ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI MẮM TRẮNG (Avicennia alba BL.) Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT AFLP

56 4.5 Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Mắm trắng ở rừng ngập mặn Cần Giờ ..... 2.1.2 Đặc trưng và đa dạng sinh học rừng ngập mặn Thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….W U X…

PHẠM VĂN BÌNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI MẮM TRẮNG

(Avicennia alba BL.) Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BẰNG KỸ THUẬT AFLP

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….W U X…

PHẠM VĂN BÌNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI MẮM TRẮNG

(Avicennia alba BL.) Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BẰNG KỸ THUẬT AFLP

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số : 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học:

TS BÙI MINH TRÍ

Lý lịch cá nhân Tôi tên là Phạm Văn Bình, sinh ngày 02 tháng 04 năm 1982, tại xã Phước Diêm, huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận Con Ông Phạm Văn Là và Bà Tăng Diệu Liếm

Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Trung học phổ thông Nguyễn Trãi, Thị xã Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận năm 2001

Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học hệ chính quy tại Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005

Tháng 09 năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình: đính hôn ngày 11- 8 – 2010 (ngày 2 – 7 AL)

Địa chỉ liên lạc: Lạc Tân, Phước Diêm, Thuận Nam, Ninh Thuận

Điện thoại: 0683.860259 hoặc 0983.889796

Email: phambinhbio@gmail.com

pvbinh@vnuhcm.edu.vn

Lời cam đoan

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Phạm Văn Bình

Lời cảm ơn

¾ Ngàn ờibiếtơn xin gởiđến Cha Mẹ và Cô,n ườiđã n ôidạy co k ôn ớn

và có được n ữn gìh m nay

¾ Thàn âm c m ơn haibên NộiNg ạiđã u n ủ g hộ,đ n viên và giú đỡ

¾ Trân rọ g c m ơn c c Thầy Cô ro g p ò g Sau Đại h c và Bộ mô Cô g

ng ệ Sin h c đã sắp xếp,b ríđể ôihoàn hàn k óa h c

¾ Lờitriân sâu sắ nhấtxin được gởiđến Thầy - TS.BùiMin Trí hướn dẫn

kh a h c,đã ận ìn giú đỡ,chỉ bảo ôi tro g c q ản đườn Đại h c ẫn Cao h c

¾ Chân hàn c m ơn Thầy Viên Ngọc Nam,c m ơn c c Thầy Cô,c c an chị

em đan àm việ và hực hiện Đề àiở Tru g âm Phân ích Thíng iệm Hóa Sin Trườn Đạih c Nô g Lâm Tp.Hồ ChíMin

¾ Chân hàn c m ơn chị Võ Thị Th y Huệ, an Hà Trần Min Dũ g, an

Ng yễn Than Tù g, em Văn Ng c Du g, Ng yễn Min Nam, em Hu nh

Qu c Thái Trần Văn Trườn và c c bạn Phi Lê,Dươn ,Trà,Phượn ,Vũ,Lẫm,… đã giú đỡ hực hiện đề àivà chia sẽ cù g ôin ữn úc b ồ v i

¾ Chân hành c m ơn em BùiThế Kiệtvà c c an em ở Ban quản ý rừn n ập mặn Cần Giờ đã n iệttn giú đỡ ôi ro g su tthờigian h hập mẫu

¾ Đồ g c m ơn c c anh chịvà c c bạn ớp Cao h c Cô g n hệ Sin h c 2 0 ,lớp CNSH 2 và bạn bè gần xa đã u n bên c n ,chia sẻ,đ ng viên và giúđỡ

¾ Lời c m ơn sau cù g xin dàn ch Em và Gia đìn em,đã ạo điểm ựa inthần để ôi iến bước

PHẠM VĂN BÌNH

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Đánh giá đa dạng di truyền loài Mắm trắng

(Avicennia alba BL.) ở rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật AFLP” được

tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4 năm 2008 đến tháng 12 năm 2009

Mắm trắng được xem là loài tiên phong, đóng vai trò quan trọng ở rừng ngập mặn Cần Giờ Trong đề tài này, 80 mẫu Mắm trắng thuộc 15 tiểu khu được thu nhận

và phân tích AFLP Chúng tôi bố trí các thí nghiệm để hoàn thiện quy trình AFLP

và sử dụng các phần mềm Statgraphics centurion, NTSYSpc 2.1 và Popgene 1.32

để xử lý số liệu và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể Mắm trắng ở rừng ngập mặn Cần Giờ

Với quy trình ổn định, chúng tôi đã ly trích được 75 mẫu có chất lượng DNA tốt và đã khảo sát thành công việc thay thế adaptor và primer tiền chọn lọc không theo kit trong quy trình AFLP Đồng thời, thực hiện thành công việc kết hợp 3

primer trong phản ứng PCR khuếch đại chọn lọc gồm 1 primer MseI-CNN và 2 primer EcoRI-ANN Tuyển chọn được 8 tổ hợp primer chọn lọc có tính đa hình cao

để phân tích AFLP, trong đó đa hình cao nhất là tổ hợp primer AM-CTG/E-AGC và

chỉ số PIC của các tổ hợp primer biến thiên từ 0,395 đến 0,415

Phân tích AFLP 75 mẫu với 8 tổ hợp primer chọn lọc thu nhận được 289 band, trong đó có 228 band đa hình, chiếm tỷ lệ 78,89% Phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 cho hệ số tương đồng di truyền của 75 mẫu biến thiên từ 0,63 đến 0,965 Với phần mềm Popgene 1.32, kết quả cho khoảng cách di truyền của các mẫu Mắm trắng thuộc 12 tiểu khu biến thiên từ 0,005 đến 0,175 Từ cây di truyền cho thấy quần thể Mắm trắng ở rừng ngập mặn Cần Giờ có mức độ đa dạng di truyền thấp nhưng có sự lai tạo khá phức tạp

ABSTRACT

The thesis: “Assessing genetic diversity of Avicennia alba in Can Gio

mangrove by AFLP marker” This thesis was carried out at Chemical and

Biological Analysis and Experiment Center, Nong Lam University, from April 2008

to October 2009

Avicennia alba is considered the major specie It plays an important role in Can Gio mangrove In this study, 80 samples were collected at 15 sub-areas in Can Gio mangrove and analyzed by using AFLP marker We arranged the experiments

to complete AFLP protocol Then using Statgraphics centurion, NTSYSpc 2.1 and Popgene 1.32 software to analyze data and evaluate the genetic diversity of

Avicennia alba in Can Gio mangrove

With stabilization of protocol, 75 high quality DNA samples were extracted

from 80 Avicennia alba leaf samples and applied for AFLP analysis Adaptor and

pre-selective primer of Invitrogen manufacturer were successfully interchanged to those in AFLP kit Simultaneously, successful combination of 3 primers which were

two EcoRI-ANN and one MseI-CNN in a multiplex selective PCR amplification

reaction was approached Eight selective primer combinations with high polymorphism were chosen from 64 combinations for AFLP analysis Among of

them, AM-CTG/E-ACC complex showed the highest polymorphism The PIC index

varied from 0.395 to 0.415

Based on data of 75 AFLP analyses using 8 primer combinations, 289 variable DNA fragment were recorded 228 of them (78.89%) were considered polymorphic By using the NTSYSpc 2.2, the coefficient of similarity of 75 samples ranged between 0.63 and 0.965 Through Popgene 1.32 software, the genetic

distance of Avicennia alba from 12 sub-areas varied from 0.005 to 0.175 The

phylogenic trees showed the low level of genetic diversity but complex crossing of

Avicennia alba population in Can Gio mangrove

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm ơn iv

TÓM TẮT v

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ xiii

DANH SÁCH CÁC BẢNG xv

Chương 1 1

GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và mục đích 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Mục đích 2

Chương 2 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về rừng ngập mặn 3

2.1.1 Phân bố 3

2.1.2 Đặc trưng và đa dạng sinh học rừng ngập mặn 5

2.1.3 Tầm quan trọng và lợi ích của rừng ngập mặn 6

2.1.4 Rừng ngập mặn Việt Nam 8

2.1.5 Rừng ngập mặn Cần Giờ 9

2.2 Đặc điểm cây Mắm trắng (Avicennia alba) 11

2.3 Đa dạng sinh học 13

2.3.1 Đa dạng di truyền 13

2.3.3 Đa dạng hệ sinh thái 14

2.3.4 Lợi ích của đa dạng sinh học 14

2.4 Các phương pháp nghiên cứu tính đa dạng di truyền 15

2.4.1 Thông tin di truyền 15

2.4.2 Phương pháp ly trích DNA 16

2.4.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) 16

2.4.4 Các marker phân tử dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 18

2.4.4.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 18

2.4.4.2 SSCP (Single - Strand Conformation Polymorphism) 19

2.4.4.3 SSR (Simple Sequence Repeat) 20

2.4.4.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 20

2.4.4.5 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 22

2.4.5 Các phần mềm dùng trong việc đánh giá đa dạng di truyền 28

2.4.5.1 NTSYSpc 2.1 28

2.4.5.2 Popgene 1.32 29

2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về đa dạng di truyền của thực vật rừng ngập mặn 30

2.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới 30

2.5.2 Các nghiên cứu trong nước 31

Chương 3 32

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 Thời gian và địa điểm 32

3.1.1 Thời gian 32

3.1.2 Địa điểm 32

3.2 Nội dung nghiên cứu 32

3.3 Vật liệu và hóa chất 33

3.3.1 Các mẫu thí nghiệm 33

3.3.2 Hóa chất thí nghiệm 34

3.3.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA 34

3.3.2.2 Hóa chất dùng trong điện di 34

3.3.2.3 Hóa chất dùng để chạy AFLP 34

3.4 Phương pháp nghiên cứu 34

3.4.1 Phương pháp ly trích DNA 34

3.4.2 Định tính và định lượng DNA 35

3.4.2.1 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 35

3.4.2.2 Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) 36

3.4.3 Phương pháp AFLP (Quy trình theo Applied Biosystems) 36

3.4.3.1 Cắt DNA và kiểm tra trên gel agarose 37

3.4.3.2 Chuẩn bị hỗn hợp enzyme 37

3.4.3.3 Thực hiện phản ứng cắt và gắn 37

3.4.3.4 Nhân bản tiền chọn lọc 39

3.4.3.5 Nhân bản chọn lọc 41

3.4.3.6 Điện di sản phẩm nhân bản chọn lọc bằng máy giải trình tự DNA (máy sequencer ABI 3100) 42

3.4.3.7 Tối ưu hóa phản ứng PCR chọn lọc 43

3.4.3.8 Chọn các tổ hợp primer chọn lọc thích hợp cho việc phân tích AFLP trên cây Mắm 43

3.4.4 Phân tích kết quả 44

Chương 4 45

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Kết quả thu thập mẫu 45

4.2 Ly trích DNA 46

4.3 Tối ưu hóa một số thành phần hóa chất trong kỹ thuật AFLP 48

4.3.1 Kết quả cắt DNA 48

4.3.2 Hiệu quả của adaptor trong giai đoạn cắt và gắn DNA 49

4.3.3 Hiệu quả của primer tiền chọn lọc 50

4.3.4 Hiệu quả của adaptor và primer tiền chọn lọc trong nhân bản chọn lọc 51

4.3.5 Tối ưu hóa phản ứng PCR chọn lọc 54

4.4 Kết quả tuyển chọn các tổ hợp primer chọn lọc thích hợp cho việc phân tích

AFLP trên cây Mắm trắng 56

4.5 Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Mắm trắng ở rừng ngập mặn Cần Giờ 60

4.5.1 Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP trên 8 tổ hợp primer 60

4.5.2 Phân tích đa dạng di truyền của 75 mẫu Mắm trắng ở rừng ngập mặn Cần Giờ 63

Chương 5 74

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74

5.1 Kết luận 74

5.2 Đề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

• 3D: 3 - Dimension

• A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine

• AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

• ATP: Adenosine - 5’- triphosphate

• BSA: Bovine serum albumine

• CTAB: Cetyltrimethyl ammonium bromide

• DNA: Deoxyribonucleic acid

• dNTP: Deoxyribonucleotide - 5- triphosphate

• EB: Extraction Buffer

• EDTA: Ethylenediaminetetraacetate

• LHQ: Liên Hiệp Quốc

• MseI-CNN, EcoRI-AN, EcoRI-ANN: N là 1 trong 4 nucleotide (A,T,G,C)

• NT: Nghiệm thức

• PCA: principal coordinate analysis

• PCR: Polymerase Chain Reaction

• PIC: Polymorphic Information Content

• PVP: Polyvinylpyrrolidone

• RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

• RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

• RNA: Ribonucleic acid

• RNM: rừng ngập mặn

• SAHN: Sequential agglomerative hierarical nested cluster analysis

• SDS: Sodium dodecyl sulfate

• Sp: Sản phẩm

• SR: Simple rounding

• SRB: Spring and rubber band

• SSCP: Single- Strand Conformation Polymorphism

• SSR: Simple Sequence Repeat

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 2.1: Tỷ lệ diện tích rừng ngập mặn của các quốc gia năm 2005 4

Biểu đồ 2.2: Sự thay đổi diện tích rừng ngập mặn trên thế giới từ năm 1980–2005 4 HÌNH Hình 2.1: Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD - PCR 21

Hình 2.2: Đoạn DNA tạo thành bởi enzyme cắt MseI và EcoRI 23

Hình 2.3: Cách gắn của adaptor MseI và adaptor EcoRI 24

Hình 2.4: Khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP 25

Hình 2.5: Khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP 26

Hình 2.6: Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP 27

Hình 3.1 : Cây Mắm ở rừng ngập mặn Cần Giờ 33

Hình 4.1: Sơ đồ vị trí lấy mẫu ở rừng ngập mặn Cần Giờ 45

Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu ly trích trực tiếp 46

Hình 4.3: Kết quả điện di các mẫu đã bảo quản ở -700 C sau khi nghiền 47

Hình 4.4: Kết quả điện di cắt thử DNA 48

Hình 4.5: Kết quả điện di của thí nghiệm 1 (kiểm tra hiệu quả gắn của 2 loại adaptor) 49

Hình 4.6: Kết quả điện di của thí nghiệm 2 (khảo sát hiệu quả của 2 loại primer tiền chọn lọc) 50

Hình 4.7: Mô hình thu nhận kích thước sp khuếch đại trong kỹ thuật AFLP 53

Hình 4.8: Cây di truyền của 75 mẫu Mắm trắng ở rừng ngập mặn Cần Giờ được dựng bởi chương trình SAHN của phần mềm NTSYSpc 2.1 64

Hình 4.9: Hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu thuộc 12 tiểu khu được phân tích bởi phần mềm NTSYSpc 2.1 67

Hình 4.10: Cây di truyền của các mẫu thuộc 12 tiểu khu ở rừng ngập mặn Cần Giờ

được dựng bởi chương trình SAHN của phần mềm NTSYSpc 2.1 68

Hình 4.11A: Phân tích 2D PCA các mẫu thuộc 12 tiểu khu ở rừng ngập mặn Cần

Giờ bằng chương trình Eigen của phần mềm NTSYSpc 2.1 70

Hình 4.11B: Phân tích 3D PCA các mẫu thuộc 12 tiểu khu ở rừng ngập mặn Cần

Giờ bằng chương trình Mod3D plot của phần mềm NTSYSpc 2.1 70

Hình 4.12: Sơ đồ khoảng cách di truyền cây Mắm trắng của 12 tiểu khu ở rừng

ngập mặn Cần Giờ được dựng bởi phần mềm Popgene 1.32 72

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Ước lượng diện tích rừng ngập mặn trên thế giới 3

Bảng 2.2: Lợi ích về kinh tế của rừng ngập mặn 7

Bảng 2.3: Diện tích đất ngập mặn và rừng ngập mặn Việt Nam 9

Bảng 2.4: So sánh đặc điểm của các chỉ thị phân tử 28

Bảng 3.1: Thành phần hóa chất tổng hợp adaptor từ 2 đoạn oligonucleotide 38

Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng cắt và gắn trong thí nghiệm 1 39

Bảng 3.3: Thành phần hóa chất của phản ứng tiền chọn lọc trong thí nghiệm 2 40

Bảng 3.4: Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản tiền chọn lọc 40

Bảng 3.5: Thành phần hóa chất của phản ứng nhân bản chọn lọc trong thí nghiệm 3 41

Bảng 3.6: Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản chọn lọc 41

Bảng 3.7: Thành phần hóa chất của phản ứng nhân bản chọn lọc trong thí nghiệm 4 43

Bảng 3.8: Các primer chọn lọc 44

Bảng 4.1: Tóm tắt thí nghiệm 2 50

Bảng 4.2: Tóm tắt các nghiệm thức trong thí nghiệm 3 51

Bảng 4.3: Kết quả điện di của thí nghiệm 3 với cặp primer MseI-CAT/EcoRI –ACC (kích thước bp/nghiệm thức) 52

Bảng 4.4: Kết quả điện di của thí nghiệm 4 54

Bảng 4.5 : Kết quả thống kê so sánh số sản phẩm khuếch đại trung bình của các nghiệm thức trong thí nghiệm 4 55

Bảng 4.6: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại chọn lọc của 64 tổ hợp primer trong kỹ thuật AFLP 56

Bảng 4.7: Kết quả thống kê so sánh số sp khuếch đại của các tổ hợp primer chọn lọc

58

Bảng 4.8: Danh sách 8 tổ hợp primer chọn lọc được tuyển chọn 59 Bảng 4.9: Tổng các sản phẩm khuếch đại chọn lọc theo từng loại primer 60 Bảng 4.10: Bảng thống kê số sản phẩm khuếch đại của 8 tổ hợp primer chọn lọc

trên 75 mẫu Mắm trắng nghiên cứu 61

Bảng 4.11: Các sản phẩm khuếch đại đa hình và mối liên quan với các đặc điểm

mẫu phân tích 63

Bảng 4.12: Bảng thống kê số sản phẩm khuếch đại của các tiểu khu với 8 tổ hợp

primer chọn lọc 66

Bảng 4.13: Khoảng cách di truyền và xác định di truyền của các mẫu thuộc các tiểu

khu tiểu khu (trên là xác định di truyền và bên dưới là khoảng cách di truyền) được phân tích bởi phần mềm Popgene 1.32 72

Diện tích rừng ngập mặn trên thế giới ước khoảng 15,2 triệu ha (Killmann, 2007) Tuy nhiên, một điều đáng báo động là diện tích rừng ngập mặn ngày càng bị thu hẹp Trong những năm 1980, mỗi năm diện tích rừng ngập mặn mất đi khoảng 185.000 ha, những năm 1990 khoảng 118.500 ha và từ năm 2000 – 2005 mỗi năm mất khoảng 102.000 ha Tính từ năm 1980 đến nay có khoảng 3,6 triệu ha rừng ngập mặn bị phá hủy chiếm khoảng 20% (Killmann, 2007) Điều này đã gây những tác hại to lớn đến đời sống xã hội qua những thay đổi khí hậu, lũ lụt, bão tố, thiên tai Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, có bờ biển dài khoảng 3260 km với khoảng 157.500 ha rừng ngập mặn (Wilkie, 2007; Killmann, 2007) Theo xu hướng chung của thế giới, diện tích rừng ngập mặn ở Việt Nam cũng giảm đáng kể Năm

1980 rừng ngập mặn Việt Nam là 269.150 ha, năm 1990 là 213.500 ha, năm 2000 là 157.500 ha, năm 2005 là 157.000 ha

Riêng rừng ngập mặn Cần Giờ, vừa là nơi thu hút du lịch vừa là nơi điều tiết khí hậu của khu vực, được xem là lá phổi của thành phố Hồ Chí Minh cũng có

những thay đổi đáng kể về số lượng và kết cấu trước và sau chiến tranh năm 1975 Trước tình hình đó, việc nghiên cứu để khôi phục, duy trì, bảo tồn và phát triển bền vững rừng ngập mặn Cần Giờ là một việc làm cần thiết Được sự quan tâm của chính quyền thành phố nhiều đề án, đề tài nghiên cứu về rừng ngập mặn Cần Giờ đã được triển khai và có một số thành công nhất định Tuy nhiên, việc nghiên cứu đa dạng về nguồn gen của các giống cây trồng rừng ngập mặn là một vấn đề còn mới,

đáng được quan tâm và phát triển Đặc biệt, Mắm trắng (Avicennia alba) được

xem là loài tiên phong, đóng vai trò quan trọng ở rừng ngập mặn Cần Giờ Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của loài này sẽ góp phần vào công tác quy hoạch, bảo tồn và phát triển bền vững diện tích rừng ngập mặn Cần Giờ Đồng thời, cũng cho phép tìm được các chỉ thị phân tử để ứng dụng vào công tác chọn, tạo giống phục vụ cho việc phát triển bền vững rừng ngập mặn Việt Nam

Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật phân tử được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền của quần thể Nhưng với những đối tượng mới, chưa biết thông tin về bộ gen thì kỹ thuật AFLP thường được sử dụng và cho độ tin cậy cao

Với thực trạng đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của TS Bùi Minh Trí, tôi đã tiến

hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền của loài Mắm trắng (Avicennia

alba BL.) ở rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật AFLP”

Rừng ngập mặn được phân bố rộng rãi trên 112 quốc gia và lãnh thổ Theo một

số tác giả, diện tích trên toàn thế giới ước lượng khoảng 10 triệu ha (Bunt, 1992),

14-15 triệu ha (Schwamborn và Saint-Paul, 1996), và 24 triệu ha (Twilley và ctv, 1992), ước lượng gần đây nhất là trên 18 triệu ha (Spalding, 1997) (trích dẫn Kathiresan và Bingham, 2001) Tuy nhiên, trong một tổng kết về diện tích rừng ngập mặn Killmann (2007) đã đưa ra con số ước lượng như trong bảng 2.1 Diện tích này chiếm khoảng 75% những bờ biển nhiệt đới trên toàn thế giới (Feller và Sitnik, 2002)

Bảng 2.1: Ước lượng diện tích rừng ngập mặn trên thế giới

Tác giả Năm Số quốc gia có RNM Tổng diện tích RNM (ha)

FAO và UNEP, 1981a, b, c

Saenger, Hegerl và Davie, 1983

FAO, 1994

Groombridge, 1992

ITTO và ISME, b 1993

Fisher và Spalding, 1993

Spalding, Blasco và Field, 1997

Aizpuru, Achard và Blasco, 2000

1980

1983 1980–1985

1992

1993

1993

1997 2000

17.075.600

Rừng ngập mặn được giới hạn trong khoảng 30o Bắc và 30o Nam Giới hạn Bắc tính từ Nhật Bản (31o 22’N) và Bermuda (32o20’N), giới hạn Nam tính từ New ealand (38°03’S), Australia (38°45’S) và bờ biển phía Đông của Nam Phi (32°59’S) Sự phân bố và thay đổi diện tích rừng ngập mặn từ năm 1980 – 2005 được trình bày trong biểu đồ 2.1 và 2.2

Biểu đồ 2.1: Tỷ lệ diện tích rừng ngập mặn của các quốc gia năm 2005

(Trích dẫn Killmann, 2007)

Biểu đồ 2.2: Sự thay đổi diện tích rừng ngập mặn trên thế giới từ năm 1980 –

2005

(Trích dẫn Killmann, 2007)

2.1.2 Đặc trưng và đa dạng sinh học rừng ngập mặn

Thực vật rừng ngập mặn phát triển tại ranh giới tiếp giáp giữa đất liền và biển,

ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với điều kiện độ mặn cao, thủy triều thay đổi lớn, gió mạnh, nhiệt độ cao, bùn lầy và đất thiếu khí nên hệ sinh thái rừng ngập mặn rất phong phú và đa dạng thông qua chuổi thức ăn mà bắt đầu từ thực vật Thực vật rừng ngập mặn cung cấp một lượng lớn lá cây giàu dinh dưỡng cho nấm,

vi khuẩn, phiêu sinh vật, tảo và các động vật sống ở tầng đáy Sự phân hủy các hợp chất hữu cơ này cũng cung cấp một lượng lớn thức ăn cho nhiều loài thân mềm (rắn), giáp xác (cua, tôm) và cá, từ đó quay lại cung cấp nguồn thức ăn cho những động vật lớn hơn

Thực vật rừng ngập mặn được chia làm 3 nhóm chính: những loài ngập mặn chủ yếu, những loài ngập mặn thứ yếu và những loài ngập mặn liên quan Những loài cây ngập mặn chủ yếu được nhận biết bởi 6 đặc điểm sau (Tomlinson,1986 Trích dẫn Kathiresan, 2005; Feller và Sitnik, 2002 và Killmann, 2007):

9 Chúng đặc trưng cho rừng ngập mặn

9 Chúng thực hiện chức năng chính của rừng và có khả năng hình thành quần thể thuần

9 Chúng có sự chuyên biệt về hình thái, đặc biệt là có hệ thống rễ trên không

và có cơ chế đặc biệt cho việc trao đổi khí

9 Chúng có cơ chế đặc biệt trong việc ngăn chặn muối vào và loại thải muối

9 Chúng có khả năng tái sinh sản

9 Chúng được phân loài từ những mối quan hệ trên cạn, những loài cây ngập mặn chủ yếu được phân chia dựa vào những quan hệ gần nhất với chúng trong mức độ di truyền họ và dưới họ

Những cây ngập mặn chủ yếu gồm có 34 loài thuộc 9 giống và 5 họ, những cây ngập mặn thứ yếu gồm 20 loài thuộc 11 giống và 11 họ, tổng cộng gồm 54 loài, 20 giống và 16 họ (Tomlinson,1986 Trích dẫn Kathiresan, 2005) Mặc khác, Duke (1992) đã xác định có 69 loài, 26 giống và 20 họ (Trích dẫn Kathiresan, 2005) Để dung hòa 2 quan điểm trên, Kathiresan đã đưa ra nhận định là có 65 loài thuộc 22

giống và 16 họ Ngoài ra, theo Feller và Sitnik (2002), chúng chỉ có 40 - 50 loài thuộc 16 họ Có sự khác biệt này là do hệ thống phân loại chưa đồng nhất, nhưng dù sao cũng thể hiện rõ sự đa dạng về thực vật trong rừng ngập mặn Sự đa dạng này phân bố không đều trên thế giới, khoảng 40 loài phân bố ở Đông nam Á, 15 loài ở Châu Phi và 10 loài ở Châu Mỹ Ngoài ra, nếu chia thành 2 nhóm lớn về đa dạng thực vật rừng ngập mặn thì: nhóm phía Đông (Australia, Southeast Asia, India, East Africa and the Western Pacific) chiếm khoảng 40 loài, còn nhóm phía Tây (West Africa, Caribbean, Florida, Atlantic South America and Pacific North and South America) chỉ chiếm khoảng 8 loài (Feller và Sitnik, 2002)

Theo Kathiresan (2000), sự đa dạng sinh học được tìm thấy tại rừng ngập mặn

Pichavaram ở niềm Nam Ấn Độ gồm 13 loài cây ngập mặn (Mắm quăn và Đước là những loài chiếm ưu thế), 52 loài vi khuẩn, 23 loài nấm, 82 loài tảo, 22 loài rong biển, 3 loài cỏ biển, 95 loài động vật phiêu sinh, 40 loài meiobenthos, 52 loài macrobenthos, 177 loài cá và 200 loài chim

Ở rừng ngập mặn Cần Giờ, tài nguyên động thực vật, thủy sản gồm: Đước, Bần trắng, Mắm trắng, Mắm biển, Đưng, Vẹt, Xu, Cóc, Chà là, Giá,…; Động vật rừng hoang giã có cá Sấu hoa cà, Khỉ đuôi dài, Rắn hổ mang, Chim nước có Bồ Nông chân xám, Già Đãy nhỏ, Diệc Xám Thủy sản nước lợ có tôm Sú, tôm Bạc thẻ, cá Ngát, cá Dứa (Lê Văn Khôi, 2006)

2.1.3 Tầm quan trọng và lợi ích của rừng ngập mặn

Với cấu trúc của rừng ngập mặn, chúng thật sự có tầm quan trọng rất lớn trong việc giảm hiệu ứng nhà kính, ngăn chặn những thiệt hại từ bức xạ UV-B, giảm nhẹ sức gió và sóng thần, hạn chế lũ lụt, ngăn chặn xói mòn bờ biển, tích tụ chất mùn, cung cấp lượng tài nguyên phong phú, gần đây cho thấy rừng ngập mặn với các vỉa san hô và cỏ biển có thể làm giảm nhẹ hoặc tiêu tan các đợt sóng thần cao 15 mét Một nghiên cứu của Nhật Bản cho thấy, một rừng ngập mặn có chiều rộng 100 mét

có thể làm giảm 50% chiều cao của sóng triều và giảm 50% năng lượng của sóng Bên cạnh những lợi ích về sinh thái, rừng ngập mặn còn mang lại những lợi ích rất lớn về kinh tế, thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Lợi ích về kinh tế của rừng ngập mặn

Quốc gia Lĩnh vực sử dụng của

RNM Giá trị (USD/ha/năm) Tác giả, năm

Indonesia Sử dụng truyền thống

3000 (chiếm một nửa thu nhập của những hộ gia đình nghèo nhất)

Sathirathai, 1998

Miền Nam Thái Lan Sự ổn định và bảo vệ

Tỉnh Koh Kong của

Irian Jaya Chống xói mòn 600/ hộ gia đình/ năm Ruitenbeek, 1992

Miền Nam Việt Nam

Bảo vệ chống lại sự thay đổi quá lớn của thời tiết

Đông Nam Thái Lan Chức năng hệ sinh thái 10000 Panapitukkµl, l998

Trên thế giới Lợi ích từ rừng và thủy

Điều hòa sự xáo trộn 1839 Costanza, l997

Việt Nam là nước có nhiều điều kiện thuận lợi cho rừng ngập mặn phát triển,

nhất là vùng ven biển Đồng bằng Nam Bộ Theo Maurand (1943), trước chiến tranh

rừng ngập mặn chiếm diện tích tương đối lớn, khoảng 400.000 ha, chủ yếu là ở

Nam bộ khoảng 250.000 ha (trích dẫn Phan Nguyên Hồng, 1988) Hai vùng có rừng

ngập mặn tập trung là bán đảo Cà Mau 150.000 ha và rừng Sát Cần Giờ 40.000 ha

(Cương, 1964; trích dẫn Phan Nguyên Hồng, 1988)

Do khai thác rừng để lấy than, gỗ, củi quá mức nên diện tích rừng ngập mặn

giảm nhanh Đến cuối năm 1960 rừng ngập mặn chỉ còn 3/4 Từ năm 1962 đến

1971 chiến tranh hóa học của Mỹ đã hủy diệt 104.123 ha mà 52 % là ở Cà Mau và

41% là ở Cần Giờ, còn lại là các tỉnh ở miền Tây Nam bộ Đến nay phần lớn vùng

bị rải chất độc hóa học, rừng đã tái sinh và thành phần chủ yếu là Mắm, Chà là và

một diện tích khá lớn được trồng Đước đôi

Rừng ngập mặn Việt Nam trải dài từ Bắc đến Nam, chia làm 4 khu vực:

9 Ven biển Đông Bắc từ Móng Cái (Quảng Ninh) đến Đồ Sơn (Hải Phòng)

9 Ven biển đồng bằng Bắc Bộ từ Đồ Sơn đến Lạch Trường (Thanh Hóa)

9 Ven biển miền Trung kéo dài từ Lạch Trường đến Vũng Tàu

9 Ven biển Nam Bộ từ Vũng Tàu tới Hà Tiên

Trong 4 khu vực này, rừng ngập mặn ở ven biển Nam Bộ là phát triển tốt nhất

Bảng 2.3: Diện tích đất ngập mặn và rừng ngập mặn Việt Nam

Phân bố các tỉnh,

thành phố

Diện tích đất ngập mặn

Tỷ lệ (%)

Diện tích rừng ngập mặn

Tỷ lệ (%)

Ven biển Bắc Bộ 122.335 ha 21% 43.811 ha 28,1%Ven biển Trung Bộ 40.042 ha 7,2% 3.000 ha 2% Ven biển Nam Bộ 373.306 ha 61,5% 82.387 ha 53%

(Nguồn: http://www.scribd.com/doc/16647042/Rungngapman) Theo thống kê năm 2000, cả nước có 606.792 ha đất ngập mặn ven biển Trong

đó, 155.290 ha là diện tích rừng ngập mặn, 25.427 ha là diện tích không có rừng ngập mặn và 226.075 ha diện tích đầm nuôi tôm nước lợ có đê cống

Vùng lõi: với tổng diện tích 4.721 ha gồm các tiểu khu 3, 4b, 6, 11, 12 và 13 với sự đa dạng cao cả về động vật, thực vật và các dạng sinh cảnh của rừng ngập mặn Vùng lõi có các chức năng chính như:

9 Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên

9 Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn và các môi trường sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước

9 Bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên cả các loài thực vật lẫn động vật

9 Nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái có giới hạn

Vùng đệm: với tổng diện tích 37.339 ha bao gồm các tiểu khu 1, 2, 4a, 5, 7, 8,

9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 và 24 Vùng đệm có các chức năng như:

9 Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của Khu dự trữ sinh quyển

9 Tạo không gian lớn hơn cho thú hoang dã ngoài vùng lõi Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết

9 Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hoá nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái

9 Các mô hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môi trường cũng được ứng dụng trong vùng này cho cư dân địa phương

Vùng chuyển tiếp: với tổng diện tích 29.310 ha bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ Vùng này có chức năng:

9 Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các loại sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cư dân địa phương Việc sử dụng đất và tài nguyên thiên nhiên trong khu vực này không được mâu thuẫn với mục tiêu của khu dự trữ sinh quyển Mối quan hệ giữa con người và thiên nhiên cần phải được hài hòa

9 Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu mở rộng không gian có sẵn như môi trường sống cho các loài thú hoang dã

từ vùng đệm.

Đây là một khu rừng theo đánh giá của các chuyên gia nước ngoài được khôi phục, chăm sóc, bảo vệ và quản lý thuộc vào loại tốt nhất ở Việt Nam và thế giới Ngày 21/ 01/ 2000, khu rừng này đã được MAB/ UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam nằm trong mạng lưới 368 Khu dự trữ sinh quyển của thế giới Đây là địa điểm lý tưởng phục vụ cho nghiên cứu khoa học, du lịch sinh thái, nghỉ ngơi của nhân dân thành phố và khách đến thành phố Hồ Chí Minh

Thảm thực vật rừng ngập mặn Cần Giờ đã bị chiến tranh hóa học hủy diệt hoàn toàn, nhưng đã khôi phục trồng lại nhanh với diện tích lớn và chất lượng tốt Năm

2006, diện tích rừng trồng mới là 19.082 ha với các loài cây chính là Đước đôi, Đưng, Dà vôi, Gõ biển, và diện tích rừng khoanh nuôi tái sinh tự nhiên là 10.982 ha với các loài như Mắm trắng, Mắm đen, Bần chua, Bần trắng, Vẹt tách, Vẹt dù, Giá,

Dà vôi, Xu ổi, Cóc, Tra, Gõ biển, Dừa lá và nhiều loài cây thân thảo khác Từ đó tạo

ra được khu rừng ngập mặn có cơ cấu nhiều loài cây, cấu trúc nhiều tầng tán, hài hòa Cùng với các loài động vật trên cạn, thủy sinh, phiêu sinh vật ngày càng phong phú, hình thành một cân bằng hệ sinh thái mới theo hướng ngày càng đa dạng

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 150 loài thực vật, các loài chủ yếu như Bần trắng, Mắm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng

Xu ổi, Trang, Đưng và các loại nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – Ô

9 Khu hệ cá có trên 137 loài thuộc 39 họ và 13 bộ

9 Khu hệ động vật có xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài hữu nhũ Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc

kè, kỳ đà nước, trăn đất, trăn gấm, rắn cạp nong, rắn hổ mang, rắn hổ chúa, vích, cá Sấu hoa cà

9 Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau Theo báo cáo về diễn biến môi trường của Việt Nam năm 2005 của tổ chức SIDA, phần đa dạng sinh học đã đánh giá: “Khu Dự trữ Sinh quyển Cần Giờ, nằm ở ven biển phía Nam thành phố Hồ Chí Minh, đã trở thành một trong những điểm phục hồi rừng ngập mặn lớn nhất thế giới Khu này có diện tích 75.740 ha, gồm chủ yếu là rừng ngập mặn, với trên 200 loài động vật và thực vật nước mặn và nước lợ”

2.2 Đặc điểm cây Mắm trắng (Avicennia alba)

Giống: Avicennia

Loài: Avicennia alba

Mắm trắng vẫn chưa xác định được kích thước bộ gene nhưng đã có 12 trình tự gene được giải mã gồm những gen nằm trong lục lạp, những gene RNA ribosome, trong đó có 6 trình tự gene chứa những trình tự lặp lại đơn giản có thể làm chỉ thị cho microsatellite

Về hình thái Mắm trắng là cây thân gỗ, có thể cao đến 20 m, đường kính 0,5 m, thân ít khi thẳng, với nhiều cành nhánh cong queo, chỉ khá thẳng khi mọc lẫn với

rừng đước (Rhizophora apiculata), vỏ nâu dợt đến xám đen, tròn, nhiều nốt bần

Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến hình mác, thuôn, bầu dục, dài 5 – 7 cm, rộng từ 2,5 – 3 cm, đầu nhọn có khi tù, chân nêm, mặt dưới phủ lông màu trắng bạc, gân bên nổi rõ cả hai mặt, có tuyến tiết muối thưa ở cả mặt dưới và mặt trên, lá khô có màu đen ở mặt trên

Hoa: nhỏ 5 – 8 mm, vàng cam, tạo thành tán - gié ở ngọn, hoa từng cặp, lá bắc nhỏ, không cọng, đài ngắn, không rụng, 5 tai đài hình bầu dục, có 2 lõm, đài bằng nhau, vành đứng hình ống thẳng có 4 thùy bằng nhau, 4 tiểu nhị (2 dài, 2 ngắn), tua nhị ngắn và trơn, bao phấn có buồng song song, hình bầu dục, bầu nhụy hình bầu dục, hơi mịn ở đầu, có nhựa thơm, 4 tiểu noãn tròn dài gắn ở đầu 1 trục, vòi nhụy rất ngắn 1 mm, trơn đầu chẻ đôi Thường ra hoa vào tháng 6 – tháng 7

Trái: Trái là manh nang hình tim, phồng lên ở một bên làm mũi trái cong qua 1 bên, dài 2 cm, vỏ dày lông mịn, xanh lục, 1 hột, không phôi nhũ, chồi mầm mọc bên trong vỏ trước khi trái rụng với 2 lá mầm xanh, dày, trục rễ mầm có nhiều lông trắng Mắm trắng là loại cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh, thích nghi với nhiều loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nước (mặn, lợ, ngọt) Mắm trắng là loài cây cho chồi gốc, thường trổ hoa vào đầu mùa mưa, cho trái vào cuối mùa mưa Chỉ vài giờ sau khi trái rụng, cây mầm bên trong hút nước lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài

và phát triển thành cây mới Mắm trắng là cây ngập mặn quan trọng, được xem là một trong những loài tiên phong ở nơi đất mới bồi của rừng ngập mặn Tại Cần Giờ,

Mắm trắng được dùng trong xây dựng, thông thường làm củi, các dụng cụ nhỏ và trái làm thức ăn cho một số loài cá.

2.3 Đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học được thể hiện qua nhiều định nghĩa như:

Theo định nghĩa của LHQ “Đa dạng sinh học là sự phong phú của mọi sự sống

có từ những nguồn trong các hệ sinh thái trên cạn, dưới nước, ở biển, và mọi tổ hợp sinh thái do chúng tạo nên“

Theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2005), đa dạng sinh học là khoa học nghiên cứu về tính đa dạng của vật sống trong thiên nhiên, từ các sinh vật phân cắt đến các động vật và thực vật và cả loài người chúng ta, từ mức độ phân tử đến các cơ thể, các loài

và các quần xã mà chúng sống

Theo Quỹ Quốc tế về Bảo tồn Thiên nhiên về đa dạng sinh học, đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật và vi sinh vật, là những gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường

Ngắn gọn hơn, đa dạng sinh học là sự phong phú về nguồn gen, loài sinh vật và

hệ sinh thái

Tóm lại, đa dạng sinh học là mức độ phong phú của toàn bộ tài nguyên thiên nhiên được tạo nên do tất cả các dạng sống, các sinh vật có trên trái đất Do vậy, đa dạng sinh học bao gồm ba mức độ: đa dạng di truyền, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái

Trong ba mức độ của đa dạng sinh học, đa dạng di truyền được xem là quan trọng nhất vì từ đó nảy sinh ra sự phong phú về cấu tạo di truyền giữa các cá thể bên trong một loài hoặc giữa các loài với nhau để rồi có thể tạo ra một sinh vật mới tăng thêm nguồn phong phú cho đa dạng sinh học Ngoài ra đa dạng di truyền còn có thể tạo ra những biến dị di truyền xảy ra bên trong hoặc bên ngoài các quần thể

2.3.3 Đa dạng hệ sinh thái

Đa dạng hệ sinh thái là sự phong phú về các khác biệt hệ sinh thái ở từng nơi

Hệ sinh thái là một hệ thống bao gồm những sinh vật và môi trường tác động tương tác với nhau trước những chu kỳ thay đổi của thiên nhiên

2.3.4 Lợi ích của đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học được đánh giá qua nhiều giá trị khác nhau như: giá trị về môi trường, giá trị kinh tế và giá trị ảnh hưởng đến đời sống con người

Về mặt môi trường, đa dạng sinh học ở từng nơi thể hiện mức cân bằng sinh thái tự nhiên nên đa dạng sinh học có khả năng điều tiết mọi biến động của môi trường do thiên nhiên tạo ra, và bảo vệ môi trường trước những biến động đó Chu

kỳ quang hợp hay đồng hoá diệp lục tố, cũng như việc chuyển hoá các chất vô cơ thành hữu cơ trong thiên nhiên đã tạo nên sự sống cho tất cả sinh vật trong đó có con người

Về mặt kinh tế, đa dạng sinh học là nguồn cung cấp thực phẩm thiên nhiên và nguyên liệu trong sản xuất cho con người Theo ước tính, hàng năm đa dạng sinh

học cung cấp cho thế giới tổng sản phẩm có giá trị là 33 ngàn tỷ USD Riêng đối với Việt Nam, đa dạng sinh học dự phần rất lớn trong kinh tế vì Việt Nam vẫn còn đặt trọng tâm vào nông nghiệp và khai thác tài nguyên là chính

Về mặt giá trị ảnh hưởng đến đời sống con người, đây là một giá trị rất quan trọng đối với đời sống, vì đa dạng sinh học đã nói lên tính phong phú cùng những nét đẹp của thiên nhiên dành cho một quốc gia

2.4 Các phương pháp nghiên cứu tính đa dạng di truyền

2.4.1 Thông tin di truyền

Nucleic acid, vật liệu mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là một polymer hình thành từ các monomer là nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (đường 5C) và một base hữu cơ (vì các nucleotide chỉ khác nhau ở base nên người ta thường dùng từ “base”thay cho

“nucleotide”)

Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: các purine gồm adenine (A) và guanine (G), các pyrimidine gồm thymine (T), cytosine (C) và uracine (U) Các nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài

Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau là deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA) Ở sinh vật eucaryote, thông tin di truyền là phân tử DNA, là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường deoxyribose và một trong bốn loại base (A, C, G, T) Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ liên kết hydro hình thành giữa base bổ sung nằm trên hai mạch: A bổ sung cho T, G bổ sung cho

C Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là 5’ phosphate tự do

và một đầu là 3’ hydroxyl tự do (hướng quy ước là 5’Æ 3’) Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, người ta gọi chúng là hai mạch đối song song Mỗi mạch đơn là một trình tự những base khác nhau, do đó mỗi mạch đơn mang thông tin khác với mạch kia Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi tính chất bổ sung Chính tính chất này giải thích được cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA, đặc biệt là cách thức tự sao chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử mẹ

2.4.2 Phương pháp ly trích DNA

Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), ly trích DNA cơ bản gồm ba bước

Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân Thông thường người ta nghiền tế bào,

mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch phenol chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol chloroform Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

Bước 3: Tủa nucleic acid Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhưng thông thường người ta dùng isopropanol Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu

Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

2.4.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase do K B Mullis phát minh năm 1985 Đây

là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu rất nhỏ Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chẩn đoán, di truyền quần thể và phân tích pháp y

Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme để nhân bản một đoạn DNA nhờ 1 cặp primer (oligonucleotide) tương hợp với hai đầu 3’ ở cả hai mạch của đoạn DNA đích (target sequence) Các

oligonucleotide được dùng làm primer này cho phép DNA mẫu được nhân bản nhờ

sự xúc tác của DNA - polymerase Quá trình này gồm 3 giai đoạn:

• Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 -

960 C)

• Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhưng thường là 50 - 560 C)

• Kéo dài: Kéo dài dây mới nhờ primer dưới sự thực hiện của DNA - polymerase (720 C)

Đó là một chu trình PCR Do các sản phẩm mới được tổng hợp ra lại được dùng làm khuôn cho một primer khác, nên sau mỗi chu kỳ số bản sao của DNA đích lại được tăng lên gấp đôi so với chu kỳ ngay trước đó Chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên được lặp lại nhiều lần (thường là 30 - 40 chu kỳ) sẽ dẫn đến việc nhân bản đoạn DNA đích đến hàng triệu phiên bản trong vài giờ đồng hồ

Ban đầu, khi chưa sử dụng loại enzyme Taq - polymerase người ta phải thêm

DNA - polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA - polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900 C ở giai đoạn tách hai

sợi của phân tử DNA Sau này khi tìm được loại Taq - polymerase từ vi khuẩn

Thermus aquaticus - loại vi khuẩn sống ở suối nước nóng - một loại enzyme chịu

nhiệt, thì chỉ cần cho một lần Taq - polymerase là đủ

Để cho các primer dễ dàng liên kết vào đoạn tương hợp trên DNA đích người ta thường tạo ra một số thay đổi ở primer Chẳng hạn như gắn thêm điểm tiếp nhận enzyme giới hạn vào đầu 5’ của mỗi primer, hay việc làm thay đổi vùng xung quanh codon khởi đầu có thể làm tăng hiệu quả dịch mã ở sinh vật Eukaryote được chuyển gen

Một phản ứng PCR có sự tham gia của các thành phần: Taq buffer, MgCl2, dNTP,

primer, Taq DNA polymerase, DNA khuôn mẫu và H2O Để phản ứng PCR thành công thì các thành phần này phải có một sự kết hợp hài hoà với nhau về nồng độ

2.4.4 Các marker phân tử dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Theo Nguyễn Văn Uyển (1996), nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng Hiếm có các cá thể trong cùng một loài hoặc cùng một giống có thứ tự các bộ ba trên DNA trong bộ gene giống hệt nhau Việc xác định tính đa dạng sinh học cực kì quan trọng trong chọn giống vì các vật liệu di truyền dùng để lai tạo thường được đòi hỏi có tính đa dạng càng lớn càng tốt

Công nghệ Sinh học thực vật đã phát triển nhiều phương pháp mới, nhạy và

chính xác để xác định và sử dụng tính đa dạng ở sinh vật

Để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các cá thể, quần thể về căn bản người ta thường dựa trên các DNA marker DNA marker có thể được chia làm hai nhóm (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

• Nhóm không dựa trên PCR (non PCR-based): RFLP

• Nhóm dựa trên PCR (PCR-based): SSCP, SSR, RAPD, AFLP…

Các phương pháp nghiên cứu tính đa dạng di truyền này đều sử dụng sản phẩm DNA đã được ly trích, tinh sạch từ phần trên

2.4.4.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Là phương pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy

các band DNA hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước Ngược lại nếu có

sự khác nhau về trình tự DNA (khác giống hoặc do đột biến) thì sẽ có sự khác nhau

về các band DNA (Phạm Thành Hổ, 1998)

Phương pháp tiến hành: DNA sau khi ly trích được phân cắt bằng một enzyme nhất định, rồi điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau tùy theo kích thước và tình trạng mở dây đơn của nó Những đoạn DNA này được chuyển từ gel sang một thể rắn (tấm lọc nitrocellulose hoặc màng lọc bằng nylon), nơi nó bị cố định Trước khi lai DNA, người ta cố định các vị trí trên màng - nơi quá trình lai

DNA sẽ xảy ra, các DNA sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (probe, hay RFLP marker) được đánh dấu bằng phóng xạ Quá trình lai giữa DNA và probe như vậy được gọi là lai DNA Sau khi lai, tấm lọc hay màng lọc được rửa để loại bỏ các probe không gắn, hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu Sau đó, DNA lai với probe sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X - quang Các band có tính đa hình (polymorphism) có thể được quan sát để đánh giá (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng rất cao Do đó, người ta có xu hướng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase

2.4.4.2 SSCP (Single - Strand Conformation Polymorphism)

Người ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn, trong điều kiện chưa qua quá trình biến tính DNA thành dây đơn (denaturation) Người ta giả định rằng: sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn (single - strand conformation) Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel, tạo ra thể đa hình

Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành Sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa và ngâm vào trong nước đá Khi đó hiện tượng snap-back sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp Để tránh hiện tượng đứt gãy cấu trúc thứ cấp, các mẫu phải được xử lý trong điều kiện lạnh Nếu P32 được dùng trong PCR, thì phim chụp X-quang sẽ thể hiện vị trí của DNA trên gel Nếu không, người ta sẽ dùng bạc để nhuộm gel DNA khi nhuộm bằng bạc sẽ nhạy cảm gấp trăm lần nhuộm ethidium bromide

SSCP marker là công cụ rất mạnh và nhanh, nhưng nó chỉ áp dụng cho việc tìm kiếm thể đa hình của những đoạn phân tử DNA tương đối ngắn (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) SSCP có thể xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lượng phân tử), và nó có thể phân biệt được sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó Người ta cho nó là công cụ hữu dụng trong xét

nghiệm bệnh di truyền ở người Trong thực vật, SSCP chưa được phát triển nhiều Người ta hi vọng, SSCP marker sẽ giúp cho việc phân nhóm di truyền ở con lai trở nên

dễ dàng hơn, khi chúng ta có primer thích hợp đối với tính trạng quan trọng nào đó

2.4.4.3 SSR (Simple Sequence Repeat)

SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide ((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại Do vậy nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gene bằng các primer đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite Sản phẩm PCR là các đoạn DNA

có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài được tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA Do số lần lặp lại cao của microsatellite ở các cá thể nên sự đa hình cao hơn ở các trường hợp khác như RFLP, RAPD và sự đa hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau Chiều dài các đoạn DNA qua điện di thường có kích thước 100 – 200 bp Tuy nhiên, SSR thường được phân tích trên DNA hệ gene nhỏ mang trình tự lặp lại và kích thước của chúng được nhận biết sau khi điện di trên gel (Phạm Thành Hổ, 1998)

Theo Khuất Hữu Thanh (2003), SSR được thực hiện theo bốn bước:

9 Ly trích và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu

9 Thực hiện phản ứng khuếch đại qua PCR với các primer đặc trưng cho các đoạn lặp đơn giản

9 Điện di kết quả trên gel polyacrylamid và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA

9 Xử lý số liệu bằng các phần mềm Map Marker Program, SYSTAT, NTSYSpc v.v lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại

2.4.4.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR Sau khi bắt cặp tại các vị trí

chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb (Phạm Thành Hổ, 1998) Các đoạn với kích thước khác nhau này được nhận biết bằng điện di Một primer có thể tạo nên

sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể được dùng như những marker để xác định sự đa dạng di truyền RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao

Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD như sau:

3’ →1 →2 → 3 5’ DNA mẫu

5’ 4 ← 5 ← 6← 3’

Hình 2.1: Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD - PCR

Ghi chú: - Các mũi tên biểu thị cho các primer (các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 tượng trưng cho các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào; các primer bắt cặp vào các vị trí 1, 2, 3 trên mạch đơn DNA mẫu 3’- 5’, các primer bắt cặp vào các vị trí 4, 5, 6 trên mạch đơn DNA mẫu 5’ - 3’ Trong trường hợp này, có 2 sản phẩm PCR được tạo thành:

- Sản phẩm A: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2

Theo Khuất Hữu Thanh (2003), kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước cơ bản:

9 Ly trích DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR

9 Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

9 Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu

Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thường gặp phải một số vấn đề:

9 Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện

di Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng

9 PCR buffer thường được cung cấp theo Taq polymerase và có thể có hoặc

không có Mg2+ Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng

độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau

9 Taq polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn Vì vậy, loại Taq polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính

xác và được xác định qua thực nghiệm

9 Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf

2.4.4.5 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP là đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975 Là kỹ thuật được áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã được khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản (Zhao và cs, 2000)

9 Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng cho các primer đã chọn trước

Adaptor là một đoạn oligonucleotide đôi, được tổng hợp nhân tạo và có trình tự tương ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA được phân cắt bởi một loại enzyme nhất định

9 Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau

Trong giai đoạn cắt DNA, có nhiều cặp enzyme được lựa chọn, như:

EcoRI/MseI, HindIII/MseI, ApaI/TaqI, PstI/MseI, KpnI/MseI Tuy nhiên, cặp

enzyme cắt EcoRI/MseI là được sử dụng phổ biến nhất và được thương mại hóa

trong bộ kit AFLP (Wong và cs, 1998; Vuylsteke và cs, 1999)

9 MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định 4 base với vị trí cắt:

9 EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định 6 base với vị trí cắt:

Ở bước này, nồng độ của enyme và điều kiện phản ứng sẽ quyết định sự thành công của phản ứng cắt Theo quy trình của nhà cung cấp Applied Biosystems, nồng

độ của enzyme EcoRI (5U) cho một phản ứng cao gấp 5 lần nồng độ enzyme MseI (1U) Mục đích là muốn việc cắt của enzyme EcoRI xảy ra hoàn toàn bởi điều này ảnh hưởng đến kết quả của kỹ thuật AFLP vì các primer chon lọc EcoRI-ANN được

gắn màu huỳnh quang

Sau giai đoạn cắt, kết quả thu nhận được 3 loại đoạn DNA Một loại đoạn DNA

được cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu, một loại đoạn DNA được cắt bởi EcoRI ở một đầu này và MseI ở một đầu khác và một loại đoạn DNA được cắt bởi MseI ở cả hai đầu

Nếu ước lượng kích thước genome của cây Mắm trắng khoảng 500 – 6000 Mb thì sau khi cắt có khoảng 2.075.196 – 24.902.345 đoạn DNA, được tính toán theo công thức:

Hình 2.2: Đoạn DNA tạo thành bởi enzyme cắt MseI và EcoRI

N N N

Số đoạn DNA = +1 = + +1

4n 44 46