THỬ NGHIỆM BỔ SUNG BỘT THÂN LÁ THÔ VÀ CHẤT CHIẾT DITERPEN LACTON TỪ THẢO DƯỢC XUYÊN TÂM LIÊN (ANDROGRAPHIS PANICULATA (BURM.F.) NEES) TRONG KHẨU PHẦN HEO THỊT

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một phần trong đề tài: “Nghiên cứu sử dụng nhóm hoạt chất diterpen lacton từ cây xuyên tâm liên Andrographi

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

^^^^^^^ ]]]]]]]

NGUYỄN THỊ YẾN

THỬ NGHIỆM BỔ SUNG BỘT THÂN LÁ THÔ VÀ CHẤT CHIẾT DITERPEN LACTON TỪ THẢO DƯỢC XUYÊN TÂM

LIÊN (ANDROGRAPHIS PANICULATA (BURM.F.) NEES)

TRONG KHẨU PHẦN HEO THỊT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

(NGÀNH CHĂN NUÔI)

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

^^^^^^^ ]]]]]]]

NGUYỄN THỊ YẾN

THỬ NGHIỆM BỔ SUNG BỘT THÂN LÁ THÔ VÀ CHẤT CHIẾT DITERPEN LACTON TỪ THẢO DƯỢC XUYÊN TÂM

LIÊN (ANDROGRAPHIS PANICULATA (BURM.F.) NEES)

TRONG KHẨU PHẦN HEO THỊT

Chuyên ngành: Chăn nuôi

THỬ NGHIỆM BỔ SUNG BỘT THÂN LÁ THÔ VÀ CHẤT CHIẾT DITERPEN LACTON TỪ THẢO DƯỢC XUYÊN TÂM LIÊN

(ANDROGRAPHIS PANICULATA (BURM.F.) NEES)

TRONG KHẨU PHẦN HEO THỊT

NGUYỄN THỊ YẾN

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS TRỊNH CÔNG THÀNH

Đại học Nông Lâm TP HCM

2 Thư ký: TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

Đại học Nông Lâm TP HCM

3 Phản biện 1: TS NGUYỄN TIẾN THÀNH

4 Phản biện 2: TS NGUYỄN PHƯỚC NINH

Đại học Nông Lâm TP HCM

5 Ủy viên: TS VÕ THỊ TRÀ AN

Đại học Nông Lâm TP HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một phần trong đề tài: “Nghiên cứu sử dụng nhóm hoạt chất diterpen lacton từ cây xuyên tâm

liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees) bổ sung trong thức ăn chăn nuôi heo gà

công nghiệp” của Sở Khoa học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh do ThS Vương Nam Trung làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận văn được phép công bố với sự đồng ý của ThS Vương Nam Trung

Nguyễn Thị Yến

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gởi lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Quý thầy, cô giảng dạy tại khoa Chăn Nuôi Thú Y đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua, giúp cho em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Ban Giám đốc và các cán bộ nhân viên trại heo Đông Á đã tạo điều kiện hết sức thuận lợi, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp Tiến sỹ Nguyễn Công Luận và một số anh chị em thuộc Trung tâm nghiên cứu sâm và dược liệu thành phố Hồ Chí Minh

Các anh chị em thuộc Phòng phân tích tổng hợp và công nghệ cao trước đây, các anh chị em thuộc bộ phân phân tích phòng Nghiên cứu dinh dưỡng chăn nuôi đã trợ giúp cho tôi trong quá trình thực hiên nội dung luận văn tốt nghiệp này

Đặc biệt, em xin trân trọng gởi lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Dân, cô Võ Thị Trà An đã định hướng, tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ em suốt quãng thời gian làm luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới cha me, anh chị em và bạn bè thân thiết

đã động viên, sát cánh cùng tôi trong suốt hành trình của cuộc sống

Tháng 9 năm 2010 Nguyễn Thị Yến

TÓM TẮT

Đề tài “Thử nghiệm bổ sung bột thân lá thô và chất chiết diterpen lacton từ thảo

dược xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees) trong khẩu phần heo

thịt” được tiến hành tại trại heo Đông Á, Trung tâm Sâm và dược liệu thành phố Hồ Chí Minh và Viện khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam trong thời gian từ tháng

6 năm 2008 đến tháng 6 năm 2010 Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá hiệu quả,

tỷ lệ bổ sung thích hợp bột xuyên tâm liên thô và chế phẩm chiết xuất diterpen lacton

từ xuyên tâm liên như một chất cải thiện tăng trưởng trong thức ăn của heo thịt

Thành phần hóa học, hoạt lực kháng khuẩn của bột thân lá và chế phẩm diterpen

lacton chiết xuất từ xuyên tâm liên đối với vi khuẩn E coli và Lactobacillus acidophilus (phân lập từ phân heo) được đánh giá trước khi bổ sung vào trong khẩu

phần heo thí nghiệm

Qua nghiên cứu chúng tôi xác định được thành phần hóa học của bột dược liệu

và bột chế phẩm diterpen lacton sử dụng trong thí nghiệm có chất lượng tương đối ổn định, có đầy đủ các hoạt chất chính thuộc nhóm diterpen lacton gồm andrographolide, neoandrographolide và dehydroandrographolide Tuy nhiên, hàm lượng các hoạt chất này ở mức tương đối thấp

Những thử nghiệm về hoạt lực kháng khuẩn của xuyên tâm liên đối với 2 gốc

(isolate) vi khuẩn E coli và Lactobacillus acidophilus cho thấy bột xuyên tâm liên

chiết với nước và cao chiết cồn từ xuyên tâm liên không có tác dụng kháng khuẩn với nồng độ khảo sát, tương ứng là 10mg/đĩa và 50mg/đĩa Nồng độ ức chế tối thiểu của

cao chiết cồn với cả hai gốc vi khuẩn E coli, Lactobacillus acidophilus đều bằng

125mg/ml; của bột xuyên tâm liên chiết với nước tương ứng với hai vi khuẩn trên là 31,5mg/ml; và 62,5mg/ml

Hai thí nghiệm trên heo thịt được tiến hành độc lập Trong mỗi thí nghiệm, heo

có trọng lượng từ 25 – 30 kg được bố trí theo 5 nhóm (5 nhóm × 6 heo × 3 lần lặp lại) Bột xuyên tâm liên (thí nghiệm 1) và chế phẩm diterpen lacton (DL) chiết xuất từ xuyên tâm liên (thí nghiệm 2) được bổ sung vào thức ăn cho heo ở 3 mức 0,15%, 0,30% và 0,45% Trong 2 nhóm còn lại, một nhóm sử dụng khẩu phần cơ sở của trại, nhóm thứ hai được bổ sung thêm hỗn hợp kháng sinh oxytetracycline và tylosin Kết quả thí nghiệm 1 cho thấy rằng mặc dù không có sự khác biệt giữa các mức bổ sung xuyên tâm liên về mặt thống kê nhưng với tỉ lệ 0,3% trong khẩu phần có hiệu quả tốt hơn so với lô đối chứng không bổ sung kháng sinh (P<0,05) Ngoài ra, ở mức bổ sung này kết quả thu được tương đương với nhóm bổ sung hỗn hợp kháng sinh (oxytetacycline và tylosin) xét về khía cạnh cải thiện tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn cũng như tỷ lệ ngày heo bệnh Tương tự như vậy, ở thí nghiệm 2, mức bổ sung 0,3% chế phẩm DL trong khẩu phần cho hiệu quả tốt hơn về tăng trọng cũng như hiệu quả sử dụng thức ăn so với lô đối chứng và các mức bổ sung bột DL còn lại Đồng thời kết quả cho thấy ở mức bổ sung 0,3% bột DL có hiệu quả tương đương với nhóm bổ sung hỗn hợp kháng sinh oxytetracycline và tylosin trong khẩu phần

Từ khóa: xuyên tâm liên, diterpen lacton, heo thịt

SUMMARY

Research project “Supplementing the leave powder and diterpen lacton extract

from andrographis paniculata in diets of growing-finishing pig” was carried out at

Institute of Agricutural sciences for South Vietnam, Dong A farm and Research Center

of Ginseng and Medicinal plants of Hochiminh city from 2008 June to 2010 June

Evaluating the chemical contents of 2 product (leave powder and preparation of

diterpen lacton (DL) extract) was conducted before the trials on pig The results

showed that they were both enough quality for the trials based on the dried matter, total ash, insoluble ash as well as the contents of total diterpen lacton and major active compounds

Antibacterial activity of aqueous extract and sediment of 96% ethanol extract

against Lactobacillus acidophilus and Escherichia coli isolated from pig’s faeces at

Dong A farm was evaluated The results showed that both of these extracts had no activity in any type of the above bacteria at the testing concentrations (50mg for sediment extract of ethanol and 20 mg/disc for equaous extract) The MIC of sediment

and equaous extract against E coli and Lactobacillus acidophilus was 125 and

31,5mg/ml; 125 and 62,5 mg/ml, respectively

Two trials in completely randomized design were conducted to determine the

effects of feeding powder of Andrographis paniculata (AP) and preparation of diterpen

lacton extract (DL) in the diet on the pig’s performance Each trial was allocated to 5 experimental groups The first one included I: control, feeding conventional completed diet from pig farm; II: feeding with antibiotics (100ppm of oxytetracycline and 50ppm

of tylosin) in their diet; III, IV, V: feeding with leave and stem powder of AP at three levels (0,15%, 0,30% and 0,45%) in their diet The second trial, three levels of DL were used instead of the leave and stem powder

Results indicated that, in the experiment I, pigs were fed by AP powder or

antibiotics significantly improved the body weight on day 146 and 202 of the experiment (P<0,05), and was higher than the control feeding groups Although, the growth rates from day 90 – 146 and 146 -202 were not statistically different (P>0,05), the growth rates of groups of feeding antibioitic and AP powder trended higher than the control one No difference was found in growth rates, body weights at two stages of the trial between antibiotic and AP powder feeding groups However, the higher growth and body weight were observed at level of feeding 0,3% AP comparing with the control group No difference was detected in feed consumption between groups Feed conventional ratios of antibiotic and 0,3% AP powder were lower significantly than the control group (P<0,05) Furthermore, the feed cost per 1 kg of body weight of pig of the feeding levels 0.3% and 0,45% was equal to antibiotic feeding group, but lower than the control group

In the experiment II, pigs fed by DL at the level of 0,3% or antibiotics had significantly improved body weight and growth rate (P<0,05) compairing with the control group Although the results indicated no differences between the control group and ones with the other levels of DL, the trend of improving of these parameters could

be observed Feed consumption showed no statistically difference between groups (P>0,05), cumulative feed efficiency conversion of the antibiotic feeding group improved comparing with the control one In general, feeding DL at level of 0,30% had better affected on the growth rate and feed efficiency conversion than the control group (P<0,05) and similar to the antibiotic group

It was concluded that the supplementation of powered Andrographis paniculta’s

leave, stem and DL at the level of 0,30% to growing – finishing pig diets had beneficial effect on their performance and it may be considered as a growth promoter, similar to antibiotic

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang Chuẩn Y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời Cam đoan iii

Cảm tạ iv

Tóm tắt v

Mục lục ix

Danh sách các chữ viết tắt xiii

Danh sách các hình xv

Danh sách các bảng xvi

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vần đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Mô tả thực vật và phân bố của cây xuyên tâm liên 4

2.2 Thành phần hóa học 5

2.3 Tác dụng dược lý và công dụng 7

2.3.1 Sử dụng xuyên tâm liên như loại thảo dược truyền thống 7

2.3.2 Tác dụng dược lý của cây xuyên tâm liên 9

2.4 Độ an toàn 14

2.5 Các phương pháp chiết xuất và phân lập diterpen lacton 15

2.6 Các nghiên cứu sử dụng xuyên tâm liên trong chăn nuôi 16

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Nội dung nghiên cứu 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Nguyên liệu thí nghiệm 19

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.2.1 Nội dung 1 Xác định thành phần hóa học và hàm lượng diterpen lacton trong bột lá xuyên tâm liên 19

3.2.2.2 Nội dung 2 Khảo sát hoạt lực kháng khuẩn của diterpen lacton đối với một số loại vi khuẩn đường ruột heo 21

3.2.2.3 Nội dung 3 Xác định mức sử dụng tối ưu bột thô và chất chiết diterpen lacton trong khẩu phần heo thịt 25

3.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 28

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Thành phần hóa học của bột thân lá xuyên tâm liên và chế phẩm DL 29

4.2 Hoạt lực kháng khuẩn của hoạt chất chiết từ xuyên tâm liên 34

4.2.1 Đánh giá sơ bộ hoạt lực kháng khuẩn của thảo dược xuyên tâm liên 34

4.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của bột chiết nước và cao chiết cồn trên 2 các gốc vi khuẩn phân lập được từ phân heo 37

4.3 Kết quả thử nghiệm trên heo 41

4 3.1 Thí nghiệm 1: sử dụng bột thân lá xuyên tâm liên 41

4.3.1.1 Tăng trọng của heo thí nghiệm 41

4.3.1.2 Hiệu quả sử dụng thức ăn 44

4.3.1.3 Tỷ lệ ngày heo bệnh và tỷ lệ heo chết trong thí nghiệm 47

4.3.1.4 Các chỉ tiêu sinh hóa máu 48

4 3.1.5 Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu 50

4.3.1.6 Chi phí thức ăn cho kg tăng trọng 52

4.3.2 Thí nghiệm 2: sử dụng bột chế phẩm diterpen lacton 52

4.3.2.1 Tăng trọng heo qua các giai đoạn thí nghiệm 52

4.3.2.2 Tiêu thụ thức ăn và hiệu quả sử dụng thức ăn 54

4.3.2.3 Tỷ lệ ngày heo bệnh và tỷ lệ heo chết trong thí nghiệm 56

4.3.2.4 Các chỉ tiêu sinh hóa máu 57

4.3.2.5 Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu 58

4.3.2.6 Chi phí thức ăn cho kg tăng trọng 61

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

5.1 Kết luận 63

5.2 Đề Nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

PHỤ LỤC 74

Phụ lục 1: Công thức môi trường dinh dưỡng MRS tổng hợp cho vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 74

Phụ lục 2: Công thức môi trường dinh dưỡng VRBA cho vi khuẩn E coli 76

Phụ lục 3: Công thức thức ăn heo thịt tại trại Đông Á 76 Phụ lục 4: Phương trình tuyến tính sử dụng để xác định hàm lượng diterpen

lacton toàn phần theo andrographolide bằng phương pháp đo quang 77

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC : High performance liquid chromatography

HSTA : Hệ số chuyển hóa thức ăn

MIC : Minimum inhibition concentration

MRS : Công thức môi trường do Man, Rogosa, Sharpe xây dựng NaCl : Natri chloride

NCCLS : National commmittee for clinical laboratory standards

VRBA : Violet red bile agar

WHO : World Heath Organization

DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Thân, lá và hoa xuyên tâm liên 4

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học của một số hoạt chất chính trong nhóm diterpen lacton thu được từ cây xuyên tâm liên 6

Hình 4.1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa 3 hoạt chất andrographolide, neoandrographolide và dehydroandrographolide 31

Hình 4.2: Phổ UV của các hoạt chất gồm andrographolide, neoandrographolide, dehydroandrographolide 32

Hình 4.3: Sắc ký đồ phân tích mẫu bột thân lá xuyên tâm liên 32

Hình 4.4: Sắc ký đồ phân tích mẫu bột chế phẩm diterpen lacton 33

Hình 4.5: Đĩa thử nghiệm hoạt tính của dịch chiết nước, cao chiết cồn và OTC trên đĩa cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 35

Hình 4.6: Đĩa thử nghiệm hoạt tính của dịch chiết nước, cao chiết cồn và OTC trên đĩa cấy vi khuẩn E.coli 36

Hình 4.7: MIC của cao chiết cồn với vi khuẩn E.coli 38

Hình 4.8: MIC của cao chiết cồn với vi khuẩn E.coli 38

Hình 4.9: MIC của OTC với vi khuẩn E.coli 39

DANH MỤC CÁC BIỀU BẢNG

Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 26

Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 27

Bảng 4.1: Thành phần hóa học của bột thân lá xuyên tâm liên 29

Bảng 4.2: Thành phần hóa học của bột chế phẩm diterpen lacton 30

Bảng 4.3: Hàm lượng các hoạt chất diterpen lacton 33

Bảng 4.4: Tác dụng kháng khuẩn của bột XTL chiết nước và cao chiết từ xuyên tâm liên trên các gốc vi khuẩn thử nghiệm 35

Bảng 4.5: MIC của bột XTL chiết nước và cao chiết cồn từ xuyên tâm liên trên 2 gốc vi khuẩn thử nghiệm 39

Bảng 4.6: Tăng trọng bình quân của heo trong thí nghiệm 1 42

Bảng 4.7: Hiệu quả sử dụng thức ăn của heo trong thí nghiệm 1 45

Bảng 4.8: Tỷ lệ heo bệnh và hao hụt trong thí nghiệm 1 47

Bảng 4.9: Một số chỉ tiêu sinh hóa máu lúc 202 ngày nuôi 1 49

Bảng 4.10: Số lượng và công thức bạch cầu lúc 202 ngày tuổi 1 51

Bảng 4.11: Khối lượng và tăng trọng heo trong thí nghiệm 2 53

Bảng 4.12: Hiệu quả sử dụng thức ăn của heo trong thí nghiệm 2 55

Bảng 4.13:Tỷ lệ heo bệnh và hao hụt trong thí nghiệm 2 56

Bảng 4.14: Một số chỉ tiêu sinh hóa máu tại thời điểm bắt đầu và kết thúc thí nghiệm 2 58

Bảng 4.15: Số lượng và công thức bạch cầu tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm 59

Bảng 4.16: Số lượng và công thức bạch cầu tại thời điểm kết thúc thí nghiệm 61

sử dụng kháng sinh đi kèm với sự phát triển của các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh và tồn dư kháng sinh trong các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật Điều này

có thể ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gia súc dẫn tới nguy cơ tiềm ẩn gây lờn thuốc và tăng khả năng nhiễm bệnh trên con người (IOM, 1998) Chính vì thế, nhiều quốc gia, tổ chức đã ban hành lệnh cấm sử dụng một số lọai kháng sinh với mục đích cải thiện tăng trưởng Ví dụ, châu Âu đã cấm sử dụng avoparcin vào năm 1997, tiếp đó, năm 1999, bacitracin, spiramycin, tylosin and virginiamycin Đến tháng 1 năm

2006, toàn bộ các kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trưởng bị cấm hoàn toàn Các loại kháng sinh được phép lưu hành trong chăn nuôi thú y được kiểm soát nghiêm ngặt thông qua việc kê toa do bác sĩ thú y, đảm bảo ngưng thuốc đúng qui định

và hàm lượng tồn dư không quá ngưỡng cho phép Ở Việt Nam, pháp lệnh cấm sử dụng 18 loại kháng sinh, hóa dược và hormon sinh trưởng trong chăn nuôi đã được ban hành (quyết định số 29/2002/QĐ-BNN) Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các chất thay thế cho kháng sinh trong phòng trị bệnh trên đàn gia súc là mục tiêu mà các nhà khoa học đang hướng tới

Trong nhiều hướng đi tìm chất thay thế kháng sinh, sử dụng thảo dược ngày càng được tập trung nghiên cứu ứng dụng không chỉ trong nhân y mà ngay cả trong lĩnh vực thú y Không chỉ tìm hiểu các phương thức sử dụng các loại thực vật để phòng và trị bệnh cho vật nuôi, các nhà khoa học đi sâu vào việc nghiên cứu, phát hiện và chiết tách những chất có họat tính sinh học cao trong chúng Diterpen lacton là nhóm hoạt chất

chính có trong cây xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Nees) Đây là loại thảo

dược được nghiên cứu và sử dụng từ lâu đời, và đã được ghi trong một số dược điển của các nước trong khu vực (Ấn Độ, Indonexia, Pakistan, Trung Quốc) Ở người, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng xuyên tâm liên với nhóm hoạt chất diterpen lacton có vai trò chính trong việc tăng cường miễn dịch, sức đề kháng, ngăn ngừa tiêu chảy, chống viêm nhiễm đường hô hấp, trị cảm cúm cùng một số tác dụng khác và hầu như không gây các tác dụng phụ trong điều trị bệnh (Chiou và ctv, 1998; Akbarsha và Murugaian, 2000; Viện Dược liệu, 2003; Kumar và ctv, 2004; Mathivanan và ctv, 2006)

Một số nghiên cứu về việc sử dụng xuyên tâm liên ở Trung Quốc, Thái Lan, Ấn

Độ trên gia súc, gia cầm cũng đã cho những kết quả khả quan về khả năng kháng khuẩn, tăng số lượng tế bào sản xuất kháng thể, hạn chế các bệnh hô hấp, tiêu chảy, cải thiện sức sản xuất cũng như khả năng thay thế một số kháng sinh thông dụng trong thức ăn cho heo, gà (Sithisomwongse và ctv, 1989; Akbarsha và ctv, 1990; Sujikara, 2000; Tipakorn, 2002; Khajarern và ctv, 2005; Watanasit và ctv, 2005) Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về ảnh hưởng của thảo dược xuyên tâm liên trên gia súc, gia cầm hầu như chưa được công bố chính thức Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài: “Thử nghiệm bổ sung bột thân lá thô và chất chiết diterpen lacton từ thảo dược

xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees) trong khẩu phần heo thịt.”

1.2 Mục tiêu

Xác định hàm lượng hoạt chất diterpen lacton trong bột thân lá thô, chế phẩm diterpen lacton cũng như hoạt tính kháng khuẩn của chúng; xác định liều bổ sung thích

hợp từng loại dược liệu trên vào thức ăn nhằm giúp heo tăng trưởng tốt, sử dụng thức

ăn hiệu quả và khỏe mạnh

1.3 Yêu cầu

- Phân tích hàm lượng diterpen lacton bằng phương pháp so màu

- Xác định MIC của bột xuyên tâm liên chiết nước và cao chiết cồn với hai gốc

vi khuẩn phân lập từ phân heo là E coli và Lactobacillus Acidophilus

- Bổ sung bột thân lá thô và chế phẩm diterpen lacton vào thức ăn heo thịt ở 3 mức khác nhau (0,15 %; 0,30 % và 0,45 %)

- Theo dõi và đánh giá tình hình bệnh, năng suất cũng như hiệu quả sử dụng thức ăn của heo trong 2 thí nghiệm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Mô tả thực vật và phân bố cây xuyên tâm liên

Ở nước ta cây xuyên tâm liên còn có các tên gọi địa phương khác nhau như Công Cộng, Khổ Đảm Thảo, Lãm Hạch Liên Ở các nước khác, nó được gọi với các tên Green Chiretta, Creat, Kariyat, King of Bitters, Halviva, Kalmegh Tên khoa học

xuyên tâm liên là Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees, thuộc họ Acanthaceae

Hình 2.1: Thân, lá và hoa xuyên tâm liên

Đây là loại cây thân thảo, sống hàng năm, cao 0,4 – 1m, thân vuông, mọc thẳng đứng, đường kính từ 2 – 6 mm, phân nhiều đốt và nhiều cành Xuyên tâm liên có dạng

lá đơn, mọc đối, có cuống ngắn, phiến lá hình mác, dài 3 – 10 cm, rộng 1 – 2 cm, gốc thuôn, đầu nhọn dài, hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục sẫm đen hơn mặt dưới, mép lá dợn sóng, cuống lá dài khoảng 0,2 cm Cụm hoa mọc ở kẽ lá và đầu cành thành chùm thưa Hoa màu trắng, điểm những đốm hồng tím Quả nang hẹp, dài khoảng 1,5 cm, có lông mịn Hạt hình trụ, thuôn dài, màu nâu nhạt Cây ra hoa từ tháng 9 - 12, ra quả từ tháng

1 - 2

Xuyên tâm liên có nguồn gốc từ Ấn Độ, sau đó được phát triển rộng ra nhiều nước nhiệt đới khác như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc, Philippines, Pakistan, Sri Lanka…Cây mọc hoang dại và được trồng chủ yếu ở các nước Châu Á Ở Việt Nam, cây được trồng ở nhiều địa phương Vào những năm

80, cây được trồng nhiều ở các tỉnh miền Bắc, sau đó giảm xuống, gần đây lại tiếp tục được khôi phục, cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc Theo khảo sát ban đầu của Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, diện tích trồng xuyên tâm liên ở Nam bộ cũng không nhiều, chủ yếu ở các trung tâm dược liệu của các tỉnh Một số nông hộ ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh Bình Dương, Đồng Tháp có trồng nhưng diện tích không nhiều Khả năng tiêu thụ sản phẩm hạn chế do nhu cầu không cao Điều này có thể là nguyên nhân dẫn tới diện tích trồng xuyên tâm liên chưa được

mở rộng (Trần Công Luận và Vương Nam Trung, 2009)

2.2 Thành phần hóa học

Xuyên tâm liên chứa hai nhóm hoạt chất chính là diterpen lacton và flavonoid Bốn loại diterpen lacton chủ yếu được biết tới gồm andrographolide (AP1), deoxyandropholide (AP2), 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide (AP3) còn được gọi với tên dehydroandrographolide và hoạt chất không có vị đắng, neoandrographolide (AP4) Tất cả các hoạt chất trên đều được chiết xuất từ lá xuyên

tâm liên Chất chiết bằng petroleum ether từ lá cây thu được là homoandrographolide (Chang và ctv, 2001; Kurian và Sankar, 2007) Nồng độ của những diterpen lacton trong xuyên tâm liên phụ thuộc vào vị trí (vùng) và mùa trồng, thời gian thu hoạch, phương pháp bảo quản sau thu hoạch, phương pháp chiết xuất và các phần của cây Lá chứa hàm lượng các thành phần hoạt tính cao nhất và rễ chứa tổng lượng thấp nhất (MPRI, 1999) Tuy nhiên, Sharma và ctv (1992) tìm thấy hạt chứa lượng hoạt chất thấp nhất Lá chứa hơn 2% andrographolide trước khi cây ra hoa, sau đó chỉ còn dưới 0,5%

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học của một số hoạt chất chính trong nhóm diterpen

lacton thu được từ cây xuyên tâm liên

Bên cạnh các diterpen lacton, nhiều loại flavonoid cũng thu được từ xuyên tâm liên trong dịch chiết Polyphenol, caffeic, chlorogenic acid, tannin và saponin cũng đã được chiết xuất từ thảo dược này (Kurian và Sankar, 2007) Các flavonoid có nhiều

trong rễ gồm 7-o-methylwogonin, wogonin, oroxylin A, andrographin, paniculin, apigenin 7 – 4’ -dimethyl ether, mono-o-methylwithtin Hai flavonoid mới được xác định là 5, 7, 2’, 3’-tetramethoxyflavanon, và 5-hydroxy-7, 2’, 3’ – trimethoxyflavon Trong rễ có một flavanon glycosid là andrographidin, các flavon glycosid là andrographidin B, C, D, E và F Thân lá xuyên tâm liên còn chứa các alkanoid, ketone

và aldehyde (Chang và ctv, 2001) Hạt xuyên tâm liên có palmitic, oleic, lenoleic acid, một lượng nhỏ sterculic và malvalic acid

2.3 Tác dụng dược lý và công dụng

2.3.1 Sử dụng xuyên tâm liên như một loại thảo dược truyền thống

Xuyên tâm liên là một cây thảo dược truyền thống, được sử dụng đầu tiên vào năm 175 trước công nguyên để trị bệnh vàng da; khi đó nó được sử dụng phối hợp với một số loài thực vật khác (Vijaykumar và ctv, 2007) Tuy nhiên, mãi tới những năm 50 của thế kỷ 20 thì loại thảo dược này mới được nghiên cứu rộng rãi Các nhà khoa học tập trung nghiên cứu về thành phần dược lý, sự an toàn, hiệu quả sử dụng cũng như

các cơ chế hoạt động các hoạt chất có trong cây

Xuyên tâm liên có vị đắng, tính hàn Theo y học cổ truyền Trung Quốc thì xuyên tâm liên có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch; ngăn ngừa cảm lạnh, giảm sốt, chống viêm; diệt khuẩn; chống tiêu chảy và phòng và trị bệnh đường ruột; bảo vệ gan, mật; ngăn ngừa một số bệnh đường hô hấp, bệnh liên quan tới hệ thần kinh và các bệnh khác

Ở Việt Nam, trong những năm chiến tranh và những năm sau chiến tranh, khi thuốc kháng sinh tổng hợp còn rất khan hiếm, xuyên tâm liên được dùng thay thế thuốc kháng sinh cho nhiều bệnh kèm theo sốt do vi khuẩn và vi-rút, đặc biệt là các bệnh liên quan đến đường hô hấp, tai mũi họng Những nghiên cứu ở nước ta cho thấy nước sắc xuyên tâm liên với tỉ lệ 5/1, 2/1 có tác dụng yếu đối với các chủng vi khuẩn

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis (Phạm Hoàng Hộ, 2000;

Viện dược liệu, 2003)

Theo khuyến cáo từ tạp chí cây thuốc tại Thái Lan, rễ xuyên tâm liên đem đun

sôi lấy nước uống có thể có tác dụng trong việc điều trị bệnh do Staphylococcus aureus Nhai lá tươi có ảnh hưởng tốt đối với những người bị bệnh cao huyết áp Chất chiết từ thân cây bằng methanol có hiệu quả đối với vi khuẩn Proteus vulgaris Thân

và lá cây ở dạng bột có tác dụng chống lại vi khuẩn Shigella nhưng không có tác dụng đối với Vibrio cholerae Chất chiết từ lá cây bằng ethanol có thể chống được vi khuẩn Staphylococcus aureus nhưng chất chiết với nước nóng lại không có được tác dụng

này Bunyapraphatsara phát hiện ra chất chiết bằng phương pháp đun sôi với dung môi

là ethanol có hiệu quả tốt trong việc ức chế hoạt động của vi khuẩn E coli (trích dẫn

bởi Tipakorn, 2002)

Cao chiết từ thân lá xuyên tâm liên được dùng thay thế cho streptomycin hoặc pyrazinamid trong liệu pháp ISP (phối hợp 3 loại thuốc isoniazid, streptomycin và pyrazinamid) để điều trị lao phổi và cho kết quả tốt trong điều trị lâm sàng

Những hiểu biết về tác dụng của thảo dược xuyên tâm liên ở người cũng đã được ứng dụng trong chăn nuôi Ở Thái Lan, trong một số trại chăn nuôi, người ta sử dụng lá hoặc trộn lá xuyên tâm liên với các lá khác cho gia súc ăn Người chăn nuôi cho rằng khi trộn lá xuyên tâm liên vào trong thức ăn của gà sẽ làm giảm tỷ lệ chết, đặc biệt là đối với các bệnh đường hô hấp trên và bệnh đường tiêu hóa (Tipakorn,

2002)

Dịch ép từ cành và toàn bộ cây dùng để trị tiêu chảy, Newcastle, bệnh đường hô hấp ở gia cầm Tại Ấn Độ, lá cây được sử dụng để điều trị bệnh ngộ độc cà độc dược, giòi trong các vết thương, giun trong mắt và ruột, sán lá gan, viêm lưỡi, táo bón, xảy thai truyền nhiễm, lao, viêm phổi, bệnh uốn ván trong các trại chăn nuôi (Susan và Fougère, 2006)

2.3.2 Tác dụng dược lý của xuyên tâm liên

Thành phần biệt dược chính của Andrographis paniculata là andrographolide

(AP1) Nó có vị rất đắng, kết tinh không màu và được gọi là một diterpen lacton – tên hóa học thể hiện cấu trúc vòng Ngoài ra, các thành phần họat tính khác cũng có liên quan tới vị đắng của xuyên tâm liên bao gồm 14-deoxy-11,12- didehydroandrographolide, homoandrographolide, andrographan, andrographon, andrographosterin, và stigmasterol Các thành phần này cũng được chiết tách từ lá của cây xuyên tâm liên Mỗi một thành phần hoạt chất trong xuyên tâm liên có hiệu lực khác nhau về mặt dược lý AP1 có hoạt lực cao xét về phương diện kháng viêm và bảo

vệ gan chống lại nhiễm độc paracetamol và galactosamine (Handa và Sharma, 1990) AP3 có tác dụng tốt đối với chứng giảm huyết áp (Zhang và ctv, 1994), trong khi đó AP4 có hiệu quả chống lại bệnh sốt rét (Mishra và ctv, 1992) Các nhà nghiên cứu cho rằng sự khác nhau về hoạt tính dược lý của các thành phần này có thể liên quan tới cấu

trúc hóa học của chúng

Khi cho chuột thí nghiệm uống andrographolide, Panossian và ctv (2000) phát hiện ra, sau 48 giờ hàm lượng chất này ở trong não là 20,9%, 14,9% trong lách, 11,1% trong tim, 10,9% trong phổi, 8,6% trong trực tràng, 7,9% trong thận, 5,6% trong gan, 5,1% trong tử cung, 5,1% trong buồng trứng và 3,2 % trong ruột non (trích dẫn bởi Jarukamjorn và Nemot, 2008) Quá trình hấp thu và bài thải andrographolide diễn ra nhanh chóng: 80% được bài thải trong vòng 8 giờ qua thận (nước tiểu) và đường tiêu hóa; 90 % bị bài tiết ra trong vòng 48 giờ

Tác dụng kích thích miễn dịch

Những nghiên cứu trên chuột chứng minh rằng andrographolide kích thích miễn dịch theo 2 cách: miễn dịch tự nhiên và miễn dịch đặc hiệu Những tác động kích thích miễn dịch của các hoạt chất andrographolide, 14-deoxyandrographolide and 14-deoxy-11,12 didehydroandrographolide từ xuyên tâm liên là kích thích sự sản sinh kháng thể cũng như các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Trong một nghiên cứu gần đây của

Xu và ctv (2007) đã phát hiện việc sử dụng chất chiết từ xuyên tâm liên hoặc andrographolide cho chuột đều có tác dụng làm tăng đáp ứng kháng thể đặc hiệu với

Salmonella và kích thích đáp ứng trung gian tế bào chống lại bệnh nhiễm khuẩn Salmonella Cả xuyên tâm liên và andrographolide đều có tác dụng làm tăng lượng kháng thể IgG chống lại S typhimurium Cho uống xuyên tâm liên (dạng chiết tách

bằng ethanol với liều 25mg/kg thể trọng) hoặc dạng andrographolide nguyên chất (1mg/kg thể trọng) ở chuột thí nghiệm đã kích thích sản sinh kháng thể và làm chậm đáp ứng quá mẫn đối với các tế bào hồng cầu cừu (Susan và Fougère, 2006) Chất chiết trong ethanol cũng có tác dụng kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở chuột hiệu quả hơn so với dạng andrographolide tinh chất Điều này chứng tỏ các thành phần khác trong xuyên tâm liên cũng có thể có có khả năng kích thích miễn dịch Người ta cho rằng andrographolide có vai trò trong việc kích thích sự sản sinh ra các bạch cầu có nhiệm vụ tiêu diệt các vi khuẩn và các phần tử ngoại lai, giải phóng ra các interferon và hoạt hóa hệ thống lympho Interferon là một protein do tế bào sản sinh ra khi vi rút xâm nhập vào tế bào, một tác nhân kháng và ức chế sự sinh sản của vi rút Các hoạt chất sinh học trong xuyên tâm liên có tác dụng làm tăng số lượng đại thực bào nhiều hơn là tác động ức chế trực tiếp vi khuẩn Andrographolide có tác dụng làm tăng lượng bạch cầu và sự sản xuất interleukin-2 (IL-2) trong các tế bào lympho ở mạch máu ngoại biên ở người (Kumar và ctv, 2004) Trong khi đó các loại kháng sinh như tetracycline, gentamicin và erythromycin lại ức chế hoạt động thực bào của bạch cầu (Zhu, 1998) Như vậy, các hoạt chất chiết tách từ xuyên tâm liên có tác dụng tăng cường miễn dịch, và chức năng này có hiệu quả hơn khi chúng được sử dụng phối hợp với các tác nhân kích thích miễn dịch khác như kẽm, vitamin C

Tác dụng kháng viêm

Tác động kháng viêm của xuyên tâm liên cũng đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu khoa học Tác động kháng viêm đã được các nhà khoa học nghiên cứu đối với tất cả các hoạt chất sinh học trong nhóm diterpen lacton:deoxyandrographolide,

neoandrographolide, andrographolide và 14–deoxy-11,12 didehydroandrographolide (Pongnaratorn và ctv, 2007) Mức độ tác động của từng hoạt chất trên lại khác nhau Hoạt chất được chiết tách từ xuyên tâm liên bằng dung môi là nước, chloroform hay ethanol đều có tác dụng làm giảm viêm; trong đó dehydroandrographolide có tác động kháng viêm rõ rệt nhất, kế đến là neoandrographolide, deoxyandropholide, và cuối cùng là andrographolide Theo các nhà nghiên cứu, ảnh hưởng này có liên quan tới tuyến thượng thận vì khi phẫu thuật cắt bỏ tuyến này thì tác động kháng viêm của xuyên tâm liên không còn nữa (Deng, 1978) Một số nghiên cứu khác xác nhận là hoạt tính kháng viêm của dehydroandrographolide là do tác động làm tăng sự tổng hợp và giải phóng andrenocorticotrophic hormon (ACTH) của tuyến yên (Amroyan và ctv, 1999) ACTH kích thích sản sinh cortisol, đây là một chất kháng viêm cơ bản

Tác dụng kháng khuẩn

Sử dụng xuyên tâm liên và các hoạt chất trong nó có tiềm năng đặc biệt quan trọng do vi khuẩn ngày càng đề kháng với các loại thuốc kháng sinh Những nghiên cứu ban đầu cho thấy dịch chiết xuyên tâm liên trong nước không có hoạt tính kháng

các loại vi khuẩn như Escherichia coli, Staphylococcus aureus (Gupta và ctv, 1990;

Leelarasamee và ctv, 1990) Tuy nhiên, sau đó các nhà nghiên cứu lại chứng minh được rằng nước sắc xuyên tâm liên ức chế được sự phát triển của các vi khuẩn

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae và Escherichia coli (Singha và ctv, 2003; Silaon và ctv, 2003; Tipakorn và ctv 2004; Xu và ctv, 2006; Sahalan và ctv, 2007; Chandran, 2009) Ngoài ra, người ta

cũng phát hiện ra các phần tử hòa tan trong nước của thảo dược này có chứa các

flavone ức chế mạnh đối với vi khuẩn Shigella dysenteriae Các lacton hòa tan trong

nước mặc dù không thể hiện được hoạt tính kháng khuẩn nhưng lại có giá trị trong điều trị nhiều loại bệnh nhiễm trùng (Chang và ctv, 2001)

Các hoạt chất từ xuyên tâm liên được chiết trong dung môi là methanol, hexan hay chloroform đều thể hiện được hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm gây bệnh

(Bobb và ctv, 2008) Radhika và Lakshmi (2010) phát hiện chiết xuất thân lá và rễ

xuyên tâm liên bằng chloroform có tác dụng kháng lại Escherichia coli (E coli), Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris Hoạt tính kháng khuẩn và

kháng nấm của thảo dược xuyên tâm liên đã được chứng minh (xét về phương diện ức

chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis, E coli, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans) khi so sánh với một số loại kháng sinh thông dụng như

streptomycin, gentamycin hay nystatin (Singha và ctv, 2003) Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng đã chứng minh được sự kết hợp giữa andrographolide và neoandropholide mang lại hiệu quả cao hơn so với các loại kháng sinh như furazolidone hay chloramphenicol trong điều trị viêm ruột do nhiễm khuẩn

Tác dụng đối với tiêu chảy và bệnh đường ruột

Xuyên tâm liên có thể dùng để ngăn ngừa và trị tiêu chảy Trong chăn nuôi heo, đặc biệt là trên heo con, tiêu chảy là một trong những nguyên nhân gây chết hàng loạt Việc sử dụng kháng sinh đã tạo ra những dòng vi khuẩn lờn thuốc Nhiều loại thuốc dùng để làm giảm tiêu chảy như bismuth, loperamide… và rất nhiều trong số đó gây nên những phản ứng phụ không mong muốn (Jarukamjorn và ctv, 2008) Điều trị bằng thảo dược là một phương pháp dễ dàng và ít tốn kém Chất chiết từ xuyên tâm liên

bằng ethanol, chloroform hay 1-butanol có tác dụng đối với tiêu chảy và viêm ruột do

vi khuẩn trên người, thỏ và chuột lang Andrographolide, neoandrographolide có hoạt

tính tương tự loperamide trong điều trị tiêu chảy do độc tố của E coli sản sinh (Gupta

và ctv, 1990) Tuy nhiên, andrographolide có tác động tốt hơn còn neoandrographolide

có ảnh hưởng kém hơn loperamide Người ta cho rằng cơ chế tác động của các hoạt chất này liên quan tới sự ức chế đáp ứng kích thích đường ruột gây ra bởi độc tố ruột

LT không bền với nhiệt (loại độc tố này hoạt động thông qua sự kích thích adenylate cyclase) và ức chế sự bài tiết do độc tố ruột ST bền với nhiệt (tác động thông qua sự

hoạt hóa guanylate cyclase) Mặc dù cơ chế tác động của các hoạt chất trong xuyên tâm liên với tiêu chảy cho đến nay vẫn chưa được biết rõ nhưng kết quả từ các nghiên cứu

chứng minh được xuyên tâm liên có thể được coi là tác nhân kháng tiêu chảy đầy tiềm năng (Anulukanapakorn và Permpipat, 1997; Bunyapraphatsara, 1999; Tipakorn và ctv, 2004)

Tác dụng bảo vệ gan

Andrographolide là thành phần hoạt chất chính trong xuyên tâm liên có tác dụng bảo vệ gan thông qua khả năng hạn chế tác động của các chất như carbon tetrachloride, hexachlorocyclohexane, galactosamine, paracetamol, alcohol – những chất gây tổn thương gan trong các thí nghiệm nghiên cứu trên chuột (Handa và Sharma, 1990; Trivedi và Rawal, 2000; Singha và ctv, 2007; Akowuah và ctv, 2008) Tuy nhiên, chất chiết từ thân lá cây có hoạt tính cao hơn andrographolide vì trong đó còn có các thành phần nhỏ khác đóng góp thêm vào tác động bảo vệ gan (Premila, 2006) Chức năng bảo vệ gan của hoạt chất có trong xuyên tâm liên là do khả năng chống oxy hóa tế bào của chúng Verma và Vinayak (2008) phát hiện ra rằng khi cho chuột uống dịch chiết xuyên tâm liên với các liều khác nhau đã làm tăng hàm lượng các enzyme chống oxy hóa của tế bào như catalase, superoxide dismutase và glucathione S transferase Tác động của chúng tương tự như chất sylimarin, một loại chất chống oxy hóa có trong cây

cỏ sữa Nghiên cứu của Phansawan và Poungbangpho (2007) phát hiện ra chiết xuất bằng ethanol có hoạt tính chống ô xy hóa cao nhất, và hoạt tính này thấp nhất khi chiết

chất của xuyên tâm liên có tác dụng tăng sự lưu thông của mật, axit và muối mật ở chuột và chuột bạch đã được gây mê Khi đưa andrographolide vào cơ thể động vật được điều trị bằng thuốc paracetamol, sẽ ngăn ngừa được tình trạng giảm lượng dịch mật sản xuất ra do sử dụng loại thuốc này Và trong trường hợp này người ta nhận thấy andrographolide hiệu nghiệm hơn sylimarin

Tác dụng hạ sốt

Andrographolide, deoxyandroandgrapholide, neoandrographolide, 14 –deoxy

-11, 12 didehydroandrographolide có tác dụng làm hạ sốt trong các nghiên cứu trên thỏ

và chuột Trong các hoạt chất trên thì 14-deoxy-11,12 dihydroandropholide có tác dụng

hạ sốt mạnh nhất, kế đến là deoxyandrographolide, neoandrographolide, và cuối cùng

2.4 Độ an toàn

Các nghiên cứu tại Trung Quốc, Ấn Độ và Thái Lan chứng minh rằng, sử dụng xuyên tâm liên trong phòng và trị bệnh có độ an toàn cao Các thử nghiệm trên động vật đối với hoạt chất andrographolide và các thành phần khác của xuyên tâm liên cho thấy độc tính của chúng rất thấp Các con chuột uống xuyên tâm liên với liều 10mg/kg trọng lượng/ngày trong khoảng thời gian 7 ngày không bị chết Ghi nhận cho thấy với liều cao này chuột giảm hoạt động và dẫn đến tình trạng hôn mê Tuy nhiên, tim, gan, thận, lách, thận của các con chuột này vẫn ở trạng thái bình thường Với liều sử dụng 500mg lá /kg/ngày trong thời gian 10 ngày thấy không ảnh hưởng tới tăng trưởng và tính ngon miệng ở chuột thí nghiệm (WHO, 2004) Thỏ được tiêm tĩnh mạch andrographolide với liều 10mg/kg, tim hoạt động bình thường Trong thử nghiệm khác

về độc lực của xuyên tâm liên thì thỏ, chuột được cho uống andrographolide, neoandrographolide với liều 1g/kg trong 7 ngày Với liều lượng này người ta không thấy có ảnh hưởng xấu tới trọng lượng cơ thể, số lượng tế bào máu, chức năng gan, thận hay các cơ quan quan trọng khác

Rất hiếm trường hợp sử dụng xuyên tâm liên cho người gây chóng mặt, tim đập nhanh Cũng giống như tất cả các loại thảo dược khác, một số người có phản ứng dị ứng với xuyên tâm liên Với liều quá cao có thể gây khó chịu, ói mửa và làm mất tính ngon miệng Tác động phụ có thể là làm giảm khả năng sinh sản (Akbarsha và Murugaian, 2000)

Theo khuyến cáo trong cuốn “Thuốc thảo dược dùng cho thú y” của Susan và Fougère (2006), liều dùng đối với gia súc nhỏ như sau: bột thân lá, 25-300 mg/kg thể trọng, chia ra trong ngày Viên chất chiết có chứa 5% andrographolide và neoandropholide (loại 100mg) dùng ¼ tới 9 viên/ngày

Tóm lại, cho tới nay hầu hết những nghiên cứu đã chứng tỏ rằng các hoạt chất thuộc nhóm diterpen lacton là những thành phần tự nhiên, có độc lực thấp khi được sử dụng đúng cách

2.5 Các phương pháp chiết xuất, phân lập diterpen lacton

Hoạt chất có trong cây xuyên tâm liên có thể được chiết xuất bằng nước, methanol, chloroform hay ethanol (Chan và ctv, 1971; Nguyễn Mạnh Cường và Trần Văn Sung, 1997) Mỗi phương pháp chiết tách có thể cho ra số lượng và số loại hoạt chất khác nhau

Theo Nguyễn Viết Tựu và các ctv (1985), bột lá xuyên tâm liên được ngâm kiệt trong cồn 950, cô thu hồi bớt cồn, rồi loại tạp bằng than hoạt tính Hỗn hợp lacton này được đem chiết hồi lưu lần lượt với benzen, chloroform, cồn 950 thu được 3 phân đoạn chiết Các phân đoạn này qua tinh chế và kết tinh nhiều lần thu được 3 loại tinh thể của

3 diterpen lacton chính trong xuyên tâm liên là andrographolide, neoandrographolide, deoxyandrographolide

Tuy nhiên, trong các thí nghiệm và trong dược lý người ta thường sử dụng ethanol để chiết tách các hoạt chất từ xuyên tâm liên Dịch chiết hay chất chiết tan trong cồn là dạng sản phẩm phổ biến nhất

2.6 Các nghiên cứu ứng dụng xuyên tâm liên trong chăn nuôi

Nghiên cứu trên thế giới về ứng dụng hoạt chất từ cây xuyên tâm liên với sức khỏe của con người và trên một số động vật thí nghiêm như chuột, thỏ được triển khai tương đối nhiều Tuy nhiên, những nghiên cứu ứng dụng thảo dược này trong ngành chăn nuôi thú y vẫn còn khá ít Các nghiên cứu này tập trung chủ yếu ở các nước thuộc khu vực châu Á, đặc biệt là Thái Lan Ngoài ra, tại trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã có sử dụng thân lá xuyên tâm liên trong điều trị tiêu chảy heo con trong những năm 1980 nhưng chưa có công bố chính thức

Saengsophon và ctv (2000) đã đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung bột xuyên tâm liên trong khẩu phần ăn gà thịt và gà lai địa phương Kết quả cho thấy với tỷ lệ bổ sung 0,18 % trong thức ăn hỗn hợp làm giảm tăng trọng của gà thịt lúc 6 tuần tuổi so với lô đối chứng không bổ sung kháng sinh và lô bổ sung kháng sinh Tuy nhiên, lượng thức ăn tiêu thụ và hệ số chuyển hóa thức ăn không sai khác so với lô đối chứng Tương tự như vậy, bổ sung kháng sinh và bột xuyên tâm liên làm giảm tăng trọng của giống gà lai địa phương ở 8 tuần tuổi đầu tiên so với lô đối chứng

Tipakorn (2002) đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của việc bổ sung xuyên tâm liên đến sự tăng trưởng, tỉ lệ chết của gà thịt tại Thái Lan Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt về tăng trọng hàng ngày, hệ số chuyển hóa thức ăn giữa các

lô thí nghiệm bổ sung xuyên tâm liên với tỉ lệ khác nhau và lô sử dụng kháng sinh (cholotetracycline) Tuy nhiên, tỉ lệ chết giảm một cách có ý nghĩa ở mức bổ sung 0,4

% xuyên tâm liên so với các lô khác

Một nghiên cứu khác tại Thái Lan của Watanasit và ctv (2005) về ảnh hưởng

của việc sử dụng xuyên tâm liên và lá ổi đến sự tăng trưởng của gà thịt Không có sự

khác biệt về tăng trọng, hệ số chuyển hóa thức ăn, tỷ lệ chết giữa tất cả các nghiệm thức sử dụng 0,2 và 0,4 % bột xuyên tâm liên, 0,2 và 0,4 % bột lá ổi, hỗn hợp bột hai loại lá trên cũng như lô sử dụng kháng sinh Tuy nhiên, tỉ lệ mỡ bụng ở gà trống ăn thức ăn có bổ sung hỗn hợp 0,2% bột xuyên tâm liên và 0,2 % bột lá ổi thấp hơn một cách có ý nghĩa so với các lô khác

Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của việc sử dụng bột xuyên tâm liên thay thế kháng sinh trong khẩu phần đến sự tăng trưởng của heo con theo mẹ ở Thái Lan, Khajarern và ctv (2005) đã cho thấy tỉ lệ bổ sung 0,05 % bột xuyên tâm liên trong khẩu phần giúp heo tăng trọng nhanh hơn và hệ số chuyển hóa thức ăn thấp hơn so với heo

ăn khẩu phần có bổ sung hỗn hợp kháng sinh (colistin, chlotetracycline.và tylosin)

Nopparatmaitree và ctv (2005) nghiên cứu về ảnh hưởng của việc bổ sung hỗn hợp bột xuyên tâm liên và gừng đến năng suất, sự tiêu hóa các chất dinh dưỡng và hình thái học của ruột non ở heo cai sữa Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa

về năng suất cũng như sự tiêu hóa các chất dinh dưỡng giữa các lô bổ sung hỗn hợp thảo dược so với các lô sử dụng hỗn hợp các loại kháng sinh (chlotetracycline, colistin

và amoxycline) Tuy nhiên, kết quả cho thấy bổ sung hỗn hợp hai loại thảo dược trên

đã giúp hình thái ruột non được cải thiện Các tác giả kết luận rằng hỗn hợp hai loại thảo dược này có thể sử dụng như một chất kích thích tăng trưởng, hỗ trợ tiêu hóa các chất dinh dưỡng và cải thiện hình thái ruột non

Mathivanan và ctv (2006) cũng tiến hành nghiên cứu sử dụng xuyên tâm liên như là chất thay thế kháng sinh kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi gà thịt ở Ấn độ Kết quả thí nghiệm chứng tỏ hệ số chuyển hóa thức ăn ở lô bổ sung xuyên tâm liên (0,2%) tốt hơn so với lô bổ sung kháng sinh virginiamycin và lô đối chứng không bổ sung bột xuyên tâm liên tại thời điểm 6 tuần tuổi

Trong báo cáo của Chanjula và ctv (2007) cho thấy không có sự khác nhau về tăng trọng, lượng thức ăn tiêu thụ, hệ số chuyển hóa thức ăn, tỉ lệ chết, chi phí thức ăn khi bổ sung xuyên tâm liên với tỉ lệ từ 0,1 – 0,3 % trong khẩu phần gà Betong so với lô

bổ sung kháng sinh (sulfamethoxazole) Tuy nhiên, khi bổ sung với hàm lượng trên 0,5% trong khẩu phần, tăng trọng và lượng thức ăn tiêu thụ giảm, chi phí thức ăn tăng

Nghiên cứu của Tummaruk và ctv (2009) chứng minh bổ sung hỗn hợp với 1.000 ppm xuyên tâm liên phối hợp với nghệ trong thức ăn heo nái giai đoạn nuôi con làm tăng khối lượng heo con /ổ (7,5%), giảm tỉ lệ hao hụt trước khi cai sữa (14,6% xuống còn 2,2%) và do đó làm tăng số heo/ổ ở giai đoạn cai sữa so với lô đối chứng sử dụng thức ăn bình thường

Trong khi đó, tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có đề tài nghiên cứu nào liên quan đến việc sử dụng bột xuyên tâm liên hay chất chiết của nó trong khẩu phần ăn của gia súc gia cầm được công bố chính thức

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

- Xác định thành phần hóa học và hàm lượng diterpen lacton trong bột thân lá thô và chế phẩm diterpen lacton từ xuyên tâm liên

- Khảo sát hoạt lực kháng khuẩn của diterpen lacton đối với một số vi khuẩn đường ruột heo

- Xác định mức sử dụng thích hợp bột thô và chất chiết diterpen lacton trong khẩu phần heo thịt

3 2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu thí nghiệm

- Bột thân lá xuyên tâm liên dạng thô (do Trung tâm Sâm và Dược Liệu Thành

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Nội dung 1 Xác định thành phần hóa học, hàm lượng diterpen lacton trong bột

lá xuyên tâm liên và chế phẩm diterpen lacton

Hoạt tính sinh học của thảo dược xuyên tâm liên có thể nói chủ yếu là dựa trên hàm lượng và thành phần của các chất trong nhóm diterpen lacton Do vậy hàm lượng

và thành phần của các hoạt chất trong bột thân lá thô và chế phẩm diterpen lacton cần phải được xác định trước khi sử dụng

10 mẫu bột xuyên tâm liên và 10 mẫu bột chế phẩm diterpen lacton do Trung Tâm Sâm và Dược liệu Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp được kiểm tra chất lượng trước khi sử dụng cho các thí nghiệm trên heo

- Các chỉ tiêu phân tích: độ ẩm, hàm lượng khoáng không tan trong acid, hàm lượng diterpen lacton toàn phần, hàm lượng ba hoạt chất chính trong nhóm diterpen lacton (dehydroandrographolide, neoandrographolide và andrographolide)

- Nơi thực hiện: tại phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam và Trung tâm Sâm và Dược Liệu Thành phố Hồ Chí Minh

- Phương pháp phân tích

Thành phần hóa học của 10 mẫu bột thân lá thô và 10 mẫu bột chế phẩm diterpen lacton được xác định theo TCVN bao gồm: độ ẩm, khoáng tổng số, khoáng không tan trong acid, hàm lượng diterpen lacton Và 6 trong số 10 mẫu (với cả hai loại dược liệu) được sử dụng để xác định hàm lượng một số hoạt chất chính trong nhóm diterpen lacton

• Xác định hàm lượng nước: cân 5 g bột xuyên tâm liên và làm khô trong tủ sấy ở

105oC đến khi khối lượng không đổi Phần khối lượng mất đi khi sấy được xác định là lượng nước có trong bột xuyên tâm liên

• Các chất khoáng không tan trong acid: cân 2 g bột xuyên tâm liên, tro hóa ở

450oC trong 4 giờ Phần tro được hòa tan bằng 25 ml 3N HCl, đun sôi trên nồi cách thủy khoảng 5 phút Đem lọc dịch qua giấy lọc, rửa sạch bằng nước cất, phần cặn còn lại được nung ở 550oC trong 4 giờ Phần này được xác định là lượng khoáng không tan trong acid của bột lá xuyên tâm liên

• Xác định hàm lượng diterpen lacton bằng phương pháp đo quang dựa trên phản ứng màu Kedde tại bước sóng 544 nm (Phạm thị Thùy An và ctv, 2008) Cân 1 g dược liệu cho vào trong bình nón Dùng ethanol 96% để chiết hoạt chất thông qua quá trình

chiết siêu âm nhiều lần Dịch chiết được cô cạn trên hệ thống cô quay chân không Sau

đó, hòa tan cặn bằng ethanol Lấy một lượng nhỏ dịch chiết đã pha loãng cho vào ống nghiệm Cho lần lượt thuốc thử Kedde A và B vào trong ống nghiệm Trộn đều để yên

5 phút, đem đọc trên máy quang phổ

• Xác định hàm lượng các hoạt chất thuộc nhóm diterpen lacton như andrographolide, neoandrographolide và dehydroandrographolide bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của hãng Shimadzu với đầu dò DAD, ở bước sóng 223 nm, cột sắc ký pha đảo C8, thể tích bơm 20μl, tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ lò cột 27oC Phương pháp định lượng được mô tả chi tiết trong nghiên cứu của Trần Công Luận và ctv (2009)

3.2.2.2 Nội dung 2 Khảo sát hoạt lực kháng khuẩn của diterpen lacton đối với một số loại vi khuẩn đường ruột heo

Để đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của các hoạt chất được chiết tách bằng nước

và cồn từ xuyên tâm liên, hai gốc vi khuẩn đường ruột heo được sử dụng trong thí

nghiệm là E coli, Lactobacillus acidophilus Cả 2 vi khuẩn này được phân lập từ phân heo lấy từ trại Đông Á Vi khuẩn E coli đại diện cho tác nhân gây bệnh cộng sinh Ngược lại, Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn có lợi trong đường tiêu hóa Phương

pháp khuếch tán trên thạch (Đỗ Trung Đàm, 2006) được sử dụng trong nghiên cứu

Chiết tách hoạt chất từ dược liệu:

• Chuẩn bị nguyên liệu gồm: bột thân lá xuyên tâm liên, cao chiết cồn để sản xuất bột chế phẩm DL do Trung tâm nghiên cứu Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

• Chiết xuất các hoạt chất tan trong nước từ bột lá xuyên tâm liên: bột lá xuyên tâm liên được cho vào trong bình cầu Thêm nước cất vào trong bình cầu có chứa mẫu theo tỷ lệ 1:10 Mẫu được ngâm trong nước trong 24 giờ sau đó đem đánh siêu âm trong 30 phút Kế đến đem lọc qua giấy lọc Loại bỏ phần cặn, chỉ lấy phần dịch Dung