NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI TRÌNH TĂNG SINH Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA SẢN PHẨM B. subtilis Rd2.11 LỎNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY DƯA LEO

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI TRÌNH TĂNG SINH Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA SẢN PHẨM B. subtilis Rd2.11 LỎNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY DƯA LEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….WUX…

TRẦN THỊ NGỌC HIỀN

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI TRÌNH

TĂNG SINH Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG

CỦA SẢN PHẨM B subtilis Rd2.11 LỎNG

LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY

DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 4/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….WUX…

TRẦN THỊ NGỌC HIỀN

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI

TRÌNH TĂNG SINH Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA SẢN PHẨM B subtilis Rd2.11 LỎNG

LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY

DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI TRÌNH TĂNG SINH

Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA SẢN PHẨM

B subtilis Rd2.11 LỎNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

Đại học Nông Lâm TP HCM

3 Phản biện 1: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM

4 Phản biện 2: TS TỪ THỊ MỸ THUẬN

Đại học Nông Lâm TP HCM

5 Ủy viên: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Đại học Nông Lâm TP HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

Tình trạng gia đình: chưa lập gia đình

Địa chỉ liên lạc: 129/A1, ấp 2/5, xã Long Hậu – Cần Giuộc – Long An Điện thoại: 0838903167, 0988415536

Email ( Fax): hienbl1901@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Trần Thị Ngọc Hiền

LỜI CẢM TẠ

Chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến,

Quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học

TS Lê Đình Đôn, Viện trưởng - Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và TS Nguyễn Văn Hùng, Trưởng Bộ môn Cơ điện tử, trường Đại học Nông Lâm TP HCM đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành tốt luận văn PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân và tập thể cán bộ Phòng Đào tạo Sau Đại học trường Đại học Nông Lâm TP HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cô Phạm Thị Minh Kiều, Bộ môn Bảo vệ Thực vật – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông Lâm TP HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi thực hiện tốt luận văn

TS Trần Thị Lệ Minh, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm TP HCM đã dìu dắt lớp tôi trong suốt thời gian học

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình tăng sinh Bacillus

subtilis Rd2.11 và đánh giá tác động của sản phẩm B subtilis Rd2.11 lỏng lên sự

phát triển của cây dưa leo (Cucumis sativus L.)” được tiến hành tại Trại thực

nghiệm – Bộ môn Công nghệ Sinh học, phòng thí nghiệm – Bộ môn Bảo vệ Thực vật – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4 năm 2009 đến tháng 4 năm 2010

B subtilis có khả năng đối kháng với nhiều loài nấm gây bệnh trên cây trồng,

đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và chế tạo chế phẩm phòng trừ sinh học đối với các loại bệnh trên cây trồng Trong đề tài này tập trung nghiên cứu dòng

B subtilis Rd2.11 với thí nghiệm xác định các thông số tối ưu của các yếu tố ảnh

hưởng đến qui trình tăng sinh B subtilis Rd2.11, tính ổn định của qui trình và thí nghiệm sinh học đánh giá tác động của sản phẩm B subtilis Rd2.11 lỏng lên sự phát

triển của cây dưa leo trồng ngoài đồng

Kết quả qui hoạch thực nghiệm mức độ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

(mật số B subtilis) của 3 yếu tố môi trường, tốc độ khuấy và thời gian lên men đã

tìm được qui trình tăng sinh đạt mật số cao với môi trường có thành phần gồm: 2% bột đậu nành, 0,05% mật rỉ và 0,3% KH2PO4; tốc độ khuấy 200 vòng/phút và thời

gian nuôi cấy B subtilis Rd2.11 ở 48 giờ là thích hợp nhất Mật số B subtilis

Rd2.11 chưa ổn định giữa các lần tăng sinh khác nhau vì có sự suy giảm rất mạnh

về mật số trong dung dịch sau thời gian tồn trữ 3 tháng B subtilis Rd2.11 vẫn lưu

giữ được đặc tính trong quá trình nuôi cấy và có tác động kích thích sự phát triển của cây dưa leo trồng ngoài đồng

ABSTRACT

The thesis “Studying the effects of the fermented process of Bacillus subtilis Rd2.11 and assessing the effects of the finished product of liquid B subtilis Rd2.11

on the growth of cucumber (Cucumis sativus L.)” was conducted at the Department

of Biotechnology, Laboratory of the Plant Protection Department, the Faculty of Argonomy, Nong Lam University in Ho Chi Minh city from April 2009 through April 2010

B subtilis was abled to antagonize different kinds of plant fungus, has been

studied and used to make preventive products for plant diseases This thesis focuses

on studing B subtilis Rd2.11 with the experiment defining optimal data of the effects of the fermentation of B subtilis Rd2.11, the stability of fermentation and biological experiments assessing the effects of the liquid B subtilis Rd2.11 on the

growth of the cucumber in the field

The experiment of the effects of 3 factors including the fermented medium,

stirring velocity and fermented time on the product quality (density of B subtilis) showed that the fermented process of B subtilis Rd2.11 reached high density in the

fermented medium of including 2% soy-bean flour, 0.05% molasses and 0.3%

KH2PO4, with the stirring velocity of 200 rpm and the most appropriate fermented

condition of 48 hours With the ratios for monitoring the density of B subtilis Rd2.11 in the liquid B subtilis Rd2.11, after a period of 3 months, it indicates that there is a drastic decrease in the density of the B subtilis Rd2.11 Thus, B subtilis

Rd2.11 does not show high stability because the fermentation equipment is

defective For biological experiment assessing the effects of the liquid B subtilis Rd2.11 on the growth of cucumber in the field, all the results showed that B subtilis Rd2.11 had useful effects of stimulating the growth of cucumber This showed the stable activity of B subtilis Rd2.11 in the culture processing

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời can đoan iii

Cảm tạ iv

Tóm tắt v

Abstract vi

Mục lục vii

Danh sách hình xi

Danh sách bảng xiii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Yêu cầu 3

2 TỔNG QUAN VÀ LÝ THUYẾT 4

2.1 Bacillus subtilis 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện 4

2.1.2 Phân loại Bacillus subtilis 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis 5

2.1.4 Sự phân bố, sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis 5

2.1.4.1 Sự phân bố của B subtilis 5

2.1.4.2 Sự sinh trưởng và phát triển của B subtilis 6

2.1.5 Bào tử và khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis 6

2.1.6 Tính đối kháng của Bacillus subtilis 8

2.1.7 Những ứng dụng từ Bacillus subtilis 10

2.1.8 Tình hình nghiên cứu Bacillus subtilis trong và ngoài nước 14

2.1.8.1 Tình hình nghiên cứu B subtilis ngoài nước 14

2.1.8.2 Tình hình nghiên cứu B subtilis trong nước 15

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis trong quá trình nhân sinh khối 17

2.3 Sơ lược về hệ thống lên men tạo chế phẩm sinh học 18

2.3.1 Kỹ thuật lên men 18

2.3.2 Các phương pháp lên men 18

2.3.3 Hệ thống lên men 19

2.3.3.1 Thiết bị lên men ngoài nước 19

2.3.3.2 Hệ thống thiết bị lên men trong nước 25

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Thời gian thực hiện 28

3.2 Địa điểm 28

3.3 Nội dung nghiên cứu 28

3.4 Vật liệu nghiên cứu 28

3.4.1 Nguyên vật liệu 28

3.4.2 Môi trường - Hóa chất 29

3.4.3 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm 29

3.5 Phương pháp nghiên cứu 29

3.5.1 Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis Rd2.11 29

3.5.2 Phương pháp bố trí các thí nghiệm 30

3.5.2.1 Cơ sở chọn các yếu tố đầu vào (X) và đầu ra (Y) 30

3.5.2.2 Giả định bài toán hộp đen 30

3.5.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 32

3.5.3 Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm B subtilis Rd2.11 lỏng 35

3.5.3.1 Phương pháp xác định mật số B subtilis Rd2.11 35

3.5.3.2 Phương pháp đánh giá tác động của sản phẩm B subtilis Rd2.11

lỏng lên sự phát triển của cây dưa leo trồng ngoài đồng 36

3.5.3.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu theo dõi diễn biến mật số B subtilis Rd2.11 trong 3 tháng ở nhiệt độ phòng 36

3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 37

3.5.4.1 Xử lý thống kê 37

3.5.4.2 Tính toán tối ưu hóa 37

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Kết quả qui hoạch thực nghiệm xác định các thông số tối ưu của thiết bị lên men Bacillus subtilis Rd2.11 39

4.1.1 Kết quả khử trùng đường ống dẫn khí, dẫn hơi và thiết bị

lên men 39

4.1.2 Kết quả khử trùng môi trường 39

4.2 Kết quả xác định các thông số tối ưu cho các yếu tố tác động lên qui trình nhân sinh khối Bacillus subtilis Rd2.11 41

4.2.1 Kết quả xác định mật số Bacillus subtilis Rd2.11 41

4.2.2 Kết quả so sánh sự khác biệt về mật số B subtilis Rd2.11 43

4.2.3 Xác định các thông số tối ưu cho các yếu tố tác động lên qui trình tăng sinh B subtilis Rd2.11 50

4.2.4 Kết quả theo dõi chỉ tiêu diễn biến mật số B subtilis Rd2.11

trong 3 tháng ở nhiệt độ phòng 53

4.3 Kết quả đánh giá tác động của sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng lên sự phát triển của cây dưa leo trồng ngoài đồng 57

4.4 Thảo luận chung 60

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

5.1 Kết luận 64

5.2 Đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 70

Phụ lục 1: Kết quả khảo nghiệm chạy khử trùng hệ thống lên men năng

suất 50 lít/mẽ 70 Phụ lục 2: Bảng kết quả phân tích thống kê xác định các thông số tối ưu

cho các yếu tố tác động lên qui trình nhân sinh khối

Bacillus subtilis Rd2.11 73

Phụ lục 3: Bảng kết quả phân tích thống kê đánh giá tác động của sản

phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng lên sự phát triển của

cây dưa leo trồng ngoài đồng 78

Phụ lục 4: Kết quả phân tích thống kê kiểm tra mật số Bacillus subtilis

Rd2.11 trong 3 tháng 86 Phụ lục 5: Một số hình ảnh về thiết bị lên men và kiểm tra mật số

B subtilis Rd2.11 88

DANH SÁCH HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Hình dạng Bacillus subtilis 5

Hình 2.2 Bacillus subtilis tạo bào tử 8

Hình 2.3 B subtilis tạo lớp màng bảo vệ rễ cây Arabidopsis thaliana 9

Hình 2.4 Bacillus subtilis đối kháng với đồng loại 10

Hình 2.5 Sản phẩm Natto – lên men đậu nành từ Bacillus subtilis 11

Hình 2.6 Sơ đồ qui trình chế biến đậu hũ lên men bởi B subtilis 12

Hình 2.7 Chế phẩm B subtilis dùng trong thủy sản 13

Hình 2.8 Sơ đồ quá trình lên men tạo chế phẩm sinh học 20

Hình 2.9 Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt có thể tích là 63m3 21

Hình 2.10 Thiết bị lên men dạng xilanh có đảo trộn bằng khí động học và thổi khí môi trường 23

Hình 2.11 Sơ đồ dây chuyền công nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy chìm 24

Hình 2.12 Sơ đồ dây chuyền công nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt 25

Hình 2.13 Sơ đồ hệ thống lên men tạo chế phẩm sinh học 26

Hình 2.14 Sơ đồ cấu tạo máy khuấy lên men 27

Hình 3.1 Mô hình bài toán hộp đen quá trình lên men 31

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm của phương pháp Box – Behnken với 3 yếu tố 32

Hình 3.3 Sơ đồ cụm thiết bị lên men 50 lít/mẻ 34

Hình 4.1 Biểu đồ diễn biến nhiệt độ trong nồi lên men theo thời gian ở chế độ khử trùng không tải 40

Hình 4.2 Biểu đồ diễn biến nhiệt độ trong nồi lên men theo thời gian ở chế độ khử trùng có tải 41

Hình 4.3 Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt về mật số B subtilis Rd2.11 theo môi

trường với 3 mức thời gian tương ứng 24, 48 và 72 giờ 44

Hình 4.4 Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt về mật số B subtilis Rd2.11 theo tốc độ khuấy với 3 mức thời gian tương ứng 24, 48 và 72 giờ 47

Hình 4.5 Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt về mật số B subtilis Rd2.11 theo thời gian 48

Hình 4.6 Khuẩn lạc B subtilis Rd2.11 trên môi trường PGA (ủ trong 24 giờ) 48

Hình 4.7 Khuẩn lạc B subtilis Rd2.11 trên môi trường PGA (ủ trong 24 giờ) 49

Hình 4.8 Khuẩn lạc B subtilis Rd2.11 trên môi trường PGA (ủ trong 24 giờ) 49

Hình 4.9 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của môi trường và tốc độ khuấy lên mật số B subtilis Rd2.11 trong quá trình nhân sinh khối 51

Hình 4.10 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thời gian lên mật số B subtilis Rd2.11 trong quá trình nhân sinh khối 52

Hình 4.11 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên mật số B subtilis Rd2.11 trong quá trình nhân sinh khối 53

Hình 4.12 Dung dịch B subtilis Rd2.11 lỏng sau 72 giờ tăng sinh được lưu trữ trong phòng thí nghiệm 54

Hình 4.13 Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt mật số B subtilis Rd2.11 sau 3 tháng và sau 72 giờ tăng sinh 54

Hình 4.14 Mật số B subtilis Rd2.11, nồng độ pha loảng 10-4 56

Hình 4.15 Cây dưa leo 5 ngày sau trồng 58

Hình 4.16 Cây dưa leo 10 ngày sau trồng 58

Hình 4.17. Cây dưa leo 15 ngày sau trồng 58

DANH SÁCH BẢNG

BẢNG TRANG Bảng 3.1 Miền thực nghiệm theo phương pháp Box – Behnken qui hoạch các

yếu tố ảnh hưởng đến qui trình nhân sinh khối B subtilis Rd2.11 33

Bảng 3.2 Ma trận thí nghiệm qui hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình nhân sinh khối B subtilis Rd2.11 33

Bảng 4.1 Mật số B subtilis Rd2.11 đạt được trong qui trình nhân sinh khối 42

Bảng 4.2 Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B subtilis Rd2.11 theo môi trường 43

Bảng 4.3 Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B subtilis Rd2.11 theo tốc độ khuấy 44

Bảng 4.4 Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B subtilis Rd2.11 theo thời gian 45

Bảng 4.5 Sự khác biệt về mật số B subtilis Rd2.11 theo thời gian 46

Bảng 4.6 Sự khác biệt về mật số B subtilis Rd2.11 theo môi trường 46

Bảng 4.7 Sự khác biệt về mật số B subtilis Rd2.11 theo tốc độ khuấy 46

Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra mật số Bacillus subtilis Rd2.11 trong 3 tháng 55

Bảng 4.9 Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B subtilis Rd2.11 ban đầu và sau lưu trữ 55

Bảng 4.10 Kết quả chiều cao trung bình của 10 cây dưa leo có xử lý và không xử lý sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng 57

Bảng 4.11 Kết quả so sánh chiều cao cây dưa leo có xử lý và không xử lý sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng 5 ngày sau trồng 59

Bảng 4.12 Kết quả so sánh chiều cao cây dưa leo có xử lý và không xử lý sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng 10 ngày sau trồng 59

Bảng 4.13 Kết quả so sánh chiều cao cây dưa leo có xử lý và không xử lý sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng 15 ngày sau trồng 59

ô nhiễm đất, việc sử dụng thuốc hóa học không theo chỉ dẫn cụ thể tạo ra sự dư thừa không chỉ tồn tại trong đất, trong nước mà còn bám vào rau, quả và nông sản gây ra hiện tượng ngộ độc, thậm chí dẫn đến tử vong ngày càng nhiều (Lương Đức Phẩm, 2000) Do đó, Việt Nam cũng như nhiều quốc gia trên thế giới đã cảnh báo và cấm

sử dụng nhiều loại thuốc hóa học, thúc đẩy xu hướng sử dụng đấu tranh sinh học ngày càng được chú ý

Tiến bộ của ngành Công nghệ Sinh học là đã tạo ra được những chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật Sản xuất những chế phẩm sinh học này dựa trên nền tảng khoa học là sự đấu tranh sinh tồn giữa các loài trong giới sinh vật Các

vi sinh vật muốn tồn tại phải tạo ra những vũ khí, ngoài khả năng thích nghi và khả năng sinh sản phát triển mạnh Vũ khí đó chính là những độc tố hoặc kháng sinh được tổng hợp bởi vi sinh vật trong suốt quá trình phát triển trong môi trường sống

có nhiều yếu tố cạnh tranh

Các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng ngày

càng phổ biến Trong đó, Bacillus subtilis từ lâu được xem như là một tác nhân

phòng trừ sinh học đối với các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng Một

số kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh được sản

sinh từ B subtilis như polymyxin, difficidin, subtilin, mycobacillin Trong các loại

kháng sinh trên thì mycobacillin có tác dụng kháng nấm mạnh nhất Dựa vào đặc

tính đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng B subtilis để phòng trị tác nhân gây bệnh trong đất phổ biến như Rhizoctonia, Fusarium, Pythium

và Phytophthora Nghiên cứu của Saman (2007) chất ethyl acetate ly trích từ B

subtilis CA32r có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Sclerotium ngay khi hạch

nấm bắt đầu nảy mầm Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã xuất hiện

nhiều sản phẩm bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ B subtilis như sản phẩm Subtilex của công ty Becker Underwood (Mỹ) dùng để phòng trị nấm Fusarium spp.,

Rhizoctonia spp và Pythium spp gây bệnh trên hạt và thối rễ Bên cạnh những ứng

dụng trong trồng trọt thì các chế phẩm từ B.subtilis cũng đã đóng góp rất lớn vào

chăn nuôi như năm 1993, Nguyễn Văn Đông đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm Biosubtyl dùng trong phòng và điều trị bệnh tiêu chảy heo con, giúp heo tăng trọng tốt

Tuy nhiên, để tạo ra được các chế phẩm sinh học từ B subtilis ứng dụng vào thực tế thì nghiên cứu về qui trình nhân sinh khối B subtilis là rất cần thiết Trong

đó, nghiên cứu các yếu tố tác động lên sinh khối B subtilis là vấn đề tiên quyết cho

xây dựng qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học

Từ thực tế trên, để xác định chính xác các thông số tối ưu cho quá trình tăng

sinh B subtilis, tên đề tài được đề nghị thực hiện là “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình tăng sinh Bacillus subtilis Rd2.11 và đánh giá tác động của

sản phẩm B subtilis Rd2.11 lỏng lên sự phát triển của cây dưa leo (Cucumis sativus L.)”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định các điều kiện tối ưu của các yếu tố tác động đến sinh khối B

subtilis Rd2.11 Từ đó, làm tiền đề xây dựng qui trình nhân sinh khối B subtilis

Rd2.11 đạt mật số cao, để sản xuất thử nghiệm các chế phẩm thuốc trừ bệnh sinh học ở qui mô công nghiệp, giúp phòng trừ bệnh hại cây trồng, nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi nhuận cao cho người dân

1.3 Yêu cầu

Xác định qui trình nhân sinh khối B subtilis Rd2.11 đạt mật số cao

Đánh giá tính ổn định của qui trình tăng sinh B subtilis Rd2.11

Đánh giá hoạt tính của B subtilis Rd2.11

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi

tổ chức Nazi của Đức Lúc đầu B subtilis được sử dụng chủ yếu để phòng trị bệnh

lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi

Năm 1949-1957 Henry và các cộng sự đã tách được các chủng thuần khiết

của B subtilis Từ “subtilis therapy” có nghĩa là “thuốc subtilis” ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa Ngày nay, B subtilis

đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên thế giới (Vũ Văn Ngữ, 1979)

2.1.2 Phân loại Bacillus subtilis

Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dưới kính hiển vi Bacillus xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que Do đó, một số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn

Tuy nhiên, Bacillus là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que, Gram

dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong ngành Firmicutes

Phân loại khoa học theo Cohn (1872), Bacillus subtilis thuộc:

Ngành (Phylum) Firmicutes

Lớp (class) Bacilli

Bộ (order) Bacillales

Họ (family) Bacillaceae

Chi (genus) Bacillus

Loài (species) B subtilis

(http://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus)

2.1.3 Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hình que, hai đầu tròn, bắt màu Gram +, kích

thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, đứng đơn lẽ hoặc hình chuổi ngắn, có khả năng di động (Hình 2.1) Sinh bào tử hình bầu dục, kích thước 1,5-1,8 x 0,8µm Ở điều kiện

1000C, bào tử của B subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ

thấp và sự khô cạn, với tác động của hóa chất và tia bức xạ (Holt, 1997)

2.1.4 Sự phân bố, sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis

2.1.4.1 Sự phân bố của B subtilis

B subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Phân bố hầu

hết trong tự nhiên, phần lớn B subtilis cư trú trong đất và rơm cỏ nên còn được gọi

là “trực khuẩn rơm cỏ” Thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 - 107 cfu/g Ảnh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do sự sản sinh ra các chất kích thích tăng trưởng cây, chất ức chế hoặc làm suy yếu các tác nhân gây bệnh cây trồng

Trong nước và đất bùn ở cửa sông cũng như ở nước biển đều có mặt bào tử

và tế bào B subtilis Đất nghèo dinh dưỡng như ở những vùng đất hoang, đất sa mạc thì sự hiện diện của B subtilis rất hiếm Ngoài ra, B subtilis còn có mặt trong

các thực phẩm như mắm, tương, chao; trong các nguyên liệu sản xuất bột mì, bột gạo (Nguyễn Đức Lượng, 2000)

Hình 2.1 Hình dạng Bacillus subtilis

(http://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus)

2.1.4.2 Sự sinh trưởng và phát triển của B subtilis

Sinh trưởng là sự gia tăng kích thước và khối lượng của tế bào, phát triển (hoặc sinh sản) là sự gia tăng số lượng tế bào Các tế bào vi khuẩn thường sinh sản bằng cách nhân đôi Vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng rất cao, tốc độ này tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng, mức độ hiếu khí Nếu giảm nhiệt độ 100C thì tốc độ sinh sản của vi khuẩn giảm từ 2 đến 3 lần (Lương Đức Phẩm, 2000)

Sự sinh trưởng của vi khuẩn có thể tạo ra sự trao đổi chất, nhưng để sản xuất một chất trao đổi như mong muốn thì cơ thể của vi khuẩn phải được sinh trưởng dưới những điều kiện nuôi cấy đặc biệt với tốc độ sinh trưởng đặc trưng Sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn liên quan chặt chẽ với các điều kiện của môi trường bên ngoài bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhau Đa số các yếu tố đó đều có một đặc tính tác dụng chung biểu hiện ở ba điểm hoạt động là tối thiểu, tối thích và cực đại

B subtilis có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 370C, phát triển bằng cách nẩy

mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid B subtilis không có không bào khi nuôi

trên môi trường thạch có glucose, chủ yếu gồm các loài sống hiếu khí

B subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, nhưng trong môi trường thiếu

oxy B subtilis vẫn phát triển được, pH thích hợp từ 7,0 - 7,4 B subtilis phát triển

trên hầu hết các môi trường cơ bản (như môi trường TSA (Trypticase Soya Agar), môi trường TSB (Trypticase Soya Broth), môi trường giá đậu-peptone (Nguyễn Duy Khánh, 2006)

2.1.5 Bào tử và khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn giúp cho vi khuẩn vượt qua

những điều kiện bất lợi của môi trường Bào tử của B subtilis có chứa các thành

phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ

giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới Bào tử B subtilis có dạng

elip đến hình cầu, kích thước chiều rộng từ 0,6 - 0,9 µm, chiều dài từ 1,0 - 1,5 µm, nằm giữa hoặc trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào

Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử (Hình 2.2) có khả năng chịu nhiệt, nhờ khả

năng tạo bào tử mà B subtilis có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (như

dinh dưỡng môi trường cạn kiệt, môi trường tích lủy sản phẩm trao đổi chất có hại, nhiệt độ cao) Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:

1 tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào,

2 tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo tiền bào tử (prospore),

3 tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ,

4 tổng hợp các lớp vỏ bào tử,

5 giải phóng bào tử

Theo Cappuccino (1992), khi môi trường sống thuận lợi thì bào tử B subtilis

sẽ hút nước và trương ra, vỏ sẽ bị phá hủy và bào tử sẽ nẩy mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới, quá trình nhân đôi xảy ra liên tục đạt được mật số tối đa Khi môi trường cạn kiệt dinh dưỡng và điều kiện sống không thuận lợi thì tế bào sinh dưỡng sẽ xuất hiện nội bào tử bên trong

Bào tử B subtilis có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học

như nhiệt độ, tia cực tím, áp suất, chất sát trùng và chất hút ẩm Bào tử có khả năng chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của môi trường là do cấu tạo trạng thái sinh học của bào tử đã thay đổi nhiều so với thể sinh dưỡng Vỏ bào tử chứa nhiều lipid

và dày làm hạn chế rất nhiều sự xâm nhập của các chất hóa học, đồng thời cấu trúc xốp của màng lại là vật cách nhiệt khá tốt

Lượng nước trong bào tử rất ít, phần lớn ở trạng thái liên kết làm cho sức chịu đựng của bào tử với môi trường nhất là với nhiệt độ tăng lên rất nhiều Trong bào tử có chứa một lượng lớn ion Ca++ và dipicolinic acid nên có giả thuyết cho rằng việc tạo phức hợp bền vững của Ca++- DPA sẽ dẫn đến sự ngưng kết các polymer sinh học trong bào tử và do đó làm tăng khả năng chịu nhiệt của bào tử do làm giảm sự biến tính của protein

Hơn nữa, các hệ enzyme trong bào tử ở trạng thái gần như không hoạt động,

các phản ứng sinh hóa gần như không xảy ra và điều này đã giúp cho bào tử B

subtilis có thể tồn tại ở trong trạng thái nghỉ trong thời gian dài hàng ngàn năm

(Cappuccino, 1992)

Hình 2.2 Bacillus subtilis tạo bào tử

(http://www.microbelibrary.org)

2.1.6 Tính đối kháng của Bacillus subtilis

B subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:

subtilin, subtilisin A, sublancin, bacilisocin, polymyxin, difficidin, mycobacillin, có tác dụng ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh, kháng khuẩn và nấm rất hữu ích Trong các loại kháng sinh trên, mycobacillin có tác dụng kháng nấm mạnh

nhất Cơ chế đối kháng của B subtilis chủ yếu dựa vào khả năng tổng hợp các loại

kháng sinh trên, đa số là các acid amin dạng chuỗi và dạng vòng; khả năng tạo ra các chất dể chuyển hóa bên ngoài thành tế bào có thể ức chế hoạt động của nhiều

loại nấm gây hại (Loeffler, 1986) Bên cạnh đó, B subtilis còn có khả năng tạo ra

các enzyme: cellulase, chitinase, và β-1,3-glucanase Các enzyme này có thể phân giải màng tế bào của nhiều loại nấm gây hại cây trồng (Marten, 2000)

Loeffler và ctv (1986) đã nghiên cứu khả năng tạo phức chất dipeptide

bacilysin của vài loài thuộc chi Bacillus bao gồm: B subtilis, B pumilus, B

coagulans và B licheniformic Thành phần của lipopeptid do Bacillus tiết ra bao

Nội bào tử

Tế bào sinh dưỡng

gồm: fengymycin, bacilysin và fencimycin có khả năng kháng nấm Bacilysin đã kìm hãm các men, fencimycin kìm hãm vi khuẩn và khuẩn ty Fencimycin ít độc đối

với cây trồng thử nghiệm và chống lại Rhizotonia solani tốt hơn các chất kháng sinh khác Công trình nghiên cứu của Tschen (1987) về phòng trừ Rhizotonia solani bởi

B subtilis đã kết luận rằng fengymycin được sản xuất bởi B subtilis F-29-3 có khả

năng bảo vệ cây trồng, hạn chế sự xâm nhiễm của Rhizotonia solani Một nghiên cứu khác trên B subtilis được phân lập từ vùng rể lúa là một loại vi khuẩn đối kháng với Rhizotonia solani và kích thích sự hình thành của rể lúa Thí nghiệm

đánh giá khả năng phòng trừ bệnh trên nhiều ruộng khác nhau cho thấy chỉ số bệnh giảm gần 66% và tăng năng suất từ 7,7% đến 26,5% (Tang và ctv, 1996)

Theo Harsh Bais, chuyên gia về thực vật và đất của Đại học Delaware (Mỹ)

đã theo dõi Arabidopsis thaliana - một loài hoa nhỏ, khi bị vi khuẩn Pseudomonas

syringae tấn công, rễ của Arabidopsis thaliana sẽ tiết ra axit malic để thu hút B subtilis B subtilis có khả năng tạo ra một màng có các đặc tính chống vi khuẩn

quanh rễ cây (Hình 2.3)

Ngoài khả năng tổng hợp kháng sinh, B subtilis còn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng nên B subtilis có tính đối kháng trên cả đồng loại (Hình 2.4) và vi sinh vật gây bệnh khác Khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, B subtilis sẽ tiêu diệt

Ghi chú:

Rễ cây Arabidopsis thaliana phóng to với lớp màng bảo vệ

do B subtilis tạo ra được đánh

dấu bằng màu xanh lục

Hình 2.3 B subtilis tạo lớp màng bảo vệ rễ cây Arabidopsis thaliana

(http://www.wattpad.com/110103-thien-nhien-dac-biet)

những tế bào xung quanh để hút chất dinh dưỡng cho đến khi phải chuyển sang

sống tiềm sinh Ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào B

subtilis đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn xung quanh, hay

những vi khuẩn đồng loại ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này Chất kháng sinh

sẽ phá vỡ màng tế bào của những vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng

và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ

Hình 2.4 B subtilis đối kháng với đồng loại

(http://www.google.com.vn/search+bacillus+subtillis)

2.1.7 Những ứng dụng từ Bacillus subtilis

Ứng dụng trong y học: một số chế phẩm được sản xuất từ B subtilis thành

ống dạng lỏng như ống subtilis 10ml, hoặc thành gói dạng bột có tác dụng chữa trị tiêu chảy do Coliform và một số bệnh đường ruột khác, hoặc dùng để đắp vết

thương ngoài da Trong kháng chiến chống Pháp, B subtilis được giáo sư Đặng

Đức Trạch, Hoàng Thủy Nguyên (bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm

B subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy Ngoài ra, một số

chế phẩm được sản xuất từ B subtilis còn được dùng trong điều trị giảm viêm đường hô hấp Năm 1949, Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa B subtilis

chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng gói và viên nang (Nguyễn Văn Bá và ctv, 2001)

Ghi chú:

Những vi khuẩn còn sống (màu xanh) đang tiêu diệt những vi khuẩn chết (màu đỏ) để tránh rơi vào trạng thái tiềm sinh

Một chủng Bacillus subtilis trước đây được biết là Bacillus natto, dùng để

lên men đậu nành tạo sản phẩm Natto (Hình 2.5), một món ăn luôn có mặt trong bửa ăn truyền thống của người Nhật với rất nhiều công dụng rất có lợi cho sức khỏe như chống mệt mỏi, giảm nguy cơ suy tim, ngăn ngừa một số bệnh ung thư, giảm rủi ro về chứng huyết khối và ổn định sự cân bằng giữa đông máu và hủy fibrin trong máu nhằm tránh cho máu không bị ứ đọng sẽ giúp kéo dài cuộc sống chất lượng cao và tăng cường sức khỏe cho con người một cách an toàn và rẻ nhất

Ghi chú:

Sản phẩm Natto làm từ đậu nành nấu

chín, thêm gia vị và ủ lên men nhờ B

có enzyme trypsin và diastase

Hình 2.5 Sản phẩm Natto – lên men đậu nành từ B subtilis

(http://vietsciences.free.fr và http://vietsciences.org)

Việc sử dụng B subtilis lên men đậu tương đã trở thành những món ăn truyền thống của rất nhiều nước Châu Á, một ứng dụng khác từ B subtilis vào đậu

hũ lên men đã tạo ra sản phẩm dạng paste hay dạng bột (Hình 2.6) có khả năng hỗ trợ tiêu hóa rất tốt (Nguyễn Đức Lượng, 2000)

Hình 2.6 Sơ đồ qui trình chế biến đậu hũ lên men bởi B subtilis

(http://www.google.com.vn/search?q=vi+khu%E1%BA%A9n+bacillus+subtillis&hl=vi&start=20&sa=N/gaia21.net/marking.htm)

Ứng dụng trong công nghiệp: B subtilis được ứng dụng rông rãi trong việc

sản xuất ra enzyme và một số sản phẩm cho công nghiệp như: amylase, protease, aminoacid Trong đó, protease đã được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất

tẩy rữa B subtilis sản xuất ra amylase xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết

α-1,4 glucoside của các polysaccharide như tinh bột, glycogen Trong nhiều năm, Viện Sinh học nhiệt đới đã nghiên cứu hoàn thiện công nghệ nền sản xuất enzyme

α-amylase và protease từ vi khuẩn B subtilis bằng phương pháp lên men bán rắn

Sản phẩm có hoạt lực enzyme α-amylase 4.000 UI/g, protease 400 UI/g đã được sản

xuất tại Pilot Công nghệ Vi sinh với qui mô 1 tấn/tháng Sản phẩm enzyme đã được cung cấp cho các nhà máy sản xuất bia với qui mô nhỏ, các công ty sản xuất thức ăn gia súc, sản xuất thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản tại khu vực phía nam (Kiều Hữu Ảnh, 1999)

Ứng dụng trong nông nghiệp: B subtilis được ứng dụng vào sản xuất các

chế phẩm nhằm làm giảm tái phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với điều trị bằng kháng sinh; bổ sung trong thức ăn để cải thiện tiêu hóa, tăng sức sinh trưởng cho vật nuôi; làm chế phẩm dùng trong thủy sản (Hình 2.7) bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi

Hình 2.7 Chế phẩm B subtilis dùng trong thủy sản

(http://www.google.com.vn/search+bacillus+subtillis)

Chế phẩm B subtilis còn được dùng trong thủy phân phụ phẩm cá tra tạo

dịch đạm thủy phân đạt hàm lượng đạm amin cao, đạm amoniac thấp làm phân bón sinh học cho rau Sau khi bón loại phân này, rau cho năng suất cao và đạt tiêu chuẩn rau an toàn (Trần Thanh Dũng, 2008)

B subtilis được ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani và Fusarium sp B subtilis còn được phối trộn với một số chủng

nấm men, nấm mốc và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic

B subtilis sử dụng để sản xuất kháng sinh cho thực vật và nhiều ứng dụng khác

trong nông nghiệp như sự phát triển của B subtilis trong cây làm tăng sự tổng hợp

Ghi chú:

Chế phẩm B subtilis có công dụng phân hủy

các chất hữu cơ, thức ăn dư thừa trong ao; hấp thụ các độc tố gốc Chlo, thuốc trừ sâu và ổn định màu nước, pH

các peptide kháng khuẩn của vi khuẩn nốt rể, đồng thời những nghiên cứu này cũng

được ứng dụng rất nhiều trong khảo sát sinh học Bên cạnh đó, B subtilis giúp tăng

năng suất vụ mùa, mặc dù chưa biết nguyên nhân là do sự ức chế mầm bệnh hay

giúp cây trồng phát triển Ngoài ra, B subtilis còn được ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch vì B subtilis có thể tiêu diệt vi khuẩn gây thối

rau quả (Lê Văn Việt, 2007)

Bên cạnh những ứng dụng hữu ích, một số chủng B subtilis cũng như B

licheniformis, B pumulis và B megaterium còn gây ra nhiều tác hại cho cây trồng,

vật nuôi và con người như chúng có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme phá

vở màng tế bào động vật hữu nhủ ; B subtilis còn sản xuất độc tố ngoại bào là

subtilisin, mặc dù subtilisin có độc tính thấp nhưng có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây ra những bệnh viêm da, viêm đường

hô hấp B subtilis gây phân hủy pectin và polysaccharide của mô thực vật dẫn đến

thối củ ở khoai tây, gây bệnh chảy nhớt khoai tây; gây những vết viêm loét trên một

số cây rừng Ngoài ra, B subtilis còn là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa,

bánh ngọt, chocolate (Lê Văn Việt, 2007) Trần Thế Hải (2008) đã đánh giá tác

động của B subtilis trên một số cây trồng khác nhau và kết luận rằng ngoài tác dụng kháng một số loài nấm gây hại bảo vệ cây trồng, B subtilis còn có tác dụng ngược

lại - làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của một số cây trồng như cây cà chua hay cây ớt, làm cho rễ cà chua hóa nâu, ức chế sự tăng trưởng về chiều cao cây

và chiều dài rễ

2.1.8 Tình hình nghiên cứu Bacillus subtilis trong và ngoài nước

2.1.8.1 Tình hình nghiên cứu B subtilis ngoài nước

Mặc dù có hàng trăm, thậm chí hàng ngàn loài vi sinh vật được nghiên cứu

và cho thấy có khả năng tác động đối với việc kiểm soát các tác nhân gây hại cây trồng trong các điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới, ngoài đồng, nhưng chỉ có một

số ít loài được đăng ký và sử dụng rộng rãi Đó là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ

biến nhất là Pseudomonas spp và Bacillus spp (Burr và ctv, 1978; Weller và Cooker, 1983) (trích Nguyễn Trọng Thể, 2004)

Các dòng B subtilis là các dòng có tính ổn định và đối kháng cao, có thể

dùng trong phòng trừ bệnh do nhiều tác nhân gây ra Korsten (1997) đã thành công

trong việc kết hợp phun B subtilis và thuốc trừ nấm để phòng trừ bệnh đốm đen trước thu hoạch do Pseudocercospora purpurea gây ra trên quả lê ở Nam Phi Collins và Jacobsen (2003) đã dùng một dòng B subtilis để phòng trừ bệnh đốm lá trên củ cải đường do Cerospora beticola Trên cây lê Trung Quốc, bệnh rụng cuốn hoa đã làm giảm đáng kể năng suất trái, bệnh gây ra do tác nhân Colletotrichum

gloeosporioides, Thyronectria pseudotrichia và Phomopsis perseaea Demoz và

Korsten (2005) cũng đã dùng B subtilis để làm giảm đáng kể tỉ lệ bệnh do các tác

nhân này gây ra Võ Thanh Hoàng (1990) cho biết có ít nhất năm giống vi khuẩn đã

được tuyển chọn và có hiệu quả đối kháng với nấm bệnh, trong đó Bacillus spp và

Pseudomonas spp được đánh giá là có nhiều triển vọng Bacillus spp đặc biệt là B subtilis có hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh thối thân nâu trái Monilinia fructicola trên cây ăn trái và bệnh rỉ trên cây đậu (trích Huỳnh Tiến Đông, 2007)

Năm 1940, Yokohamo đã sử dụng chế phẩm B subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus

paraciticus Roman và các cộng sự đã nghiên cứu và cho biết B subtilis làm giảm

đi 40% đến 50% aflatoxin trong dịch chứa aflatoxin trong vòng 20 ngày Albot và

Boisson (1962) đã phát hiện B subtilis có tác dụng trong điều trị bệnh tiêu chảy do

lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với vi khuẩn lên men lactic chữa chứng loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả

2.1.8.2 Tình hình nghiên cứu B subtilis trong nước

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm có

nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng rất phát triển, đặc biệt là về B subtilis Bước đầu

đã tạo ra được những kết quả đáng chú ý Nguyễn Việt Long (2001) bước đầu đã

chọn được một số dòng Bacillus có khả năng phòng trừ bệnh đốm vằng trên lúa đối kháng với Rhizotonia solani trên ruộng lúa nước tại tỉnh Đồng Tháp Nguyễn Trung

Thành (2004) đã chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn đối kháng phân lập từ đất để

khống chế nấm Rhizotonia solani, Sclerotium rolfsii và Ralstonia solanacearum

Bước đầu đã chọn lọc được 47 dòng vi khuẩn Bacillus spp phân lập trên mẫu rể của

25 loại cây trồng khác nhau có tính đối kháng với nấm Rhizotonia solani,

Sclerotium rolfsii và Ralstonia solanacearum

Trần Thế Hải (2008) đã nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nhân sinh khối

Bacillus spp dòng Rd2.11 ở qui mô phòng thí nghiệm và chọn lọc được một qui

trình nhân sinh khối Bacillus spp đạt mật số cao với các yếu tố: môi trường (bột

đậu nành 20g/lít, KH2PO4 0,5g/lít, mật rỉ 3g/lít), tốc độ lắc 180 vòng/phút, thời gian

90 giờ và pH dao động trong khoảng từ 5,5 đến 7,5 là thích hợp cho sự sinh trưởng

và phát triển của Bacillus spp trong quá trình nhân sinh khối Đồng thời thí nghiệm

cũng đánh giá tác động của một số dòng vi khuẩn đối kháng trên cây trồng in vitro

và cho thấy rằng Bacillus spp ngoài tác dụng kháng một số loại nấm gây hại, bảo

vệ cây trồng thì một số dòng Bacillus spp cũng có tác dụng gây hại, làm giảm khả

năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Huỳnh Tiến Đông (2007), nghiên cứu, đánh giá khả năng phòng trị bệnh lỡ

cổ rễ do Rhizotonia solani gây ra trên cây cải ngọt của chế phẩm B subtilis và chế phẩm sinh học Citrex cho thấy B subtilis có tính kháng mạnh hơn, tác động ức chế

tác nhân gây bệnh cao hơn và hiệu quả hơn so với Citrex Bên cạnh đó, chiều cao và

năng suất cây cũng đạt cao hơn khi được xử lý với B subtilis

Năm 1971, Trần Minh Hùng và ctv đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm B

subtilis dạng viên nuôi cấy trên môi trường đậu tương Chế phẩm này dùng cho heo

uống từ 0,5 đến 1g/kg thể trọng, kết quả heo sau khi sử dụng chế phẩm B subtilis

tăng trọng nhanh Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm

chế phẩm coli - subtly (Echerichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát bệnh

tiêu chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt

Vũ Ngọc Bội (2004) nghiên cứu qui trình thủy phân protein cá bằng protease

từ B subtilis S5 Năm 2007, Lê Văn Việt đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, protease và phytase của một số chủng B subtilis và thử nghiệm

sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) Trung tâm sinh học liên hiệp sản xuất hóa

chất thuộc bộ công nghiệp nặng Tp HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm

Bactophyl từ B subtilis để phòng trừ các loại nấm gây bệnh trên rau cải

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis

trong quá trình nhân sinh khối

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của B

subtilis trong quá trình nhân sinh khối như: môi trường dinh dưỡng, điều kiện pH,

nhiệt độ, thời gian, không khí và tốc độ khuấy

Điều kiện dinh dưỡng: dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến hai giá trị của vi

khuẩn, đó là số lượng và kích thước của tế bào B subtilis là loài vi sinh vật dị

dưỡng nên đòi hỏi phải cung cấp dinh dưỡng trong quá trình phát triển Nhu cầu về dinh dưỡng của vi khuẩn rất đa dạng, quan trọng nhất là nguồn nitơ, carbon, kế đến

là các khoáng chất và vitamin Nitơ có trong thành phần protein, acid nucleic và những hợp chất khác có chứa N của tế bào vi khuẩn Các loài vi khuẩn có thể sử dụng đạm từ các nhóm nitrat, nitric Bên cạnh đó thì các khoáng chất khác như: lưu huỳnh (S), phosphor (P), kali (K), calci (Ca), magiê (Mg), sắt (Fe) cũng rất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn Do đó, nếu thành phần dinh dưỡng không đầy đủ phải tiến hành cung cấp muối khoáng trong quá trình nuôi cấy bằng cách thêm vào các hợp chất vô cơ

Không khí: B subtilis là loài vi khuẩn hiếu khí Trong quá trình trao đổi khí

đòi hỏi phải có các nguyên liệu như: oxy, hydrat carbon và các acid hữu cơ Quá trình hô hấp của vi khuẩn ngoài việc cung cấp các nguyên tố dinh dưỡng thì không khí sạch là thành phần không thể thiếu

Nhiệt độ: B subtilis chủ yếu được nuôi cấy và nhân sinh khối với khoảng

nhiệt độ chủ yếu từ 270C đến 350C Tuy nhiên, ở nhiệt độ từ 500C đến 700C B

subtilis cũng có thể phát triển được

Thời gian: thời gian tăng sinh B subtilis được tính toán sao cho phù hợp với

tính hữu ích của thí nghiệm, có 3 mức thời gian được tiến hành thử nghiệm trong giới hạn của đề tài: 24, 48 và 72 giờ

pH: mỗi loài vi sinh vật có khoảng giá trị biến thiên mà chúng có thể tồn tại

và phát triển Điều kiện tự nhiên thường có pH biến thiên trong khoảng từ 5 đến 9

B subtilis là loài có thể phát triển được với điểm cực đại pH của môi trường khoảng

từ 10 đến 11 Tuy nhiên, pH thích hợp cho sự phát triển của B subtilis nằm trong

khoảng từ 6 đến 7,5 (Brock,1995)

Tốc độ khuấy:vận tốc khuấy phù hợp cho sự phát triển của Bacillus spp nói

chung trong quá trình nhân sinh khối nằm trong khoảng từ 150 đến 200 vòng/phút (Lê Đình Đôn, 2006)

Sự sinh trưởng và phát triển của B subtilis trong quá trình nhân sinh khối tác động rất lớn đến chất lượng của sản phẩm (mật số B subtilis) Nên việc đánh giá

chất lượng sản phẩm phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố trên Theo Nguyễn Thanh Phương (2008) đã nghiên cứu hệ thống nhân giống nhanh trong Công nghệ Sinh học khẳng định: tốc độ quay của trục khuấy ở khoảng 150 đến 200 vòng/phút và nhiệt độ từ 24oC đến 50oC là khoảng giới hạn thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và

phát triển của B subtilis trong quá trình tăng sinh

2.3 Sơ lược về hệ thống lên men tạo chế phẩm sinh học

2.3.1 Kỹ thuật lên men

Trước khi sự lên men bắt đầu, môi trường phải được pha chế và khử trùng,

hệ thống lên men đã vô trùng, và nuôi cấy khởi đầu phải có một số lượng vi sinh vật vừa đủ ở trong một trạng thái sinh lý phù hợp để cấy truyền vào hệ thống lên men Kết thúc quá trình lên men các sản phẩm thu nhận được tinh sạch và xử lý thêm tùy theo mục đích sử dụng

2.3.2 Các phương pháp lên men

Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật để chúng tạo ra sinh khối hay các sản phẩm trao đổi chất Tùy theo đặc điểm của từng loài vi sinh vật mà người ta sẽ xây dựng qui trình nuôi cấy và thu nhận sản phẩm khác nhau

Lên men bề mặt: nuôi cấy vi sinh vật để chúng phát triển trên bề mặt môi trường (rắn hoặc lỏng) Vi sinh vật sử dụng những chất dinh dưỡng trong môi trường và cần oxygen phân tử của không khí để hô hấp Để vi sinh vật mọc đều trên

bề mặt môi trường và sử dụng được nhiều chất dinh dưỡng, sinh ra nhiều enzyme cần thiết thì ta nên đổ lớp môi trường mỏng (khoảng 2 đến 5 cm)

Lên men chìm: nuôi cấy vi sinh vật để chúng phát triển trong môi trường Vi sinh vật chỉ sử dụng được oxygen hòa tan trong môi trường, nên trong quá trình lên men cần phải sụt khí và khuấy liên tục Phương pháp này hiện đại, dể thực hiện ở qui mô lớn hơn Tuy nhiên, nếu có vi sinh vật tạp nhiễm thì toàn bộ mẻ nuôi cấy bị nhiễm và phải bỏ hết; do đó, trong lên men chìm cần phải giữ điều kiện vô trùng tuyệt đối trong tất cả quá trình Đối với phương pháp lên men bề mặt vi sinh vật được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng không tuyệt đối, nếu có vi sinh vật tạp nhiễm thì chỉ cần loại bỏ phần đó

Quá trình lên men vi sinh: sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy là quá trình

lên men vi sinh vật Đây là quá trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo giống, nhân giống sinh khối, lên men và thu nhận sản phẩm cuối cùng (Hình 2.8) Các giai đoạn này có liên quan mật thiết và ảnh hưởng qua lại lẫn nhau (Nguyễn Văn Bá và ctv 2001)

2.3.3 Hệ thống lên men

2.3.3.1 Thiết bị lên men ngoài nước

™ Thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt

Dạng thiết bị lên men này được sử dụng rộng rãi cho các quá trình tiệt trùng

để nuôi cấy vi sinh vật - sản sinh ra các chất hoạt hoá sinh học

Thiết bị lên men có thể tích 63 m3 (Hình 2.9) Dạng thiết bị lên men này là một xilanh đứng được chế tạo bằng thép không rỉ hay kim loại kép có nắp và đáy hình nón Trên nắp có bộ dẫn động cho cơ cấu chuyển đảo và cho khử bọt bằng cơ học; ống nối để nạp môi trường dinh dưỡng, vật liệu cấy, chất khử bọt, nạp và thải không khí; các cửa quan sát; cửa để đưa vòi rửa; van bảo hiểm và các khớp nối để cắm các dụng cụ kiểm tra

Hình 2.8 Sơ đồ quá trình lên men tạo chế phẩm sinh học

Tạo môi trường lên men

bổ sung dinh dưỡng Nguyên liệu

Khử trùng môi trường Nhân giống cho sản xuất

Hình 2.9 Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt có thể tích 63m3 (http://www.vocw.edu.vn)

Thiết bị lên men được trang bị áo (17), van xả (16) ở đáy của thiết bị dùng để

xả liệu, bên trong có trục (6) được gắn cánh khuấy trộn để trục chuyển động, trục khuấy được dẫn động bởi động cơ qua bộ truyền động Cơ cấu chuyển đảo gồm có các tuabin (8) với các cánh được định vị ở 2 tầng, còn tuabin hở thứ ba được gắn chặt trên bộ sủi bọt (13) để phân tán các bọt không khí

Động cơ - bộ truyền động làm quay trục (6) và các cơ cấu đảo trộn (8), (12), (14) Sử dụng bộ giảm tốc và bộ dẫn động có dòng điện không đổi để điều chỉnh

vô cấp số vòng quay trong giới hạn 110 ÷ 200 vòng/phút

Thiết bị lên men được tính toán để hoạt động dưới áp suất dư 0,25 MPa và để tiệt trùng ở nhiệt độ 130 ÷ 1400C, cũng như để hoạt động dưới chân không Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, áp suất bên trong thiết bị 50 kPa; tiêu hao không khí tiệt trùng đến 1 m3 (m3/phút) Chiều cao cột chất lỏng trong thiết bị 5 ÷ 6 m khi chiều cao của thiết bị hơn 8 m

Để đảm bảo tiệt trùng trong suốt quá trình (giữ được hơi), các trục của cơ cấu chuyển đảo phải có vòng bít kín Các vòng bít kín được tính toán để hoạt động ở áp

1 - Động cơ; 2 - Hộp giảm tốc; 3 - Khớp nối;

4 - Ổ bi; 5 - Vòng bít kín; 6 - Trục; 7-Thành thiết bị; 8 - Máy khuấy trộn tuabin; 9 - Bộ trao đổi nhiệt kiểu ống xoắn; 10 - Khớp nối; 11 - Ống nạp không khí; 12 - Máy trộn kiểu cánh quạt; 13 - Bộ sủi bọt; 14 - Máy khuấy dạng vít; 15 - Ổ đỡ; 16 - Van xả liệu; 17 - Ao;

18 - Khớp nạp liệu; 19 - Khớp nạp không khí

suất 0,28 MPa và áp suất dư không nhỏ hơn 2,7 kPa, nhiệt độ 30 ÷ 2500C và số vòng quay của trục đến 500 vòng/ phút Nhờ các vòng đệm này mà ngăn ngừa được

sự rò rỉ môi trường hay sự xâm nhập không khí vào khoang thiết bị ở vị trí nhô ra của trục Thời gian hoạt động ổn định của các vòng bít kín này không nhỏ hơn 2000

giờ khi tuổi thọ 8000 giờ (trích Lê Văn hoàng, 2004)

™ Thiết bị lên men đảo trộn bằng khí động học và thông gió môi trường

Thiết bị bên trong có trang bị các vòi phun, ống khuếch tán, các bộ làm sủi bọt để nạp không khí Không khí vào được dùng để khuấy trộn môi trường, đảm bảo nhu cầu oxy cho vi sinh vật và thải các chất chuyển hoá tạo thành

Thiết bị lên men dạng xilanh (Hình 2.10) Thiết bị loại này về kết cấu bên ngoài tương tự như thiết bị lên men có khuấy trộn bằng cơ học, nhưng bên trong không có cơ cấu khuấy trộn bằng cơ học Ống khuếch tán dạng xilanh (9) có miệng loa ở đáy, được lắp bên trong thiết bị Máy thông gió (2) được lắp theo đường tâm của thiết bị Nhờ các cánh hướng, không khí có áp suất được đưa vào máy thông gió theo tiếp tuyến đến tán phễu tròn làm nhũ tương không khí - chất lỏng chuyển động xoáy Nhũ tương tuần hoàn liên tục theo vòng khép kín bên trong theo mép biên của xilanh, vòng không gian giữa thành trong và thành ngoài thiết bị, sau đó một lần nữa lại lên trên qua miệng loa Việc chuyển đảo và thổi khí mạnh do tạo ra vùng tuần hoàn bên trong Để thải nhiệt sinh lý có kết quả hơn, ngoài áo (10) có nhiều ngăn còn bổ sung bề mặt làm lạnh của ống khuếch tán (9) Kết cấu của thiết

bị lên men được tính toán cho hoạt động dưới áp suất dư

Đặc tính kỹ thuật của thiết bị lên men có đảo trộn bằng khí động học:

Thể tích của thiết bị lên men: 25, 49, 63, 200 (m3)

Áp suất làm việc 0,2 ÷ 0,3 (Mpa)

Hệ số chứa đầy: 0,5

Tốc độ thoát không khí từ thiết bị thông gió: 25 (m/s)

Tiêu hao không khí cho 1 m3 môi trường vi sinh vật: 0,5 ÷ 0,2 (m3)

Hình 2.10 Thiết bị lên men dạng xilanh có đảo trộn bằng khí động học và

thổi khí môi trường (http://www.vocw.edu.vn)

Thiết bị lên men loại này có thể tích làm việc nhỏ hơn so với các thiết bị lên men đảo trộn bằng cơ học, được hoạt động với môi trường lên bọt mạnh, được áp dụng trong những trường hợp khi giống sinh vật không cần phải khuấy trộn mạnh

và độ nhớt không lớn (trích Lê Văn hoàng, 2004)

Các thiết bị lên men trên chỉ ứng dụng trong qui mô sản xuất nhỏ, hiệu quả kinh tế không cao Do đó, để sản xuất lớn các chất hoạt hoá sinh học bằng tổng hợp

vi sinh thì việc ứng dụng các hệ thống thiết bị lên men với qui mô công nghiệp là rất kinh tế (xem Hình 2.11 và Hình 2.12)

1 - Khớp xả liệu; 2 - Thiết bị thổi khí; 3 - Ống xoắn; 4 - Cửa; 5 - Khớp nối để nạp không khí; 6 - Khớp thải không khí; 7 - Khớp nạp liệu; 8 - Cầu thang; 9 - Ống khuếch tán; 10

- Áo; 11 - Thành thiết bị; 12 - Ống quá áp

Hình 2.11 Sơ đồ dây chuyền công nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương

pháp nuôi cấy chìm (http://www.phobachkhoa.com)

1 - Hỗn hợp điều chỉnh môi trường; 2, 6, 21 - Bơm; 3 - Cột đưu lưu

lượng vào; 4, 8 - Thùng trữ; 5 - Chứa môi trường lên men; 7 - Cột

quan sát giống vi sinh; 9 - Thiết bị truyền nhiệt, làm nguội môi

trường; 10 - Thùng lên men chính; 11 - Thùng lên men trung gian;

12, 18, 19, 23 - Thiết bị lọc không khí; 13 - Định lượng chất phá bọt;

14 - Thanh trùng dầu phá bọt; 15 - Thùng chứa dầu phá bọt; 16 - Bộ

góp không khí; 17 - Làm lạnh không khí; 20 - Thùng chứa trung gian

của giống trung gian; 22 - Bộ lọc không khí; 24 - Máy lọc không khí

có thể quan sát được

Hình 2.12 Sơ đồ dây chuyền công nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương

pháp bề mặt (http://www.phobachkhoa.com)

2.3.3.2 Hệ thống thiết bị lên men trong nước

Hiện nay, Việt Nam chỉ mới bắt đầu ứng dụng hệ thống nhân giống nhanh ở một vài trung tâm nghiên cứu, viện, trường học, nhưng chủ yếu là nhập từ nước ngoài như Trung Quốc và Công hòa Liên bang Đức Trong nước, chưa có đơn vị nào công bố đã nghiên cứu ứng dụng thiết bị lên men tạo chế phẩm sinh học

Bộ môn Công nghệ Sinh học và Bộ môn Cơ điện tử - trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã nghiên cứu, thiết kế, lắp đặt và vận hành thử nghiệm thiết bị lên men công suất 50 lít/mẽ với kết quả bước đầu rất khả quan, đồng thời mở hướng cho những nghiên cứu mới về thiết bị ngành Công nghệ Sinh học

1 - Nồi hấp; 2 - Tủ chứa khay đựng môi trường nhân giống; 3 -

Bàn trung gian; 4 - Bàn nuôi mốc giống; 5 - Gầu tải cám; 6 -

Thùng chứa cám; 7 - Thiết bị thanh trùng; 8 - Thùng chuẩn bị

dịch môi trường; 9 - Phòng hấp khay; 10 - Bàn trung gian cho

mốc sản xuất; 11 - Tủ chứa khay đã cấy mốc; 12 - Phòng nuôi

mốc sản xuất; 13 - Tủ đựng khay mốc sau sản xuất; 14 - Lọc khí;

15 - Máy nghiền; 16 - Phòng sấy