ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP

ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆPĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*********

TRẦN THỊ HUYỀN

ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG

VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG

TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ

TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

(NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC)

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*********

TRẦN THỊ HUYỀN

ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG

VI KHUẨN EDWARSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG

TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ

TRÊN CÁ NUÔI CÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Trần Thị Huyền, sinh ngày 28 tháng 10 năm 1981 tại huyện Hưng

Hà, tỉnh Thái Bình Con ông Trần Đình Hùng và bà Trần Thi Hải

Tốt nghiệp phổ thông tại trường Trung học phổ thông Nguyễn Trung Trực, thành phố Hồ Chí Minh, năm 1998

Tốt nghiệp Đại Học ngành Thủy Sản, hệ Chính Quy tại Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Sau đó làm việc tại trường Đại Học Công Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, chức vụ Giảng Viên

Tháng 09 năm 2006 theo học cao học ngành Công Nghệ Sinh Học tại Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Đã lập gia đình : Chồng Đỗ Ngọc Vinh, năm kết hôn 2007

Địa chỉ liên lạc: 40/458 A Lê Đức Thọ, phường 17, quận Gò Vấp, thành phố

Hồ Chí Minh

Điện thoại: 0937594879

Email: huyensh06@yahoo.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào

Ngày tháng năm 2010

Trần Thị Huyền

Em cũng gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu

Cám ơn tất cả các bạn, anh chị và các em lớp cao học Công Nghệ Sinh Học

đã giúp đỡ, cùng tôi làm việc trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng em xin cảm ơn chồng Đỗ Ngọc Vinh đã luôn động viên tinh thần,

an ủi và chia sẻ cuộc sống cho em có thêm thời gian để hoàn thành trong suốt thời gian 4 năm học tập và thực hiện thành công luân văn tốt nghiệp thạc sĩ

TÓM TẮT

Đề tài “ Điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng Edwardrsiella ictaluri - Ứng

dụng trong chẩn đoán nhanh sự hiện diện của edwardsiellosis trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus)” được nghiên cứu tại trường Đại Học Công

Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 8 năm 2010

Mục đích nghiên cứu là phát triển kỹ thuật Dot-ELISA để phát hiện E ictaluri

trên cá tra phơi nhiễm edwardsiellosis bằng kháng huyết thanh thỏ

Kháng huyết thanh được sản xuất bằng cách tạo miễn dịch trên thỏ bằng hỗn

hợp vi khuẩn E ictaluri đã bị bất hoạt bằng formalin và tá chất Freund’s Complete Kháng huyết thanh chuyên biệt cho E ictaluri và hiệu giá ngưng kết thu được đạt

đến 1/512 Kỹ thuật Dot-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) được ứng

dụng để phát hiện E ictaluri trên cá tra được gây nhiễm bệnh thực nghiệm Kết quả cho thấy kỹ thuật này có thể phát hiện E ictaluri với giới hạn phát hiện là 2.9 x 105

tế bào/ml Độ nhạy, độ chuyên biệt, giá trị âm tính, dương tính giả lần lượt là 100%, 100%, 0%, 0% Đối với mẫu cá có triệu chứng bệnh “gan thận mủ” thu tại An

Giang, phương pháp Dot-Elisa có tỉ lệ phát hiện E.ictaluri cao nhất là 93,3% Trong

khi phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính và kit sinh hóa 14GNR cho kết quả thấp hơn và chỉ đạt 81,7 và 90% Tóm lại, kháng huyết thanh thỏ có có đáp ứng miễn dịch tốt và việc sử dụng kháng huyết thanh này trong phương pháp Dot-Elisa

có thể đáp ứng được yêu cầu của một công cụ hiệu quả cho chẩn đoán phát hiện

nhanh E ictaluri trên cá tra bị lây nhiễm vi khuẩn này

ABSTRACT

Study entitled as “Producing rabbit antiserum against Edwardrsiella ictaluri – Application in quick diagnosis of edwardsiellosis in tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus)” was conducted at HoChiMinh City University of Industry from

September, 2008 to August, 2010 This study was aimed to develop Dot-ELISA

technique to detect E ictaluri in edwardsiellosis suffered catfish by using rabbit

antiserum

Rabbit antiserum was produced by immunizing rabbit with a mixture of

formalin killed cell of E ictaluri and Freund’s Complete Adjuvant The collected serum was specific for E ictaluri and its agglutination titer was up to 512 Dot-

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) technique was developed to detect

E ictaluri in experimentally infected catfish Results showed that this technique could detect E ictaluri at the detection limit of 2.9 x 105 cell/ml Its sensitivity and specification, false negative/positive results and detection level was 100, 0, and 100%, respectively Edwardsiellosis suffered catfish from An Giang Province were sampled for detection of the bacterium by Dot-ELISA, slide agglutination techniques and IDS 14GNR biochemical kit The highest detection level was 93.3% for Dot-ELISA Meanwhile, those of slide agglutination and IDS 14GNR kit were lower and only reached 81.7 and 90.0 %, respectively In conclusions, rabbit antiserum was successfully produced and its application in Dot-ELISA technique

could considered as an effective method for quick detection of E ictaluri in

edwardsiellosis suffered catfish

i

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

Chương 1 1

GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 3

1.2.1 Mục tiêu 3

1.2.2 Yêu cầu 3

Chương 2 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nuôi 4

2.1.1 Trên thế giới 4

2.1.2 Việt Nam 5

2.2 Vi Khuẩn Edwardsiella ictaluri 6

2.2.1 Khái quát 6

2.2.2 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 8

2.2.3 Đặc điểm sinh hóa 8

2.3 Đặc điểm kháng nguyên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 10

2.4 Một Số Phương Pháp Phát Hiện Edwardsiella ictaluri 11

2.4.1 Phương pháp phân lập – định danh 11

2.4.2 Phương pháp huyết thanh học 12

2.4.3 Phương pháp PCR 14

2.5 Phương pháp Dot-ELISA 14

ii

2.5.1 Khái niệm Dot-ELISA 15

2.5.2 Một số nghiên cứu ứng dụng của phương pháp Dot-ELISA 15

Chương 3 18

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian 18

3.1.2 Địa điểm 18

3.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.2.1 Dụng cụ - Thiết bị 18

3.2.2.1 Hóa chất cho nuôi cấy vi khuẩn 23

3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể 23 3.2.2.3 Hóa chất dùng cho Dot-Elisa 23

3.3 Nội dung nghiên cứu 20

3.4 Các phương pháp nghiên cứu 21

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC (Formalin Killed Cell) 21

3.4.1.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 21

3.4.1.2 Phương pháp tạo FKC 21

3.4.2 Phương pháp tạo miễn dịch trên thỏ 22

3.4.3 Phương pháp lấy máu - thu huyết thanh thỏ 23

3.4.4 Phương pháp thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính, 24

3.4.5 Phương pháp xác định hiệu vi giá ngưng kết của huyết thanh thỏ 24

3.4.6 Phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC bằng Dot-Elisa 25

3.4.7 Phương pháp xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 27

3.4.8 Phương pháp gây bệnh nhiễm bệnh thực nghiệm cho cá tra giống với vi khuẩn Edwardsiella ictalri 27

3.4.9 Phương pháp phân phân lập – phát hiện Edwardsiella ictalri 28

3.5 Bố trí thí nghiệm và phương pháp thực hiện 29

3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh thỏ cho phản ứng ngưng kết với KFC E ictaluri và vi khuẩn E ictaluri 29

3.5.2 Thí nghiệm 2: Xác định hiệu giá ngưng kết nhanh của kháng huyết thanh thỏ với FKC E ictaluri và vi khuẩn E ictaluri trên phiến kính 30

3.5.3 Thí nghiệm 3: Thực hiện phương pháp Dot-ELISA cho phát hiện vi khuẩn E ictaluri dạng FKC 30

iii

3.5.4 Thí nghiệm 4 : Thực hiện kỹ thuật Dot-ELISA cho phát hiện vi khuẩn E

ictaluri 31

3.5.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát mật độ vi khuẩn E ictaluri cho thí nghiệm phát hiện bằng phương pháp Dot-ELISA 31

3.5.6 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm phương pháp Dot-ELISA phát hiện vi khuẩn E ictaluri hiện diện trên cá tra giống gây bệnh “gan thận mủ” thực nghiệm 32

3.5.7 Thí nghiệm 7: Ứng dụng chẩn đoán phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn Edwarsiella ictaluri có trong mẫu bệnh cá tra 36

Chương 4 37

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Xác định hiệu giá vi ngưng kết giữa kháng huyết thanh thỏ và vi khuẩn vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 37

4.1.1 Kết quả hiệu giá ngưng kết sau 7 ngày 37

4.1.2 Kết quả hiệu giá ngưng kết sau 14 ngày 40

4.2 Xác định hiệu giá ngưng kết nhanh trên phiến kính giữa kháng huyết thanh thỏ với FKC E ictaluri và E ictaluri sống 42

4.3 Thử nghiệm Dot- ELISA phát hiện FKC E ictaluri 44

4.4 Thử nghiệm phương pháp Dot-ELISA cho phát hiện E ictaluri sống 47

4.5 Khảo sát mật độ vi khuẩn E ictaluri cho thí nghiệm phát hiện 49

4.6 Kiểm chứng phương pháp Dot-ELISA trên mẫu cá tra giống được gây bệnh thực nghiệm 52

4.7 Kiểm chứng phương pháp Dot-ELISA trên mẫu cá tra giống mắc bệnh gan thận mủ tại ao nuôi 56

Chương 5 59

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 Kết Luận 59

5.2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHIB Brain Heart Infusion Broth

Bộ NN&PTNT Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn BSA Bovine Serum Albumine

Dot-ELISA Dot-Enzyme-linked immunosorbent assay

FA Freund’s adjuvant

FATs Fluorescent Antibody Tests

FITC Flourescent isothiocyanate

FKC Formalin Killed Cell

HRP horseradish peroxidase

IgG Immunoglobulin G

NTB nitroblue tetrazolium

OD Optical Density

OIE World Organisation for Animal Health

PBS Phosphate buffer saline

PVDF Polyvinylidene fluoride

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SRAC Southern Regional Aquaculture Center

PCR Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Real-Time Polymerase Chain Reaction

TBS Tris-buffered saline

TBST Tris-buffered saline + Tween 20

v

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sự khác nhau giữa các loài thuộc giống Edwardsiella 7

Bảng 2.2 Bảng phân tích đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn E ictaluri 10

Bảng 3.1 Các lần tiêm và lấy máu thỏ kiểm tra kháng thể 23

Bảng 3.2 Quy trình thực hiện phản ứng ngưng kết huyết thanh thỏ - FKC 25

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể cho phản ứng ngưng kết với

các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E ictaluri sau 7 ngày 37

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát độ pha loãng huyết thanh thỏ cho phản ứng ngưng

kết với các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E ictaluri sau 14 ngày 40

Bảng 4.3 Kết quả hiệu giá ngưng kết nhanh trên phiến kính 42

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm

Dot-Elisa xác định FKC E ictaluri 46

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm

Dot-ELISA xác định E ictaluri sống 47

Bảng 4.6 Khảo sát mật độ E ictaluri cho thí nghiệm phát hiện 51

Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra sự hiện diện E ictaluri trên mẫu cá bệnh thực

nghiệm và mẫu đối chứng 53

Bảng 4.8 Kết quả xác định sự hiện diện của vi khuẩn E ictaluri có trong mẫu

cá bệnh thu tại An Giang 56

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 20

Hình 2.3 Cá tra bị bệnh đốm trắng trên gan (G), thận (Th), tỳ tạng (Tt) 7

Hình 2.4 Khuẩn lạc E ictaluri trên môi trường BHIA sau khi ủ 24 giờ 9

Hình 3.2 Phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính 23

Hình 4.1 Kết quả khảo sát độ pha loãng huyết thanh thỏ cho phản ứng ngưng

kết với các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E ictaluri sau 7 ngày 37

Hình 4.2 Kết quả khảo sát độ pha loãng huyết thanh thỏ cho phản ứng ngưng

kết với các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E ictaluri sau 14 ngày 41

Hình 4.3a Kết quả phản ứng ngưng kết nhanh âm tính trên phiến kính 42

Hình 4.3b Kết quả phản ứng ngưng kết nhanh âm tính trên phiến 42

Hình 4.4 Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm

Hình 4.5 Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm

Hình 4.6 Kết quả khảo sát mật độ vi khuẩn E ictaluri 50

Hình 4.7 Mẫu mô gan thận cá chết do gây bệnh thực nghiệm 53

Hình 4.8 Kết quả kiểm tra E ictaluri cho thí nghiệm Dot-Elisa 54

Hình 4.9 Kết quả kiểm tra E Ictaluri cho thí nghiệm IDS 14 GNR 54

vii

Hình 4.10 Kết quả xác định sự hiện diện vi khuẩn E ictaluri có trong mẫu cá

viii

1

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trong mười năm qua, cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) từ một loài

cá bản địa với thế mạnh và hiệu quả kinh tế có được đã trở thành sản phẩm chiến lược của quốc gia, là một trong những mặt hàng thủy sản xuất khẩu ưu thế ở Việt Nam Theo Bộ NN & PTNT, năm 2008 lượng cá tra xuất khẩu trên 550.000 tấn, đạt kim nghạch hơn 1,4 tỉ đô la, chiếm 32,4 % tổng kim nghạch xuất khẩu thủy sản của cả nước Thị trường tiêu thụ cá tra đã và đang được mở rộng và có uy tín

ở 130 nước và vùng lãnh thổ, khu vực nhập khẩu lớn là Ucraina, Nga, Bắc Phi, Trung Đông, Mỹ

Từ những lợi thế trên, đầu năm 2010, Bộ NN&PTNT chính thức công bố quy hoạch vùng nuôi cá tra dự kiến vào năm 2010, và trong bản “Quy hoạch phát triển sản xuất và tiêu thụ cá tra vùng ĐBSCL năm 2010, định hướng đến năm 2020” đã xác định cá tra là đối tượng nuôi chủ lực, việc sản xuất và hoạt động tiêu thụ cá tra là một hoạt động kinh tế quan trọng phục vụ tiêu dùng trong nước

và xuất khẩu của đất nước Song cùng sự phát triển nghề nuôi, mở rộng quy mô sản xuất để đạt những mục tiêu trên, trong nhiều năm qua, người nuôi cá bị thiệt hại khá lớn do nhiều dịch bệnh xảy ra Trong đó, bệnh gan thận mủ đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá Năm 2002, qua nghiên cứu của Crumlish và

cộng tác viên, tác nhân gây bệnh này trên cá tra được xác định là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vì thế, hiện nay đối với từng hộ nuôi, việc áp dụng nhiều

mô hình nuôi tiên tiến, tìm ra phương pháp phòng trừ bệnh hiệu quả áp dụng cho nghề nuôi cá tra nói riêng và nghề nuôi nuôi trồng thuỷ sản nói chung đã trở thành một vấn đề mang tính cấp thiết

2

Tuy nhiên để phòng bệnh cho cá tra nuôi cần phải xác định sự hiện diện

của tác nhân gây bệnh – vi khuẩn E ictaluri Từ trước đến nay, đã có nhiều phương pháp phát hiện E ictaluri khác nhau đã được nghiên cứu và ứng dụng

như: RT-PCR (Lenania và ctv, 2003), PCR, ELISA (John và Dean, 1996; Karen

và ctv, 2000; Eric và ctv, 2007; OIE, 2009) Western blot (OIE, 2009), phân lập truyền thống (Craig và ctv, 1993; Hawke và ctv, 1998; Ferguson và ctv, 2001; Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thị Thanh Loan, 2007),…nhưng hầu hết các phương pháp trên đều đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, kỹ thuật viên được huấn luyện thuần thục hay thời gian phân lập – phát hiện kéo dài kéo theo việc ứng dụng vào thực tiễn phục vụ cho nhu cầu chẩn đoán bệnh cho cá nuôi có phần hạn chế Chính vì thế, sự cần thiết của một phương pháp phát hiện sớm vi khuẩn hiện diện trong cơ thể cá là điều quan trọng, sẽ hạn chế các thiệt hại về kinh tế, nâng cao tỷ lệ sống cho cá nuôi

Trong những phương pháp phát hiện nhanh mầm bệnh dựa trên kỹ thuật miễn dịch, Dot-ELISA với lợi thế có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đối cao, tốn ít thời gian sàng lọc mẫu với số lượng lớn và quy trình thực hiện không quá phức tạp và cho kết quả trong khoảng thời gian ngắn đã đáp ứng được yêu cầu trên

Do đó hiện nay phương pháp này đã và đang được quan tâm nghiên cứu

Trước tình hình đó, được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hữu Thịnh, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Điều chế huyết thanh thỏ

kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri - Ứng dụng trong chẩn đoán nhanh bệnh

gan thận mủ trên cá tra” nhằm phát hiện nhanh loài vi khuẩn này trên cá tra nuôi

ở Việt Nam trước

3

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu

 Điều chế huyết thanh thỏ kháng vi khuẩn Edwadrsiella ictaluri

 Ứng dụng kỹ thuật Dot-ELISA trong phát hiện nhanh E ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pansianodon hypopthalmus)

1.2.2 Yêu cầu

 Thu được kháng huyết thanh thỏ kháng vi khuẩn E ictaluri

 Xác định hiệu giá vi ngưng kết giữa vi khuẩn E ictaluri dạng KFC với kháng huyết thanh thỏ

 Thực hiện thành công kỹ thuật Dot-ELISA cho phát hiện vi khuẩn E ictaluri

 So sánh các phương pháp phát hiện vi khuẩn với phương pháp Dot-ELISA

4

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nuôi

2.1.1 Trên thế giới

Bệnh nhiễm khuẩn huyết trên cá da trơn xuất hiện đầu tiên vào năm 1976

ở miền đông nam Hoa Kỳ, đặc biệt là các bang Mississipi, Alabama, Arkansas,

Louisiana, Georgia, và Florida Dịch bệnh này suốt một thập kỉ qua đã gây thất

thu hàng tỉ đô la cho ngành nuôi cá da trơn (James và ctv, 1990; Hawke và ctv, 1998)

Cá bị bệnh nổi đầu lên trên mặt nước và để lộ những đường bơi xoắn ốc trên lớp bùn ao, sau đó cá chết Cá có thể trương bụng, lồi mắt và mang cá nhợt nhạt, nhiều đốm đỏ trên lưng, cuống đuôi Gốc vây ngực chuyển sang màu trắng nhạt, da vùng bụng, và mang cá chuyển từ màu đỏ thành màu nâu (Hawke và ctv, 1998)

Hình 2.1 Đốm trắng trên gan cá da trơn Hình 2.2 U nhọt trắng, đỏ trên thân cá

( Nguồn trích từ SRAC Publication No 477, 2006)

5

Đến năm 1979, Hawke và ctv dựa vào các dấu hiệu bệnh này đã phát hiện

tác nhân gây bệnh Edwardsiella ictaluri Vi khuẩn này chỉ sống sót trong nước

khoảng tám ngày, nhưng nó đã được chứng minh có khả năng sống đến 95 ngày

ở nhiệt độ từ 18 – 250C khi được ủ bên trong ao bùn

Bệnh nhiễm khuẩn huyết của cá da trơn là một bệnh theo mùa rõ rệt, dịch bệnh xảy ra khi nhiệt độ nước dao động trong khoảng từ 240C đến 280C (750F –

820F) Đây là điều kiện nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn Do đó, dịch bệnh thường thấy vào tháng năm, tháng sáu và tháng chín, tháng mười trong

ao nuôi ở miền tây nước Mỹ Bên ngoài khoảng nhiệt độ này, tỉ lệ chết có thể

xuất hiện nhưng thấp và bệnh thường ở thể mãn tính (John và Craig, 1995; Oktay

và ctv, 2008)

Nghiên cứu Hawke và cộng tác viên vào năm 1998 cho thấy vi khuẩn E ictaluri còn là tác nhân gây bệnh trắng gan, và được phân lập đầu tiên trên cá nheo (Ictalurus punctatus) Tuy nhiên, những biểu hiện bệnh lý trên cá nheo

hoàn toàn khác so với cá tra bị nhiễm bệnh (Oktay và ctv, 2008)

2.1.2 Việt Nam

Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 Trên gan, thận và lách cá xuất hiện nhiều đốm trắng có đường kính 1 – 3 mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục Tuy nhiên, nguyên

nhân gây bệnh chỉ được xác định là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ba năm

sau đó (Ferguson và ctv, 2001; Từ Thanh Dung và ctv, 2003)

Tại Việt Nam cao điểm của dịch bệnh thường xảy ra từ tháng 09 đến tháng 12 hằng năm vào thời kì thời tiết chuyển mát Thiệt hại do bệnh cũng rất lớn, tỉ lệ chết có thể đến 90% trên cá tra giống và 50% trên cá tra nuôi thương phẩm Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu trong ao nuôi mật độ cao, chất lượng nước kém và trong nuôi cá lồng bè (Từ Thanh Dung và ctv, 2003; Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

6

Giống như những bệnh khác, cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E ictaluri

thường biểu hiện lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu, bụng chướng tỏ, mắt lồi, xuất huyết điểm xung quanh vùng miệng Cá bệnh không có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn (Ferguson và ctv, 2001, Eric và ctv, 2007)

Năm 2007, theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh, khi giải phẫu bên trong cá bệnh, một số cơ quan nội tạng như gan, lá lách, thận bị hoại tử, tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5 – 2,5 mm Thận và tỳ tạng sưng to, đặc biệt thận bị sưng và nhũn Bệnh này còn gọi là bệnh “bệnh đốm trắng” hay

“bệnh hoại tử nội tạng” Đây là bệnh tích điển hình của cá tra Vì vậy, nông dân nuôi cá tra thường gọi là “bệnh gan thận mủ”

Hình 2.3: Cá Tra bị bệnh đốm trắng trên gan(G), thận (Th), tỳ tạng (Tt)

(Nguồn trích Từ Thanh Dung và ctv, 2003)

2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

2.2.1 Khái quát

Edwardsiella một giống thuộc họ Enterobacteriaceae, có dạng hình que

mảnh, Gram âm, kích thước 1 x 3 µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004; Don và James và ctv, 2005) Giống

Edwardsiella thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí tùy ý gồm có ba loài: E tarda, E ictaluri và E hoshinae Trong đó, Việt Nam thường gặp hai loài: E tarda và E

7

ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trên các loài cá vùng nhiệt đới (Ferguson và ctv,

2001; Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Edwardsiella ictaluri có dạng que thẳng nhỏ với kích thước 1 µm x 2 -3

µm Tuy nhiên, vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá tra có một số đặc điểm khác với mô tả của Plumb (1993) như có dạng que và kích thước biến đổi So với E tarda phát triển tốt ở nhiệt độ 370C, ngược lại E ictaluri phát triển tốt ở nhiệt độ

280C và yếu ở nhiệt độ 370C Sự khác nhau về loài của giống vi khuẩn này được

mô tả chi cụ thể theo Don và James (2005)

Bảng 2.1: Sự khác nhau giữa các loài thuộc giống Edwardsiella

Đặc điểm E tarda E hoshine E ictaluri

Sinh indole

Sinh H2S

Di động

Biến dưỡng malonate

Lên men L-arabinose

Lên men sucrose

Lên mentrehalose

Lên men D-mannitol

+ + +

d + + +

Trong đó: d: dương tính yếu nhưng âm tính trong môi trường TSI

Nguồn trích dẫn :* Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 2005

8

Hình 2.5: Vi khuẩn E ictaluri

2.2.2 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella ictaluri có kích cỡ 0,75 x 2,5 µm Trên môi trường brain heart infusion agar (BHIA), khuẩn lạc E ictaluri sau hai mươi bốn giờ ủ trong

suốt và nhỏ li ti Sau bốn mươi tám giờ ủ, khuẩn lạc phát triển rõ hơn, có nhân,

có màu trắng hơi trong, lồi, tròn với đường kính từ 0,5 – 2 mm Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số trực khuẩn ngắn đứng riêng lẻ, một số tạo thành chuỗi 2 – 3

tế bào và bắt màu hồng nhạt (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007)

(Nguồn trích Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp số 1 & 2/2007)

2.2.3 Đặc điểm sinh hóa

Đặc điểm sinh hóa của tác nhân gây bệnh viêm ruột nhiễm khuẩn huyết,

Edwardsiella ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke (1979), và chi tiết hơn bởi

Waltman (1986) và Plumb (1989) Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển từ 25 –

30 0C Khoảng nhiệt độ thích hợp cho loài vi khuẩn này ở Việt Nam là từ 22 – 28

0

C (trích dẫn bởi Ildiko và ctv, 2007)

Mặc dù đặc điểm sinh hóa, tiến trình phát bệnh của nhiễm khuẩn huyết và những vùng thương tổn bệnh lý liên quan đã được xác định nhưng cơ chế xâm nhập vào trong vật chủ nhạy cảm vẫn chưa được hiểu rõ Miyazaki (1985) cho

Hình 2.4: Khuẩn lạc E ictaluri trên đĩa

môi trường BHIA ủ ở 280C sau 48 giờ

9

rằng E ictaluri xuất hiện đầu tiên ở khoang mũi và sau đó lây nhiễm sang não thông qua ống mũi, sau đó lây lan toàn bộ hệ thống tuần hoàn và kết thúc bằng sự

nhiễm trùng máu (trích dẫn bởi Ildiko và ctv, 2007; Oktay và ctv, 2008)

Vi khuẩn E ictaluri có thể tăng trưởng trên môi trường BHI có bổ sung

thêm 1,5 % NaCl, tăng trưởng tốt trong khoảng pH từ 7-7,5 Ở pH 6 tỉ lệ tăng

trưởng giảm 60%, và ở pH 5 hay pH 8, tăng trưởng giảm 23% và 33% E ictaluri không tăng trường ở pH 4 và pH 9 (John và Dean, 1996)

Vi khuẩn này không có enzyme cytochrome oxidase, khử nitrate thành nitrite, có các enzyme như lysine và orthinine decarbonxylase và lên men glucose, maltose, không sinh indole và biến dưỡng citrate và các nguồn carbon khác, không sản sinh sắc tố và không có các enzyme protease, esterase, pectinase, chitinase, lipase, alginase, collagenase, hyaluronidase (Waltman và

ctv, 1986; Hawke và ctv, 1998; Ferguson và ctv, 2001; Don và ctv, 2005) Tại

Việt Nam, E ictaluri phân lập đầu tiên từ cá tra là vi khuẩn Gram âm, không di

động, lên men không oxy hóa Cho phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính (Từ ThanhDung và ctv, 2003)

Năm 2007 theo kết quả của Nguyễn Hữu Thịnh định danh vi khuẩn bằng kit IDS 14GNR Kết quả khảo sát phản ứng sinh hóa bằng kit IDS 14GNS hoàn

toàn đồng nhất với kết quả định danh bằng kit API 20E đối với E.ictaluri được phân lập từ cá tra (P hypophthalmus) và trên cá hồi (Oncorhynchusmykis)

Oxidase - không đổi màu

LDC + khuẩn lạc mọc, môi trường có màu tím

Di động - khuẩn lạc mọc không nhòe đường cấy

2.3 Đặc điểm kháng nguyên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Những nghiên cứu trước đây về tác nhân gây bệnh xuất huyết ruột trên cá

da trơn cho thấy có mối quan hệ huyết thanh học của ba mươi hai chủng E ictaluri với nhau, đặc biệt các chủng gây bệnh này có sự tương đồng về protein

và lipopolysaccharide khi được phân tích bằng kỹ thuật điện di SDS Trong đó, chỉ có một sự thay đổi nhỏ trong phần cấu trúc kháng nguyên O trên 3 chủng được phân lập Tuy nhiên, một vài biến đổi đã không loại bỏ sự nhận biết kháng

nguyên bằng kháng huyết thanh E ictaluri trên thí nghiệm miễn dịch siêu kết

dính hay Western blot (Michelle và ctv, 2002; Mark và ctv, 2003, Victor và ctv, 2009)

11

Sự tương đồng kháng nguyên của E ictaluri cũng đã được chứng minh rõ

ràng hơn từ kết quả nghiên cứu của James và ctv (1990) bằng thí nghiệm vi ngưng kết với các kháng nguyên tế bào bị bất hoạt bởi formalin hay bị bất hoạt bởi nhiệt Mức độ biến đổi đặc điểm kháng nguyên của hầu hết các chủng nghiên cứu là rất ít, điều này đã được chứng minh chúng có cùng một kiểu huyết thanh kháng nguyên Và theo những nghiên cứu gần đây, các đồng tác giả đã chứng

thực E ictaluri là một loài không có sự khác biệt rõ ràng về đặc điểm kháng

nguyên tế bào giữa các chủng với nhau (trích dẫn bởi Victor và ctv, 2009)

Ngoài ra, các chủng vi khuẩn E ictaluri được phân lập từ các cá bệnh đều

có sự tương đồng về các đặc điểm sinh học, thêm vào đó khi sử dụng kháng thể

đơn dòng cho mục đích phát hiện E ictaluri được phân lập từ các nơi khác nhau

đã thể hiện rõ hơn sự tương đồng về huyết thanh học Từ đó các nhà nghiên cứu

đã xây dựng chiến lược kiểm soát dịch bệnh ESC trên các da trơn Kết quả này cũng phù hợp nghiên cứu khác (James và ctv, 1990; John và Dean, 1996)

Một nghiên cứu khác sử dụng một mô hình đã chứng minh E ictaluri

không gây hiện tượng dung huyết (hemolysin) khi được ủ với tế bào hồng cầu của cừu và thỏ Ngược lại, vi khuẩn này có khả năng gây hiện tượng hemolysin trên hồng cầu cá nhưng lại không thể thực hiện trên hồng cầu người Theo

Williams (2005) định nghĩa một hemolysin hai thành phần trên E ictaluri tương đồng với yếu tố gây độc trên E tarda Mặc khác, sự kiểm tra tính gây độc khi sử

dụng một chủng đột biến hemolysin cùng dòng trên cá cá da trơn thuần chủng đã

không chứng minh được dấu hiệu khác biệt khi so sánh với chủng E ictaluri

hoang dại (trích dẫn bởi Ildiko, 2007)

2.4 Một số phương pháp phát hiện Edwardsiella ictaluri

2.4.1 Phương pháp phân lập – định danh

Vi khuẩn Edwadrsiella ictaluri được nuôi cấy phân lập đầu tiên từ các cơ

quan thận, não trên những môi trường tryptic soy agar (TSA) với 5 % máu cừu hoặc môi trường brain heart infusion agar (BHIA) khoảng hai ngày ở nhiệt độ từ

12

200C – 300C Sự tăng trưởng của E ictaluri thường được phát hiện sau bốn mươi

tám giờ nuôi cấy xuất hiện với khuẩn lạc trắng nhỏ (Hawke và ctv, 1998; Oie, 2009)

Hiện nay, phương pháp nuôi cấy và kiểm tra sinh hóa có ý nghĩa đầu tiên

cho việc phát hiện E ictaluri khi có sự bùng phát dịch bệnh trong tự nhiên Các

mẫu mô được nuôi cấy trong môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) trong 48 giờ, sau đó phân tích sinh hóa để xác định sự nhiễm vi khuẩn giả định (Từ Thanh Dung và ctv, 2003; Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007) Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp là khá ít, chỉ có thể phát hiện vi khuẩn khi chúng hiện diện với mật độ cao trong mẫu (Jesus, 2006)

2.4.2 Phương pháp huyết thanh học

Với những đặc điểm sinh hóa đã được nhận biết, sự đồng nhất về kháng

nguyên theo loài và huyết thanh học có thể dễ dàng phân biệt giữa E ictaluri và

vi khuẩn họ đường ruột khác Các kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (FATs - fluorescent antibody test), enzyme-linked immunostaining và ELISA đã được dùng cho mục đích chẩn đoán - phát hiện vi khuẩn Những kháng thể đơn dòng đặc biệt (MAbs) thường được sử dụng cho thử nghiệm này, nhưng các kháng

nguyên đa dòng có được từ thỏ sau khi gây miễn dịch bằng FKC của E.ictaluri

cũng có thể được sử dụng

Mặc dù các phương pháp phát hiện dựa trên kháng thể được sử dụng cho mục đích chẩn đoán bên ngoài nhưng vẫn chưa được chấp nhận như một phương pháp chính thống, phương pháp có thể là sự sàng lọc có giá trị với số lượng lớn mẫu cá được yêu cầu kiểm tra cho sự phát triển chiến lược kiểm soát dịch bệnh Độ đặc hiệu của phương pháp được chứng minh từ các kháng thể

chống lại E ictaluri bằng huyết thanh của cá phục hồi sau dịch bệnh Theo đó, một số phương pháp được sử dụng để phát hiện E ictaluri như phương pháp

ngưng kết nhanh trên phiến kính, vi ngưng kết hay phương pháp ngưng kết thụ

13

động Đây là phương pháp này có thể cung cấp nhanh dữ liệu định lượng tại giá

trị tối thiểu khi không yêu cầu độ nhạy cao (OIE, 2009)

Ngoài ra, kỹ thuật kháng thể phát huỳnh quang được ứng dụng phát hiện

sự hiện diện của E ictaluri trên các vết bôi lấy từ các cơ quan lây nhiễm hay

bệnh tích được quan sát chẩn đoán ban đầu trên cá Các vết bôi được làm khô và

ủ khoảng 5 phút với kháng thể thỏ đặc hiệu Sau đó được ngâm với kháng thể

kháng kháng thể thỏ liên kết fluorescent isothiocyanate (FITC) Thí nghiệm hoàn

tất trong khoảng thời gian 20 phút có thể phát hiện được vi khuẩn này có trong

mẫu bệnh (OIE, 2009).Một phương pháp sử dụng với kháng thể liên kết phát

huỳnh quang có những phổ màu khác nhau cũng đã được nghiên cứu và so sánh với phương pháp nuôi cấy vi khuẩn truyền thống nhằm xác định các mầm bệnh

trên cá như E ictaluri Với phương pháp này, mô thận, não cá được lấy từ 101 cá

có triệu chứng bệnh được sử dụng cho thí nghiệm này, kết quả phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn bằng phương phát trên với độ nhạy đạt 80,7% và độ đặc hiệu

là 83,9% khi được kiểm chứng với phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tiêu chuẩn

Đây là một kỹ thuật phát hiện nhanh và hiệu quả sự hiện diện của E ictaluri trên

cá bệnh (Victor và ctv, 2006a)

Bên cạnh đó, kỹ thuật miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) cũng được sử

dụng để phát hiện trực tiếp vi khuẩn E ictaluri trên các mô bệnh từ cá bị nhiễm

bệnh Các vết bôi được chuẩn bị như phương pháp IFAT, bước đầu tiên là như nhau, nhưng bước ủ thứ hai sử dụng globulin đặc hiệu khác kháng kháng thể thỏ, liên kết với horseradish peroxidase Từ đó, ELISA đã được cải tiến để phát hiện

kháng thể của cá với E ictaluri và được sử dụng rộng rãi (Somsak và John,

1993; John và ctv, 1996; OIE, 2009)

Bên cạnh đó, một phương pháp phát hiện nhanh khác FAT and ELISA nhưng thiếu độ tin cậy ở nồng độ lây nhiễm vi khuẩn thấp (OIE, 2009)

14

2.4.3 Phương pháp PCR

Phát hiện vi khuẩn bằng kỹ thuật dựa trên phương pháp PCR đã phát triển cho sự phát hiện các mầm bệnh khác trên cá, đất và các hệ thống khác Theo nghiên cứu của Lelania và ctv (2003) độ nhạy của phương pháp pháp hiện PCR được xác định ở mức độ thấp tương đương khoảng 2,5 tế bào/ml trong mẫu DNA

từ cả tế bào E ictaluri và hỗn hợp dịch máu từ cá da trơn không bị lây nhiễm và

tế bào E ictaluri Phương pháp này có thể phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn

trong khoảng từ 105 tế bào/ml đến 108 tế bào/ml Trong tương lai, phương pháp này được áp dụng trong các chương trình chọn giống cá da trơn đề kháng bệnh nhiễm trùng huyết trên cá (OIE, 2009)

2.5 Phương pháp Dot-ELISA

Một kỹ thuật đáp ứng cho ứng dụng hiệu quả sự liên kết kháng nguyên- kháng thể gọi là Dot-Immunobloting hay Dot-ELISA được thực hiện lần đầu tiên bởi Hawkes vào năm 1986 (Martin, 2006) Đặc điểm hình thành phương pháp được chứng minh là sự kết hợp của hai phương pháp ELISA và Western blot, không giống như Elisa truyền thống có khả năng định lượng, Dot ELISA dễ dàng thực hiện hơn và có khả năng định tính nhanh với một vệt chuyển thấm có thể quan sát được trên nền giấy trắng

Phương pháp này khá thích hợp với các phòng thí nghiệm nhỏ, và dĩ nhiên những năm gần đây phương pháp này có giá trị hơn khi được sử dụng cho mục đích sản xuất kit phát hiện nhanh thương mại cho chẩn đoán các loại kháng nguyên khác nhau Tuy nhiên, những kit thương mại khá đắt tiền và do mỗi một kit chỉ có hiệu quả nhất định với từng đối tượng khác nhau Vì thế cần có nhiều

sự thỏa hiệp được thực hiện giữa người sản xuất và người sử dụng để có thể giải thích đầy đủ những cơ chế hoạt động của kit (Donald và ctv, 2000)

15

2.5.1 Khái niệm Dot-ELISA

Phương pháp Dot-ELISA được thực hiện trên pha rắn có độ linh hoạt cao cho phát hiện kháng nguyên hay kháng thể Thí nghiệm này sử dụng một số lượng rất ít tác nhân được chuyển vào trên bề mặt của pha rắn như màng nitrocellulose hay những màng khác liên kết ngẫu nhiên với các protein Sau khi

ủ với kháng thể gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên sẽ hình thành liên kết kháng nguyên – kháng thể Sự kết hợp này cho phản ứng với kháng thể thứ cấp liên kết enzyme Sau khi thêm vào một chất kết tủa hay cơ chất phát quang gây nên sự hình thành vệt màu trên pha rắn Phản ứng dương tính dễ dàng nhìn thấy bằng mắt thường như các vệt màu nâu sau khi enzyme phân giải cơ chất (Jayakumar

và ctv, 1995; Padmanaban và ctv, 1999; Clive, 2002; Martin, 2006; Shigetoshi và ctv, 2006)

Hình 2.6: Phương pháp Dot-ELISA (Martin, 2006)

2.5.2 Một số nghiên cứu ứng dụng của phương pháp Dot-ELISA

Hơn nữa thập kỉ qua, thí nghiệm Dot-ELISA đã được sử dụng cho chẩn đoán sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn, virus và kí sinh trùng Đối với virus,

từ những năm 1986, kỹ thuật Dot-ELISA đã được dùng để chẩn đoán kháng thể virus Bằng việc sử dụng kháng thể đa dòng và khoảng thời gian thí nghiệm từ 3 – 5 giờ đủ để cho kết quả phát hiện với độ nhạy bằng và hơn các phương pháp khác như: trung hoà huyết thanh, ức chế ngưng kết hồng cầu, kháng thể phát

16

huỳnh quang (Heberling và Kater, 1986) Ngoài ra, Dot-ELISA còn có thể ứng dụng để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên kí sinh trùng hoặc trên đĩa microtiter cho kiểm soát với quy mô lớn hay dipsticks cho xác định với số lượng

nhỏ (Pappas, 1998; Hisashi và ctv, 2003) Do đó, những năm 1990 kỹ thuật

Dot-ELISA đã được thực hiện trong các phòng thí nghiệm cho việc chọn lọc sự nhiễm ký sinh trùng Kỹ thuật này có những thuận lợi là có thể quan sát bằng mắt thường, kháng nguyên được chuyển thấm trên giấy cenllulose và có thể bảo quản trong 3 năm ở nhiệt độ 40C Bởi vì những thuận lợi này, kỹ thuật Dot-ELISA được sử dụng cho chẩn đoán sự hiện diện của ký sinh trùng (Hisashi và ctv, 2003)

Ngoài ra, kỹ thuật Dot-ELISA trên màng nitrocellulose còn được ứng

dụng việc xác định vi khuẩn Xanthomonas campestris gây bệnh cho cây trồng

vào năm 1987 Kết quả thí nghiệm thể hiện trong một phản ứng đặc hiệu xảy ra

sự ngưng kết tương đồng giữa kháng huyết thanh và vi khuẩn Mật độ vi khuẩn

103 đến 2.103 cfu/ml cho một lần chuyển thấm có thể được phát hiện, nhưng phản ứng chéo hiển nhiên dễ xảy ra với mật độ kháng nguyên cao hơn Đồng thời thí nghiệm cho thấy sự tách chiết tế bào có được từ sự ly tâm các vi khuẩn bị bất hoạt bởi nhiệt độ có kết quả ngưng kết tương tự với tế bào sống Những tế bào không liên quan không phản ứng kháng huyết thanh này (Lazarovits và ctv,

1987; Austin và Austin, 1989; Pappas, 1998)

Riêng đối với các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, hiện nay đã có một số bài báo liên quan đến việc sử dụng Dot-ELISA cho mục đích chẩn đoán Năm

1997, phương pháp này đã được dùng cho phát hiện nhanh các loài thuộc nhóm

vi khuẩn Aeromonas trên cá, dựa trên kết quả thu được từ nghiên cứu này cho

thấy phương pháp này có thể phát hiện được cả 6 loài thuộc nhóm vi khuẩn này, đặc biệt hoàn toàn không có phản ứng chéo với các loài vi khuẩn đường ruột khác Đồng thời khi so sánh với phương pháp nuôi cấy truyền thống, kết quả thống kê cho biết không có sự khác biệt giữa phương pháp này và Dot-Elisa với

17

độ tin cậy 97% (Majahao, 1997) Tiếp theo những năm sau đó là các nghiên cứu

sử dụng Dot-ELISA cho mục đích phát hiện một số vi khuẩn như V cholorela (Ambrosio và ctv, 2001), E tarda (Swain và ctv, 2001) hay V parahaemolyticus (Zang và ctv, 2006) và A hydrophilla (Siwaporn và ctv, 2007)

Do đó, hiện nay ngay đầu năm 2010, Dot-ELISA vẫn được sử cho nghiên

cứu chẩn đoán sự hiện diện của vi khuẩn E ictaluri trên cá bơn Nhật với hiệu giá

kháng thể sơ cấp thu được là 1/800 và kháng thể thứ cấp là 1/1000 Kết quả này

cho thấy độ đặc hiệu của phương pháp khi chỉ phát hiện E ictaluri và không có

phản ứng chéo với nhiều vi khuẩn đường ruột khác (Zhu và ctv, 2010)

18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

Giống vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophilla,

cá tra thí nghiệm được cung cấp từ phòng thí nghiệm bệnh học, thuộc khoa Thủy Sản, trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM

Vi khuẩn Edwardsiella tarda với số code 170310 và thỏ thí nghiệm được

mua ở viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

Cá tra bệnh được tại ao nuôi thuộc tỉnh An Giang

3.2.1 Dụng cụ - Thiết bị

- Các loại becher 1000 ml, 500ml, 100ml, các loại erlen 1000 ml, 500ml, 100ml, eppendorf 1,5 ml, đầu típ các loại, đèn cồn, đũa thủy tinh, đĩa ELISA 96 giếng, giấy bạc, khay inox, que cấy

23

- Thiết bị bao gồm: máy cất nước, máy ủ nhiệt lạnh, máy đo quang phổ, Máy lắc ổn nhiệt, máy chụp hình, tủ lạnh, Tủ đông – 20 0C, tủ mát, nồi hấp tiệt trùng, pH kế

3.2.2.1 Hóa chất cho nuôi cấy vi khuẩn

 Môi trường Brain Heart Infusion agar (BHIA)

 Môi trường Brain Heart Infusion broth (BHIB)

 Tá dược Freund’s (FA) (Sigma)

 Dung dịch formalin 40 %

3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể

 Dung dịch đệm phosphate (PBS) có pH 7,2

 Huyết thanh thỏ sạch bệnh làm huyết thanh đối chứng

3.2.2.3 Hóa chất dùng cho Dot-Elisa

 Hộp màng lai PVDF (polyvinylidene fluoride)15 cm x 15 cm

 Kháng thể cộng hợp HRP (horseradish peroxidase) kháng IgG của thỏ

 NTB (nitroblue tetrazolium): cơ chất phát màu

Điều chế FKC của

Edwardsiella ictaluri

Điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng FKC

Xác định hiệu giá vi ngưng kết kháng huyết thanh và FKC

Thực hiện kỹ thuật Dot-ELISA phát

hiện FKC và vi khuẩn E ictaluri

Ứng dụng trong phát hiện

nhanh vi khuẩn E ictaluri

Kiểm chứng phương pháp

Dot-ELISA phát hiện E ictaluri trên mẫu

gây bệnh thực nghiệm

3.3 Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Nội dung 5: Ứng dụng phát hiện nhanh vi khuẩn E icalturi trên cá tra

bệnh gan thận mủ trong ao nuôi

3.4 Các phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

dạng FKC (Formalin Killed Cell)

3.4.1.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn

Dùng que cấy vòng đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống vào môi trường thạch BHIA và ủ trong trong tủ ấm 280C trong 48giờ Đây là bước tăng sinh

sơ khởi để chọn lọc khuẩn lạc như mong muốn

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào bình môi trường BHI Broth Nắp chặt bình

và nuôi cấy lắc ở tủ lắc ủ nhiệt 28 0 C trong 24 giờ Yêu cầu bình nuôi cấy lớn để thu được khối lượng sinh khối cần thiết

3.4.1.2 Phương pháp tạo FKC (Andrea và ctv, 1998; James và ctv, 1990)

Sau 24 giờ vi khuẩn tăng sinh mạnh, bất hoạt vi khuẩn bằng formalin với liều lượng được tính bằng công thức

V formalin= 0,5 % x Vdd Trong đó: V formalin : thể tích formalin

Vdd : thể tích canh BHI Bảo quản vi khuẩn đã bị bất hoạt trong điều kiện 40C khoảng 48 giờ

Sau khi bất hoạt bằng formalin, tiến hành thu nhận vi khuẩn bằng cách ly tâm môi trường đã nuôi tăng sinh vi khuẩn lấy phần cô đặc nằm dưới ống ly tâm, có màu trắng trong vòng 15 phút

Vi khuẩn thu được rửa bằng nước muối sinh lý 3 lần Sau mỗi lần rửa li tâm lại để rửa sạch hết formalin Xác định khối lượng vi khuẩn thu được và huyền phù với dung dịch PBS có pH 7,2 với tỉ lệ 100 mg/ml Bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 100C cho đến khi sử dụng

3.4.2 Phương pháp tạo miễn dịch trên thỏ (Đỗ Ngọc Liên, 2004; Andrea và ctv, 1998)

 Cách tiêm gây miễn dịch: Lựa chọn thỏ không có dấu hiệu nhiễm bệnh, khỏe mạnh, không bị dị hình, có trọng lượng khoảng 2kg Tiêm dưới da ở vùng lưng, chân thỏ tại nhiều vị trí khác nhau nhằm tạo đáp ứng miễn dịch ban đầu

Hình 3.1: Thỏ thí nghiệm

 Quy trình tạo miễn dịch trên thỏ

 Các bước thực hiện như sau: pha trộn FKC Edwardsiella ictaluri

trong dung dịch PBS pH 7,2 có mật độ 4.108 tế bào/ml với FCA với tỉ

lệ 1:1 Lắc đều cho hỗn hợp đồng đều và sánh Tiêm hỗn hợp dung dịch trên cho thỏ thí nghiệm với liều lượng 2ml/lần tiêm Cạo sạch lông ở phần lưng của thỏ, sát trùng bằng cồn 700 trước khi tiêm Dùng

23

kim tiêm nhỏ tiêm dưới da tránh không phạm vào phần thịt của thỏ Quan sát tình trạng sức khỏe của thỏ trong suốt quá trình gây đáp ứng miễn dịch

 Các lần tiêm và lấy máu ở tĩnh mạch tai thỏ kiểm tra sự xuất hiện của kháng thể

Bảng 3.1 Các lần tiêm và lấy máu thỏ kiểm tra kháng thể

Ngày tiêm Ngày lấy máu Dung dịch tiêm Liều lượng

Chú thích: FA: Freund’s adjuvant (Sigma); FKC: vi khuẩn bị giết bằng formalin

 Nuôi thỏ sau khi gây miễn dịch

Nuôi thỏ bằng thức ăn tổng hợp được cung cấp từ viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh và cà rốt sạch mua tại siêu thị Co.op mart Cho thỏ ăn 3 lần một ngày (8 giờ sáng, 11 giờ trưa, 4 giờ chiều) với lượng thức ăn bằng 10% trọng lượng cơ thể

3.4.3 Phương pháp lấy máu - thu huyết thanh thỏ (Đỗ Ngọc Liên, 2004)

Cách tiến hành: lấy máu tĩnh mạch tai thỏ bằng ống tiêm vô trùng

Bước 1: Để cho máu đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ, sau đó để qua đêm ở tủ lạnh 40C

Bước 2: Tách cục máu đông và rót tất cả phần dịch lỏng vào ống nghiệm li tâm

Bước 3: Ly tâm cục máu đông 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C và lấy

ra phần dịch từ các cục máu đông để thu gom vào phần dịch ở bước 2

Bước 4: Ly tâm toàn bộ phần dịch thu gom từ 15 – 20 phút ở 1.500 vòng/phút ở 40C Bảo quản huyết thanh ở - 200C

- Đối với vi khuẩn E ictaluri dạng FKC: nhỏ 2 giọt dịch FKC pha loãng trong

PBS pH 7,2 đạt mật độ quang OD là 0,8 lên phiến kính, hòa cùng 2 giọt huyết thanh pha loãng ở nồng độ đầu tiên (Hawke và ctv, 1998)

- Đối với vi khuẩn E ictaluri sống: nhỏ 2 giọt huyền phù vi khuẩn trong PBS

pH 7,2 đạt mật độ quang OD 0,8 lên phiến kính, tiếp tục hòa cùng 2 giọt huyết thanh pha loãng ở nồng độ đầu tiên

- Thực hiện phản ứng ngưng kết tương tự với huyết thanh thỏ sạch bệnh làm thí nghiệm đối chứng

- Theo dõi và quan sát trong vòng 30 giây Nếu trên phiến kính có nhiều cụm

liên kết li ti – chứng tỏ huyết thanh thỏ có kháng thể kháng FKC và E ictaluri

- Thí nghiệm được thực hiện tiếp tục với các dung dịch huyết thanh pha loãng kết tiếp Mỗi một nồng độ thực hiện lập lại 3 lần

Hình 3.2: Phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính

3.4.5 Phương pháp xác định hiệu vi giá ngưng kết của huyết thanh thỏ

(Austin và Austin, 1989; Eijiro và ctv, 1998 )

Phản ứng vi ngưng kết trực tiếp được thực hiện trên đĩa ELISA 96 giếng Kết quả của sự ngưng kết có thể được quan sát trực tiếp hoặc bằng kính lúp: nếu có mạng ngưng kết li ti bao phủ đáy giếng là phản ứng ngưng kết dương tính (+), ngược lại kháng nguyên tụ dưới đáy giếng thành hạt màu trắng là phản ứng âm tính (-) Phương pháp thực hiện trên đĩa microplate theo các bước sau:

25

Chuẩn bị huyền phù FKC của E ictaluri trong PBS pH 7,2 với mật độ quang

là 0,8 tại bước sóng 540nm Thêm 25 µl dung dịch pha loãng kháng thể PBS pH 7,2 vào 11 giếng ngoại trừ giếng thứ nhất

Cho 25 µl huyết thanh thỏ vào các giếng 1 và 2 Dùng pipet để trộn hỗn hợp dịch trong giếng 2, như vậy ta đã có dung dịch huyết thanh được pha loãng 2 lần Chuyển 25 µl của giếng 2 sang giếng 3 rồi trộn hỗn hợp cho đều, tiếp tục cho đến giếng thứ 11, giếng cuối cùng là 25 µl dung dịch PBS pH 7,2 Cuối cùng ta được một dãy pha loãng bậc 2 Thêm 25 µl huyền phù vi khuẩn (FKC) vào mỗi giếng và bọc mỗi đĩa lại bằng một miếng phim Lắc nhẹ đĩa trên mặt phẳng bàn để hỗn hợp hòa trộn lại với nhau Thí nghiệm lập lại ương tự với huyết thanh thỏ sạch bệnh làm đối chứng

Ủ đĩa ở nhiệt độ 40 C trong 16 giờ trước khi đọc kết quả

Bảng 3.2 Quy trình thực hiện phản ứng ngưng kết huyết thanh thỏ - FKC

3.4.6 Phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC bằng

Dot-Elisa

Quy trình phát hiện kháng nguyên được chuyển thấm (Đỗ Ngọc Liên, 2004; Nourollahi, 2004)

Bước 1 (Chuyển thấm vệt): Tạo vết chuyển thấm kháng nguyên lên màng lai

ướt với với thể tích là 5 µl có mật độ quang (OD) 0,8 Để chuẩn bị màng lai ướt,