on useful insects such as wolf spider (Lycosa sp.) and plant bug (Cyrtorhinus lividipennis) in rice fields, while the pesticide Actara 25WG (thiamethoxam) did

Therefore, preservation and exploitation of the native entomopathogenic fungi in the field should be a priority way for biological control program recently

MỤC LỤC

Trang

Lời cám ơn i

Lời cam đoan ii

Tóm tắt iii

Summary v

Mục lục vii

Danh mục các chữ viết tắt xi

Danh mục các bảng xii

Danh mục các hình xiv

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 4

4 Thời gian, đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng 6

1.2 Triệu chứng côn trùng bị bệnh do vi nấm 7

1.3 Đặc điểm nhận biết nấm B bassiana và M anisopliae 7

1.4 Độc tố và cơ chế tác động của nấm B bassiana và M anisopliae 12

1.4.1 Độc tố và cơ chế tác động của nấm B bassiana 12

1.4.2 Độc tố và cơ chế tác động của nấm M anisopliae 14

1.5 Sự phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng 17

1.6 Đặc điểm di truyền của nấm B bassiana và M anisopliae 18

1.6.1 Vai trò vùng rDNA-ITS 19

1.6.2 Sự khác biệt di truyền của nấm Beauveria 19

1.6.3.Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về di truyền của B bassiana 23

1.6.4 Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về di truyền của M anisopliae 25

1.7 Đặc điểm sinh học của nấm B bassiana và M anisopliae 30

1.7.1 Điều kiện để nấm gây bệnh côn trùng phát triển 30

1.7.2.Một số kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học của B bassiana và M anisopliae 31

1.7.2.1 Một số kết quả nghiên cứu trong nước 32

1.7.2.2 Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới 34

1.8 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về khả năng gây bệnh

của B bassiana và M anisopliae đối với sâu hại cây trồng 40

1.8.1 Kết quả nghiên cứu trong nước 40

1.8.2 Kết quả nghiên cứu trên thế giới 43

1.9 Chế phẩm sinh học từ nấm B bassiana và M anisopliae 47

1.9.1 Các chế phẩm sinh học từ B bassiana và M anisopliae trên thế giới 47

1.9.2 Các chế phẩm sinh học từ B bassiana và M anisopliae ở Việt Nam 48

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.1 Nội dung nghiên cứu 49

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 49

2.3 Vật liệu nghiên cứu 49

2.4 Phương pháp nghiên cứu 51

2.4.1 Phân lập và xác định loài nấm Beauveria và Metarhizium theo phương pháp phân loại truyền thống 51

2.4.2 Phân loại xác định loài, phân tích sự khác biệt di truyền của nấm Beauveria và Metarhizium dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA 52

2.4.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm B bassiana và M anisopliae ký sinh trên sâu hại cây trồng 56

2.4.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm 56

2.4.3.2 Khả năng hình thành bào tử của nấm B bassiana và M anisopliae 57

2.4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của nấm B bassiana và M anisopliae 58

2.4.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm B bassiana và M anisopliae 58

2.4.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử của nấm B bassiana và M anisopliae 59

2.4.3.6 Ảnh hưởng của ẩm độ đến sự hình thành và nảy mầm của bào tử nấm B bassiana và M anisopliae 59

2.4.3.7 Ảnh hưởng của một số hoạt chất trừ sâu, trừ nấm đến sự phát triển và nảy mầm của B bassiana và M anisopliae 60

2.4.4 Đánh giá độc tính của nấm B bassiana và M anisopliae trên một số sâu hại hại cây trồng 60

2.4.4.1 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) của nấm B bassiana và M anisopliae trong điều kiện in vitro 61

2.4.4.2 Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N lugens)

của nấm B bassiana và M anisopliae trong điều kiện nhà lưới 61

2.4.4.3 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) của nấm B bassiana và M anisopliae trong điều kiện nhà lưới 61

2.4.4.4 Khả năng gây bệnh của nấm B bassiana và M anisopliae trên một số sâu hại cây trồng trong nhà lưới và ngoài đồng 62

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 68

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 69

3.1 Những kết quả nghiên cứu về nấm Beauveria 69

3.1.1 Phân lập, định danh nấm Beauveria theo phương pháp phân loại truyền thống 69

3.1.2 Phân loại và phân tích sự khác biệt di truyền của nấm B bassiana dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA 75

3.1.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm B bassiana 81

3.1.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm 81

3.1.3.2 Khả năng hình thành bào tử của nấm B bassiana 83

3.1.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của nấm B bassiana 84

3.1.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm B bassiana 85

3.1.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử của nấm B bassiana 87

3.1.3.6 Ảnh hưởng của ẩm độ lên sự hình thành và nảy mầm của nấm B bassiana 92

3.1.3.7 Ảnh hưởng của một số thuốc trừ sâu, trừ nấm đến sự phát triển và nảy mầm của bào tử B bassiana 93

3.1.4 Đánh giá độc tính của nấm B bassiana trên một số sâu hại cây trồng 97

3.1.4.1 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) của nấm B bassiana trong điều kiện in vitro 97

3.1.4.2 Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N lugens) của nấm B bassiana trong điều kiện nhà lưới 98

3.1.4.3 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) của nấm B bassiana trong điều kiện nhà lưới 99

3.1.4.4 Khả năng gây bệnh của nấm B bassiana trên một số sâu hại cây trồng trong nhà lưới và ngoài đồng 101

3.2 Những kết quả nghiên cứu về nấm Metarhizium 110

3.2.1 Phân lập, định danh nấm Metarhizium theo phương pháp phân loại truyền thống 110

3.2.2 Phân loại và phân tích sự khác biệt di truyền của nấm M anisopliae dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA 117

3.2.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm M anisopliae ký sinh trên sâu hại cây trồng 126

3.2.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm 126

3.2.3.2 Khả năng hình thành bào tử của các MPL M anisopliae 128

3.2.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của nấm M anisopliae 129

3.2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm M anisopliae 130

3.2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử của nấm M anisopliae 133

3.2.3.6 Ảnh hưởng của ẩm độ lên sự hình thành và nảy mầm của nấm M anisopliae 137

3.2.3.7 Ảnh hưởng của một số thuốc trừ sâu, trừ nấm đến sự phát triển và khả năng nảy mầm của nấm M anisopliae 138

3.2.4 Đánh giá độc tính của nấm M anisopliae trên sâu hại cây trồng 143

3.2.4.1 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) của nấm M anisopliae trong điều kiện in vitro 143

3.2.4.2 Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N lugens) của nấm M anisopliae trong điều kiện nhà lưới 144

3.2.4.3 Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S exigua) của nấm M anisopliae trong điều kiện nhà lưới 144

3.2.4.4 Khả năng gây bệnh của nấm M anisopliae trên một số sâu hại trong nhà lưới và đồng ruộng 146

3.3 THẢO LUẬN CHUNG 158

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 164

1 KẾT LUẬN 164

2 ĐỀ NGHỊ 166

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 167

TÀI LIỆU THAM KHẢO 168

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: amplified fragment length polymorphism

B bassiana: Beauveria bassiana

DUL - R: dulmage- Rhodes

ETS: external transcribed spacer

GNN: gián nâu nhỏ

IGS: Intergenic Spacer

ITS: Internal Transcriberd Spacer

M anisopliae: Metarhizium anisopliae

MPL: mẫu phân lập

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

PCR: Polymerase Chain Reaction

PEG: Polyethylen Glycol

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

Pr1: Protease

rDNA: Ribosomal DNA

rRNA: Ribosomal RNA

SXN: sâu xanh nho

LA: Long An; BTh: Bình Thuận; BT: Bến Tre; CC: Củ Chi; TN: Tây Ninh Q.2: Quận 2; Q,9: Quận 9; TG: Tiền Giang; TV: Trà Vinh; KG:Kiên Giang

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1.Các kỹ thuật phân tử được sử dụng để nghiên cứu di truyền

của nấm Beauveria 20

Bảng 2.1 Số đăng ký và chiều dài trình tự (bp) vùng ITS-rDNA của các mẫu B.bassiana trên thế giới dùng để so sánh 55

Bảng 2.2 Số đăng ký và chiều dài trình tự (bp) vùng ITS-rDNA của các mẫu M anisopliae trên thế giới dùng để so sánh 56

Bảng 2.4 Các nghiệm thức phun nấm B bassiana ở thí nghiệm đồng ruộng 64

Bảng 2.5 Các nghiệm thức phun nấm M anisopliae ở thí nghiệm đồng ruộng 65

Bảng 2.6 Các nghiệm thức phun nấm M anisopliae ở thí nghiệm đồng ruộng 66

Bảng 3.1 Các nguồn nấm B bassiana phân lập được từ một số sâu hại ở các tỉnh, thành phía Nam 70

Bảng 3.2 Kích thước bào tử của các MPL B bassiana 74

Bảng 3.3 Chiều dài (bp) và số đăng ký trình tự trên GenBankcủa 13 MPL B bassiana nghiên cứu 77

Bảng 3.4 Tỷ lệ nảy mầm (%) của các MPL B.bassiana ở thời gian khác nhau 82

Bảng 3.5 Khả năng hình thành bào tử của các MPL B bassiana sau 10 ngày nuôi cấy 83

Bảng 3.6 Sự hình thành bào tử của các MPL B bassiana ở các thời gian nuôi cấy khác nhau 84

Bảng 3.7 Sự phát triển của khuẩn lạc của các MPL B bassiana ở các mức nhiệt độ khác nhau 88

Bảng 3 8 Sự hình thành bào tử của các MPL B bassiana ở nhiệt độ khác nhau 89

Bảng 3.9 Tỷ lệ nảy mầm (%) của các MPL B bassiana ở nhiệt độ cao 90

Bảng 3.10 Sự hình thành và nảy mầm của bào tử B bassiana ở các mức ẩm độ 91

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu đến sự nảy mầm của B bassiana 93

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm đến sự nảy mầm của nấm B bassiana 95

Bảng 3.13 Tỷ lệ sâu xanh da láng chết (%) khi phun nấm B bassiana 96

Bảng 3.14 Hiệu lực trừ rầy nâu của các MPL B bassiana 98

Bảng 3.15 Hiệu lực trừ sâu xanh da láng của các MPL B bassiana 99

Bảng 3.16 Hiệu lực của B bassiana kết hợp với thuốc trừ sâu Actara 25WG đối với rầy nâu tại Đức Hòa, Long An, năm 2005 104

Bảng 3.17 Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis)và nhện bắt mồi (Lycosa sp.) trên ruộng thí nghiệm tại Đức Hòa, Long An, năm 2005 105

Bảng 3.18 Các nguồn nấm M anisopliae phân lập được từ

một số sâu hại cây trồng ở các tỉnh, thành phía Nam 110

Bảng 3.19 Kích thước bào tử của các MPL M anisopliae 115

Bảng 3.20 Chiều dài (bp) và số đăng ký trình tự trên GenBank

của 16 MPL M anisopliae nghiên cứu 117

Bảng 3.21 Tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) của các MPL M anisopliae ở

các thời gian khác nhau 126

Bảng 3.22 Khả năng hình thành bào tử của các MPL M anisopliae

sau 10 ngày nuôi cấy 127

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử

Bảng 3.28 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu đến sự nảy mầm của nấm

M anisopliae ở các nồng độ hoạt chất khác nhau 139

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm đến sự nảy mầm của

nấm M anisopliae ở các nồng độ hoạt chất khác nhau 141

Bảng 3.30 Tỷ lệ sâu xanh da láng chết (%) sau khi phun nấm M anisopliae

Bảng 3.33 Hiệu lực của nấm M anisopliae kết hợp với thuốc trừ sâu

Actara 25WG đối với rầy nâu tại Đức Hòa, Long An, năm 2005 150

Bảng 3.34 Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) và nhện bắt mồi

ăn thịt (Lycosa sp.) trên ruộng thí nghiệm tại Đức Hòa, Long An 151

Bảng 3.35 Hiệu lực (%) của nấm M anisopliae đối với sâu xanh da láng

tại Tân Hạnh, Đồng Nai, năm 2006 152

Bảng 3.36 Kết quả sử dụng nấm M anisopliae để trừ sâu xanh da láng

trên hành lá tại Tân Hạnh, Đồng Nai, năm 2006 156

Bảng 3.37 Tỷ lệ (%) sâu xanh da láng bị nấm M anisopliae ký sinh trên

ruộng hành sau thí nghiệm, Tân Hạnh - Đồng Nai, năm 2007 156

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Triệu chứng sâu hại bị bệnh do nấm 7

Hình 1.2 Beauveria bassiana (Bals.) Vuill 8

Hình 1.3 Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin 10

Hình 1.4 Metarhizium flavoviride W Gam & Rozsypal 10

Hình 1.5.Cấu trúc hóa học độc tố beauvericin của nấm B bassiana 13

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm của nấm B bassiana 14

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học độc tố destruxin A, B của nấm M anisopliae 15

Hình 1.8 Cơ chế xâm nhiễm của nấm M anisopliae 17

Hình 1.9 Sơ đồ vùng ITS - rDNA của nấm 19

Hình 2.1 Sơ đồ vùng rDNA của nấm và các vị trí primer dùng khuếch đại vùng rDNA –ITS 53

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp nested-PCR 54

Hình 2.3 Nuôi cấy nấm trên môi trường SDAY +K để xác định số lượng bào tử 57

Hình 2.4 Máy vortex VELP 58

Hình 2.5 Thí nghiệm xác định nồng độ bào tử đối với sâu xanh da láng trong phòng thí nghiệm, năm 2005 62

Hình 2.6 Thí nghiệm phun nấm trên rầy nâu hại lúa trong lồng lưới, năm 2005 62

Hình 2.7 Thí nghiệm phun nấm trên sâu xanh da láng hại hành lá trong lồng lưới, năm 2005 62

Hình 2.8 Nhân sinh khối nấm trong môi trường dịch 63

Hình 2.9 Thí nghiệm phun nấm trừ rầy nâu ngoài đồng 63

Hình 3.1 Nấm B bassiana ký sinh trên một số sâu hại cây trồng 71

Hình 3.2 Nấm B bassiana ký sinh trên một số sâu hại cây trồng 72

Hình 3.3 Khuẩn lạc của các MPL B bassiana nuôi cấy trên môi trường PDA 73

Hình 3.4 Beauveria bassiana (Bals.) Vuill 73

Hình 3.5 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS- rDNA của 13 MPL B bassiana sử dụng 2 primer ITS5 và ITS4 76

Hình 3.6 Sơ đồ phân nhóm loài của 13 MPL B bassiana nghiên cứu với mẫu B bassiana của thế giới dựa trên trình tự vùng ITS - rDNA 78

Hình 3.7 Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 13 MPL B bassiana dựa trên trình tự vùng ITS - rDNA 79

Hình 3.8 Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 13 MPL B bassiana dựa trên trình tự vùng ITS1-rDNA 79

Hình 3.9 Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 13 MPL B bassiana

dựa trên trình tự vùng ITS2 - rDNA 80

Hình 3.10 Khuẩn lạc nấm B bassiana trên các môi trường dinh dưỡng

khác nhau ở 14 ngày sau cấy 85

Hình 3.11 Tốc độ phát triển trung bình của các MPL B bassiana trên các

môi trường dinh dưỡng khác nhau 86

Hình 3.12 Khả năng hình thành bào tử của các MPL B bassiana trên các

môi trường dinh dưỡng khác nhau 87

nấm B bassiana trong in vitro 93

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm lên sự phát triển của

nấm B bassiana trong in vitro 95

Hình 3.15 Hiệu lực trừ rầy nâu (%) của nấm B bassiana

Hình 3.18 Mật số rầy nâu trên ruộng thí nghiệm và ruộng nông dân

sau khi phun nấm B bassiana 107

Hình 3.19 Tỷ lệ rầy nâu (%) bị nhiễm nấm B bassiana sau thí nghiệm

tại Đức Hòa, Long An vụ hè thu 2006 và đông xuân 2006-2007 108

Hình 3.20 Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) và nhện bắt mồi

ăn thịt (Lycosa sp.) 108

Hình 3.21 Ảnh hưởng của việc phun nấm B bassiana để trừ rầy nâu đến

năng suất lúa 109

Hình 3.22 Nấm M anisopliae ký sinh trên một số sâu hại cây trồng 112 Hình 3.23 Nấm M anisopliae ký sinh trên một số sâu hại cây trồng 113 Hình 3.24 Khuẩn lạc của các MPL M anisopliae nuôi cấy

trên môi trường PDA 114

Hình 3.25 Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok 115

Hình 3.26 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA của các MPL

M anisopliae, sử dụng hai primer ITS5 và ITS4 117

M anisopliae trên thế giới dựa trên trình tự vùng ITS – rDNA 119

Hình 3.28 Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 16 MPL M anisopliae

dựa trên trình tự vùng ITS-rDNA 121

Hình 3.29 Sơ đồ phân nhóm mối quan hệ di truyền của 16 MPL M anisopliae

dựa trên trình tự vùng ITS1- rDNA 122

Hình 3.30 Sản phẩm PCR khuếch đại gen Pr1 của các MPL M anisopliae

với cặp primer METPR1/METPR4 124

Hình 3.31 Sản phẩm PCR khuếch đại gen Pr1 của 10 MPL M anisopliae

với cặp primer METPR2/METPR5 124

Hình 3.32 Sơ đồ phân nhóm di truyền của 10 MPL M anisopliae

dựa trên trình tự gen Pr1 125

Hình 3.33 Khuẩn lạc nấm M anisopliae trên các môi trường dinh dưỡng

khác nhau ở 14 ngày sau nuôi cấy 130

Hình 3.34 Tốc độ phát triển trung bình của các MPL M anisopliae trên

các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau 132

Hình 3.35 Khả năng hình thành bào tử của các MPL M anisopiae trên

các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau ở 14 ngày sau nuôi cấy 132

Hình 3.36 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên sự phát triển của nấm M anisopliae

Hình 3.42 Tỷ lệ rầy nâu (%) bị nấm M anisopliae ký sinh sau thí nghiệm

tại Đức Hòa, Long An, vụ hè thu 2006 và đông xuân 2006-2007 155

Hình 3.43 Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) và nhện bắt mồi

ăn thịt (Lycosa sp.) 155

Hình 3.44 Ảnh hưởng của việc phun nấm M anisopliae đến năng suất 156 Hình 3.45 Nấm M anisopliae ký sinh trên rầy nâu và sâu xanh da láng 163 Hình 3.46 Kết quả phun nấm B bassiana trừ rầy nâu hại lúa

tại Long An, năm 2006 – 2007 163

Hình 3.47 Bọ xít mù xanh và nhện bắt mồi ăn thịt 163

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây, sự phát triển tính kháng của sâu hại đối với thuốc trừ sâu hóa học, ảnh hưởng của thuốc hóa học đến sức khỏe con người, môi trường và thiên địch tự nhiên của sâu hại đã tạo áp lực mạnh cho sự phát triển việc nghiên cứu và

sử dụng các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp IPM Nghiên cứu sử dụng các loại vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus và tuyến trùng để quản lý sâu hại cây trồng là một trong những biện pháp sinh học lý tưởng với mục tiêu là hạn chế tác hại của thuốc hóa học, bảo vệ môi trường sống, bảo vệ nguồn tài nguyên sinh vật có ích nhằm tạo ra một nền nông nghiệp sạch và bền vững

Trong các loại nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng, Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae là hai loại nấm được quan tâm phát triển và ứng dụng nhiều do

có phổ ký chủ rộng, ký sinh gây chết cho nhiều loại sâu hại cây trồng nông lâm nghiệp,

đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trên thế giới như tác nhân phòng trừ

sinh học Nấm Beauveria bassiana gây bệnh trên 700 loài côn trùng thuộc bộ cánh

cứng (Coleoptera), cánh nửa (Hemiptera), cánh đều (Homoptera), cánh bằng (Isoptera)

và sâu non bộ cánh vảy (Lepidoptera) [14], [29], [97], [134] Metarhizium anisopliae

cũng đã được ghi nhận là gây bệnh cho hơn 200 loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), cánh thẳng (Orthoptera) và bộ cánh nửa (Hemiptera) [29], [52], [144],

[188], [219] Hai loại nấm này đang được sử dụng trong việc phòng trừ nhiều loại sâu hại trên đồng ruộng như rầy hại lúa, sâu tơ, bọ cánh cứng hại khoai tây, bọ xít Blissus,

bọ phấn, bọ trĩ, nhện đỏ, sâu khoang, rầy xanh, rệp phấn, mối, bọ cánh cứng hại dừa, cào cào và mọt hại kho ở nhiều quốc gia trên thế giới như Hà Lan, Phần Lan, Thụy Điển, Philippines, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Úc, New Zealand, Braxin, Trung Quốc và Ấn Độ [14], [15], [29], [96, [115], [183], [191], [193] Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã sản xuất thành công và thương mại hóa các chế phẩm sinh học từ nấm

B bassiana như Ostrinil, Boverin, BotaniGard, Naturalis-L, Mycotrol GHA và từ M

anisopliae như BioGreen, Metaquino, Bio-Blast, Cobican, Green Muscle, Bio-Path

[15], [137], [181]

Ở nước ta, hướng nghiên cứu sử dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sâu hại được đề cập đến từ những năm 70 của thế kỹ trước, nhưng trong khoảng 15 năm trở lại đây mới có nhiều công trình được công bố về lĩnh vực này Viện Bảo Vệ

Thực Vật đã nghiên cứu sử nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae để

phòng trừ một số loài sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp với các chế phẩm Boverit, Muskardin và Mat [20], [29], [32], [33], [168] Chế phẩm Metavina sản xuất từ nấm

Metarhizium anisoplaie cho hiệu quả cao trong việc trừ các loại mối hại cây công

nghiệp, cây ăn trái và cây cảnh [34], [35], [37] Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

đã tuyển chọn được một số mẫu nấm có tiềm năng trừ sâu hại trên cây lúa, rau, màu và cây ăn trái với hai chế phẩm đã được thương mại hóa là Biovip, Ometar và đang được ứng dụng rộng rãi tại các tỉnh Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh ở qui mô hộ nông dân [8], [10], [12], [13], [14], [15] Kết quả của các mô hình thực hiện trên diện rộng đã khẳng định cả hai nấm này đều không ảnh hưởng đến thiên địch của sâu hại, hệ

sinh thái, con người và môi trường Vì vậy, B bassiana và M anisopliae không những

giữ vai trò quan trọng là tác nhân kiểm soát sinh học côn trùng gây hại, có tiềm năng kinh tế, mà còn là giải pháp an toàn cho môi trường thay thế thuốc trừ sâu hóa học

Tuy nhiên, các đặc tính sinh học, cấu trúc di truyền quần thể và cả định danh tới loài cho các mẫu nấm hiện diện ở Việt Nam vẫn còn ít dữ liệu cơ sở và không nhiều thông tin về di truyền phân tử Hơn nữa, những biến đổi di truyền giữa các cá thể trong một quần thể cũng cần thiết được nghiên cứu nhằm xác định những biến dị có ích và kiểm soát quản lý sự phân hóa dịch chuyển các quần thể phụ mới phát sinh dưới tác động của ký chủ và điều kiện tự nhiên Gần đây, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp cho việc phân tích cấu trúc và sự biến động di truyền của các cá

thể trong quần thể nấm gây bệnh côn trùng nói chung và nấm B bassiana, M anisopliae nói riêng Bằng cách phân tích rDNA, sự khác biệt di truyền trong B bassiana và M anisopliae, mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nấm trong cùng loài sẽ

được nhận biết một cách dễ dàng và rõ ràng hơn Trình tự vùng ITS-rDNA đã được sử

dụng trong việc xác định, định danh loài nấm từ chi Beauveria và Metarhizium, hỗ trợ

cho việc định danh cấp loài và dưới loài, là cơ sở nền tảng để hiểu biết chi tiết hơn về vùng phân bố địa lý và đa dạng sinh học, mối quan hệ giữa gen gây bệnh và quá trình hình thành bệnh côn trùng Điều quan trọng là phải sử dụng các loài nấm bản địa vì việc du nhập các loài nấm ngoại lai sẽ tăng thêm khó khăn trong việc xác định hiệu lực của các loài nấm phân bố ở Việt Nam, và nhất là các loài nấm du nhập này có tồn tại lâu dài hay không, có tác động lên môi trường sinh thái và côn trùng có ích tại địa phương hay không là vấn đề cần được xem xét đánh giá

Hiện nay ở Việt Nam, chi nấm Beauveria chỉ có một loài là B bassiana và chi Meatrhizium có hai loài là M anisopliae và M flavoviride hiện diện trên đồng ruộng

và đã được các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ dịch hại cây trồng [20] Việc nghiên cứu xác định loài nấm dựa trên đặc điểm hình thái học sẽ khó phân

biệt, nhận biết được hết các loài khác nhau trong chi Beauveria và Metarhizium Ngoài

ra, nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh đối với sâu hại, mối liên hệ giữa nấm và côn trùng vật chủ cũng như quá trình hình thành bệnh côn trùng cho những mẫu mới phát hiện còn ít dữ liệu hoặc chưa được nghiên cứu phân tích Do vậy, sử

dụng các dữ liệu di truyền để định danh, xác định các loài của chi Beauveria và Metarhizium hiện đang phân bố trên đồng ruộng, xác định những mẫu nấm có độc tính

cao là cần thiết, góp thêm cơ sở khoa học cho việc định danh đến loài nấm ký sinh côn

trùng dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử Từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu

đặc tính sinh học và đánh giá độc tính của các mẫu phân lập nấm Beauveria và

Metarhizium ký sinh trên côn trùng gây hại” đã được thực hiện

2 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Bên cạnh phương pháp phân loại truyền thống, các kỹ thuật sinh học phân tử đã

và đang được ứng dụng trong các nghiên cứu phân loại định danh các loài trong chi

nấm gây bệnh côn trùng Beauveria và Metarhizium Trong đó, phân tích trình tự rDNA

trên vùng ITS-rDNA đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới Phương pháp định danh này còn ít hoặc chưa được thực hiện ở nước ta Định danh các loài nấm trong chi

Beauveria và Metarhizium không những chỉ dựa vào đặc điểm hình thái học mà còn

kết hợp với dữ liệu trình tự của các đoạn DNA có tính bảo tồn cao hoặc chuyên biệt

cao Định danh loài nấm dựa vào đặc điểm hình thái đòi hỏi phải có nhiều kinh nghiệm và thời gian nên việc chọn vùng trình tự ITS – rDNA để định danh ở cấp độ

loài của nấm Beauveria và Metarhizium là hướng tiếp cận mới, góp thêm cơ sở khoa

học để phát triển phương pháp định danh nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

Kết quả luận án đã cung cấp nhiều dẫn liệu khoa học về sự khác biệt di truyền

của nấm B bassiana và M anisopliae phân bố ở phía Nam Việt Nam Cấu trúc trình tự vùng ITS-rDNA của 13 MPL B bassiana và 16 MPL M anisopliae đã được đăng ký

trên ngân hàng dữ liệu GenBank cung cấp dữ liệu cơ sở cho các nhà khoa học khai thác

sử dụng để nghiên cứu về cấu trúc quần thể, nguồn gốc phân bố địa lý của B bassiana

và M anisopliae Kết quả cũng đã chứng minh quần thể nấm M anisopliae có sự biến động di truyền, đa dạng hơn so với B bassiana và sự biến động di truyền chủ yếu xảy

ra trên vùng ITS1-rDNA của M anisopliae và vùng ITS2-rDNA của B bassiana

Phương pháp nested-PCR trong nghiên cứu với qui trình thực hiện phù hợp có thể sử

dụng để sàng lọc, phát hiện nhanh những mẫu nấm M anisopliae có độc tính gây bệnh

cao trong nghiên cứu ứng dụng

Kết quả của đề tài cung cấp những thông tin cần thiết về đặc điểm sinh học của

nấm B bassiana và M anisopliae nhằm thiết lập các dữ liệu sinh học cho các mẫu nấm bản địa Kết quả nghiên cứu chi tiết, có hệ thống từ in vitro, nhà lưới, đồng ruộng về hiệu lực của nấm B bassiana và M anisopliae, về tác động bất lợi của thuốc trừ nấm

đối với nấm ký sinh côn trùng đã góp thêm cơ sở khoa học để bổ sung thêm vào danh sách các mẫu nấm gây bệnh côn trùng có độc tính cao hiện đang có ở nước ta

Kết quả luận án là bằng chứng cho thấy các mẫu phân lập B bassiana và M anisopliae trong nghiên cứu rất có hiệu quả trong phòng trừ sâu hại, an toàn đối với

thiên địch của sâu hại và môi trường, việc sử dụng trên diện rộng để kiểm soát sâu hại

là có cơ sở tin cậy

3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Nghiên cứu, định danh xác định các loài từ chi nấm Beauveria và Metarhizium

bằng phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái học, và kỹ thuật sinh

học phân tử dựa trên trình tự DNA vùng ITS-rDNA, nhằm xác định số loài của chi

Beauveria và Metarhizium phân bố ở những vùng thu thập mẫu

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh, các yếu tố ảnh hưởng

đến độc tính của các mẫu nấm Beauveria và Metarhizium đã định danh được loài nhằm

thiết lập cơ sở dữ liệu sinh học cho các mẫu nấm bản địa, cung cấp những thông tin cơ bản cho việc chọn mẫu nấm có độc tính cao sử dụng trong nghiên cứu ứng dụng phòng trừ dịch hại cây trồng

4 THỜI GIAN, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

4.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 11 năm 2003 đến tháng 11 năm 2007

4.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu Beauveria và Metarhizium ký sinh

gây bệnh trên một số ký chủ sâu hại

4.3 Phạm vi nghiên cứu

Phân lập và định danh đến loài các mẫu nấm Beauveria và Metarhizium dựa trên

đặc điểm hình thái học và trình tự rDNA-ITS, phân tích sự khác biệt di truyền của các mẫu phân lập đồng thời nghiên cứu đặc điểm sinh học cũng như đánh giá khả năng gây bệnh trên một số sâu hại trong nhà lưới và đồng ruộng tại TP Hồ Chí Minh, các tỉnh Đồng Nai và Long An

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU NẤM GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

Từ năm 2700 trước công nguyên, nhà triết học Hy Lạp Aristotle đã tìm hiểu về hiện tượng ong bị bệnh chết hàng loạt, 200 năm sau các nhà khoa học đã chứng minh được côn trùng và một số động vật không xương sống khác bị chết là do nhiễm một số loại vi nấm Năm 1709, Balisneri là người đầu tiên mô tả về nấm gây bệnh trên côn trùng, mở ra hướng nghiên cứu về bệnh lý côn trùng Đến thế kỷ 18 các nhà khoa học

đã chứng minh nấm gây bệnh côn trùng là loại vi sinh vật có khả năng lan truyền bệnh

từ vật chủ này sang vật chủ khác Năm 1815, Agrostino Bassi nhà bệnh lý học đầu tiên

đã mô tả khá tỉ mỉ về bệnh nấm trắng muscardin (nấm bạch cương) trên tằm, có thể phân biệt được mô của ký chủ với nấm ký sinh và đã đưa ra biện pháp ngăn ngừa Đến năm 1835 ông đã xác định được nấm trắng muscardin là nguyên nhân chính gây bệnh cho tằm [29], [136] Từ năm 1885 đến 1890, Louis Pasteur đã định danh được nấm

trắng gây bệnh trên tằm là Beauveria bassiana và những thí nghiệm nghiên cứu của

ông làm nền tảng cho việc nghiên cứu dùng nấm để trừ côn trùng hại cây trồng Năm

1944, Steinhaus là nhà khoa học đầu tiên thành lập phòng thí nghiệm chuyên nghiên cứu về bệnh lý côn trùng mở đường cho hướng nghiện cứu thực nghiệm về khả năng lây nhiễm bệnh và khả năng ứng dụng để phòng trừ sâu hại ngoài đồng ruộng [3], [29], [36], [136]

Metschnikoff (1845-1916) đã phát hiện và phân lập được Entomophthora anisopliae trên sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì (Anisopliae austrinia), qua 6 lần đổi tên đến năm 1883, Sorokin N đặt tên là Metarhizium anisopliae Sau đó vài loài được

mô tả mới bởi Petch 1931, 1935, qua nhiều năm kiểm tra đến năm 1976, Tulloch đề

nghị tên gọi nấm M anisopliae với hai dạng dưới loài là M anisopliae var anisopliae Sorokin và M anisopliae var major (Johstom) qua phân lập từ một số mẫu côn trùng

thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và cánh bằng (Isoptera) [210] Đến nay trên thế giới

đã mô tả được hơn 700 loài nấm gây bệnh côn trùng hầu hết thuộc nấm bất toàn

Deuteromycetes và Entomophthorales trong tổng số 100.000 loài nấm được biết [29], [60], [74], [136]

1.2 TRIỆU CHỨNG CÔN TRÙNG BỊ BỆNH DO VI NẤM

Khi bị bệnh nấm, côn trùng ngừng vận động 2 – 3 ngày, màu sắc thân thay đổi, ngay tại vị trí nấm phát triển, bên trong thân của sâu non xuất hiện những vệt đen, không có hình thù nhất định Cơ thể có màu hồng, vàng nhạt và trắng, thân hơi cứng, màu sắc thay đổi phụ thuộc vào màu sắc của bào tử nấm gây bệnh Kích thước cơ thể

bị ngắn lại hoặc bị khô đét do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn và chết (hình 1.1) Hiện tượng này gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là đặc trưng của bệnh nấm và trải qua hai giai đoạn:

Hiện tượng chấn thương: các mô bị tổn thương do nấm gây ra, các lympho máu đọng

lại và mô tái sinh được tạo thành bên trên bề mặt phần thân côn trùng bị tổn thương

Hiện tượng nhiễm trùng máu: do lympho chứa đầy sợi nấm, ở giai đoạn này xảy ra

hiện tượng thực bào do các tế bào bao vây nuốt một phần tiểu thể nhất định tạo thành những hợp bào và các tế bào khổng lồ làm cho côn trùng chết [4], [14], [29]

Hình 1.1 Triệu chứng sâu hại bị bệnh do nấm (V.T.T.Oanh, 2004)

1.3 ĐẶC ĐIỂM NHẬN BIẾT NẤM Beauveria bassiana VÀ Metarhizium

anisopliae KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG HẠI CÂY TRỒNG

Chi nấm Beauveria thuộc nấm bất toàn (Hypocreales:Clavicipitaceae) có khả

năng làm chết côn trùng do độc tố, thuộc dạng ký sinh không bắt buộc Beauveria được

xem như là tác nhân sinh học kiểm soát côn trùng gây hại có hiệu quả bởi các đặc điểm gây bệnh cho côn trùng: không độc với động vật máu nóng và có thể sản xuất ở qui mô

thương mại Chi Beauveria có 4 loài được nghiên cứu nhiều đó là B bassiana (Bals.)

Vuill.; B brongniartii (Sacc.) Petch; B album (Limber) Saccas và B vermiconia

DeHoog [29] Trong 4 loài trên, B bassiana và B brongniartii được xem là gây bệnh

phổ biến cho nhiều loại côn trùng hại cây trồng và được phân biệt dựa trên hình dạng,

kích thước bào tử Vuillemin (1912) đã mô tả chi Beauveria và nấm Botrytis bassiana (Balsamo-Crivelli) là một loài, các loài trong chi Beauveria sinh sản bằng bào tử đính

và chúng được phân loại theo đặc điểm hình thái học Đây là loài nấm quan trọng với các đặc tính giá bào tử trần là những tế bào lớn không ngăn vách, không màu, ở đỉnh hoặc ở các nhánh ngang của sợi nấm Tế bào sinh bào tử trần mọc rải rác hoặc từng cụm, phần gốc của tế bào hình bình, phần ngọn cuống hẹp, ngoằn ngoèo hình chữ chi hoặc ziczắc không đều, có răng 1 x 5-20 µm (hình 1.2) Bào tử trần không ngăn vách, hình cầu hoặc gần cầu đôi khi hình elip có kích thước 2-2,5 x 2,5 - 4,5 µm, màu trắng hay vàng nhạt (hình 1.2), bề mặt khuẩn lạc dạng bột có màu trắng ngà [1], [3], [4], [29], [136], [190]

PDA; B- Cấu trúc cành bào tử; B- Hình dạng bào tử (Luangsa-Ard và cs , 2006 Độ phóng đại

400 lần)

Theo Kirk và cs (2001) [121], về mặt hình thái Beauveria được phân biệt dựa vào hình dạng của tế bào sinh bào tử Trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria sinh ra

các sợi nấm trắng và bào tử đính, khi bào tử già có các giọt dịch màu vàng xuất hiện ở

giữa đối với loài B amorpha và B velata Một số loài khác xuất hiện các giọt dịch màu

đỏ trên bề mặt khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng [76], [121], [123]

Trước đây, các loài trong chi Beauveria được nhận biết dựa vào kích thước bào tử, tuy

nhiên phương pháp định danh này thường gặp nhiều khó khăn bởi vì các loài nấm

Beauveria không khác biệt nhiều về kích thước Dựa vào đặc điểm hình thái, De Hoog (1972) [76] đã mô tả rất chi tiết hình dạng của tám loài trong chi Beauveria và cho biết

A

chỉ có thể nhận biết chắc chắn được hai loài là B bassiana và B denso nhờ dựa vào

hình dạng của bào tử đính Theo Glare và cs (1998) [98], sự khác biệt về hình thái giữa

các loài trong chi Beauveria chịu ảnh hưởng bởi các điều kiện nuôi cấy và thành phần

các chất có trong môi trường dinh dưỡng, vì vậy, rất khó nhận biết đến loài nếu chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái Tương tự, Samson (1981)[189] khi xác định 16 mẫu

Beauveria cũng chỉ phân biệt được hai loài là B bassiana và B denso hoặc B tenella

Về sau B denso được đổi tên là B brongniartii và đã phát hiện thêm một loài mới nữa

là B album.

Chi nấm Metarhizium (Hypocreales:Clavicipitaceae) thuộc nấm bất toàn, loài

Metarhizium anisopliae được mô tả đầu tiên bởi Metschnikoff (1879) dưới tên gọi Entomophthora anisopliae sau đó được đổi tên thành Metarhizium bởi Sorokin (1883)

Sự chỉnh sửa tên là Metarhizium lần đầu tiên được thực hiện bởi Tulloch (1976) [211]

dựa vào các đặc điểm phân loại chính là các đặc điểm hình thái học Chi nấm được xác định dựa trên sự sắp xếp của các chuỗi mang thể bình và các cột chứa bào tử khô, màu xanh, hình trụ hoặc hơi bầu dục, các cột được tạo thành do sự kết hợp của các chuỗi

bào tử Tulloch đã chấp nhận Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride là 2 loài duy nhất của chi đồng thời cũng phân biệt loài và dưới loài của Metarhizium anisopliae dựa trên kích thước bào tử: (1) Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok var anisopliae có bào tử ngắn, chiều dài khoảng 5-8 m (hình 1.3) Sợi nấm khi phát

triển bên trong cơ thể côn trùng có chiều rộng khoảng 3 – 4 µm, dài 20 µm chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ [130], [134], (2)

Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok var major (Jonhston) có bào tử dài, chiều dài

khoảng 10 - 14 /16 m Nhóm này sau được Rombach và cs (1986) [184] đổi tên thành

Metarhizium anisopliae var majus (Johnson) Tulloch Metarhizium flavoviride được

mô tả lần đầu tiên bởi Gams và Rozsypal (1973) [96] Loài này khác Metarhizium anisopliae ở chỗ bào tử có màu xanh vàng hoặc xanh xám và bề ngang bào tử lớn hơn

hơn (hình 1.4) Hai loài chính này cũng được ghi nhận bởi Humber (1997) [109], Rombach và cs (1986, 1987) [185], [186] đã đưa ra một bản tóm tắt khái quát về các

loài trong chi Metarhizium và được chấp nhận bao gồm các các nhóm phân loại sau: M

album Petch; M brunneum Petch; M anisopliae (Metsch.) Sorokin var anisopliae; M anisopliae (Metsch.) Sorokin var major (Jonhston) Tulloch; M flavoviride Gams và Rozsypal var flavoviride và M flavoviride Gams và Rozsypal var minus Rombach,

Humber và Roberts

Dựa trên màu sắc của khuẩn ty và các đặc điểm hình thái khác nhau, một số

nhóm phân loại mới đã được mô tả ở Trung Quốc như M cylindrosporae Chen and Guo, M guizhouense Chen and Guo, M pingshaense Chen and Guo [115] và M taii Liang & Liu cùng với dạng sinh sản hữu tính là Cordyceps taii Liang & Liu [128] Tuy nhiên, việc các nhóm phân loại này có được chấp nhận là các loài của chi Metarhizium

riêng biệt không thì vẫn chưa biết rõ

dạng bào tử (Luangsa-Ard và cs, 2006) Độ phóng đại 400 lần.

PDA; B- Cấu trúc cành bào tử; C- Hình dạng bào tử.(Luangsa-Ard và cs, 2006) Độ phóng đại

400 lần.

Trong những năm vừa qua, ngoài đặc điểm hình thái học, các loài nấm của chi

Metarhizium đã được xác định bằng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử cũng như các kỹ

thuật khác Các nhà nghiên cứu đã sử dụng RAPD marker để nghiên cứu tính đa dạng

di truyền của các mẫu nấm Metarhizium anisopliae phân lập từ một số loại côn trùng

C

B

ký chủ và từ các khu vực trồng mía khác nhau ở Australia Kết quả là đã quan sát được

sự đa dạng di truyền cao ở 31 mẫu nấm nghiên cứu [93] Các marker PCR có mồi chuyên biệt cũng được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền của các mẫu

Metarhizium anisopliae phân lập từ đất và côn trùng ở Braxin [210], ngoài ra Curran

và cs (1994) [75] nhận thấy có sự khác biệt giữa các loài dựa trên các dữ liệu về trình

tự rDNA Thêm vào đó, các công nghệ dựa trên PCR bao gồm RAPD cũng được sử dụng để đánh giá sự đa dạng trong kiểu gen của các loại nấm gây bệnh côn trùng khác

nhau, bao gồm cả Metarhizium anisopliae [49] Cũng ở thời điểm đó, Rath và cs (1995b) [173] đã chứng minh rằng có thể phân biệt 16 mẫu Metarhizium anisopliae

bằng hệ thống API50CH, bao gồm việc sử dụng 49 loại carbohydrates Các tác giả này kết luận rằng việc sử dụng carbohydrates là một tiêu chuẩn phân loại có liên quan tới

sinh học và rất hữu ích để phân biệt các loài của chi Metarhizium Phân tích RFLP

phức hợp gen rDNA và mtDNA cũng là công cụ hữu ích để xác đinh đặc điểm của các

mẫu nấm Metarhizium anisopliae Điều này cũng được chứng minh bởi Mavridou và

cs (1998) [144] trong khi nghiên cứu các khác biệt trong phạm vi loài dựa trên vùng

28S-rDNA của 25 mẫu Metarhizium anisopliae var anisopliae phân lập từ nhiều côn

trùng ký chủ và vùng địa lý khác nhau

Driver và cs (2000) [80] bắt đầu tiến hành đánh giá lại quá trình phân loại của

chi Metarhizium bằng cách sử dụng dữ liệu trình tự và các bản đồ RAPD từ 123 mẫu nấm đã được công nhận là Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride hoặc Metarhizium album Dữ liệu này đã khẳng định tính phát triển đơn nhánh (monopoly) của nhóm Metarhizium anisopliae và nhận thấy nhóm này bao gồm 4 nhánh nhỏ, trong

đó có 2 nhánh tương ứng với 2 nhóm Metarhizium anisopliae var anisopliae và Metarhizium anisopliae var major còn 2 nhánh còn lại là các chi mới được phân biệt dựa trên dữ liệu trình tự vùng ITS Hai chi mới này được đặt tên là M anisopliae var lepidiotum và M anisopliae var acridum Bên cạnh M album, M flavoviride var flavoviride và M flavoviride var minus, 3 nhánh còn lại còn đại diện cho 2 chi mới dựa trên trình tự ITS là M flavoviride var novazealandicum và M flavoviride var pemphigum

Gần đây, các nghiên cứu về phân loại và quá trình lịch sử ảnh hưởng tới sự phân

bố hiện tại của nấm này đã được thực hiện bởi Bidochka và cs (2005) [52] Dựa trên các nghiên cứu về di truyền quần thể, các tác giả kết luận: (1) sự kết hợp các kiểu gen

của Metarhizium anisopliae cùng với sự lựa chọn loại môi trường sống xảy ra ở các vùng cực và vùng ôn đới, (2) sự kết hợp các kiểu gen của Metarhizium cùng với loại côn trùng ký chủ ưa thích xảy ra ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, (3) Metarhizium

thực sự do sự kết hợp của 10 -15 loài chưa được xác định, bao gồm cả 3 loài

Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride và Metarhizium album, trong đó có

những đơn vị phân loại tuy không khác biệt về mặt hình thái nhưng lại khác biệt về quan hệ phát sinh loài và (4) Đông Nam Á có thể là nguồn gốc của sự tiến hoá và đa

dạng của Metarhizium anisopliae Hơn nữa, ở một số dòng nấm Metarhizium anisopliae còn phát hiện thấy RNA sợi kép và các dòng nấm có quan hệ di truyền với

nhau được nhận thấy là có RNA sợi kép tương đồng [50], [54], [126]

Trong một thời gian dài người ta không tìm thấy dạng sinh sản hữu tính nào của

Metarhizium Do đó, Metarhizium anisopliae được xếp vào nhóm Deuteromycota (nấm

bất toàn) thuộc Hyphomycetes (nấm sợi) Vào năm 1991, Liang và cộng sự [128] đã

mô tả loài Cordyceps taii có một giai đoạn sinh sản vô tính và được gọi là Metarhizium taii Sau đó Liu và cs (2001) [133] đã phân lập được loài Cordyceps brittlebankisoides

và đến năm 2002 [134] đã chứng minh loài này chính là dạng sinh sản hữu tính của

Metarhizium anisopliae var major Do đó, chi Metarhizium Sorokin ngày nay được

xếp vào nhóm Nectriaceae, Hypocreales và Ascomycetes [59]

Nhìn chung, từ khi phát hiện đến nay có khoảng 8 loài trong chi Metarhizium

được nhận biết, tuy nhiên chỉ có hai loài được xác định là ký sinh gây bệnh cho nhiều loại côn trùng và đã được sử dụng như là tác nhân sinh học trong việc phòng trừ côn

trùng gây hại là M anisopliae (Sorok.) Metsch 1883 và M flavoviride Gams, 1973

1.4 ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA NẤM B bassiana VÀ M anisopliae

ĐỐI VỚI CÔN TRÙNG

1.4.1 Độc tố và cơ chế tác động của nấm Beauveria bassiana

Độc tố diệt côn trùng của nấm B bassiana

Nấm B bassiana tạo ra hỗn hợp độc tố bao gồm beauvericin, bassianolide và

cosporein Trong đó, độc tố chính gây hại cho côn trùng được nghiên cứu nhiều nhất là beauvericin Cấu trúc của beauvericin là một hexadepsipeptide đã được phân lập từ

nấm ký sinh côn trùng như Beauveria spp., Paecilomyces spp.[103], [158] Beauvericin

có cấu trúc và chức năng tương tự những chất kháng sinh gây hại màng tế bào enniatin

A, B và C và có sự khác biệt của những hợp chất này so với N-methyllamino acid [201] Beauvericin bao gồm một chuỗi lặp lại của 3 phân tử N-methyphenylalanine liên kết với 3 phân tử 2-hydroxyisovaleric acid Beauvericin tạo phức hợp với ion Na+ và

K+ dẫn đến làm tăng tính thấm của màng tế bào tự nhiên và nhân tạo Beauvericin còn

là kháng sinh chống lại một số vi khuẩn như Bacillus subtilis, Escherrichia coli [162]

(Nguyễn Ngọc Tú và cs, 1997) [5]

Hamill và cs (1960) đã kết tinh được độc tố diệt côn trùng của nấm B bassiana

là beauvericin (hình 1.5) Đến năm 1971, Ovehinnokov và cộng sự đã tổng hợp được độc tố này và đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất có sắc tố vàng là tenelin và basianin, những sắc tố này là do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron sinh ra Công thức nguyên là C45H57O9N3, là một loại dexipeptit vòng, có điểm sôi 93 – 940C Từ một lít môi trường nuôi cấy, các nhà khoa học Trung Quốc ở Trường Đại học Tổng hợp Nam Khai đã tách ra được 1,5g và

từ 1 kg môi trường đặc đã tách ra được 3,8g beauvericin (trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy

2004) [29]

Cơ chế tác động của nấm Beauveria bassiana lên côn trùng

Bào tử nấm B bassiana phát tán trong không khí tiếp xúc và xâm nhập vào cơ

Beauvericin

thể côn trùng qua lớp vỏ kitin ngoài (epicuticle) gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm xuyên qua lớp kitin, phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện tế bào nấm đầu tiên (có dạng chuỗi ngắn như nấm men), tiết độc tố beauvericin, bassianolide, oosporein và một số chất khác để hủy diệt tế bào bạch huyết (lympho-cyte), làm tê liệt hoặc gây ức chế miễn dịch côn trùng Khi độc tố nấm đã tiêu diệt hết tế bào bạch huyết côn trùng sẽ bị chết, cơ thể côn trùng bị khô và cứng do các sợi nấm đan xen lại mọc phủ bên ngoài cơ thể [4], [14] [29]

1.4.2 Độc tố và cơ chế tác động của nấm Metarhizium anisopliae

Độc tố diệt côn trùng của nấm M anisopliae

Tumura (1964), Cuyama (1965 – 1966) đã phát hiện trong huyết tương của côn

trùng bị nhiễm nấm M anisopliae và trong dịch nuôi cấy nấm này có sự hiện diện của độc tố Độc tố diệt côn trùng của nấm M anisopliae gồm một số ngoại độc tố có tên là

destruxin A và destruxin B, là một phức hợp có nhiều chất đồng phân, là các sản phẩm thứ cấp depxipeptit Destruxin A có công thức nguyên là C29H47O7N5 có điểm sôi là

1880C Destruxin B có công thức nguyên là C30H50O7N5, có điểm sôi là 2340C (hình 1.7) Cấu trúc cơ bản gồm 5 aminoacid và một α-hytroxy acid Destruxin gây chán ăn, gây ngộ độc cho côn trùng sau khi hấp thụ vào da [42] Một số destruxin làm tê liệt côn trùng [85] và một số destruxin khác gây ức chế miễn dịch [62] Từ những năm 1961 –

1962, Kodaira và cộng sự đã tách được độc tố destruxin A và destruxin B từ dịch nuôi

cấy nấm M anisopliae Trong khoảng thời gian từ năm 1965 - 1970, Tamura và cộng

sự đã tách được những độc tố trên từ môi trường Czapek - Dox có chưa 0,5% pepton

và từ 1 lít dịch nuôi cấy có thể nhận được từ 13 - 15 mg độc tố destruxin A và B Đến năm 1971 đã tổng hợp nhân tạo được destruxin B (trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004) [29]

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học độc tố destruxin A – B của nấm Metarhizium anisopliae

(Nguyễn Ngọc Tú và cs, 1997) [5]

Năm 1981, Pais và cộng sự [166] đã xác định được 14 loại depsipeptide từ môi

trường nuôi cấy nấm Metarhizium anisopliae Trong đó có 5 loại đã được biết trước đó

là destruxin A, B, C, D và desmethyldestruxin B Cấu trúc của các hợp chất mới được đặt tên là destruxin E, A1, A2, B1, B2, C2, D1, D2 và E1 Các khác biệt nằm ở chuỗi peptide, ví dụ như chứa pipecolic acid thay vì proline và chứa valine thay vì isoleucine Trong khi Strasser và cs (2000) [207], Vey và cs (2001) [214] cho rằng có hơn 28 loại destruxin khác nhau đã được xác định và mô tả thì Pedras và cs (2002) [168] liệt kê tới

35 loại destruxin thuộc các nhóm A (9), nhóm B (10), nhóm C (3), nhóm D (3), nhóm

E (7), nhóm F (1) và 1 nhóm mới (gồm 2 pseudodestruxin) Liu và cs (2004) [135] cũng cho biết là có hơn 35 loại destruxin khác nhau đã được xác định đặc điểm

Các loại destruxin có rất nhiều hoạt tính sinh học và các hoạt tính này đã được

mô tả chi tiết bởi Roberts (1981) [179], Strasser và cs (2000) [207], Vey và cs (2001) [214], Pedras và cs (2002) [168] Các hoạt tính quan trọng nhất của các loại destruxin:

(1) Tác động lên côn trùng và có liên quan tới tính độc

(2) Tác động lên các tế bào khác nhau cũng như các dòng tế bào khác nhau (3) Tác động lên động vật có xương sống

nhà nghiên cứu nhận thấy rằng tính nhạy cảm của các loại côn trùng đối với destruxin khác nhau rất nhiều khi chất này được tiêm vào khoang máu Ở bộ côn trùng cánh vảy, triệu chứng xảy ra là triệu chứng uốn ván, và nếu sử dụng ở các liều cao hơn sẽ gây ra chứng liệt titanic

Destruxin E được xem là loại độc tố có hoạt tính diệt côn trùng nhóm chích hút cao nhất, Roberts và cs (1989) [180] cho biết khoảng 50% cá thể rệp bị chết khi sử dụng destruxin E ở liều lượng 0,4m/cm2 Tính ăn của rệp hại bắp cải Brevicoryne brassicae bị giảm khi cho 8,8 ppm destruxin E vào thức ăn Hoạt tính diệt côn trùng

của destruxin E cũng đã được chứng minh bởi Poprawski và cs (1994) [171], nhộng

của Empoasca vitis rất nhạy cảm với destruxin E khi phun trên lá khoai tây hay phun trực tiếp lên côn trùng Ấu trùng Pieris brassicae và Agrotis segetum tuổi 1 cũng được

thử nghiệm phun dịch trích destruxin thô với tỷ lệ chết trên 70%, trong khi đó destruxin A được báo cáo là có ít hoạt tính nhất đối với các loại côn trùng này Trong các thí nghiệm khác, các tính chất làm côn trùng chán ăn khi dùng các loại destruxin A,

B và E liều thấp cũng được ghi nhận bởi Amiri và cs (1999) [42], Krasnoff và cs (1996) [122] Nguồn thức ăn là lá bắp cải có phun destruxin A, B và E sẽ làm giảm tính

ăn của ấu trùng Plutella xylostella và Phaedon cochlearia một cách đáng kể Cũng

trong báo cáo này, destruxin B được ghi nhận là không có hoạt tính ở nồng độ 400ppm

Cơ chế tác động của nấm M anisopliae lên côn trùng

Khi tiếp xúc với lớp kitin ngoài của côn trùng, bào tử M anisopliae sẽ nảy mầm

tạo thành ống mầm, túi ngoại bào hoặc túi áp suất xuyên qua lớp kitin tới lớp kitin non (procuticle), đỉnh đĩa bám (appressorium) phình to hình thành các phiến xâm nhiễm phát triển phân nhánh tạo nên một mạng sợi nấm chằng chịt bên trong cơ thể và tiết các độc tố destruxin A, B để giết chết côn trùng [60]

Bào tử Metarhizium xâm nhập vào lớp kitin của côn trùng được là do sự phối

hợp giữa các enzyme phân hủy kitin và áp lực cơ học Đầu tiên, các enzyme làm mềm lớp sáp trên vỏ kitin và tạo ra các lỗ thủng chung quanh vòi xâm nhiễm giúp cho ống mầm xâm nhập sâu vào bên trong khoang ruột và tế bào máu của ký chủ Nhóm enzyme phân hủy kitin gồm có subtilisin-like protenase, esterase, lipase, trysin,

aminopeptidase và chitinase Enzyme phân hủy protein là một endoprotease Pr1 (vì các

protein bao bọc các sợi kitin phải được phân hủy trước khi men chitinase hoạt động)

Pr1 chủ yếu được tổng hợp trong quá trình hình thành đĩa bám trên bề mặt rắn hay trên lớp kitin của côn trùng Ngoài Pr1 còn có một số endoprotease khác như Pr1b, Pr2, Pr3, Pr4 và metalloproteinase hổ trợ cho Pr1 hoạt động và vai trò của Pr1 là nhân tố

chính làm tăng khả năng xâm nhiễm của nấm, kết hợp với cyclodepsipeptide (destruxin) giết chết côn trùng một cách nhanh chóng [119], [125], [216]

1.5 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM TRONG CƠ THỂ CÔN TRÙNG

Giai đoạn phát triển của nấm từ khi xâm nhiễm vào trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết là giai đoạn sống ký sinh của nấm Ở giai đoạn này, nấm thường

A, Bào tử nấm

B, Bào tử nảy mầm, xâm nhập qua lớp cutin

C, Tiết độc tố diệt tế bào bạch huyết

D, Phá hủy tế bào máu

tạo rất nhiều sợi nấm ngắn, phân tán khắp cơ thể theo dịch máu Trước khi nấm sinh sản phát triển trong máu, phải vượt qua phản ứng phòng vệ của côn trùng và sự tạo độc

tố của nấm có thể làm suy yếu phản ứng tự vệ của côn trùng Côn trùng có thể phản ứng với sự xâm nhiễm của nấm bằng cách sử dụng dịch thể như phenoloxidase, lectins Peptid và protein, hoặc sử dụng cơ chế của vách tế bào như sự thực bào hoặc kết nang [14], [57] Côn trùng chết có thể là kết quả của sự phối hợp các hoạt động như làm giảm dinh dưỡng, làm tắc nghẽn cơ thể hoặc sự xâm lấn của các cơ quan và tác động

của độc tố với côn trùng Đối với nấm B bassiana, tạo ra phức hợp độc tố gồm beauvericin, bassianolide và oosporein, nấm M anisopliae tạo độc tố destruxin làm tê

liệt côn trùng [84], [85] hoặc gây ức chế miễn dịch [62] Sau khi côn trùng chết, nấm thường phát triển hoại sinh trong ký chủ Gặp điều kiện thích hợp nấm tạo thành từng lớp bào tử ở bề mặt cơ thể vật chủ và bị phóng thích đi Bào tử phát tán thụ động nhờ gió, mưa và những yếu tố khác

1.6 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA NẤM Beauveria bassiana VÀ Metarhizium

anisopliae

Hiện nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong việc định danh các mẫu nấm dựa vào cơ sở dữ liệu ở mức độ DNA, protein, hoặc enzyme Dữ liệu được tập hợp dưới dạng nguồn dữ liệu mở cho phép các nhà nghiên cứu sử dụng kết

quả đề tham khảo và so sánh đánh giá Đối với nấm Beauveria và Metarhizium, sự đa

dạng di truyền, phân tích PCR-RFLP vùng rDNA, RAPD và phân tích isozyme đã được thực hiện [68], [98], [125], [126], [174] Đặc biệt trình tự vùng rDNA-ITS đã

được nhiều tác giả sử dụng để phân nhóm và xác định đặc điểm di truyền của nấm B bassiana và M anisopliae thu thập ngoài tự nhiên [141], [148], [208]

1.6.1 Vai trò vùng rDNA-ITS

rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá rDNA của sinh vật có nhân thật chứa 40 bản sao hoặc hơn của một cấu trúc gen rRNA 28S, 18S, 5.8S và 5S sắp xếp thành một chuỗi lặp lại nằm nối tiếp nhau, chứa nhiều vùng bảo tồn và biến động trên

toàn bộ chiều dài [218] Ở đầu 5’ của 18S và đầu 3’ của 28S có một vùng được gọi là vùng bảo tồn bên ngoài (external transcribed spacer- ETS) Giữa 18S và 5.8S, giữa 5.8S và 28S lần lượt là 2 vùng bảo tồn bên trong (internal transcribed spacer 1-ITS1 và internal transcribed spacer 2-ITS2) (hình 1.9) Giữa các bản sao của gen rDNA có một vùng được gọi là intergenic spacer (IGS) thường biến đổi ngay cả trong cùng loài [5], [55], [56], [138], [141] Nghiên cứu so sánh trình tự rDNA đóng vai trò quan trọng định danh loài, xác định quan hệ di truyền và đặc biệt có ý nghĩa trong ngành phân loại nấm Từ trước đến nay, nấm thường được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái học,

cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein [98] Hiện nay, với sự phát triển của các kỹ thuật phân tử, các so sánh dựa trên trình tự nucleotide được xem

là cơ sở quan trọng để nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể có hình thái giống nhau bởi vì sự khác biệt này ít bị thay đổi bởi điều kiện ngoại cảnh [55], [100]

phiên mã bên ngoài; ITS: vùng phiên mã bên trong (www.plantbio.berkeley.edu)

1.6.2 Sự khác biệt di truyền của nấm Beauveria

Nấm Beauveria được phát hiện cách đây gần 2 thế kỷ, là vi sinh vật được sử

dụng nhiều cho nghiên cứu về nấm gây bệnh trên côn trùng [68] Tuy nhiên, những

nghiên cứu về sự tiến hóa và di truyền của Beauveria chỉ mới bắt đầu từ những năm

1980 khi có sự phát triển của nhiều kỹ thuật phân tử và phương pháp phân tích di truyền tạo sự thuận lợi tiến bộ trong việc phân loại, hệ thống phát sinh và đa dạng quần

thể của nấm Beauveria Trong suốt những năm 1980 đến 1990, đa số những nghiên

cứu đã được công bố tập trung vào các lĩnh vực phân loại hóa học, sinh hóa và các kỹ

thuật phân tử để phân tích sự khác biệt di truyền và mối quan hệ trong chi Beauveria

[176], [198] (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các kỹ thuật phân tử được sử dụng để nghiên cứu di truyền, mối quan hệ

tiến hóa và phát sinh loài của nấm Beauveria [206]

1988, St Leger và cs,1992

Hình thái học/sinh hóa học/men

acetyesterase/ men thủy phân casein Mugnai và cs, 1989

Đọc trình tự vùng bảo toàn ribosome (rDNA) Rakotonirainy và cs,1991

Phân tích sự đa hình dựa vào sự khác biệt về

kích thước đoạn DNA được phân cắt bởi các

men cắt khác nhau

Kosir và cs,1991, Maurer và cs, 1997

Phân tích sự bất bình thường của nhiễm sắc

Chỉ thị phân tử chuyên biệt cho phân loại dựa

vào sự khác biệt về cấu trúc của sản phẩm

PCR chuỗi đơn

Hegedus và Khachatourians, 1993a,

1996 Phân tích sự đa hình dựa vào sự khác biệt

những đoạn DNA phân cắt từ DNA ti thể Hegedus và cs, 1993b

Phân tích sự đa hình dựa vào sự khác biệt về

kích thước đoạn DNA được phân cắt bởi các

men cắt khác nhau và trình tự vùng ITS

Neuvéglise và cs, 1994

Trình tự vùng intron của ribosome Neuvéglise và Brygoo, 1994,

Neuvéglise và cs, 1996 Chỉ thị phân tử dựa vào sự khác biệt các đoạn

DNA được khuyếch đại bởi các primer có

trình tự ngẫu nhiên

Bidochka và cs,1994; Cravanzola và cs,1997; Maurer và cs,1997

Chỉ thị về hình thái và chỉ thị phân tử RAPD Glare và Inwood, 1998

Như vậy, từng loại marker phân tử khác nhau sẽ có những thông tin khác nhau giúp cho việc đánh giá chính xác hơn là chỉ dùng đặc điểm hình thái như trước đây Theo Stephen (2005) [206], các kỹ thuật như huyết thanh học, sự đa hình sợi đơn, isozyme, phân loại hóa học, ribosome DNA introns, AFLP dù có hữu dụng đến mấy cũng không thể đánh giá một các hoàn hảo sự khác biệt di truyền Gần đây, hầu hết các phương pháp này được thay thế bằng việc dùng dữ liệu trình tự nucleotide để phân tích

quan hệ di truyền trong chi Beauveria Dựa vào đa hình vùng ITS, sự khác biệt trên

vùng rDNA, Hegedus và cs (1996) [105], Huang và cs (2002) [108], Michael và cs

(2005) [148] đã phân nhóm được các loài trong chi Beauveria theo nguồn gốc địa lý và theo hình dạng bào tử cũng như đã chứng minh Cordyceps staphylinaedicola và Beauveria bassiana xếp cùng nhóm di truyền và có mối quan hệ gần với nhau, còn loài Cordyceps scarabaeicola có quan hệ gần với loài B caledonica [176], [206], [208]

Nguồn gốc phát sinh của nấm Beauveria

Theo Bidochka và cs (2002) [51], Clarkson và cs (1998) [68], Stephen (2005)

[206], nguồn gốc của Beauveria là từ nấm Clavicipitaceous hoặc Pyrenomycetes, tuy

nhiên dựa vào vùng SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA) thì nguồn gốc phát

sinh loài trong chi Beauveria cùng nguồn gốc xuất phát từ Sordariomycetes

(Hypocreales:Clavicipitaceae) Gần đây, Stephen (2005) [206] đã cho biết để xác định

nguồn gốc Beauveria cần phải dựa vào các vị trí khác nhau trên vùng SSU-rRNA hoặc

dựa trên sự phân tích các vị trí tương đồng trên vùng ITS Một nghiên cứu khác về

nguồn gốc và sự phân ly của Beauveria là dựa trên các vị trí tương đồng của các

introns, trình tự không mã hóa Từ phân tích vùng ITS tác giả đã rút ra kết luận là mối

quan hệ giữa Beauveria và kiểu giới tính của nấm Cordyceps, như là mối quan hệ giữa Cordyceps militaris đối với Beauveria và vị trí của Cordyceps scarabaeicola trong chi Beauveria là cùng một nhánh với B caledonica

Kết quả tương tự khi phân tích sự khác biệt di truyền dựa trên dữ liệu vùng

ITS1 - 5.8S - ITS2 cũng đã được Rehner và cs (2004) [176] báo cáo B bassiana là

một nhánh của 2 nhóm khác nhau và đã được chứng minh là có phổ ký chủ tương đối rộng với nhiều nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc trừ sâu sinh học thương mại như Mycontrol, Botanigard, Boverin để trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng trên đồng ruộng

Tính chuyên hóa ký chủ

Có nhiều kết luận từ những nghiên cứu trước đây về tính chuyên hóa ký chủ của

nấm Beauveria Những nghiên cứu này báo cáo về sự tương quan giữa các dữ liệu

marker di truyền (isozyme, RAPD, ITS, RFLP) và sự chuyên hóa ký chủ [49], [72],

[73], [159] [172] Ngược lại, kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác cho rằng khi

sử dụng những phương pháp định danh khác, ở những lần phân lập khác nhau cho thấy không có mối tương quan có ý nghĩa thống kê giữa kiểu gen và sự chuyên hóa ký chủ,

về mối tương quan giữa kiếu gen và nguồn gốc ký chủ Kết quả nghiên cứu ở cấp độ

phân tử của Rehner và cs (2004) [176] đã xếp Beauveria thành 4 nhóm A, B, C, D trong đó nhóm B (B brongniartii) và nhóm D (B caledonica, B vermiconia) có sự chuyên biệt ở một bộ côn trùng (chỉ gây bệnh cho Melolontha melolontha trong bộ Coleoptera) Sự chuyên hóa ký chủ được xem là rất rộng trong nhóm A (B bassiana)

và C (hình dạng bào tử gần giống với B bassiana) ký sinh gây bệnh trên 7 bộ côn

trùng khác nhau nhưng qua kiểm tra hoán vị cho thấy không phân biệt được sự chuyên biệt ký chủ trong 2 nhóm này [143], [206] Ngược lại, Neuveglise và cs (1994) [159] cho rằng có sự tương quan giữa kiểu gen và sự chuyên hóa ký chủ, các mẫu nấm thu thập trên ký chủ nào, ở địa phương nào sẽ gây bệnh cao cho chính ký chủ đó ở tại nơi thu mẫu

Di truyền quần thể nấm Beauveria

Hiện nay có rất ít nghiên cứu về sự đa dạng allen, sự kết hợp allen, các kiểu sao

chép, các quần thể khác biệt, hoặc di cư kiểu gen (gen flow) của nấm Beauveria Các nghiên cứu về di truyền quần thể của Beauveria gặp nhiều phức tạp do thiếu các dữ

liệu đặc trưng của loài và quần thể, thiếu các marker di truyền liên quan, ảnh hưởng trực tiếp đến việc mô tả loài và các mối quan hệ di truyền Các nghiên cứu trước đây về

quần thể nấm B bassiana và B brongniartii đã được tiến hành với các marker di

truyền như phân tích RFLP [159], hoặc RAPD [49], [73] Mặc dù các nghiên cứu này

đã chứng minh được sự khác biệt di truyền, kiểu marker và phương pháp phân tích dữ liệu nhưng cũng không cung cấp nhiều thông tin cho việc xác định cấu trúc quần thể

Do vậy, cần thiết là phải phân nhóm từ cá thể đến quần thể [51], [188] Mặt khác, sự phân tích đa gen rất có giá trị cho phân tích di truyền quần thể, đến những phân nhánh nhỏ nhất xung quanh quần thể đang tồn tại Thêm vào đó, chẩn đoán nguồn gốc phát sinh loài dựa vào nhiều locus, các thông số di truyền của quần thể là rất cần thiết