HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐÈN LED ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN (bản word)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2TRẦN THỊ HỒNG THÚY HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI CẤYIN VITROVÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐÈN LED ĐẾN SỰSINH TRƯỞNG CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN Chuy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRẦN THỊ HỒNG THÚY

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI CẤYIN

VITROVÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐÈN LED ĐẾN SỰSINH TRƯỞNG CỦA CÂY LAN KIM

TUYẾN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệmMã số:60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM BÍCH NGỌC

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn trân thành đến cô –

TS Phạm Bích Ngọc Cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôitrong suốt thời gian thực hiện đề tài Cô đã luôn tạo điều kiện cho tôi đượchọc tập và nghiên cứu Tôi thật sự rất biết ơn cô đã truyền cho tôi những địnhhướng khoa học cùng lòng saymênghiên cứu khoa học, luôn động viên, khích

lệ tôi, giúp tôi biết cách vượt qua những khó khăn của công tác nghiên cứu,biết được niềm vui và hạnh phúc khi nghiên cứu thànhcông

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học Trường Đạihọc Sư phạm Hà nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tạiTrường Cảm ơn các thầy cô giáo khoa Sinh - Trường Đại học Sư phạm Hànội 2 đã tận tình dạy dỗ chúng tôi, nhờ vậy chúng tôi mới có được những trithức quí giá như ngày hômnay

Xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – ThầyChu Hoàng Hà và Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao côngnghệ - Trường Đại học Sư phạm Hà nội 2 đã tạo điều kiện cho tôi tiến hànhthí nghiệm và làm luận văn tạiđây

Cảm ơn anh chị em phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệsinh học, Cảm ơn các bạn La Việt Hồng, Đỗ thị gấm, Nguyễn Khắc Hưng,Nguyễn Đình Trọng, Hồ Hoài Thương Đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôitrong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Cảm ơn Ban giám hiệu Trường THPT Xuân Hòa cùng các đồng nghiệp

đã tạo điều kiện cho tôi tiếp tục học nâng cao kiến thức

Cảm ơn tất cả những người bạn cùng thực tập với tôi và lớp Sinh họcthực nghiệm K16 đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt chặng đường vừa

qua Được học tập và làm việc cùng các bạn là niềm hạnh phúc và may mắn của tôi.

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình cùngnhững người bạn thân của tôi Gia đình đã tiếp cho tôi nghị lực, cho tôi sựbình yên trong tâm hồn, luôn bên tôi những lúc khó khăn Những người bạnthân luôn bên tôi, ủng hộ, khích lệ và động viên Tình cảm của các bạn luônlàm tôi cảm động và trântrọng

Xuân Hòa, ngày 11 tháng 12 năm 2014

Tác giả

Trần Thị Hồng Thúy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Hoàn thiện quy trình nuôi cấyin vitrovà

nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kim tuyến” là công trình nghiên cứu của tôi Những số liệu và kết quả nghiên cứu

trong luận văn này là trung thực chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thứcnào và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi

sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tintrích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồngốc

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này

Tác giả

Trần Thị Hồng Thúy

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ và sơ đồ

Danh mục hình ảnh

MỞ ĐẦU 1 LÍ DO CHỌNĐỀTÀI 1

2 MỤC ĐÍCH VÀ NHIỆM VỤNGHIÊNCỨU 3

2.1 Mục đích nghiêncứu 3

2.2 Nhiệm vụnghiêncứu 4

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦAĐỀTÀI 4

3.1 Ý nghĩa khoa học củađềtài 4

3.2 Ý nghĩa thực tiễn củađềtài 5

4 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊNCỨU 5

4.1 Đối tượngnghiên cứu 5

4.2 Phạm vinghiên cứu 5

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY LANKIMTUYẾN 6

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây lankimtuyến 6

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái và nhu cầu ánh sáng của cây lankimtuyến 6

1.1.1.2 Phân bố 7

1.1.2 Vai trò của cây lan kim tuyến trongyhọc 8

MỤC LỤC

1.1.3 Những nghiên cứu về nhân giống lan kim tuyến bằng kĩ thuậtinvitro8

1.2 TỔNG QUAN VỀ ÁNH SÁNG ĐỐI VỚITHỰCVẬT 11

1.2.1 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ởthựcvật 11

1.2.2 Vaitròcủ a ánhsá ng đốivớiquá trìnhsinhtrưởngvàpháttriển củathựcvật 12

1.2.2.1 Cường độánhsáng 13

1.2.2.2 Quang phổánhsáng 13

1.2.2.3 Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thựcvật 15 1.2.3 Vai trò của ánh sáng trong nhân giốngin vitrothựcvật 16

1.2.4 Đèn LED 19

1.2.4.1 Giới thiệuđènLED 19

1.2.4.2 Ưu, nhược điểm củađènLED 19

1.2.4.3 Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sángLED trong nuôi cấyinvitro 21

1.2.4.4 Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ởViệtNam 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNHĐỀTÀI 26

2.1.1 Địa điểm tiến hànhđềtài 26

2.1.2 Thời gian tiến hànhđềtài 26

2.2 VẬT LIỆUNGHIÊNCỨU 26

2.2.1 Vật liệu thựcvật 26

2.2.2 Môi trường và điều kiệnnuôicấy 26

2.2.2.1 Môi trường nuôi cấycơbản 26

2.2.2.2 Điều kiệnnuôicấy 27

MỤC LỤC

2.2.2.3 Dụng cụ và thiết bị được sử dụng trongthínghiệm 27

2.2.3 Hệ thốngánhsáng 282.3 PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU 282.3.1 Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống loài lan kim tuyến

(AnoectochilussetaceusBlume) thông qua cảm ứng tạo protocorm

likebodies(PLBs) 28

2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa

sinhtrưởng đến sự hình thành protocom likebodies(PLBs) 28 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạochồi từcụmPLBs 30 2.3.1.3 Thínghiệm3:Nghiêncứuxácđịnhmôitrườngphùhợpchosự

sinh trưởng và tạo rễ của chồi nuôi cấytừPLBs 31 2.3.2 Khảosát ảnhhưởngcủaánh sáng LEDđếnnuôicấylankimtuyếninvitro

32

2.3.2.1 Thí nghiệm 4:Khảosát ảnhhưởngcủaánh sángLEDđếngiai

đoạnnhân đa chồi lankim tuyến 32 2.3.2.2 Thí nghiệm 5:Khảosát ảnhhưởngcủaánh sángLEDđếngiaiđoạn

sinh trưởngvàtạo rễcủachồi lan kim tuyến in vitro dướiđ è n

LED 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU KĨ THUẬT NHÂN GIỐNG LOÀI LAN KIM

TUYẾN (Anoectochilus setaceusBlume) THÔNG QUA CẢM ỨNG TẠO

PROTOCORM LIKEBODIES(PLBs) 353.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành protocomlikebodies 353.1.2 Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạo chồi từcụmPLBs 42

MỤC LỤC3.1.3 Nghiêncứuxácđịnhmôitrườngphùhợpchosựsinhtrưởngvà

tạo rễ của chồi lan kim tuyến nuôi cấytừ PLBs 45

3.2 KHẢOSÁTẢNHHƯỞNGCỦA ÁNHSÁNGLED ĐẾNNUÔICẤY

LANKIM TUYẾNINVITRO

52

3.2.1 Khảos á t ả n h h ư ở n g c ủ a á n h s á n g L E D đ ế n g i a i đ o ạ n n h â n đ achồi của cây lankimtuyến 53

3.2.1.1 Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng khác nhau đến tỉ lệ hìnhthành

chồi và hình thái chồi của cây lan kim tuyến nuôi cấyinvitro 53

3.2.2.2 Đánh giá quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan

kimtuyến nuôi cấy in vitro thông qua một số chỉ tiêu về hình thái và hóa sinh 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 KẾTLUẬN 63

2 KIẾN NGHỊ VỀ CÁC NGHIÊN CỨUTIẾPTHEO 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

PHỤ LỤC

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Nội dung chữ viết tắt

2 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

7 KH&CN Khoa học và công nghệ

8 LED Đi–ốt phát quang (Light-Emitting Diode)

9 MS Môi trường nuôi cấy Murashige và Skoog (1962)

10 NAA Axit α-naphtaleneacetic

11 PLBs Protocorm like bodies

15 IFR cường độ ánh sáng đỏ xa

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1 Hình 1.1 Hình thái cây và hoa lan kim tuyến

(Anoectochilus setaceus)[ 6 ] 7

2 Hình 1.2 Phân bố lan kim tuyến ở Việt Nam [2] 7

3 Hình 1.3 Các bước sóng ánh sáng và sự hấp thu các

bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và

cường độ quang hợp củaAnacharissp [11]. 11

4 Hình 3.1 Hình ảnh các PLBs lan kim tuyến trong các

môi trường cảm ứng khác nhau

8 Hình 3.5 Chồi chuyển từ K2 sang môi trường sinh

trưởng chồi và tạo rễ K1, S2 (sau 30 ngày nuôi

9 Hình 3.6 Sinh trưởng của chồi ở nghiệm thức K2-K1 49

10 Hình 3.7 Lan kim tuyến sinh trưởng trong vườn ươm 51

11 Hình 3.8 Quy trình nhân giống lan kim tuyến

(Anoectochilus setaceusBlume) thôngqua

12 Hình 3.9 Cây lan kim tuyến nhân đa chồi dưới ánh sáng

13 Hình 3.10 Cây giống lan kim tuyến nuôi cấy dưới đèn

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1 Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác

2 Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo PLBs 29

3 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy tạo chồi từ cụm PLBs 30

4 Bảng 2.3 Môi trường sinh trưởng chồi và tạo rễ chồi lan

5 Bảng 2.4 Bố trí các nguồn ánh sáng trong thí nghiệm 4 33

6 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

đến sự hình thành protocom like bodies 35

7 Bảng 3.2 Quá trình sinh trưởng của PLBs trongm ô i

8 Bảng 3.3 Tạo chồi từ PLBs (sau 30 ngày nuôi cấy) 43

9 Bảng 3.4 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh và hiệu suất

nhân cây của toàn quy trình nuôi cấy 46

10 Bảng 3.5 Tác động của các điều kiện chiếu sáng đến tỉ

lệh ì n h t h à n h c h ồ i v à h ì n h t h á i c h ồ i l a n k im

tuyến

53

11 Bảng 3.6 Tác động của các điều kiện chiếu sáng đến hệ

12 Bảng 3.7 Tác động của các điều kiện chiếu sáng đến tỉ

lệ hình thành rễ, số lượng rễ và chiều dài rễ 56

13 Bảng 3.8 Một số chỉ tiêu về hình thái và hóa sinh của

cây lan kim tuyến nuôi cấyin vitro 57

4 Biều đồ 3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đến một số

chỉ tiêu quan trọng về hình thái và hóas i n h

của cây lan kim tuyến nuôi cấyin vitro 60

Lankimtuyến đượcbiết đếnnhiềukhôngnhữngbởi giá trịlàmcảnh, mà bởigiá trịlàmthuốccủa nó.Lan kim tuyến là nguồn dược thảo quý, được thu muachủ yếu để xuất khẩu sang Trung Quốc với giá rất cao Ở Việt Nam lan kimtuyến phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể không nhiều, tái sinh chậm vàđòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo Hiện nay, nguồn nguyên liệu từ một số câythuốc mang các hoạt tính dược liệu quý, đặc hữu như lan kim tuyến ngoài tựnhiên đang khôngđủđáp ứng nhu cầu điều trị ngày càng tăng và việc khai thácquá mức (với hình thức khai thác nhổ cả cây) dẫn đến nguy cơ tuyệt chủngloại dược liệu quý hiếm này nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn Lankim tuyến được cấp báo thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêmcấm khai thác vì mục đích thương mại[3] và nhóm thực vật rừng đang nguycấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam[2]

Hiện nay, các loài lan kim tuyến không chỉ được nghiên cứu về hoạt

tính sinh họcmàcòn về các phương pháp nuôi cấyin vitro Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấyin vitrocây lan kim tuyến với mong muốn tạo ra

số lượng lớn cây lan kim tuyến để đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của thịtrường Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu như: Chow và cộng

sự (1982), đã nhân giốngin vitrothành công loài lan kim tuyếnAnoectochilus formosannustừ hạt [22] Ket NV và cộng sự (2004) đưa ra quy trình nhân nhanh lan kim tuyến loàiAnoectochilus formosanusbằng

phương pháp tạo đachồivớinguồnmẫuban đầulàchồiđỉnh[34].PhùngVănPhêvàcộngsự(2010)đãnghiên cứu thành côngkĩthuật nhân

roxburghii(Wall.)Lindl,vớinguyênliệulàthểchồi[14].

Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Niệm (2012), đã thiết lập quy trình

nhân nhanhin vitrohoàn chỉnh loài lan kim tuyếnAnoectochilus setaceusvới

nguyên liệu là chồi và mắt đốt ngang thân [16] Trương Thị Bích Phượng,Phan Ngọc Khoa (2013) cũng đã nhân lan kim tuyến qua nuôi cấy cụmprotocorm (2,0 × 2,0 mm) được hình thành từ hạt [15] Trước nhu cầu rất lớn

về lan kim tuyến dùng để làm thuốc, thực phẩm chức năng của các công tydược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng nghiên

cứu nhân nhanh giống lan kim tuyếnin vitro Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có công bố khoa học nào về nhân giống cây lan kim tuyếnin vitrothông

qua cảm ứng tạo protocorm like bodies nhằm tăng hệ số nhân chồi cũng nhưhiệu suất nhân cây

Trong nhân giốngin vitrothực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng,

cường độ và thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, pháttriển của thực vật Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trìnhchiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất

của cây Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến trong nhân giốngin vitrohiện

nay là đèn huỳnh quang Mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sựtăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lại phảitiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn nàygây ra Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65%dùng cho thắp sáng trong phòng nuôi cây và khoảng 25% để làm mát phòngnuôi Do đó, sự phát triển nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các

phòng nuôi cấy mô sẽ mang lại nguồn lợi đáng kể để giảm chi phí sản xuất trong vi nhân giống [35].

Các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấymôhiện nay chủ yếu tậptrung vào nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình phátsinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của thực vật mà chưa đi sâu tìm

hiểu vai trò của ánh sáng trong nhân giốngin vitro, đặc biệt là nguồn chiếu

sáng từ đènLED(Light - Emitting Diode) Hiện nay, đèn LED là thiết bị chiếusáng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấymôvà nâng cao khả năng tăngtrưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn và tuổi thọ cao[20] LED có những đặc tính tốt hơn so với các nguồn sáng khác như: đènhuỳnh quang, đèn sợi đốt, đèn natri cao áp Bước sóng của nó phát ra rất đặcbiệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sửdụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng

hợp chlorophyll [44],quang hợp [43] và phát sinh hình thái[27].

Hiện nay chưa có công bố khoa học nào về nghiên cứu ảnh hưởng của

ánh sáng LED đến nhân giốngin vitrolan kim tuyến ở Việt Nam Viện Công

nghệ sinh học đang thực hiện chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước

“Nghiên cứu phát triển công nghệ chiếu sáng LED phục vụ nông nghiệp Tây

Nguyên” (mã số: TN3/C09 KH&CN) trong đó có nội dung “Nghiên cứu ảnhhưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro”.

Căn cứ vào những phân tích đã nêu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Hoàn

thiện quy trình nuôi cấyin vitrovà nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sự

sinh trưởng của cây lan kim tuyến”.

2 MỤC ĐÍCH VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊNCỨU

2.1 Mục đích nghiêncứu

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanhin vitrocây lan kim tuyến

thông qua cảm ứng tạo protocorm like bodies Nhằm rút ngắn thời gian thu

các đợt cây giống, số lượng cây giống, giúp hạ giá thành cây giống, góp phầnbảo tồn nguồn gen lan kim tuyến Cung cấp cây giống với số lượng khônggiới hạn cho các nhà vườn trồng làm nguyên liệu dược và thực phẩm chứcnăng.

Bước đầu nghiên cứu sử dụng đèn LED trong nuôi cấyin vitrolan kim

tuyến

2.2 Nhiệm vụ nghiêncứu

2.2.1 Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống in vitro cây lan kim

tuyến(thôngquacảmứng tạo protocorm likebodies)

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự hìnhthành protocom like bodies (PLBs)

Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạo chồi từ cụm PLBs

Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng và tạo rễcủa chồi nuôi cấy từ cụm PLBs

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình phát sinh đachồi của cây lankimtuyến nuôi cấy invitro

Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình nhân đa chồi củacây lan kim tuyến: Tỉ lệ hình thành chồi và hệ số nhân chồi

Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình tạo rễ và sinh

trưởng của cây lan kim tuyến nuôi cấyin vitro: Sự tạo rễ và một số chỉ tiêu hình thái và sinh lí của cây lan kim tuyến nuôi cấyin vitro(chiều cao cây,

đường kính thân, số lá trên cây, diện tích lá trung bình, hàm lượng diệp lục)

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀTÀI

3.1 Ý nghĩa khoa học của đềtài

Hoàn thiện quy trình nuôi cấyin vitrocây lan kim tuyến sẽ cung cấp những cơ sở khoa học cho công tác nhân giốngin vitrocây trồng nói chung

và cây lan kim tuyến nói riêng Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn gen lan kim tuyến là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay.

Nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kimtuyến cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED đến nuôi

cấyin vitrolan kim tuyến Góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy lan kim tuyếnin vitro.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đềtài

Xây dựng quy trình nhân nhanh lan kim tuyến thông qua cảm ứng tạoPLBs nhằm nhân giống lan kim tuyến với số lượng lớn, hạ giá thành câygiống, góp phần bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý

Nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sự sinh trưởng của cây lan kimtuyến là cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong nuôi

cấyinvitrocây trồng nói chung và lan kim tuyến nói riêng, hướng tới tìm

nguồn ánh sáng thích hợp thay thế đèn huỳnh quang và các loại đèn đangdùng trong nuôi cấy lan kim tuyến hiện nay, là cơ sở giúp hạ giá thành sảnphẩm là cây lan kim tuyến giống Hoặc định hướng cho các nghiên cứu tiếptheo về ứng dụng của đèn LED đến cây lan kimtuyến

4 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊNCỨU

4.1 Đối tượng nghiêncứu

Cây lankimtuyếninvitrodoPhòng Côngnghệtếbàothực vật, Viện

Côngnghệsinhhọc,Viện HànlâmKhoahọcvàCôngnghệViệtNamcungcấp

4.2 Phạm vi nghiêncứu

Đề tài thực hiện nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan kim tuyến

và khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED trong nuôi cấyin vitrolan kim

tuyến trong phạm vi phòng thí nghiệm tại Viện Công nghệ sinh học

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY LAN KIMTUYẾN

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây lan kimtuyến

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái và nhu cầu ánh sáng của cây lan kimtuyến

Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceusBlume) là cây thảo, mọc ở đất,

có thân rễ mọc dài Thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang

2-4 lá xòe sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn,cỡ 3-4 × 2-3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lụcsẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu-đỏ với mạng gân màu vàng-lụchay hồng); cuống lá dài 2-3 cm Cụm hoa dài 10-15 cm, mang 4-10 hoa mọcthưa Lá bắc hình trứng, chóp thót nhọn đột ngột, dài 8-10mm,màuhồng.Hoathườngmàutrắng,dài2,5-3cm;cácmảnhbaohoadàikhoảng6mm,môi

dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu,hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [2].

Hình 1.1 Hình thái cây và hoa lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus)

Ở Việt Nam lan kim tuyến phân bố

rộng: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản

Bạ), Yên Bái, Vĩnh phúc (Tam Đảo), Hà

Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị

(Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy),

Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)[6]

Trên thế giới lan kim tuyến phân bố ở:

Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông),

Ấn Độ, Lào, Inđônêxia, Nêpan, Butan,

Hình 1.2 Phân bố lan kim tuyến ở Việt Nam[2]

Mianma, Thái lan, Campuchia, Malaysia [6].

1.1.2 Vai trò của cây lan kim tuyến trong yhọc

Theo Đông y, lan kim tuyến vị ngọt, tính mát, tác dụng bổ âm nhuậnphế, tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, làm mát phổi, mát máu,

an thần Cây thuốc có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm phế quản, viêmgan mãn tính, chữa các chứng bệnh như ho khạc ra máu, thần kinh suy nhược,gây mất ngủ, kém ăn, trị lao phổi, tiêu hóa kém, chán ăn, phổi kết hạch Ngoài

ra, còn chữa tăng huyết áp, suy thận, di tinh, đau lưng, phong thấp, tiêu đờm,giải độc, giải nhiệt[51]

Trongy học hiệnđại,lan kimtuyếnđược sử dụng làm thuốctrịlaophổi,hodo phếnhiệt,phong thấp, đaunhứckhớp xương, chấn thương,viêmdạdàymãntính, viêmkhíquản, viêmganmãntính, suynhược thần kinh;giúptăngcườngsứckhoẻ,làm khíhuyếtlưu thông,có tínhkháng khuẩn[6]

Trong nghiên cứu của He và Wang (2005) đã tìm thấy ở loài lan kim

tuyến (Anoectochilus roxburghii) các hoạt chất như hợp chất béo, các

flavanoit, glucoside và các steroid [26] Huang và cộng sự (2007) đã thànhcông trong việc phát hiện và định lượng hai hoạt chất quan trọng trong lankim tuyến là oleanolic acid và ursolic acid [29] Năm 2008, Cai và Gong đãnghiên cứu thành phần hóa học của lan kim tuyến và tìm thấy 10 hoạt chấtnhư beta-D-glucopyranosyl-(3R)-hydroxybutanilide, stearic acid, palmiticacid, beta-sitosterol, succinic acid, p-hydroxy benzaldehyde, daucosterol,methyl 4-beta-D-glucopyranosyl-hutanoate; p-hydroxy cinnamic acid vào-hydroxy phenol[21]

1.1.3 Những nghiêncứuvềnhân giốnglankim tuyến bằng kĩ thuậtinvitro

Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi

nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các

kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác

nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.

Thuật ngữ protocorm dùng để mô tả những cấu trúc hình cầu nhỏ củalan hình thành từ hạt Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ mẫu

cấyinvitrokhông được gọi là protocorm.

Protocorm like bodies (PLBs) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu

trúc tương tự protocorm được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹoin vitro.

Protocorm like bodies (PLBs) đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân

giốngin vitroở các loài lan nói chung Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy

bản chất của PLBs là các thể phôi soma [48]

Cây giống lan kim tuyến nuôi cấyin vitrocó những ưu điểm sau:

- Cây giống có phẩm chất di truyền tốt, sinh trưởng nhanh, các hoạtchất dược tính có hàm lượng cao, do cây giống được tạo ra bằng kĩ thuật nuôicấymôtế bào nên vẫn giữ nguyên được phẩm chất di truyền giống câymẹ

- Cây giống có hình thái đồng đều, sạch bệnh, khả năng tái sinhtốt

- Cây giống có thể được sản xuất ở quymôlớn, không phụ thuộc vàomùa vụ, thờitiết

- Vận chuyển cây giống rất thuậnlợi

Như vậy, việc ứng dụng nghiên cứu khoa học vào nhân giốngin vitro,

trồng và bảo tồn lan kim tuyến cần triển khai, phát triển, tạo nguồn nguyênliệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc và tạo thêm việc làm cho người dân

Trên thế giới đã có các công trình nghiên cứu xây dựng quy trình nhân

nhanhin vitrocác loài lan kim tuyến từ hạt hoặc chồi đỉnh lan kim tuyến.

Chow và cộng sự (1982), đã nghiên cứu thành công nhân giống loài lan kim

tuyếnAnoectochilustừ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2 MS +

0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối Môi trường được sử dụng để nhânnhanh chồi là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/L

BAP + 0,5 mg/L NAA [22].

Huang và Liu (2002) đã thành công trong việc tìm ra môi trường cảmứng sản sinh mầm rễ (protocorm) từ hạt của loài lan kim tuyến là môi trườngKnudson C bổ sung 0,5 mg/L 6-BA và 20% dịch chiết khoai tây[28]

Ket và cộng sự (2004) đưa ra quy trình nhân nhanh lan kim tuyến

loàiAnoectochilus formosanusbằng phương pháp tạo đa chồi với nguồn mẫu

ban đầu là chồi đỉnh, hệ số nhân chồi đạt 11,1 chồi/mẫu và 100% mẫu chồi ra

rễ trên môi trường có bổ sung 0,5 g/L than hoạt tính [34]

Nguyễn Văn Kiệt (2004) cũng đã đưa ra quy trình nhân giốngin vitrothành công cho loài lan kim tuyếnAnoectochilus formosanusvới vật liệu

ban đầu là chồi đỉnh tại đại học Hungbuk, Hàn Quốc [45]

ỞViệtNamnhân giốngin vitrolan kimtuyếnđãđược các Viện

nghiêncứuvàTrungtâmnhân giống cây trồng quantâmthực

hiện.NguyễnQuangThạch, PhíThị CẩmMiện(2012)đãthựchiệnđềtài“Nghiêncứukĩthuật nhângiống loàilan

kimtuyến(Anoectochilus setaceusBlume)invitrobảo tồnnguồndược liệuquý”

vớihệ sốnhân chồiđạt6,55chồi/mẫu(từđoạnthân 1-2cm)[16]Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu thành công kĩ thuật

nhân nhanh chồiin vitroloài lan kim tuyếnAnoectochilus roxburghii(Wall.)

Lindl Với nguyên liệu là thể chồi cao 2-3 cm, hệ số nhân chồi 5,33 lần [14]

Viện Công nghệ sinh học (2012) đã thực hiện dự án “Nghiên cứu hoàn

thiện quy trình kỹ thuật sau nuôi cấyin vitrovà trồng bảo tồn nguồn gen tại trại

thực nghiệm Tam Đảo với hệ số nhân chồi (từ đoạn thân 1,0-2,0 cm) là 5,3chồi/mẫu[6]

Trương Thị Bích Phượng và Phan Ngọc Khoa (2013) đã thực hiện thí

nghiệm nhân giốngin vitrocây lan kim tuyến từ đốt thân với hệ số nhân chồi

4,6 chồi/mẫu sau 12 tuần nuôi cấy, nhân từ cụm protocorm (nuôi cấy từ hạt)đạt 5,62 chồi/cụm [15]

1.2 TỔNG QUAN VỀ ÁNH SÁNG ĐỐI VỚI THỰCVẬT

1.2.1 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thựcvật

Sự sống trên trái đất phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời bởi ánh sáng làđiều kiện cho quá trình quang hợp xảy ra Mọi sự sống trên trái đất không thểtách rời quá trình này

Ngày nay, chúng ta biết đến quang hợp là quá trình giúp thực vật dùngnăng lượng ánh sáng để tạo glucose và phóng thích oxy từ carbonic và nước

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợpthuộc vùng quang phổ có bước sóng từ 400 đến 700 nm với cực đại hấp thụ từ

660 đến 680 nm Đơn vị đo cường độ ánh sáng trong các nghiên cứu về thựcvật hiện nay là dòng photon quang hợp (photosynthetic photon flux – PPF),tính bằng μmol.mmol.m-2.s-1, nghĩa là số lượng photon tham gia vào quá trình quanghợp của thực vật tính trong 1 giây trên một đơn vị diện tích 1m2

Các bước sóng ánh sáng được sử dụng trong quang hợp chỉ là một phầnnhỏ của toàn bộ quang phổ điện từ Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanhđiều khiển quá trình quang hợp hiệu quả nhất Khả năng kích thích cácelectron của ánh sáng liên quan đến bước sóng hơn là cường độ của chùmsáng Chỉ có một phần nhỏ ánh sáng được thực vật thực sự hấp thu

Hình 1.3 Các bước sóng ánh sáng và sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp của Anacharis sp [11]

1.2.2 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thựcvật

Năng lượng bức xạ được thực vật sử dụng theo hai cách hoàn toànriêng biệt: như một nguồn năng lượng và như một nguồn thông tin Ánh sángđặc biệt phù hợp với vai trò thứ hai Ánh sáng có thể truyền thông tin quanhiều dạng khác nhau; trong đó, có tối thiểu 4 dạng đặc trưng: chất lượng,lượng, hướng và quangkỳ

Chất lượng: Dạng năng lượng bức xạ, màu, quang phổ, thành phầnbước sóng là tất cả những từ dùng diễn tả đặc trưng này của ánhsáng

Lượng: Số lượng năng lượng bức xạ, cường độ, số photon, tốc độ dòngxác định rõ đặc trưng thứ hai này

Hướng: Có sự đa dạng rất lớn giữa các môi trường sống khác nhau theohướng chiếu sáng

Quang kỳ: Mô tả sự khác nhau đều đặn do chu kì ngày đêm và sự thayđổi độ dài ngày theo mùa

Nhiều đặc tính về phát triển hình thái của thực vậtex vitrobị ảnh hưởng

bởi các điều kiện môi trường như ánh sáng (về chất lượng, cường độ, thờigian và hướng chiếu sáng), nhiệt độ, thành phần khí (CO2, O2, H2O, C2H4),thành phần môi trường[32]

Năng lượng bức xạ có những ảnh hưởng quan trọng lên hình thái vàhoạt động của thực vật bao gồm sự phát triển khả năng quang hợp, tham giavào nhịp nội sinh và định hướng về không gian và thời gian

Quang phát sinh hình thái là quá trình kiểm soát sự sinh trưởng, pháttriển và phát sinh hình thái của thực vật dưới ánh sáng Quá trình này đượcđiều khiển bởi ít nhất bốn con đường khác nhau của các quang thụ thể

Trong điều kiện tối, cây phát triển theo một chương trình gọi là

“kotomorphogensis”, chẳng hạn như kéo dài chồi, có rất ít hay không có lá

mầm và lá thật, bị vàng hóa.

Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, sự kéo dài đốt thân,vv.) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400-500 nm (xanh lục), 600-700 nm(đỏ) và 700-800 nm (đỏxa)

Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn lên sự quang phát sinh hình thái ở thựcvật thông qua các quang thụ thể Thực vật bậc cao có ít nhất ba loại quang thụthể (photoreceptor) có độ hấp thu chọn lọc với các ánh sáng quang phổ khácnhau, điều hòa sự phát sinh hình thái, đó là:

- Phytochrome (650 - 680 nm; ánh sáng đỏ/đỏxa)

- Các thụ thể nhận ánh sáng xanh gồm cryptochrome (340-520 nm; ánhsáng xanh UV-A),phototropin

- Thụ thể hấp thu tia cực tím UV – B (290-350 nm) vàUV-A

Sự chiếu sáng có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của tế bào,môthực vật

và sự sinh tổng hợp chất biến dưỡng sơ cấp và thứ cấp Chúng tăng theocường độ chiếu sáng và hiện tượng bão hòa ánh sáng xuất hiện sau khi cường

độ chiếu sáng đạt đến điểm bão hòa ánh sáng, khác nhautừloài này đến loàikhác[49]

1.2.2.1 Cường độ ánhsáng

Cường độ ánh sáng từ 1000-2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấynhiều loại mô Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậmlại Theo Ammirato (1987), ánh sáng tham gia vào sự phát sinh và phát triểncủa phôi soma [18] Ánh sáng ở cường độ cao gây nên sự sinh trưởng của môsẹo, ở cường độ trung bình kích thích tạo chồi; ngoài ra, ở cường độ thấp sẽtăng chiều cao và lá có màu xanh đậm

1.2.2.2 Quang phổ ánhsáng

Vấn đề quang phổ ánh sáng đã được nhiều tác giả nghiên cứu nhưPierik (1987) Ảnh hưởng của ánh sáng ở các bước sóng khác nhau được trìnhbày tóm tắt trong bảng 1.2[40]

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật

Kéo dài thực vật Nảy mầm (730 nm)

làm tổn thương các mô thựcvậtCực tím UV – C 100 Cây chết ngay lập tức

1.2.2.3 Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thựcvật

Ánh sáng trắnglà tổng hợp của các loại ánh sáng có bước sóng khác

nhau (400-800 nm), thích hợp cho nhiều loại đáp ứng của thực vật Trong

nuôi cấy dịch huyền phù củaPerilla frutescens, sự chiếu ánh sáng trắng với

cường độ 27,2 W.m-2trong suốt thời gian nuôi cấy rất hiệu quả và lượnganthocyanin được tạo ra cao gấp hai lần so với không chiếu sáng [49] Ánh

sáng trắng tăng cường sự sinh trưởng của chồi câyArtemisia annuaL và làm

tăng hàm lượng artemisinin của nó Trong điều kiện tối, chồi không sinhtrưởng và artemisinin không tạo ra[33]

Ánh sáng đỏ (700-780 nm)/đỏ xa (trên 750 nm)có 2 tác động chủ yếu là:

Kéo dài rễ: trong nuôi cấy lông rễ củaArtemisia annuaL, sinh khối lông

rễ và hàm lượng artemisia dưới ánh sáng đỏ cao hơn 17 đến 67% so với dướiánh sáng trắng [47]

Kéo dài lóng thân: tỉ lệ bức xạ tia đỏ: đỏ xa (R: Fr) có ảnh hưởng đến

sự kéo dài lóng thân ở thực vật[31]

Ánh sáng xanh: thúc đẩy sự sinh trưởng củamôsẹo và ức chế sự kéo

dài thân Mô sẹo được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh 435 nm cho nhiều sinhkhối (18,4 g DW/l) và PeG (2,4 g/l) nhất, lần lượt cao hơn 19 và 41% so vớikhi nuôi cấy dưới ánh sáng trắng Điều này được giải thích do hoạt tính củaPAL trongmôsẹo được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh cao hơn so với dưới ánhsáng trắng trong toàn bộ thời gian nuôi cấy [39] Ánh sáng xanh tăng cũng

làm giảm chiều cao củaAntirrhinum[30].

Ánh sáng xanh lục và tia UV gần: Bước sóng UV gần (200-380 nm)

và xanh lục có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật do tác động đếnquang hợp và sự phát triển bình thường của cây Ngược lại khi loại bỏ mộtcách có chọn lọc các tia UV gần và xanh lục từ ánh sáng trắng sẽ tăng cườngsinh trưởng cho cây[50]

Như vậy, ánh sáng được coi là yếu tố sinh thái vừa có tác dụng giớihạn, vừa có tác dụng điều chỉnh đối với đời sống sinh vật, đặc biệt là thực vật.Ánh sáng trắng trực tiếp tham gia vào quá trình quang hợp Ánh sáng điềukhiển chu kỳ sống của sinh vật Tùy theo cường độ và chất lượng của ánhsángmànó ảnh hưởng nhiều hay ít đến quá trình trao đổi chất và năng lượngcùng nhiều quá trình sinh lý của các cơ thể sống Ngoài ra ánh sáng còn ảnhhưởng nhiều đến nhân tố sinh thái khác như nhiệt độ, độ ẩm, không khí đất vàđịahình.

1.2.3 Vai trò của ánh sáng trong nhân giốngin vitrothựcvật

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp cóbước sóng từ 400-700 nm, với đỉnh từ 660-680 nm Sự phát sinh hình thái doánh sáng (sự nảy mầm, sự kéo dài đốt thân…) xảy ra ở những dải bước sóng

từ 400-500 nm (xanh lục), 600-700 nm (đỏ) và 700-800 nm (đỏxa)

Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng đóngvai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô Hiệnnay, ánh sáng trắng (phổ ánh sáng từ khoảng 200 nm đến 800 nm) của đènhuỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm nuôicấy mô Ánh sáng đơn sắc từ đèn LED (đi-ốt phát quang) cũng đã và đangđược nghiên cứu làm nguồn sáng trong nhân giống thực vật Sử dụng ánhsáng đơn sắc đỏ (600-700 nm) hoặc đỏ xa (700-800 nm) hoặc kết hợp vớixanh lam của đèn LED làm cây tăng trưởng rất tốt và tiết kiệm điện năng hơn

so với dùng đèn huỳnhquang

Một trong những yếu tố của môi trường ảnh hưởng lên quá trình tạo rễcủa mẫu cấy là ánh sáng Ánh sáng góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất địnhcủa đoạn cắt Chỉ cần cường độ ánh sáng thấp cho quá trình tạo rễ, vì cường

độ ánh sáng cao quá sẽ ngăn cản sự tạo rễ Đối với một số loài, quang kỳ cóthể ảnh hưởng đến sự tạorễ

Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự ra rễ Ánh sáng đỏ camthích hợp cho sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời Sự phát sinh hình thái thựcvật bị ảnh hưởng bởi các nhân tố của môi trường như nhiệt độ, CO2, chất dinhdưỡng, chất lượng ánh sáng, thời gian và cường độ chiếu sáng Những nhân tốnày ảnh hưởng đến sự tăng trưởng chồi và phát sinh hình thái bên cạnh vai tròcủa nó trong quang hợp Debergh và cộng sự (1992) đã chứng minh rằngcường độ chiếu sáng có tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũng như conđường phát sinh hình thái đồng thời ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố vàthủy tinh thể của cây con [23] Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng quan trọngtrên một số đặc tính hình thái như sự kéo dài ở cây Cúc và cây Cà chua [42].Hình thái giải phẫu lá và kích thước lá ở cây Phong [41].

Nguồn chiếu sáng nhân tạo được sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay

Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật theo 2khuynh hướng sau: Hoàn toàn thay thế hay cung cấp một phần ánh sáng banngày cho quang hợp hay quang phát sinh hình thái

Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật đòi hỏi phảicân bằng giữa các quá trình sinh lý của thực vật và các vấn đề kinh tế củangười nuôi trồng Ánh sáng khác nhauvềchất lượng, cường độ và thời gianchiếu sáng, mỗi đặc tính này đều có ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật.Tổng lượng ánh sángmàcây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tácđộng trực tiếp lên quang hợp, sự tăng trưởng và năng suất cây Sự tác độngnày có thể đo được dựa trên kích thước cây, số lượng hoa và các thuộc tínhkhác Trong nhiều trường hợp, hình thái thực vật (chiều cao, hình dáng…) bịảnh hưởng chủ yếu bởi chất lượng ánh sáng Điều này tùy thuộc vào cường độ

và sựphân phối dải năng lượngnhư ánhsáng xanh,đỏvàđỏxaphátratừđèn.Thựcvậtrất nhạy cảmvớicácđiềukiện ánh sáng,vìvậysựtăngtrưởngvàphát triểnởthựcvật có thểtăngbởi ánhsáng nhântạovàcácđặc tínhthíchnghi

Trong các nguồn chiếu sáng nhân tạo hiện nay, các nguồn sáng chủ yếuđược sử dụng cho thực vật là: Đèn sợi đốt, đèn compact, đèn huỳnh quang,đèn LED.

Đèn sợi đốtlà một trong những nguồn sáng nhân tạo cổ điển nhất mà

hiện nay vẫn được dùng ở nước ta Trong đó năng lượng trong vùng khả kiếnkhoảng 5%, còn chủ yếu là bức xạ hồng ngoại Tuy nhiên, trong thực tế đènsợi đốt có ưu điểm là giá rẻ, dễ lắp đặt Đèn sợi đốt được dùng phổ biến để ứcchế sự ra hoa của cây hoa cúc và kích thích sự ra hoa của cây thanh long trongmùa đông (với cây hoa cúc mỗi đêm phải thắp khoảng 4 giờ, cây thanh longkhoảng 8 giờ)

Hiện nay trong các phòng nuôi câyin vitrophần lớn sử dụng đèn huỳnh

quang Đèn huỳnh quang chủ yếu được sử dụng cho sinh hoạt của con người.Ánh sáng đèn huỳnh quang là sự phối trộn của nhiều vùng quang phổ từnhững vùng ánh sáng có bước sóng ngắn 320 nm đến bước sóng dài 800 nm

Có những vùng bước sóng ngắn không có lợi cho sự sinh trưởng và phát triểncủa thựcvật

Một loại đèn nữa cũng thường được sử dụng cho cây trồng là đènhuỳnh quang compact Đèn compact là loại đèn huỳnh quang áp suất thấp, sửdụng bột huỳnh quang đất hiếm 3 màu So với đèn sợi đốt, đèn compact cóhiệu suất sáng cao hơn đối với mắt người, nhưng đối với phổ quang hợp củathực vật, đèn compact có ít thành phần đỏ (660 nm) và không có đỏ xa (730nm) Mặc dù quang phổ phát ra từ đèn huỳnh quang compact bao gồm cácvùng sáng đỏ và xanh có hiệu quả hơn đèn sợi đốt, tuy nhiên còn có một tỷ lệlớn các vùng quang phổ xanh lá cây (Green) và vàng (Yellow) nên làm lãngphí năng lượng[5]

Như vậy, mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự tăng trưởngthực vật nhưng đèn huỳnh quang trong nuôi cấy mô chiếm nhiều không gian,

tuổi thọ thấp, có những vùng quang phổ không cần thiết, tiêu tốn nhiều điệnnăng và tạo ra nhiệt lượng cao trong phòng nuôi cây, do đó chúng ta phải tốnthêm một lượng điện năng đáng kể để điều hòa nhiệt độ trong phòng Chi phíđiện năng ước tính khoảng 65% dùng cho tăng sáng trong phòng nuôi cấy vàkhoảng 25% để làm mát phòng nuôi [35].

1.2.4 Đèn LED (Light-emittingdiode)

1.2.4.1 Giới thiệu đènLED

Đi–ốt phát quang (LED) là nguồn sáng bán dẫn, sẽ cung cấp lượng ánhsáng đơn sắc khi có dòng điện một chiều chạy qua nó ĐènLED(khác vớibóng LED) được định nghĩa là tổ hợp bóng LED, phần quang học, tỏa nhiệt

và nguồn nuôi [11] LED đầu tiên được phát minh bởi Texas Instrument vàonăm 1960 Tại thời điểm đó cường độ sáng của LED còn rất thấp và chỉ cóánh sáng đơn sắc đỏ Sau này cường độ sáng của LED đã tăng lên rất nhiều vàbiên độ dải màu cũng tăng theo (đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh dương,trắng…) Đến những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đèn LED tạo nênmột cuộc cách mạng nhanh chóng, đem lại nhiều tiện dụng cho các thiết bị kỹthuật số và một dãy các thiết bị mới đa chức năng, như tín hiệu ra vào, đènnổi, đèn giao thông, đèn vòm, đèn tường, đèn dưới nước, đèn ngoài trời.Trong những năm gần đây, LED mới thực sự được quan tâm như là mộtnguồn bức xạ cho thực vật do tiềm năng ứng dụng thương mại của nó rất lớn[35]

Để tiến hành nghiên cứu chế tạo các hệ thống đèn LED thích hợp trongnhân giống cây trồng và kỹ thuật phá đêm, chúng ta sẽ phải lựa chọn các bướcsóng thích hợp với phổ hoạt động của các sắc tố thực vật

1.2.4.2 Ưu, nhược điểm của đènLED

LED đem lại nhiều lợi ích trên các phương diện như sau:

Tiết kiệm điện năng:LED có năng suất cao, do đó năng lượng tiêu thụ

bởi LED nhỏ, giúp cho việc nhân giống có chi phí hiệu quả và tiết kiệm Sửdụng đèn LED có thể tiết kiệm điện năng đến 11% và giảm khí thải CO2từ261-348 triệu tấn vào năm 2020.

Tuổi thọ: LED có tuổi thọ cao, từ 20.000 – 100.000 giờ (đèn sợi đốt cótuổi 1000 giờ, đèn huỳnh quang có tuổi thọ 8000 giờ)

Dải màu: LED có nhiều các dải màu, gồm cả các ánh sáng trắng Ánhsáng trắng cũng có thể được tạo ra khi hòa trộn LED màu đỏ, xanh lơ và xanhlục Thay vào đó, thông qua việc kết hợp một cách sáng tạo các LED có màusắc khác nhau, ảnh hưởng thay đổi màu có thể tạo ra từ một vật cố định đơngiản nhờ sự hoạt hóa động lực của các phần khác nhau của LED

Không phát ra tia UV và tia hồng ngoại: LED không tạo ra tia UV, tạorất ít nhiệt, vì vậy là đối tượng phát sáng lý tưởng Ánh sáng LED không gâychói, mỏi mắt Do tiêu hao nhiệt rất ít, LED hầu như không làm nóng môitrường xung quanh, do đó giảm nhiều nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh đểtạo điều kiện cho cây sinh trưởng

Độ bền: Đèn LED có độ bền rất cao chịu được sốc nhiệt và va đập.Kích thước nhỏ và dễ thay đổi linh hoạt trong thiết kế: Một LED đơn lẻrất nhỏ và tạo ra ít ánh sáng toàn bộ Tuy vậy, điểm yếu này thực sự là thếmạnh của nó Các LED có thể gắn với nhau thành bất cứ hình dạng nào tạonên một loạt kiện lumen mong muốn Thêm nữa, LED có thể thu nhỏ hỗn hợpánh sáng, kiểm soát sự phân phối ánh sáng nhờ các thấu kính epoxy, đơn giảnhóa cấu trúc của hệ đèn LED Một thiết bị kiểm soát có thể được gắn với phứchợp LED để làm mờ một cách chọn lọc các đèn LED độc lập, dẫn đến việckiểm soát phân phối động lực, lượng và màu của ánh sáng

Thân thiện với môi trường, không chứa thủy ngân và các chất độc khác.Thời gian bật sáng rất ngắn (<100 ns)

Dễ điều khiển bằng kỹ thuật số với khả năng thay đổi độ sáng 100%

Hiệu suất biến đổi năng lượng cao.

Điện áp nuôi một chiều thấp (3V)

Phân bố ánh sáng định hướng cao dẫn đến hiệu suất hữu ích cao

Chi phí bảo hành và thay thế hệ thống thấp

Tạo màu có độ bão hòa cao không cần bộ lọc sáng

Hoạt động trong dải nhiệt độ môi trường cao (-40oC đến 60oC)

Nhược điểm của đèn LED

Rào cản duy nhất của công nghệ chiếu sáng rắn là giá thành của LED,nhưng với tốc độ phát triển mau chóng, rào cản này sẽ được dỡ bỏ

1.2.4.3 Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sángLED trong nuôi cấy invitro

Trên thế giới gần đây các đi-ốt phát sáng (LED) là thiết bị chiếu sángđược xem là đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấymôvà nâng cao khả năngtăng trưởng sinh học Bước sóng của LED phát ra rất đặc biệt, chiều rộng củavạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnhvực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng hợp diệp lục [44], quanghợp [43] và phát sinh hình thái[27]

Một vài loại cây trồng thành công dưới hệ thống LED, những cây nàybao gồm: Tiêu dưa, Lúa mì, Bó xôi [20], [27]

Xu hướng nghiên cứu ứng dụng đèn LED vào sản xuất rau và hoa đangđược nhiều nước xác định là nhiệm vụ ưu tiên đầu tư để nâng cao chất lượngsản phẩm và tiết kiệm năng lượng [5]

ỞViệtNamngoài việc được sử dụng rộng rãi trong các thiết bị, LEDcũng được ứng dụng trong các nghiên cứu nông nghiệp Việc sử dụng LEDnhư một nguồn bức xạ cho thực vật được đặc biệt chú trọng trong những nămgần đây do tiềm năng của nó trong ứng dụng thương mại rất lớn Hệ thốngbứcxạLEDtoànphầncómộtsốlợiđiểmvượttrộisovớinhữnghệthống

chiếu sáng hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấymô[35] Sự phátsáng cực đại của LED đỏ và xanh với độ dài sóng thích hợp tạo hiệu quảquang hợp tối đa.LEDđỏ có thể được ứng dụng cho thực tiễn vi nhân giống do

sự phát photon cao cũng như giá thành thấp khi so sánh đèn LED với đèn cómàu khác Sự kết hợp giữa các đènLEDcó màu sắc khác nhau có thể tạo raánh sáng thích hợp cho quá trình quang hợp Một số loại cây như Dâu tây,Chuối sinh trưởng tốt dưới đèn LED[36]

Từ năm 1996 đến nay, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thànhcông hệ thống phát sáng LED trên một số loại cây trồng như Dâu tây, Bạchđàn, Địa lan, Lan hồ điệp, Chuối, Lan Ý, Lily, Cúc và Lan Hài Những cây

này nuôi cấy ở điều kiệnin vitrodưới hệ thống đèn LED không những sinh

trưởng và phát triển tốt,màcòn sinh trưởng và phát triển tốt cả ở điều

kiệnexvitro[11].

Đến nay các nhà khoa học đã đạt được một số thành tựu trong nghiêncứu hệ thống chiếu sáng LED trên thực vật như:

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2003) đã nghiên cứu đáp ứng của cây

Dâu tâyin vitrodưới ánh sáng đơn sắc đỏ và xanh Kết quả cây Dâu tây sinh

trưởng bình thường dưới điều kiện chiếu sáng 90% ánh sángLEDđỏ + 10%ánh sáng LED xanh, 80% ánh sáng LEDđỏ+ 20% ánh sáng LED xanh, 70%ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh.Trong đó, dưới điều kiện chiếusáng 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh, các chỉ tiêu đánh giá

sự sinh trưởng của cây Dâu tây đều tốt hơn so với các điều kiện chiếu sángcòn lại[37]

Năm 2003, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã đánh giá sự sinh trưởng và

phát triển của cây Chuối nuôi cấyin vitrodưới tỷ lệ đèn LED khác nhau: 100%

ánh sáng LED đỏ, 90% ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh, 80%ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh, 70% ánh sáng LED đỏ +

30% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED xanh và đèn huỳnh quang.Nghiên cứu đã khẳng định cây Chuối sinh trưởng và phát triển tốt dưới điềukiện chiếu sáng 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh [38].

Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn phát sángnhân tạo sử dụng ánh sáng đơn sắc trong nhân giống vô tính hiệu quả của câyLan Ý Kết quả trọng lượng tươi của cây cao nhất khi sinh trưởng dưới điềukiện 80% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 20% ánh sáng LED xanh [36]

Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Bá Nam (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởngcủa hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa

Cúc (Chrysanthemum morifoliumcv “Nút”) nuôi cấyin vitro Dưới các điều

kiện chiếu sáng khác nhau: 100% LED đỏ, 100% LED xanh, 50% LEDđỏ+50%LEDxanh,70%LEDđỏ+30%LEDxanh,80%LEDđỏ+20%LEDxanh, 90% LED đỏ + 10% LED xanh và ánh sáng đèn huỳnh quang (neon).Những chồi Cúc phát triển tốt nhất dưới điều kiện chiếu sáng 90% ánh sángLED đỏ kết hợp với 10% ánh sáng LED xanh, cho trọng lượng tươi và số lá

lớn nhất so với các điều kiện chiếu sáng còn lại [12].

Nguyễn Bá Nam và cộng sự (2012) đã nghiên cứu thành công ảnhhưởng của các loại mẫu cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả năng tái

sinh chồi cây hoa Cúc (Chrysanthemum morifoliumramat.cv “Jimba”) nuôi cấyin vitro Dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100% LED đỏ, 100%

LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh, 70% LED đỏ + 30% LED xanh,80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ + 10% LED xanh, ánh sáng đènhuỳnh quang (neon) và trong tối Kết quả 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với30% ánh sáng LED xanh làtỷlệ phù hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu

lá và gián tiếp từ lớp mỏng tế bào thân cây Cúc so với các điều kiện chiếusáng còn lại[10]

Hoàng Văn Cương và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh

sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy hoạt chất saponin thông

qua nuôi cấy mô sẹo của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensisHaetGrushv)in vitro Các mẫu mô sẹo và cây được nuôi cấy dưới

5 loại ánh sáng khác nhau: 100% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED

đỏ, ánh sáng LED xanh và ánh sáng LED đỏ kết hợp với tỷ lệ 50 : 50, 30 : 70,

20 : 80; ánh sáng huỳnh quang được sử dụng làm đối chứng Kết quả cho thấytrọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo thu được là cao nhất khi cácmẫu lá được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh và ánh sáng đỏ kết hợp với tỷ lệ

50 : 50[4].

Ngoài những nghiên cứu trên, phòng Sinh học phân tử và Chọn tạogiống cây trồng thuộc Viện Sinh học Tây Nguyên còn thực hiện trên một sốđối tượng khác như: Lan Hài [7], Đồng tiền [9] đều cho kết quả tốt

Theo Dương Tấn Nhựt (2010), nguồn sáng LED chưa được chú trọng ởViệt Nam [11] Các nghiên cứu về ánh sáng đèn LED trong nuôi cấymôtế bàothực vật trong nước chủ yếu được thực hiện ở phòng Sinh học phân tử vàChọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Sinh học Tây Nguyên[13]

Hiện nay một số Viện nghiên cứu và Trung tâm nhân giống cây trồng

đã bắt đầu nghiên cứu về đèn LED với mục đích tìm nguồn sáng thích hợpthay thế đèn huỳnh quang để giảm giá thành sản xuất câygiống

1.2.4.4 Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ởViệtNam

HệthốngđènLEDlàmột nguồn sáng chocây trồngđang đượcchúýđặcbiệttrong nhữngnăm gần đâyvìứngdụng rộngrãicủanótrongthương mại

Công nghệ chiếu sáng bằng chất rắn (Solid - state lighting) dựa vàoviệc sử dụng đènLEDlà một trong những tiến bộ lớn nhất trong lĩnh vực chiếusáng nhân tạo cho cây trồng đã được ứng dụng trong vài thập kỷ gần đây.LED có rất nhiều ứng dụng như: nghiên cứu điều khiển môi trường, chiếusáng trong nuôi cấy mô, chiếu sáng bổ sung và chiếu sáng theo quang chu kỳtrong nhà kính (greenhouse)[5]

Tạ Thế Hùng và Lê Tất Khương đã đưa ra đề xuất nghiên cứu ứng dụngđèn LED vào sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở Đà Lạt và vùng phụ cậnnhư sau:

- Nghiên cứu phát triển các dạng đèn LED hiệu quả cao và ứng dụngtrong sản xuất rau, hoa, quả

+ Phát triển các dạng đèn LED tiết kiệm năng lượng, hiệu quả cao tiếntới thay thế dần các dạng đèn truyền thống

+ Nghiên cứu ứng dụng đèn LED điều khiển nở hoa

+ Nghiên cứu ứng dụng đèn LED sản xuất một số loại rau, quả có giátrị kinh tếcao

- Nghiên cứu ứng dụng đèn LED sản xuất các cây dược liệu có giá trịkinh tế cao (sâm Ngọc Linh, sâm HànQuốc )

- Nghiên cứu ứng dụng đèn LED trong ngành nuôi cấymô[5]

Tuy nhiên các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấymôhiện naychủ yếu tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quátrình phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của thực vật nuôi cấy

mà chưa đi sâu tìm hiểu vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống, đặc biệt lànguồn chiếu sáng từ đènLED

Hiện nay ở nước ta chưa có cơ sở nào nghiên cứu một cách hệ thốngtác động của đèn chiếu sáng LED đến sự sinh trưởng của cây trồng, so sánh

ưu nhược điểm của việc sử dụng đèn chiếu sáng LED để thay thế các đènchiếu sáng khác như đèn sợi đốt, đèn huỳnh quang đặc biệt là so sánhvềtácđộng tăng trưởng cây trồng và hiệu quả tiết kiệm điện năng khi sử dụng cácnguồn sáng nhân tạo khác nhau Vì vậy nghiên cứuứngdụng công nghệ chiếu

sáng LED trong nuôi cấyin vitrolà một hướng nghiên cứu có giá trị khoa học

và công nghệ cao, có ý nghĩa thực tiễn rất to lớn đối với công nghệ vi nhângiống ở nước ta Đây là hướng nghiên cứu liên nghành, cần có sự phối hợpchặt chẽ của các nhà sinh học, nông nghiệp, vật lý và công nghệcao

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀTÀI

2.1.1 Địa điểm tiến hành đềtài

Trong đề tài này, các thí nghiệm xây dựng quy trình nhân giốngin vitrolan kim tuyến thông qua PLBs và các thí nghiệm nuôi lan kim tuyếnin vitrodưới đèn LED được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam

Thu thập và xử lý các số liệu về hệ số nhân chồi, chiều cao cây, sốrễ/cây, số lá/cây được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, ViệnCông nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Xử lý các số liệu về diện tích lá, thành phần diệp lục của câyin vitrođược thực hiện tại Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao

công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà nội2

2.1.2 Thời gian tiến hành đềtài

Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2014 đến tháng 12/2014

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊNCỨU

2.2.1 Vật liệu thựcvật

Nguồn mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu cây lan

kim tuyếnin vitrođã được phân loại thuộc loàiAnoectochilus setaceusBlume

do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy

2.2.2.1 Môi trường nuôi cấy cơbản

Môi trường cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm là môi trườngKnudson C bao gồm các muối đa lượng, vi lượng theo Knudson 1946 vàđược Morel cải tiến (1965)+ 100 ml/L nước dừa + 100 ml/L dịch chiếtkhoai

tây + 10-30 g/L saccaroza Bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như kinetin,2,4-D, GA3…tùy theo từng giai đoạn nuôi cấy Tất cả các môi trường nuôi cấylan kim tuyến đều có pH = 5,5

2.2.2.2 Điều kiện nuôicấy

Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống loài lan kim tuyến

(AnoectochilussetaceusBlume) thông qua cảm ứng tạo PLBs được thực hiện

gồm 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm từ 2-7 nghiệm thức Tất cả các thí nghiệmđược nuôi cấy trong điều kiện giống nhau: nhiệt độ 22oC, chiếu sáng 16giờ/ngày bằng ánh sáng đèn huỳnh quang Thí nghiệm cảm ứng tạo PLBsđược nuôi cấy trong điều kiện lỏng, lắc 80 vòng/phút

Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy lan kim

tuyếninvitrođược thực hiện gồm 2 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm với 6 nghiệm

thức ánh sáng khác nhau Tất cả các thí nghiệm được nuôi cấy trong điều kiệngiống nhau: nhiệt độ phòng 27oC, chiếu sáng 16 giờ/ngày

2.2.2.3 Dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong thínghiệm

Nồi khử trùng, đũa khuấy, ống đong (100 ml, 250mlvà 1000 ml),phễu,dao cấy, kẹp cấy, bình thủy tinhthểtích250mlvà500ml,đèncồn,tủcấyvôtrùng,máyđopH,kínhhiểnvihuỳnhquang,micropipette,cân,máylắc

Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nước

“Nghiêncứu phát triển công nghệ chiếu sáng LED phục vụ nông nghiệp TâyNguyên” thuộc chương trình Tây Nguyên 3 “Khoa học và công nghệ phục

vụ phát triển kinh tế - xã hội vùng Tây Nguyên" Các thí nghiệm được tiếnhành có sử dụng trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm cấp nhà nước

về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

Hấp khử trùng

Tất cả các môi trường nuôi cấy và dụng cụ nuôi cấy được hấp khửtrùng ở nhiệt độ 117°C, áp suất 1 atm trong thời gian 15phút

2.2.3 Hệ thống ánh sáng

Các thí nghiệm1,2,3 được bố trí dưới ánh sáng đèn huỳnh quang

Các thí nghiệm 4,5 được bố trí dưới ánh sáng đèn LED và đèn huỳnhquang (đối chứng) Hệ thống đèn LED được bố trí ở các giàn riêng biệt,khoảng cách giữa đèn LED tới bề mặt đặt bình nuôi cấy là 30 cm Các giànđèn LED được sản xuất và lắp đặt bởi Trung tâm Công nghệ cao, Viện Hànlâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các giàn đèn được che kín xungquanh để các mẫu nuôi cấy chỉ chịu tác động ánh sáng từ mỗi giàn đèn củatừng thí nghiệm riêng biệt Hệ thống đèn được bố trí như bảng2.4

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

2.3.1 Nghiên cứukĩthuật nhân giống loài lan kim tuyến

(AnoectochilussetaceusBlume) thông qua cảm ứng tạo protocorm like

bodies(PLBs)

2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa

sinhtrưởng đến sự hình thành protocom like bodies(PLBs)

Theo Vũ Văn Vụ và cộng sự khi nuôi phôi vô tính, hai loại môi trườngkhác nhau có thể được sử dụng, môi trường thứ nhất thường phải có auxin,còn môi trường thứ hai không hoặc chứa auxin ở nồng độ thấp[17]

Trong thí nghiệm 1 chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetinlên khả năng cảm ứng hình thành PLBs lan kim tuyến- nguồn mẫu ban đầucho quy trình nhân nhanh lan kim tuyến thông qua PLBs

Chúng tôi nhận thấy, các mẫu thể chồi có khả năng cảm ứng tạo PLBstốt hơn khi nuôi cấy trong điều kiện lỏng, lắc Do đó, các thí nghiệm cảm ứngtạo PLBs được nuôi cấy trong điều kiện lỏng, lắc 80 vòng/phút, 16 giờ chiếusáng/ngày, ở nhiệt độ phòng 22oC

Chuẩn bị nguyên liệu: Cắt đốt thân dài 1-2 cm nuôi lắc trong môitrường Pr0 (hoặc Pr1,Pr2, Pr3, Pr4, Pr5, Pr6 tùy nghiệm thức) sau 30 ngày thìthu chồi