XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*****K*J*****

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA

VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ

TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)

TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*****K*J*****

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ

CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ

TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)

TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản

XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN

GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON

HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA

NGUYỄN THỊ BẠCH MAI

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS TS LÊ THANH HÙNG

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

2 Thư ký: TS NGUYỄN TẤT TOÀN

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

3 Phản biện 1: TS LÊ HỒNG PHƯỚC

Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy Sản II

4 Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

5 Ủy viên: TS NGUYỄN HỮU THỊNH

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất cứ công trình nào khác

Ký tên

Nguyễn Thị Bạch Mai

LỜI CẢM ƠN

Con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên,

hỗ trợ về mặt tinh thần và vật chất để con hoàn tất quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Tôi cũng gởi lời cám ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa Thủy Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học hập, làm đề tài

Đặc biệt, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp Khoa Thủy Sản đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn tất luận văn; cảm ơn bạn Nguyễn Thị Ri, nhân viên Phòng Xét nghiệm Thủy Sản của công ty Vĩnh Thịnh và các bạn sinh viên khoa Thủy Sản đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2010

Nguyễn Thị Bạch Mai

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện với ba mục tiêu là xác định mật độ vi khuẩn E ictaluri

trong huyền phù có OD550 0,125 và Mc-Farland 0,5; xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách và trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra gây bệnh thực nghiệm

bởi E ictaluri và xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho bệnh gan thận mủ trên

cá tra tại thực địa

Kết quả đề tài cho thấy:

- Mật độ vi khuẩn trong huyền phù (X ± SE) có OD550 0,125 và Mc-Farland 0,5 tương đương nhau (lần lượt là 1,4 × 108 ± 0,3 × 108 và 1,3 × 108 ± 0,3 × 108

cfu/mL)

- Mật độ vi khuẩn ở gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm tăng dần theo thời gian, cao nhất vào ngày thứ 7 đối với cá 2 – 5 g, > 50 g và ngày thứ 8 đối với cá 10 – 20g Mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách ở cỡ cá 2 – 5 g và > 50 g đạt trên 108 cfu/g từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8 sau khi gây bệnh và ở cỡ cá 10 – 20 g là

từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau khi gây bệnh

- Dịch mẫu thu từ thận cá tra 2 – 5 g nhiễm bệnh thực nghiệm bởi E ictaluri

vào ngày thứ 7 đạt được mật độ vi khuẩn trên 108 cfu/mL

- Trong cùng phương pháp thực hiện, cùng cơ quan kiểm tra: không có sự khác biệt có ý nghĩa (P >0,05) về đường kính vòng kháng khuẩn của doxycyclin ở

24 và 48 giờ; có sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) về đường kính vòng kháng khuẩn của amoxicillin và tetracyclin giữa 24 giờ và 48 giờ Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa (P > 0,05) về kết quả nhận

định tính nhạy cảm của E ictaluri ở 24 và 48 giờ đối với 4 kháng sinh thử nghiệm ở

tất cả các cơ quan kiểm tra và các phương pháp thực hiện

- Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh ở 24 giờ của E ictaluri giữa

phương pháp Bauer Kirby với các phương pháp thực địa trong cùng cơ quan kiểm tra, cùng loại kháng sinh không có sự khác biệt có ý nghĩa

- Cả 3 phương pháp thực địa có thể dùng làm kháng sinh đồ trong việc xác

định sự nhạy cảm của vi khuẩn E ictaluri đối với kháng sinh tại thực địa

ABSTRACT

Study was conducted with three objectives: to determine a concentration of

Edwardsiella ictaluri in bacterial suspension with OD550 of 0.125 and 0.5 Mc

Farland standard turbidity; to determine a concentration of Edwardsiella ictaluri in

liver, kidney and spleen and in liver, kidney and spleen suspension of fish which

were artificially infected with Edwardsiella ictaluri; to develop a field antibiogram test in comparison with the standard antibiogram test for Edwardsiella ictaluri on

catfish

The results of the present study indicated that:

- Bacteria concentration in suspension with OD550 of 0,125 (1,4 x 108 ± 0,03

x 108 cfu/mL) was similar to that in 0.5 Mc-Farland standard suspension (1,3 x 108

± 0,06 x 108 cfu/mL)

- Bacteria concentration in liver, kidney and spleen of experimental fish increased by experimental time and reached the highest values on the 7th and 8thexperimental days for fish with 2-5g and >50g and for 10-20g fish respectively The bacteria concentration of above 108 cfu/g was observed on fish with 2-5g and >50g from the 6th – 8th days, and on fish with 10-20g from the 6th – 9th days

- Bacteria concentration of above 108 cfu/mL was also observed in kidney suspension of 2-5g fish on the 7th experimental day

- There was no significant difference (P>0.05) in diameter of zone of inhibition between 24 and 48 hours for doxycyclin when testing on the same organ with the same method whereas there were significant differences (P<0.05) in that for amoxicillin and tetracyclin However, there was no statistical difference in

antibiotic sensitivity of E ictaluri between 24 and 48 hours to the four antibiotics

tested on all of the organs with the applied methods

- There were no significant differences in antibiotic sensitivity at 24 hours of

E ictaluri between Bauer Kirby method and the field methods when testing the

same antibiotic on the same organ

- All of three field method could be applied as antibiogram test in identifying

sensitivity of E ictaluri to antibiotic in the field

2.2.1 Gây cảm nhiễm nhân tạo bằng phương pháp tiêm 9

2.2.2 Gây cảm nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ngâm 9

2.3 Nghiên cứu về sự nhạy cảm và tính kháng kháng sinh của E ictaluri 10

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.5.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 22

3.5.1.2 Mật độ vi khuẩn trong dịch nghiền và dịch mẫu thu bằng tăm bông 24

3.5.2.1 Định danh vi khuẩn bằng bộ test IDS-14GNR 25

3.5.2.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ test API-20E 26

3.5.3.1 Phương pháp kháng sinh đồ trong phòng thí nghiệm 27

3.6.1 Thí nghiệm 1: Xác định mật độ vi khuẩn E ictaluri trong huyền phù

3.6.2 Thí nghiệm 2: Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách và

dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm 30

3.6.2.1 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách cá tra 30

3.6.2.2 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu ở gan, thận, lách cá tra thu bằng

3.6.3 Thí nghiệm 3: Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho cá tra bệnh

gan thận mủ tại thực địa và so sánh với qui trình trong phòng thí nghiệm 33

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Thí nghiệm 1: Xác định mật độ vi khuẩn E ictaluri trong huyền phù có

4.2 Thí nghiệm 2: Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách và

dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra nhiễm bệnh thực nghiệm 36

4.2.1 Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách cá tra 36

4.2.2 Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra 43

4.3 Thí nghiệm 3: Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho cá tra bệnh

gan, thận mủ tại thực địa và so sánh với qui trình trong phòng thí nghiệm 47

4.3.1 Kết quả kháng sinh đồ ở 24 và 48 giờ 47

4.3.1.1 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK) ở 24 và 48 giờ 47

4.3.1.2 Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của E ictaluri 51

4.3.2 So sánh kết quả kháng sinh đồ ở 24 giờ của các phương pháp 53

4.3.2.2 Kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của E ictaluri 55

4.3.4 Thao tác thực hiện – Ưu, nhược điểm của các qui trình thực hiện

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A hydrophila Aeromonas hydrophila

API-20E Identification system for Enterobacteriaceae and other

non-fastidious Gram-negative Rods

BHIA Brain Heart Infusion Agar

BHIB Brain Heart Infusion Broth

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

ĐKVKK Đường kính vòng kháng khuẩn

IDS14GNR Identification system with 14 biochemical reaction for

identification of non-fastidious Gram-negative Rods

E ictaluri Edwardsiella ictaluri

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn E ictaluri được phân lập từ cá bệnh ở

Hình 3.2 Các loại kháng sinh dùng trong thí nghiệm 21

Hình 3.3 Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân 23

Hình 3.4 Qui trình định lượng vi khuẩn E ictaluri 25

Hình 3.5 Bộ định danh IDS 14 GNR 26

Hình 3.6 Kết quả test API-20E 27

Hình 3.7 Cá bệnh gan thận mủ trong ao nuôi ở Vĩnh Long 28

Hình 3.8 Bố trí thí nghiệm đối với cá 10 – 20 g 31

Hình 3.9 Nghiền mẫu bệnh phẩm trong eppendorf bằng chày nhựa 32

Hình 3.10 Thu mẫu bệnh bằng tăm bông vô trùng 33

Hình 4.1 Cá tra 10 – 20 g bị xuất huyết sau khi gây nhiễm thực nghiệm 37

Hình 4.2 Cá tra > 50 g bị gan thận mủ và xuất huyết sau khi gây nhiễm

Hình 4.3 Cá tra có gan, thận, lách bị mủ 42

Hình 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của E ictaluri ở lách cá bệnh theo 3 phương

Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ có sự hiện diện của khuẩn lạc A hydrophila 58

Hình 4.6 Kết quả kháng sinh đồ chỉ thấy vòng vô khuẩn của A hydrophila 58

Hình 4.7 Kết quả kháng sinh đồ của phương pháp phết có vòng kháng khuẩn

Hình 4.8 Khuẩn lạc E ictaluri phát triển vào trong vòng kháng khuẩn 60

Hình 4.9 Khuẩn lạc mọc quá ít khó xác định vòng vô khuẩn 60

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn 22

Bảng 4.1 Chất lượng nước của bể thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn

Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá cỡ 2 – 5 g 38

Bảng 4.3 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá tra cỡ 10 – 20 g 39

Bảng 4.4 Mật độ vi khuẩn trong gan, thận và lách cá tra cỡ > 50 g 40

Bảng 4.5 Trọng lượng của gan, thận và lách cá (g/cá hoặc g/5 cá) 43

Bảng 4.6 Chất lượng nước của bể thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn trong

Bảng 4.7 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra cỡ 2 – 5 g 44

Bảng 4.8 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra cỡ

Bảng 4.9 Mật độ vi khuẩn trong dịch mẫu thu từ gan, thận, lách cá tra trên 50 g 46

Bảng 4.10 Kết quả kháng sinh đồ trên gan cá sau 24 và 48 giờ ủ ở 30oC 48

Bảng 4.11 Kết quả kháng sinh đồ trên thận cá sau 24 và 48 giờ ủ ở 30oC 49

Bảng 4.12 Kết quả kháng sinh đồ trên lách cá sau 24 và 48 giờ ủ ở 30oC 50

Bảng 4.13 Kết quả đánh giá sự nhạy cảm với kháng sinh của E ictaluri trên

Bảng 4.14 Kết quả kháng sinh đồ (ĐKVKK) của E ictaluri ở các phương pháp

Bảng 4.15 Kết quả đánh giá sự nhạy cảm với kháng sinh của E ictaluri trên gan,

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt Vấn Đề

Trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra ở nước ta phát triển rất nhanh đã góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim ngạch xuất khẩu Tuy nhiên, khi nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật

độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và thiệt hại cũng nhiều hơn

Cá tra nuôi thường gặp phải bệnh nghiêm trọng là gan thận mủ, bệnh này gây thiệt hại rất lớn cho nghề nuôi Đây là bệnh do vi khuẩn nên hướng điều trị chủ yếu là sử dụng kháng sinh Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không đúng đã gây nên hiện tượng kháng thuốc Kháng sinh đồ thực hiện trên vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và xuất huyết trên cá tra nuôi tại các trang trại thuộc các tỉnh Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Bến Tre cho thấy mức độ nhạy của thuốc trên vi khuẩn gây bệnh ngày càng giảm dần Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ từ 1/2006–3/2008 cho thấy sự nhạy cảm với kháng sinh của đa số vi khuẩn được khảo sát ngày càng giảm dần chứng tỏ vi khuẩn gây bệnh ngày càng kháng thuốc nên dẫn đến tỷ lệ thành công thấp trong điều trị (Nguyễn Đức Hiền, 2008)

Xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh, đưa ra phác đồ điều trị chính xác

là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình trị bệnh cho cá Xác định đúng nguyên nhân gây bệnh thì hiệu quả điều trị bệnh sẽ được tăng cao Phác đồ điều trị bệnh chính xác giúp khống chế bệnh một cách nhanh chóng và tiết kiệm chi phí cho người nuôi; tránh được trường hợp dùng thuốc, hóa chất bừa bãi, sử dụng không đúng cách, quá liều dẫn đến tình trạng vi khuẩn kháng thuốc, cá tích lũy thuốc, hóa chất trong cơ thể Để xác định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn cần thực hiện thử

nghiệm kiểm tra kháng sinh đồ Phương pháp kháng sinh đồ được sử dụng hiện nay

là phương pháp Bauer Kirby Đây là phương pháp đòi hỏi người thực hiện phải có

kỹ thuật tốt và mẫu bệnh phải được chuyển tới các phòng thí nghiệm được trang bị đầy đủ máy móc và trang thiết bị Bên cạnh đó, ngoài thời gian chuyển mẫu bệnh từ

ao nuôi về phòng thí nghiệm còn phải tốn thêm 6 – 7 ngày để xác định được tính kháng của vi khuẩn Như vậy, để biết được chính xác nguyên nhân gây bệnh phải mất hơn 7 ngày Thời gian chờ đợi trước khi điều trị này là quá lâu đối với người nuôi cá; một khi dịch bệnh bùng phát thì thiệt hại do bệnh là rất lớn (tỷ lệ cá chết có thể lên đến 90% trên cá tra giống và 50% trên cá tra nuôi thịt) (Nguyễn Hữu Thịnh

và Trương Thanh Loan, 2007) Vì vậy, để có kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn gây bệnh trong thời gian ngắn hơn và đáng tin cậy là nhu cầu chính đáng từ thực tiễn sản xuất

Hiện nay, các phòng xét nghiệm của các Công ty thuốc Thủy sản và các Công ty Nuôi trồng Thủy Sản thực hiện kháng sinh đồ trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng cách sử dụng dịch nghiền từ thận cá bệnh Bên cạnh đó, kháng sinh đồ trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm còn được thực hiện bằng cách sử dụng dịch mẫu thu bằng tăm bông vô trùng từ thận cá bệnh (Furones, 2001) Các phương pháp kiểm tra nhanh sự nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh này đã góp phần nâng cao hiệu quả điều trị bệnh bằng việc sử dụng kháng sinh phù hợp trong giai đoạn bệnh mới bắt đầu Tuy nhiên, việc áp dụng các phương pháp này còn tùy tiện và chưa có nghiên cứu kiểm chứng Do đó, việc nghiên cứu xây dựng một phương pháp làm kháng sinh đồ nhanh, đơn giản nhưng kết quả đáng tin cậy là một việc làm cần thiết

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đề tài “XÂY DỰNG QUI TRÌNH KIỂM

TRA KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ

TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC ĐỊA”

đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Xây dựng qui trình làm kháng sinh đồ cho bệnh gan thận mủ trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus) trong điều kiện thực địa nhanh, đơn giản

1.3 Mục đích đề tài

Góp phần nâng cao hiệu quả điều trị bệnh gan thận mủ bằng việc sử dụng kháng sinh hợp lý

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về bệnh gan thận mủ

Năm 1979, nghề nuôi cá da trơn (Ictalurus punctatus) ở Mỹ đương đầu với

một dịch bệnh nghiêm trọng, đó là bệnh nhiễm trùng máu và viêm ruột (Enteric Septicemia Catfish: ESC) Bệnh này được xem là một trong những bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng nhất về phương diện kinh tế trong những trang trại nuôi cá da trơn công nghiệp ở miền Nam nước Mỹ (Francis-Floyd và ctv, 1987)

Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

lần đầu tiên được mô tả ở đồng bằng sông Cửu Long vào năm 1998 (Ferguson và ctv, 2001) Bệnh này gây hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá tra ở nước ta Bệnh gan thận mủ thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô Thời điểm phát triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm

2.1.1 Tác nhân gây bệnh

Edwardsiella ictaluri (E ictaluri) là tác nhân gây nên bệnh ESC trên cá da

trơn Mỹ (Hawke, 1979; Hawke và ctv, 1981) và bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở Indonesia (Yuasa và ctv, 2003) và ở Việt Nam (Crumlish và ctv, 2002)

E ictaluri thuộc họ Enterobacteriaceae, có dạng hình que mảnh, gram âm,

kích thước 1 × 2 – 3 μm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao E

ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi cho phản ứng catalase dương tính, cytochrome

oxidase âm tính và lên men trong môi trường O/F glucose (Đỗ Thị Hòa, 2004) Chúng có khả năng di động yếu ở 25 – 30oC nhưng không di động ở 37oC, có khả năng lên men và sinh hơi ở 20 – 30oC nhưng không sinh hơi ở 37oC (Plumb, 1994)

Theo Speyerer và Boyle (1987) và Newton và ctv (1988), có 1 - 3 plasmid liên kết với E ictaluri (trích dẫn bởi Plum, 1994) Chức năng của chúng vẫn chưa

được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng chúng quan trọng trong việc nâng cao

tính kháng đối với kháng sinh của E ictaluri E ictaluri là một trong những loài khó phát triển của giống Edwardsiella và tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi

cấy Trên môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) ở 26oC chúng cần 3 ngày

để mọc thành các khuẩn lạc hình tròn màu trắng (Baxa và ctv, 1990) hoặc cần từ 36 – 48 giờ ở 28 – 30oC để phát triển trên BHIA và vi khuẩn tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng khi ủ ở 37oC (Plumb, 1994)

Khi trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát

triển nhanh hơn E ictaluri (như Aeromonas sp.), chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E

ictaluri phát triển rất chậm (Plumb, 1994) Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu

một môi trường có tính chọn lọc cho E ictaluri là Edwardsiella ictaluri agar (EIA) giúp tăng tính chính xác khi phán đoán sự có mặt của E ictaluri trong lần phân lập

vi khuẩn đầu tiên

Khi dịch bệnh ESC được đề cập đến lần đầu tiên vào năm 1977, người ta cho

rằng E ictaluri là mầm bệnh bắt buộc vì nó không thể tồn tại ở môi trường ngoài ký

chủ (Hawke, 1979) Tuy nhiên, nghiên cứu của Plumb và Quinlan (1986) chứng minh rằng chúng có thể tồn tại trong bùn đáy ao trên 90 ngày ở 25oC

2.1.2 Đường truyền lây

E ictaluri có thể lây nhiễm cho cá qua nhiều con đường khác nhau:

(1) Vi khuẩn trong nước có thể xâm nhập vào cơ thể cá thông qua đường mũi, đến dây thần kinh khứu giác rồi đến màng não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và ctv, 1986; Morrision và Plum, 1994) Sự nhiễm trùng bắt đầu và lan rộng từ màng não đến hộp sọ và vùng da trên sọ tạo thành một lổ lõm ở đầu (Plumb, 1994) Vi khuẩn này tấn công vào mũi làm giảm chức năng của niêm mạc mũi ở lớp màng

nhầy Khi quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy có sự hiện diện E ictaluri trên bề

mặt màng nhầy và trong biểu mô

(2) E ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa Đầu tiên vi khuẩn

qua đường miệng phát triển ở ruột, gan, thận và cơ trong vòng 2 tuần gây cảm nhiễm làm ruột trương to, đầy hơi (Fracis-Floyd và ctv, 1987) Vi khuẩn từ đường tiêu hóa xâm nhập qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts và ctv, 1986)

(3) E ictaluri cũng xâm nhập qua mang Thí nghiệm chứng minh trong suốt

quá trình ngâm, vi khuẩn phát triển thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng lớn Sau đó xâm nhập vào cơ thể cá qua biểu mô che phủ mang (Nusbaum và Plumb, 1996)

Tóm lại, vi khuẩn E ictaluri có thể xâm nhập từ môi trường nước vào cơ thể

cá qua mũi, mang và qua miệng bằng đường thức ăn gây bệnh cho cá

2.1.3 Triệu chứng, bệnh tích

Bệnh thường xảy ra trên cá giống và cá thịt Tỷ lệ chết lên đến 100% sau 5 ngày phát bệnh đối với cá giống, cá nuôi thương phẩm chết 30 - 50% trong 1 đợt dịch

2.1.3.1 Triệu chứng

Cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E ictaluri thường kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu,

bụng chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan, thận, lách bị hoại tử tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5 – 2 mm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

2.1.3.2 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể

Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, lách sưng ít hơn Trên gan, thận, lách xuất hiện đốm trắng hoại tử Khi bệnh nặng, chúng phát triển thành đốm trắng tròn có chứa dịch hơi đặc (mủ), đường kính khoảng 1 – 3 mm khắp

bề mặt và cả bên trong gan, thận, lách (Từ Thanh Dung và ctv, 2003)

Cá bị bệnh thường tích dịch viêm ở xoang bụng có màu hơi vàng và có thể

lẫn máu Cá nhiễm E ictaluri thường bỏ ăn do đó ruột trống không chứa thức ăn,

lòng ruột có chứa dịch lẫn máu Đồng thời còn thấy cá bị xuất huyết điểm trên ruột,

cơ và mô mỡ (Plumb, 1994)

Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể ở gan: Quan sát tiêu bản gan có đốm trắng dưới kính hiển vi cho thấy đây là vùng hoại tử Các tế bào gan không còn sát nhau như ở mô gan bình thường mà tách rời ra từng tế bào hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc với nhiều mức độ Giai đoạn đầu có hiện tượng sung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là hệ thống xoang mao mạch giữa các dãy tế bào gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị sưng to Sau đó, do quá trình sung huyết kéo dài dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzyme (protease, lipase, ) làm các tế bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử Lúc này quan sát thấy những tế bào

đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu hủy

Khi cá bệnh nặng, những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng khử độc và lọc máu, các chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm cá chết Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất khả năng tiết mật của gan Một số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan Điều này có thể do khi gan bị hoại tử, ống dẫn mật và túi mật cũng bị hoại tử và túi mật bị vỡ, dịch mật thoát ra ngoài

Bệnh tích vi thể ở thận: Cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các phản ứng sưng viêm xảy ra ở toàn bộ tổ chức Thận sưng to đồng thời bị nhũn do sung huyết, một phần có thể do tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do

hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hư hại Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và làm mất chức năng các đơn vị cấu tạo nên thận Mô tạo máu nằm xen kẽ với các tế bào nội tiết của thận cũng bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút Khi thận

bị hoại tử, chức năng bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ Trong khi đó quá trình trao đổi chất lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, hai loại hormone tuyến thượng thận là adrenalin và noradrenalin không được sản xuất khi thận bị hoại tử cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý của cá

Bệnh tích vi thể ở lách: Cùng với gan và thận, lách cũng là cơ quan bị hủy hoại nặng khi cá bị bệnh gan thận mủ Những đốm trắng trên lách là những vùng

mô hoại tử với nhiều mức độ khác nhau

Đối với cá bệnh nặng, nhiều vùng hoại tử dạng hạt lan rộng, phá hủy các tiểu thể hình elip là vùng chức năng của lách, nơi tiêu hủy các vật lạ và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá nhiều sẽ gây ra tình trạng quá tải đến một lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái hóa Quá trình hoại tử ở lách bắt đầu từ quá trình thoái hóa và hoại tử các tiểu thể lách làm mất

chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu bảo vệ cơ thể chống các tác nhân gây bệnh Cũng như thận, mô tạo máu bị phá hủy nên lách mất chức năng cung cấp máu cho cơ thể

2.2 Các phương pháp gây cảm nhiễm nhân tạo cho cá

2.2.1 Gây cảm nhiễm nhân tạo bằng phương pháp tiêm

Williams và Lawrence (2005) sử dụng mật độ vi khuẩn E ictaluri R4383WT

tăng dần 5,2 × 103 cfu/mL; 5,2 × 104 cfu/mL và 5,2 × 105 cfu/mL tiêm trên cá da

trơn Mỹ (I punctatus) giống, trong khoảng nhiệt độ nước 26oC đã gây chết cá với tỉ

lệ lần lượt là 67,2%, 100% và 100% Trong khi đó E ictaluri WT tiêm với mật độ

5,7 × 103 cfu/mL; 5,7 × 104 cfu/mL; 5,7 × 105 cfu/mL; 5,7 × 106 cfu/mL gây chết cá với tỉ lệ là tăng dần từ 63,5% đến 100%

Theo Nguyễn Hữu Thịnh (2007), phương pháp tiêm là phương pháp gây bệnh bằng cách đưa trực tiếp vi khuẩn vào cá qua đường tiêm Thông thường ta tiêm vi khuẩn vào xoang bụng hoặc cơ Phương pháp này làm cho cá bệnh nhanh

do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào cơ thể Theo nghiên cứu của Lương Trần Thục Đoan (2006), tiến hành tiêm vi khuẩn ở hai mật độ là 105 cfu/mL và 106 cfu/mL, kết quả cá chết vào ngày thứ 5 và ngày thứ 6 trong thời gian theo dõi 10 ngày

2.2.2 Gây cảm nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ngâm

Baxa và ctv (1990) đã gây cảm nhiễm cho cá hồi chinook (Oncorhynchus

tshawytscha) và cá hồi vân (O mykiss) với E ictaluri bằng phương pháp ngâm ở

mật độ 4,0 và 7,9 × 108 cfu/mL trong vòng 30 phút Tỷ lệ chết sau 14 ngày thử nghiệm là 92% và 48% tương ứng với cá hồi chinook và cá hồi vân Nghiên cứu này cũng cho thấy tỷ lệ chết tỷ lệ thuận với nồng độ cảm nhiễm Tỷ lệ chết của cá hồi chinook ở các nồng độ ngâm 4 × 106, 4 × 107 và 4 × 108 cfu/mL lần lượt là 4%, 18% và 92%

Klesius và Sealey (1995) sử dụng vi khuẩn E ictaluri gây cảm nhiễm trên

cá da trơn Mỹ (I punctatus) với mật độ 107 cfu/mL bằng phương pháp ngâm trong vòng một giờ (trích dẫn bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006)

Hanson và ctv (1999) gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm cá da trơn

Mỹ bột và giống với E ictaluri ở mật độ 6,4 × 104 cfu/mL trong vòng 4 tuần (trích dẫn bởi Lê Thị Nga, 2009)

Shoemaker và ctv (1999) cũng ngâm cá trong vòng 30 phút với mật độ vi khuẩn là 107 cfu/mL theo dõi trong vòng 14 ngày cho thấy tỷ lệ chết là 45,6% (trích

dẫn bởi Võ Thị Thanh Bình, 2008)

Lim và ctv (2000) dùng mật độ 1,7 - 2 × 107 cfu/mL ngâm cá da trơn Mỹ với kích cỡ 10,6 ± 0,1 g ở điều kiện 26 ± 2oC trong vòng 1 giờ với tỷ lệ chết 66,7%

trong khoảng thời gian 14 ngày

Gần đây nhất Williams và Lawrence (2005) sử dụng E ictaluri R4383WT và

E ictaluri R4383HM với mật độ 7 × 107 cfu/mL và 7,2 × 107 cfu/mL ngâm trên cá

da trơn Mỹ, tỷ lệ cá chết lần lượt là 85% và 90% Ngoài ra, Williams và Laurence

(2005) đã sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E ictaluri so sánh với phương pháp

ngâm trên cá da trơn Mỹ ở các mật độ tăng dần, kết quả thí nghiệm cho thấy không

có sự khác biệt về tỉ lệ chết giữa hai phương pháp ngâm và tiêm

Hiện nay người ta còn sử dụng phương pháp nuôi chung với cá bệnh để gây cảm nhiễm cho cá

2.3 Nghiên cứu về sự nhạy cảm và tính kháng kháng sinh của E ictaluri

2.3.1 Trong nước

Khi cá bệnh, người nuôi thường dùng kháng sinh để chữa trị dẫn đến việc vi

khuẩn E ictaluri trên cá tra kháng với một số loại kháng sinh như oxytetracycline,

oxolinic acid và sulphonamic (Từ Thanh Dung và ctv, 2003) Kết quả nghiên cứu

của Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan (2007) cho thấy E ictaluri còn

kháng với các loại kháng sinh như sulfamethoxazole/trimethoprim (100%), colistin

(97,8%), florphenicol (42,5%), amoxicilin (40,4%), oxytetracyclin (31,9%), doxycyclin (27,7%)

Kháng sinh đồ được thực hiện trên cá tra bị bệnh gan thận mủ và xuất huyết nuôi tại các trang trại thuộc các địa phương như Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Bến Tre cho thấy mức độ nhạy của thuốc trên vi khuẩn gây bệnh ngày càng giảm dần Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ từ 1/2006 – 3/2008 cho thấy độ nhạy của đa số kháng sinh được khảo sát ngày càng giảm dần chứng tỏ

vi khuẩn gây bệnh ngày càng kháng thuốc dẫn đến tỉ lệ thành công thấp trong điều trị (Nguyễn Đức Hiền, 2008)

Theo Nguyễn Tuấn Đức (2008), kháng sinh có tỷ lệ kháng cao đối với bệnh gan thận mủ trên cá tra là colistin 77%, florfenicol 67%, tetracyclin 47%, streptomycin 40%, oxytetracycline 30%, doxycycline 17% Đây là kết quả nghiên cứu năm 2008, so với năm 2007 thì tỷ lệ kháng có sự chênh lệch khá lớn Tỷ lệ

kháng của vi khuẩn E ictaluri năm 2007 là 86,67% (colistin), 6,67% (florfenicol),

16,67% (tetracycline), 76,67% (streptomycin), 13,33% (amoxicillin), 20% (oxytetracyclin), 3,33% (doxycycline)

Kết quả nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2009) cho thấy đa số vi

khuẩn E ictaluri nhạy với cefotaxime, nitrofurazole và giảm tính nhạy trên nhiều

loại kháng sinh như cefazoline (2%), cefalexine (2%), neomycine (6%), amoxcixiline + clavulanic acid (8%) và ampiciline (14%) Trong khi đó đa số vi khuẩn đã kháng flumenquine, trimethoprime/sulfamethoxazole và kháng với enrofloxacine (93%), chloramphenicol (82%), streptomycine (80%) Đặc biệt, hiện tượng đa kháng đã tìm thấy 86% tổng số chủng đa kháng kháng sinh (kháng từ 3 loại kháng sinh trở lên), số chủng vi khuẩn đề kháng 6 đến 9 loại kháng sinh chiếm

tỷ lệ khá cao (70%) Phần lớn vi khuẩn kháng với các loại kháng sinh như flumequine, trimethoprime/sulfamethoxazole, streptomycine, enrofloxacine, chloramphenicol, tetracycline, doxycycline, norfloxacine

Khảo sát sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loại kháng sinh của 102 chủng vi

khuẩn thuộc giống Edwardsiella (bao gồm 42 chủng E tarda , 41 chủng E ictaluri

và 19 chủng E hoshinae) cho thấy tất cả các chủng Edwardsiella đều nhạy cảm tự

nhiên đối với tetracycline, aminoglycoside, β-lactam, quinolone, antifolate,

chloramphenicol, nitrofurantoin và fosfomycin Các chủng Edwardsiella cho thấy

có sự kháng thuốc tự nhiên đối với macrolide, lincosamide, streptogramin, glycopeptide, rifampin, fusidic acid và oxacillin Tuy nhiên sự nhạy cảm tự nhiên của một số ít loài vi khuẩn khác nhau đối với một số loại kháng sinh (chẳng hạn như macrolide và cefaclor), sự khác nhau này biểu hiện rõ đối với nhóm

benzylpenicillin Trong khi E tarda kháng tự nhiên đối với nhóm kháng sinh benzylpenicillin, E hoshinae lại nhạy với kháng sinh này Một số chủng E ictaluri

nhạy cảm tự nhiên đối với nhóm kháng sinh penicillin trên, tuy nhiên có một số chủng lại kháng với kháng sinh nói trên (Stock và Wiedemann, 2001)

Crumlish và ctv (2002) ghi nhận các chủng E ictaluri phân lập trên cá tra ở

Việt Nam nhạy cảm hoàn toàn với amoxycillin, florfenicol và kháng với oxytetracycline, sulfamethoxazole/trimethoprim và oxolinic acid Thử nghiệm in

vitro đánh giá sự nhạy cảm đối với florfenicol của E ictaluri trên cá da trơn Mỹ (I punctatus) của McGinnis và ctv (2003) cho thấy chúng rất nhạy cảm với florfenicol

Đường kính vòng vô khuẩn đối với các chủng vi khuẩn thu được từ các đợt dịch bệnh là 31 – 51 mm, giá trị trung bình là 46,5 mm; trong khi đó đối với các chủng

vi khuẩn thu được từ cá được gây bệnh thực nghiệm thì giá trị này dao động trong khoảng 31 – 50 mm, giá trị trung bình là 35,3 mm

2.4 Phương pháp thu mẫu và làm kháng sinh đồ trong thủy sản

2.4.1 Thu mẫu cá

Khi lấy mẫu cần thu tối thiểu 10 cá sắp chết (Austin and Austin, 1999; trích dẫn bởi Furones, 2001; Frerichs, 1993; O.I.E., 1995) hoặc 10 cá có triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh Phải lấy cá còn sống, nếu cá không sống phải giữ cá trong điều kiện lạnh (nhưng không được làm đông) cho đến khi thu mẫu mô hoặc chuyển

cá đến phòng thí nghiệm (Furones, 2001)

Nếu mẫu phải được gửi tới phòng thí nghiệm, cá cần phải được đóng gói trong những dụng cụ thích hợp với nước bão hòa oxy, tuy vậy cá vẫn có thể chết trong quá trình vận chuyển (Furones, 2001) Trong trường hợp này, mẫu có thể được dùng để xét nghiệm hoặc không tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian vận chuyển Thời gian vận chuyển là 24 giờ ở 4oC thì mẫu được chấp nhận đối với cá nước lạnh, nhưng đối với cá nước ấm thì mẫu không được dùng để xét nghiệm bệnh

do vi khuẩn sau khi chết 1 giờ (Frerichs, 1993) Nếu cá cần phải được gửi đến phòng thí nghiệm sau khi đã chết, chúng sẽ được lau khô, đóng gói riêng biệt và được giữ lạnh (Furones, 2001)

2.4.2 Thu mẫu bệnh

Theo khuyến cáo của Office International des Epizooties (O.I.E) (O.I.E., 1995), loại mẫu sẽ thay đổi phụ thuộc vào cỡ cá Đối với cá bột cần phải thu nguyên con nhưng phải khử khuẩn bên ngoài trước khi thu; cá nhỏ (4 – 6 cm), thu toàn bộ nội quan; trong khi cá lớn hơn 4 – 6 cm thu từng cơ quan (Furones, 2001)

Để xác định bệnh do vi khuẩn thì các cơ quan được chọn là thận và lách,

1983) Khi thu mẫu cần làm chết cá bằng cách đâm xuyên qua đỉnh đầu (Frerichs, 1993; Post, 1983) hoặc shock nhiệt (đặt cá vào nước đá) Giải phẫu cá lấy thận (cá phải được khử khuẩn bằng ethanol 70% hoặc hợp chất ammonium bậc 4 trước khi mổ), thu mẫu mầm bệnh bằng cách dùng miếng gạc hoặc tăm bông phết lên thận (Noga, 1995) Dùng tăm bông này cấy chuyền vi khuẩn sang đĩa thạch

Thu mẫu bệnh ở ruột, giải phẫu cá lấy ruột trong điều kiện vô trùng (cá phải được khử khuẩn bên ngoài bằng nước muối sinh lý vô trùng 0,85%) Chất dịch trong ruột được thu vào ống đựng mẫu vô trùng Đối với mầm bệnh trên da, dùng dao cạo lớp nhớt và cho vào ống eppendorf vô trùng Đồng nhất chất dịch và nhớt bằng nước muối sinh lý vô trùng 0,85% theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 9 thể tích nước muối sinh lý (Miranda và Rojas, 2007)

2.4.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Theo Dalsgaard (2001), các thử nghiệm về sự nhạy cảm với kháng sinh của những tác nhân gây bệnh trên cá cho thấy không có sự thống nhất về môi trường được sử dụng khi thực hiện kháng sinh đồ Các môi trường khác nhau được đề nghị cho thử nghiệm sự nhạy cảm của mầm bệnh trên người như Mueller-Hinton Agar (MHA), Tryptone Soya Agar (TSA), Antibiotic Medium 3, Diagnostic Sensitivity Test Agar Tuy nhiên các môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHIA), Heart Infusion Agar, Columbia Blood Agar thường được sử dụng cho các vi khuẩn khó nuôi cấy MHA và những sự cải biến khác của môi trường này đã được sử dụng thường xuyên nhất trong các nghiên cứu đã được xuất bản về tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) đề nghị sử dụng MHA cho thử nghiệm sự nhạy cảm của mầm bệnh trên người và điều này cũng thích hợp với những tác nhân gây bệnh cá Đối với các thử nghiệm về sự nhạy cảm với kháng sinh của những vi khuẩn gây bệnh trên cá, người ta đề xuất rằng, nếu có thể nên sử dụng môi trường MHA hoặc MHA cải biến trong nghiên cứu (Dalsgaard, 2001)

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2005) đề nghị sử dụng môi trường MHA bổ sung thêm NaCl, máu ngựa trong các thử nghiệm về sự nhạy cảm của các sinh vật khó nuôi cấy Môi trường được dùng trong thử nghiệm về sự

nhạy cảm của các mầm bệnh có nhu cầu tăng trưởng đặc biệt như Flavobacterium

là Cytophaga Agar (Anacker và Ordal, 1959) và Renibacterium salmoninarum là

KDM2 Agar (Evelyn, 1977)

Trong thử nghiệm về sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh, môi trường thường được sử dụng để tráng huyền dịch vi khuẩn và đặt đĩa kháng sinh là MHA hay TSA (Furones, 2001) MHA là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ, các vi khuẩn dễ mọc vì các lý do: cho kết quả có tính lập lại cao khi thử nghiệm kháng sinh đồ với các loại môi trường; ít ức chế với sulfamides, trimethoprime và tetracycline; thích hợp cho tăng trưởng của hầu hết các vi khuẩn

dễ mọc (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007)

Plumb và ctv, (1995) đã sử dụng BHIA và MHA trong thử nghiệm về sự

nhạy cảm đối với kháng sinh của E ictaluri Kết quả nghiên cứu cho thấy không có

sự sai khác về đường kính vòng vô khuẩn ở hai môi trường này Trong thử nghiệm

về sự nhạy cảm với sulfadimethoxine-ormetoprim của E ictaluri thì sử dụng MHA cho kết quả chính xác hơn BHIA Tuy nhiên, E ictaluri tăng trưởng rất yếu, phải ủ

48 giờ mới đọc kết quả Nên sử dụng môi trường chứa ít thymidine hoặc thymine vì môi trường có nhiều các hợp chất này sẽ ức chế kháng sinh nhóm sulphonamides và trimethoprim

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện, mỗi nghiên cứu sử dụng các môi trường khác nhau (Furones, 2001) Gakken’s semi-synthetic dysentery agar được sử dụng trong thử nghiệm về sự nhạy cảm với sulphadiazine kết hợp trimethoprim (Kimura và ctv., 1983); Nutrient broth được sử dụng trong thử nghiệm về sự nhạy cảm với Baytril (enrofloxacin) (Bragg and Todd, 1988); Brain heart infusion broth

và KDM2 dạng lỏng trong thử nghiệm với quinolones (Bowser and House, 1990);

MHA và 1% NaCl (Ledo và ctv., 1987); Mueller–Hinton Agar bổ sung thêm 1% NaCl hoặc 0,1% L-cysteine hydrochloride cho thử nghiệm về sự nhạy cảm của

Vibrio hoặc Renibacterium salmoninarum (Toranzo và ctv., 1992)

2.4.4 Kháng sinh đồ trong phòng thí nghiệm

Theo CLSI (2005), để pha huyền dịch vi khuẩn cần tối thiểu 3 khuẩn lạc đã nuôi cấy thuần Huyền dịch phải có mật độ vi khuẩn là 1 – 2 × 108 cfu/mL, mật độ này tương đương với mật độ quang là 0,08 – 0,13 đo ở bước sóng 625 nm và ống chuẩn McFarland 0,5 hoặc khoảng 60 NTU (Nephelometric turbidity units) khi dùng máy đo độ đục Khi huyền dịch đã đạt được mật độ vi khuẩn thích hợp thì cho vào đĩa MHA và trang đều Sau đó tiến hành đặt đĩa kháng sinh, số đĩa kháng sinh không được quá 5 và 12 đối với đĩa petri có đường kính 100 mm và 150 mm hay khoảng cách tính từ tâm của hai đĩa kháng sinh tối thiểu là 24 mm Ðem ủ đĩa ở 22

± 2oC trong 24 – 28 giờ hoặc 44 – 48 giờ Nếu ủ ở 28oC thì thời gian ủ là 24 – 48 giờ

Để tiến hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp kháng sinh khuếch tán trên mặt thạch trước hết cần phải chuẩn bị vi khuẩn có thời gian phát triển từ 18 - 24 giờ, các đĩa môi trường MHA, các đĩa kháng sinh phải đạt được nhiệt độ phòng (vì khi bảo quản phải được giữ ở nhiệt độ lạnh) Sau đó, chuẩn bị huyền phù vi khuẩn bằng cách chọn các khuẩn lạc riêng lẻ giống hệt nhau và hòa vào 4 mL nước muối sinh lý và đem lắc đều Theo nguyên tắc, huyền dịch phải có độ đục tương đương với độ đục của ống chuẩn Mc-Farland 0,5 Tuy nhiên việc so sánh hai độ đục này (huyền dịch và Mc-Farland 0,5) bằng mắt thường dẫn tới sai số khá cao Ðể nâng cao độ chính xác, Hiệp Hội Vi Sinh của Pháp đề nghị cách thức sau: huyền dịch sẽ được đo OD ở bước sóng λ = 550 nm; giá trị OD huyền dịch là 0,125 (đây là OD của Mc-Farland 0,5 ở bước sóng λ = 550nm), chấp nhận cho giá trị OD dao động trong khoảng 0,12 – 0,13 Sau khi huyền dịch đã có được độ đục đúng yêu cầu thì thực hiện pha loãng 100 lần và cho huyền dịch đã pha loãng vào hai đĩa môi trường

MHA (2mL/đĩa) Ðĩa môi trường sau khi đã cho huyền dịch vi khuẩn vào thì tiến hành tráng đều vi khuẩn trong đĩa, kế đến đổ bỏ huyền dịch còn dư và đóng đĩa kháng sinh vào đĩa Ðem ủ đĩa trong tủ ở nhiệt độ 35 – 37oC (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007)

Cách làm kháng sinh đồ khác là dùng vi khuẩn đã phân lập trên đĩa để pha huyền dịch vi khuẩn Độ đục của huyền dịch vi khuẩn phải được điều chỉnh, bằng cách đo mật độ quang hoặc so với ống McFarland để đạt được mật độ vi khuẩn phù hợp với thử nghiệm kháng sinh đồ Sau khi huyền dịch đã có được độ đục đúng yêu

trang đều (Furones, 2001)

Theo CLSI (2005), có thể làm kháng sinh đồ bằng cách nhúng tăm bông vô trùng vào huyền dịch vi khuẩn (huyền dịch phải có độ đục khi đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 625 nm trong khoảng 0,08 – 0,13 hoặc đã được hiệu chỉnh độ đục theo độ đục của ống McFarland 0,5) trong 15 phút Sau đó, dùng tăm bông đã thấm huyền dịch phết đều lên đĩa môi MHA Phết đều đĩa môi trường trong 3 lần, giữa mỗi lần phết phải xoay đĩa 60o Sau khi phết, để đĩa khô và đặt đĩa kháng sinh, thời gian chờ đĩa khô tối đa là 15 phút

2.4.4 Kháng sinh đồ tại thực địa

Theo Furones (2001), kháng sinh đồ trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm được thực hiện bằng cách dùng tăm bông vô trùng phết lên thận, sau đó nhúng tăm có mầm bệnh từ thận vào 2 mL nước muối sinh lý Tiếp đến là tráng đều 0,1 mL dịch vi khuẩn trên đĩa môi trường Sau khi đĩa môi trường khô, dùng kẹp khử trùng gắp đĩa giấy có tẩm kháng sinh cho vào đĩa môi trường Tiến hành đọc đĩa (đo đường kính vòng vô khuẩn) sau khi ủ đĩa 24 giờ Bên cạnh việc thực hiện kháng sinh đồ trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm, cần phải cấy phân lập và nuôi cấy thuần vi khuẩn gây bệnh Phương pháp này có thể thực hiện trên tất cả các mẫu cá bệnh

Bên cạnh phương pháp vừa nêu ở trên, các phòng xét nghiệm của các Công

ty thuốc Thủy sản và các Công ty Nuôi trồng Thủy Sản còn thực hiện kháng sinh đồ trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng cách sử dụng dịch nghiền từ thận cá bệnh Qui trình thực hiện đơn giản như sau: cắt 1 g thận cá bệnh, dùng đũa hoặc chày thủy tinh

vô trùng nghiền nát mẫu thận trong ống nghiệm vô trùng Tiếp đến thêm 9 mL nước muối sinh lý vô trùng vào mẫu thận đã nghiền nát Lắc đều dịch mẫu và dùng pipette chuyển 2 mL dịch mẫu vào đĩa môi trường nuôi cấy Tiếp đến là tráng đều dịch mẫu trong đĩa môi trường và hút bỏ lượng dịch mẫu dư, để khô tự nhiên, đặt đĩa kháng sinh và đọc kết quả sau khi ủ 24 và 48 giờ

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ 10/2009 đến 2/2010 Địa điểm nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản – Đại học Nông Lâm TP.HCM và Phòng Xét Nghiệm Thủy Sản của Công ty Vĩnh Thịnh tại Vĩnh Long

3.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu các nội dung chủ yếu sau đây:

(1) Xác định mật độ vi khuẩn E ictaluri trong huyền phù có OD550 = 0,125

và Mc-Farland 0,5

(2) Xác định mật độ vi khuẩn trong gan, thận, lách và trong dịch mẫu thu từ

gan, thận, lách cá tra gây bệnh thực nghiệm bởi E ictaluri

(3) Xây dựng qui trình thực hiện kháng sinh đồ cho bệnh gan thận mủ trên cá tra tại thực địa

3.3 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ và thiết bị cần thiết cho nghiên cứu gồm tủ sấy, tủ cấy vi sinh vật, tủ ấm… và các dụng cụ thông thường trong nuôi cấy vi khuẩn

3.4 Vật liệu dùng trong nghiên cứu

3.4.1 Cá

Cá tra bị bệnh gan thận mủ trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm tại phòng thí nghiệm và nuôi ao ở Vĩnh Long

3.4.2 Vi khuẩn

Vi khuẩn giống gốc E ictaluri VL33 lưu giữ trong môi trường NB và

glycerol ở -20 0C tại phòng thí nghiệm Bệnh học – Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm TP.HCM được dùng để gây bệnh thực nghiệm

Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn E ictaluri được phân lập từ cá bệnh ở Vĩnh

3.4.3 Môi trường

Brain Heart Infusion Agar (BHIA), Brain Heart Infusion Broth (BHIB) và Nutrient Broth (NB)

3.4.4 Đĩa giấy tẩm kháng sinh

Đĩa giấy tẩm kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu gồm tetracycline (TC), doxycycline (DXC) và amoxycillin (AML) của công ty Nam Khoa (Việt Nam) và florfenicol (FFC) của công ty Oxoid (Anh) (hình 3.2) Hàm lượng kháng sinh trong mỗi đĩa được trình bày ở bảng 3.1

Hình 3.2 Các loại kháng sinh dùng trong thí nghiệm

Bảng 3.1 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn (NCCLS, 2000; trích dẫn

bởi Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007)

Tên kháng sinh

Hàm lượng kháng sinh/ đĩa (μg)

Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nhạy Trung bình Kháng

3.4.5 Bộ test sinh hóa định danh vi khuẩn

Sử dụng bộ test định danh trực khuẩn Gram âm dễ mọc IDS-14GNR (công ty

Nam Khoa) để định danh vi khuẩn E ictaluri và test API-20E (công ty BioMérieux)

để định danh các vi khuẩn Gram âm họ đường ruột

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

3.5.1.1 Mật độ vi khuẩn trong huyền phù

Dùng que cấy vòng lấy một vài khuẩn lạc E ictaluri phát triển trên BHIA ở

30oC, 48 giờ huyền phù trong 10 mL nước muối sinh lý 9‰ Từ huyền phù gốc, tiến hành pha loãng theo hệ số 10 từ 10-1 đến 10-5 trong nước muối sinh lý 9‰ (hình 3.3) Dùng micropipette chuyển 0,1 mL từ loạt mẫu pha loãng vào giữa đĩa BHIA Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa Dùng que trang bằng thủy tinh trang đều mẫu trên mặt đĩa thạch, lật ngược đĩa lại và đem ủ 30oC, 48 giờ Ghi nhận

kết quả số lượng khuẩn lạc phát triển trên các đĩa trong khoảng giới hạn 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa thạch

Hình 3.3: Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân (Lê Thị Vu Lan

và Phạm Minh Nhựt, 2008)

• Cách tính số lượng vi khuẩn (theo Trần Linh Thước, 2002)

Tính số lượng vi khuẩn trong 1 mL huyền dịch theo công thức sau :

A = N/(n1Vf1 + … + niVfi) Trong đó :

A: số tế bào vi khuẩn trong 1 g hay 1 mL mẫu (cfu/g hay cfu/mL)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích (mL) mẫu dùng để cấy

f: độ pha loãng tương ứng