Phân lập, tuyển chọn, và tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter Xylnum H6, Chế tạo màng sinh học

ncamđoan MỤCLỤC 1.1.LịchsửnghiêncứuvềvikhuẩnAcetobacter.... 1.Thànhphầnmôitrường………...23Bảng2.2.Cáchsửlýmàng……….3 4 Bảng3.1.Quansátthờigiandặcđiểmmàngtạothành………..37Bảng3.2.Hàmlượngaxita

Kho¸luËntètnghiÖp ChuyªnnghµnhvisinhvËt

1

Hµ­néi­–­2008

ncamđoan

MỤCLỤC

1.1.LịchsửnghiêncứuvềvikhuẩnAcetobacter 7

1.2.PhânloạiAcetobacter 8

1.2.1.Cáctiêuchuẩnphânloạivikhuẩn 8

1.2.2.LượcsửphânloạiAcetobacter 9

1.3.ĐặcđiểmchungcủaAcetobacter 11

1.3.1.ĐặcđiểmkhuẩnlạcAcetobacter 13

1.3.2 ĐặcđiểmmàngvikhuẩnAcetobactertrênmôitrườnglỏng 13 1.3.3 NhucầudinhdưỡngcủachủngAcetobacter 14

1.3.4.ConđườngchuyểnhoáCacbon 14

1.3.5.ĐặcđiểmcủamộtsốloàivikhuẩnAcetobacter 15

1.4 Cơsởkhoahọccủaquátrìnhlênmenaxetic 18

1.5 Cácyếutốđiềukiệnvàmôitrườngảnhhưởng 19

1.6 Màngsinhhọc(Bacterialcellulose,Biocellulose–BC) 20

Chương2.Nguyênliệuvàphươngphápnghiêncứu 22 2.1.Đốitượng–hoáchất 22

2.1.1.Đốitượng 22

2.1.2.Thiếtbị-hoáchất 22

2.2.Phươngphápnghiêncứu 24

2.2.1.PhânlậpchủngvikhuẩnAcetobacter 24

2.2.2.TuyểnchọnAcetobacetrchomàng 25

2.2.3 TuyểnchọnvikhuẩnAcetobacterthuầnkhiết 25

2.2.4 PhânbiệtvikhuẩnbằngphươngphápnhuộmGram 26

2.2.5 Phươngphápxácđịnhkhảnăngtổnghợpaxit 27

2.2.6 Phươngphápxácđịnhsốlượngtếbàovikhuẩn 28

2.2.7.Phươngpháptuyểnchọncácchủng 28

2.2.8 Phươngphápxácđịnhsốlượngtếbàovikhuẩn 29

2.2.9 Phươngphápquyhoạchhoátoánhọcthựcnghiệm 29

2.2.10.Phươngpháptạovếtthươngởthỏ 33

Chương3.Kếtquảvàthảoluận 35 3.1.PhânlậpvàtuyểnchọnchủngvikhuẩnAcetobacter 35

3.2.Nghiêncứumộtsốđặctínhhìnhthái 39

3.2.1 QuansáthìnhdạngtếbàovikhuẩnAcetobacterxylinum 39

3.2.2 Khảosátkhảnăngtạoaxitaxeticcủavikhuẩn 39

3.2.3 Nghiêncứumộtsốđặctínhsinhhọccủachủng 42

3.2.4 KhảosátkhảnăngtạomàngcủavikhuẩnA.xylinum 43

3.3 NghiêncứuđộngtháisinhtrưởngpháttriểnA.xylinumH6 47

3.4 TốiưuhoámôitrườngdinhdưỡngchochủngvikhuẩnH6 51

3.4.1.Thiếtlậpmôhìnhtoánhọc 52

3.4.2.Tốiưuhoá 56

3.5.BướcđầudùngmàngBCtrịbỏngởthỏ 58

Chương4.Kếtluậnvàkiếnnghị 62 4.1.Kếtluận 62

4.2.Kiếnnghị 62

Bảng:

Bảng1.1.Nhữngđặcđiểmphânbiệt,sosánhAcetobacter……… 12Bảng2.

1.Thànhphầnmôitrường……… 23Bảng2.2.Cáchsửlýmàng……….3 4

Bảng3.1.Quansátthờigiandặcđiểmmàngtạothành……… 37Bảng3.2.Hàmlượngaxitaxeticcủamộtsốchủng………

40Bảng3.3.ĐặcđiểmsinhhoácủachủngvikhuẩnA.xylinum……… 42Bảng 3.4.KhảosátkhảnăngtạomàngcủavikhuẩnA.xylinum…………43

Bảng3.5.KhảosátkhảnăngtạomàngcủaH6……… 45Bảng3.6.Tươngquangiữanồngđộphaloãng……….48

Bảng3.7.Thờigiannuôicấyvàhàmlượngtếbào………

49Bảng3.8.Cácyếutốvàmứckhảosát………53Bảng3.9.Matrậnthựcnhiệm……….54Bảng3.10.Kiểmtrasựthíchứngcủamôhình……… 56Bảng3.11.Tốiưuhoámôitrường………57

Hình3.4.Đồthịbiểudiễnhàmlượngaxitaxetic……… 40H ìn h 3.5.VòngphângiảiCaCO3củavikhuẩnAcetobacterxylinum 41

Hình3.6.Màngmỏng,dịchnuôicấyđục……… 45Hình3.7.Màngmỏng,dịchnuôicấytrong………45

4 6 Hình3.9.MàngBCcủachủngH6 46Hình3.10.ĐồthịtươngquangiữasốlượngtếbàocủachủngH6 49Hình3.11.ĐồthịsinhtrưởngpháttriểncủachủngH6……… 50H ình3.12.Đồthịbiểudiễntỉlệlànhvếtthương 59Hình3.13.Vếtthươngsửdụngmàngtrịbỏng………

60H ì n h 3.14.VếtthươngsửdụngmàngBCtẩmdầumùusau9ngày……… 60H ì n

h 3.15.VếtthươngsửdụngmàngBCtẩm dầumùusau15ngày………61H ì n h 3.16.VếtthươngkhôngdùngmàngBC,bôidầumùusau15ngày… 61

Ngàynay,đốivớicácquốcgiatrênthếgiớicôngnghệsinhhọc(CNSH)khôngcònlàmộtnghànhmớimẻmàn ó đãt r ở thànhmộtnghànhkinhtếchủđạotrongsựpháttriểnkhoahọckĩthuậtvàcôngnghệ.LàmộtbộphậncủaCNSH,côngnghệvisinhđãvàđangngàycàngpháttriểnmạnhmẽvàngàycàngc ó nhữngứngdụngthiếtthựcv à o cuộcsống.Bằngviệcứngdụngcácquátrìnhlênmenvisinhvậtđãtạorachếphẩmgiúpchúngtatậndụngvàtiếtkiệmchiphítrongviệcgiảiquyếtn h i ề u vấnđềvídụnhưtrongnôngnghiệp,côngnghiệp,bảovệmôitrường Mộttrongcácchủngvikhuẩnđ ư ợ c s

ử dụngrộngrãinhấttrongcôngn g h ệ lênmenv i sinhl à v i khuẩnAcetobacter(còng

NhờvàomộtsốđặctínhlýhoávượttrộimàmàngBCngàynayđượcc o i nhưmộtn g u ồ n polymers i n h h ọ c mới,mộtnguồnnguyênliệucót i ề m n ă n g Hiệnnay,các n h à khoa họcđãt ì m rat h ê m mộtsốtínhnăngđặcbiệtc ủ a màngnhư:bámchắcvàobềmặtkhinướcbốchơilạicóthểdichuyyểnqua,ngăncảnđượcsựxâmnhậpcủavikhuẩn…[7],

[8].NhờđómàmàngB C đượcứ n g dụngtrongr ấ t nhiềuc á c lĩnhv ự c khácn h a u : côngnghệthựcp h ẩ m làmthạchdừalàđồăntrángmiệngkháphổbiến,trongcôngnghệsảnxuấtg i ấ y chấtlượngc a o, trongy họclàmmàngt h a y thếchoda tạmthờiởc ácbệnhn h â n bỏng,mộtl o ạ i màngsiêuthấm,trongk h o a họcv ậ t liệumới

vớiviệcsảnxuấtmicrochấtlượngcao,tácdụngtrongbảovệmôitrườngdos ả n xuấtraEM(EffectiveMicorgamisms) [11].

ỞViệtNamviệcnghiêncứu,sửdụngmàngBCmớichỉđượcquantâmtrongthờigiangầnđâyvàmớithuđượcnhữngkếtquảbướcđầu(dùngmàngđ ắ p lênvếtthươnghở,dùngmàngđắpmặtnạdưỡngdachophụnữ)[7],

[8].Việcnghiêncứur a mộtmôitrườngdinhdưỡngtốiư u nhấtc h o chủngvikhuẩnAc

etobacterxylinump h á t triển,chết ạ o màngsinhhọctrênquymôc ô n g nghiệpvẫnđ

nghiíncứulớpmăngnhầyxuấthiệntrínbềmặtbi a, rượuvangv ă đưađếnk ế t luận:

măngđ ó đượctạothănhdomộtloạitrực khuẩnmẵ n g gọitínlă Mycodermaaceti.

Cùngvớinhữngn gh ií n cứutrínvềvikhuẩnAcetobacter,câc nghiíncứu t i

ế p theocũngnhưnhữngnghiíncứusaun ă y đề u nhằmmụcđíchtìmh i ể u rõthímvătìmcâchcảithiệnquâtrìnhlínmengiấm.Từngbướcnghiínc ứ u nhữngứng d ụ n g m

ớic ủ a vikhuẩnAcetobacterb ằ n g c â c h phđnl ậ p câcchủngvikhuẩnthuầnkhiết,ng

hiíncứuc â c đ ặ c đ i ể m cấut ạ o , s i n h l ý , sinhhoâcủachúngđểtìmranhữngchủngtốtnhấtchotừngứngdụngdựatríncơsởlăcâctiíuchuẩnphđnloạiđêđượcđưara

1.2 PhđnloạiAcetobacter

1.2.1 CâctiíuchuẩnphđnloạivikhuẩnAcetobacter

ĐểphđnloạivikhuẩnAcetobactercómốtsốtiíuchuẩnphđnloại:

+Đặcđ i ể m p h đ n l ậ p : l ă n ơ i cưtrúcóliínquanđ ế n đ i ề u k i ệ n môitrườngsống

+Đặcđiểmhìnhthâi:hìnhdạngtếbăo,câchsắpxếptếbăo,khảnăngdiđộng,vỏnhầy,măusắckhitếbăonhuộmGram…

+Đặcđiểmnuôicấy:dựavăotrạngthâi,đặcđiểm,đặctính(trơn,xùxì…),t í

n h chất(đục,trong…),măus ắ c …

c ủ a v ế t mọc(khuẩnl ạ c ) trínmôitrườngthạch.Khinuôicấytrínmôitrườnglỏngcầnlưuýđếnsựbiếnđổicủamôitrườngsaumộtthờigiannuôic ấ y (môitrườngđụch a y trong,cómùit h ơ m haykhôngmùi,cómăuvăngnđuhayvăngnhạt)

- Khảnăngoxihoáglucozơthànhaxitgluconic

- Khản ă n g sửdụngmuốiamonlàmnguồnnitơtrongmôitrườngHoyervàsửdụngrượuetyliclàmnguồncacbon

x e t i c thành4nhómdựatrên2dấuhiệusau:

- Mộtlà:khản ă n g sửdụngđạmamoniđểthựch i ệ n q u á trìnhs i n h trưởngvàpháttriểncủamình

- Hailà:cóhaykhônggiaiđoạndiđộngtrongquátrìnhpháttriển

Dựavàonơisốngđặctrưngcủavikhuẩnaxeticmànăm1926,Henebergđãchiachúngthành4nhómkhácnhau:

- Nhóm1:v i khuẩnkhôngp h á t triểntrênb i a vìh o a hublonđ ộ c v ớ i chúng

Chođếnnay,kh oá phânloạicủaBergey vànhiềutácgiả khácxếpvikhuẩn

Acetobacterv à vikhuẩnGlucobacterthuộcvàomộth ọ riêngt ê n l à : Acetobacteriac

úngthànhcácnhóm độclậpvàthuđượcmộtsốkếtquả

Bảng1.1.Nhữngđặcđiểmphânbiệt,sosánhAcetobacter,Gluc

onobactervớiPseudomonas

Đặcđiểmsosánh Gluconobacte Acetobacter Pseudomonas

300C,c ó khản ă n g oxih o á r ư ợ u etylict h à n h axitaxetic,k h ả năngoxihoáhoàntoàncáchợpchấthữucơ(cácloạiđườngvàdẫnxuấtcủac h ú n g ) đểtạothànhcáchợpchấtxetonhoặccácaxithữucơtươngứng

1.3.1 ĐặcđiểmkhuẩnlạcAcetobacter

Khinghiêncứuvềkhuẩnlạccủavikhuẩnaxetictrênmôitrườngđặc,ngườitathấyrằng:khuẩnlạcđềuđặn,đườngkínhkhuẩnlạctrungbình3mmriêng1sốloàinh

ư:Acetobacteraceti,Acetobacterxylinumcókhuẩnlạcnhỏhơnđườngkínhd=1mm,

bềmặttrơnbóng,phầngiữakhuẩnlạclồilêndàyvàsẫmmàuhơnxungquanh

Nhưngmộtsốloàikhácthìkhuẩnlạccóđườngkínhnhỏhơn(d=4-5mm),bềmặttrơnnhẵnkhôngmàu,mỏngnhưhạtsươngnhỏ,cóthểdùngquenuôicấytáchrakhỏimôitrườngdễdàng.Tuynhiêncũngcónhữngkhuẩnlạcă n sâuvàomôitrường,khócóthểgạtrabằngquenuôicấy

1.3.2 ĐặcđiểmmàngcủavikhuẩnAcetobactertrênmôitrườnglỏng

Ởmôitrườnglỏngv i khuẩnAcetobacterc ó sựhìnhthànhmàngtrênmặtthoáng

,màngtạothànhcóđộdàymỏngkhácnhauvàđặcđiểmcủacácl o ạ i màngcũngkhácnhau

Cól o ạ i màngdàyn h ư sứa,nhẵnv à trơnbóng,khilắcnhẹsẽc h ì m xuốngđáybìnhvàcóthểtiếptụchìnhthành1lớpmàngmới

Cóloạimàngmỏngnhưtờgiấycelophen,dai,nhẵn,khilắccũngchìmxuốngđáybìnhvàhìnhthànhnên1lớpmàngmới,dịchnuôicấytrongvàcómùithơmdễchịu.Khinghiêncứumàngnàythấycónhiềusợicellulosegiốngnhưsợibông,chắck h o ẻ đ

ượcđ a n kếtv ớ i nhaubởichínhc á c vikhuẩnAcetobactertạonênđộdẻodai,độđàn

hồitốtvàtínhchắckhoẻcủamàng

Cónhữngmànglạirấtmỏng,dễvỡ, khôngnhẵnmàn h ă n nheo,bámt h e o thànhbình,d ị c h nuôicấyt h ư ờ n g cómàuv à n g nâu,khôngtrongvakhôngcómùithơmdễchịu

Mộtsốloàivikhuẩncókhảnăngtựtổnghợppolysaccaritphântửlớnnhưcellulose,dextran…

(Acetobacterxylium,Acetobacteraceti,Acetobacterkiitzingianum…).Điểnhìnhlà vikhuẩnAcetobacterxylinumcóthểtổnghợpđ ư ợ c nhữngsợicellulosegiốngnhưnh

ữngsợibông

1.3.4.Conđườngchuyểnhoácacbon

NghiêncứuvềkhảnăngchuyểnhóaCcáctácgiảđãđiđếnkếtluận:vikhuẩnaxeticcóthểoxihóacácbontheonhữngconđườngsau:

+Conđườngthứnhất:khôngcósựphotphorilhóacơchấtvàsựthamgiacủacácenzymđặchiệu

+Conđườngthứh a i : oxyhóacơc h ấ t đãđ ượ c photphorilh ó a trongconđư

ờngpentozophotphat

+Conđườngthứba:Entner–Doudoroff(ED).

+Conđườngthứtư:chutrìnhKrebshoặcGlyoxinat

1.3.5 ĐặcđiểmmộtsốloàivikhuẩnAcetobacter

1.3.5.1 Acetobacteraceti

Trựckh uẩn ngắn,kíchthước0, 4–0 , 8 x1 –

1, 2 m,khôngdiđộngđược,thườngx ế p thànhchuỗidài,bắtmàuGramâm,màuvàngvớithuốcn h u ộ m iot.Khuẩnlạcto,sángtrêngelatinvớidịchlênmenchứa10%đườngsaccarozơtạothànhmàngnhầy,nhẵn.Chúngcókhảnăngpháttriểntrênmôitrườngcónồngđ ộ rượucao(11% ) vàcóthểt í c h luỹđế n6 % axita x e t i c trongmôitrường.Chúngthườngpháttriểntrênmôitrườngbia vớinhiệtđột h í c h hợplà300C

1.3.5.2 Acetobacterxylinum

Trựckhuẩnhìnhque,k í c h thướckhoảng2m,tếbàođứngriêngrẽhoặcxếpthànhtừngchuỗi,khôngdiđộngđược,thuộcnhómvikhuẩnGramâm,cáctếbàođượcbaobởichấtnhầytạovángnhănvàdàykhigặpH2SO4vàthuốcn h u ộ m iốts ẽ bắ tmàux a n h (dop hả n ứngc ủ a cellulose),chúngcóthểtíchluỹ4,5%axitaxetictrongmôitrường

1.3.5.4 Acetobacteracetosum

Trựckhuẩncókíchthước0, 4–

0,8x1m.Cáctếbàoxếpriêngrẽthànhtừngchuỗi,khôngdiđộngđược.Nhiệtđ ộ thíchhợpnhấtchochúngpháttriểnlà300C–360C

1.3.5.5 Acetobacterkiitzingianum

Cómàngnhày,n h ẵ n ởmépv à đượcnângcaolênthànhbình.Tếbàod ạ n g trựckhuẩn,ngắn,to,thô,khôngdiđộng.KhuẩnlạctrênGelatinvớidịchl ê n mennhớt,nhỏ,tạothànhmàngx ế p nếpt r ê n môit r ư ờ n g ẩm.Thíchhợppháttriểnở300C

1.3.5.6 Acetobactershiitzenbacchii

Trựckhuẩnk h á dài,k í c h thướckhoảng0 , 3 – 0 , 4 x 1 , 0 –

3,6m,thườngxếpđôihoặcđứngriêngrẽ,cóthểtạovángnhầyvàkhôngbềnvững.C

ó khảnăngtíchluỹtrongmôitrườngđến11,5%axitaxetic,dođóthườngđ ư ợ c sửdụngđểchưyểnhoárượuthànhgiấmtheophươngphápĐức(phươngphápnhanh)

1.3.5.7 Acetobacterlindreni

Trựckhuẩn

xếpriêngrẽtạochuỗi,thỉnhthoảngcótếbàophồngtohìnhc ầ u , k hô ng diđộng.Khuẩnlạctrêngelatinv ớ i dịchlênmentròn,nhỏ,màuv à n g , trênmôitrườnglỏngt ạ o vángmàun â u , nhớt.Thíchhợppháttriểnở 250C

1.3.5.8 Acetobacterorleanense

Trựckhuẩndàitrungbình,khôngdiđộng,gặpđiềukiệnnhiệtđộcaocóthểsinhratếbàodịhìnhkéodàihoặcphìnhto.Tạovángvikhuẩnrấtdàytrênmôitrườnglỏng.Cóthểpháttriểntrongmôitrườngcónồngđộrượucao

(10%-12%)vàtíchluỹđến9,5%axitaxetic.Thườngđượcdùngđểchuyểnhoárượuvangthànhg i ấ m theophươngphápPháp(phươngphápc h ậ m hayphươngphápOrleans).Thíchhợppháttriểnở250C–300C

1.3.5.9 Acetobactersuboxydans

Cód ạ n g hìnhquen g ắ n , đứngriêngrẽhoặcxếpthànhchuỗingắn,khôngcókhảnăngdiđộng,tạothànhnhữngvángmỏng,dễvỡ.Cókhảnăngchuyểnh o á glucozơthànhaxitgluconic,o x y hoárượusobitthànhsocboza

sauđóchuyểnthànhmàunâu.Khuẩnlạctrênthạchvớidịchlênmentròn,màutrắngsữa,vềsauphầngiữakhuẩnlạchoánâu,phíangoàimàuv à n g n h ạ t Cókhảnăngt ạ o thànhaxitgluconic.Nhiệtđ ộ thíchh ợ p chosựpháttriểnlàtừ300C–350C

1.3.5.11 Acetobacterascendens

Trựckhuẩnkhôngd i động,cáck h u ẩ n l ạ c trênglucozơ,genlatinkhôtrắngvớivànhsángc h ó i Trênmôitrườnglỏngt ạ o thànhmàngnhầychắc,n â n g lêntheothànhbình.Thíchhợppháttriểnở250C

bảnchấtcelluloset r ê n b ề mặtmôitrườngnuôicấy.V ớ i nhữngnghiêncứuh i ệ n naychothấylớpmàngnàycóthểđượcứngdụngvàorấtnhiềunghànhquantrọngc ó ý n

g h ĩ a thựctiễntrongcuộcsống.Đồngthờik h ả năngt ạ o màngcủacácchủngvikhuẩntrênrấtkhácnhauvìvậycầnphảituyểnchọnranhữngchủngv i k h u ẩ n cók h ả n ă n g

VikhuẩnAcetobacterl à loạiv i khuẩnưaấm,n h i ệ t đột h í c h h ợ p là2 50C–

320C,sốnghiếukhídovậycầncungcấpmộtlượnglớnoxichoquátrìnhlênmen.Theonghiêncứungườitathấyrằng:đểoxihoá1molrượucầnsửdụngđến1molO2nhưngtrongthựctếlượngO2c ầ nphảidùnggấpđôi

Đểquátrìnhlênmentiếnhànhnhanhhơntrongdịchlênmencầncungc ấ p thêmmộtsốchấtnhư:rượuetylic,axitaxetic,cácchấtkhoáng,cácmuối(NH4)2SO4,MgS

O4.7H2O,CaH2PO4,FeCl3…,vitaminv à mộts ố chấtk í c h t h í c h khácnhư:peptôn,caonấmmen,caothịt,nướcsốtcàchua…

1.6 Màngsinhhọc(Bacterialcellulose,Biocellulose-BC)

MàngB C cót h ể đượctổnghợpt ừ n h i ề u n h ó m v ikhuẩnn h ư : Pseudomon

as,Azotobacter,Argrobacterium,Acetobacter…

nhưngchỉv ớ i vikhuẩnAcetobacterxyliumcellulosemớiđượctổngh ợ p mạnh.Bảnc hấtc ủ a màngBClàsựkếthợpgiữacellulosevàtếbàovikhuẩnAcetobacterxylinum.C

ellulozơnàyđượchìnhthànhtừrấtnhiềusợinhỏ,cácsợinàyđượckếthợpvớinhaudựatrênliênkếthidrovàlựcvandecvandovậycácsợinhỏliênkếtvớinhaurấtchặt,mộtphầnquyđịnhtínhchấtcủamàngBC

SovớicellulosecủatếbàothựcvậtthìcellulosecótrongBCcócùngc ô n g thứchoáhọc(làmộtloạipolysaccaritcaophântử,cócấutrúcbềnvững,đ ư ợc cấut ạ o từrấ

tn h i ề u đơnphânl à cácg ố c1,4glucozit.Mỗicellulosethườngchứakhoảngtừ140–1000gốcglucozơ)[12].Tuynhiên,doquátrình

tổnghợpcellulosekhácnhaunênchúngcós ự khácbiệtv ề tínhchấtlýhoá như:độbềncơhọc,khảnăngpolymerhoá,độtinhsạch…

ưuviệthơnhẳntếb à o thựcvật.RiêngtínhđànhồivàđộbềncơhọccủacellulosetrongmàngBCđãđượcsosánhtươngđươngvớinhôm

Nhờnhưngt h u ộ c t í n h đặcb i ệ t trênmàmàngB C đượcs ử dụngrấtnhiềuởcácnước pháttriển,ứngdụngrộngrãitrongcáclĩnhvựcnhư:thựcphẩm,côngnghiệp,nôngnghiệp,bảovệmôitrường,côngnghệvậtliệumới

vàđặcbiệtvớiyhọc,màngBCởcácnướctrênthếgiớiđượcnghiêncứuvàứngdụngtrongtrịbỏng,làmmặtnạdưỡngda…

ỞV i ệ t Nam,t ừ nhữngn ă m 2000nhómnghiên cứuHuỳnhT h ị NgọcL a nvàcộngsự,bộmônvisinh,khoaDuợccủaĐạihọcYDuợcThànhPhốHồChíMinhđã

cómộtc ô n g trìnhnghiêncứuv ề màngB C từAcetobacterxylium.Bướcđầunghiênc

ứuđượcmộtsốcáctínhchấtđặcbiệtcủamàngBCnhư:k h ả năngt h ấ m h ú t tốt,đ ộ thôngthoángcao,cók h ả năngngăncảnv i khuẩnxâmnhập…

đểlàcơsởchoviệcchếtạomàngsinhhọcdùngtrongtrịbỏngởViệtNam.Đặcbiệt,vớinhữngtínhchấtquýcủamàngBCđãvàđangh ứ a hẹnnhữngứngdụngtrongy họcvàcôngnghiệpmỹphẩm,đ ư ợ c coilàmộtvậtliệupolymercótriểnvọng

2.Từcácch ủ n g phânl ậ p đượctuyểnc h ọ n c á c chủngchomàngdai,mỏng,trong.

v à mộts ố d ụ n g c ụ h o á sinhthôngdụngkhác

2.1.2.2 Hoáchất

Cácloạihoáchấtthôngdụng:glucozơ,axitaxetic,rượuetylic,pepton,c a o nấmmen,caothịt,agar– agar,NaOH,MgSO4.7H2O,KH2PO4,

(NH4)2SO4,CaCO3,thuốcnhuộmtímgentian,d u n g dịchfucshin,dungd ị c h lugol

…đượcmuatừTrungQuốchoặcsảnxuấttạiViệtNam

Nướcdừanguyênchất,nướcmíaépnguyênchất,nướcdừa,dầumùu(muatừviệnbỏngQuốcgia).

trên9mlnướccấtbằngpipetvôtrùng.Sauđó,dùngpipetvôtrùnghút1mldịchtừốngnghiệmđựngmẫumànggốcchovàoốngnghiệmt h ứ nhất,đậynútbôngvàlắc đềuốn

)vàohộppetridẫchuẩnbịtrên.Dùngbàntrangthuỷ

tinhtrangmộtlầnkhắpmặtthạch.Baogóicẩnthậnvàcấttrongtủấm ở28oC

-30oC.Sau3–

4ngàytrênmôitrườngthạchcóxuấthiệncáckhuẩnlạcriêngr ẽ Dựavàođặcđiểmcủakhuẩnlạcnhư:kíchthước,màusắc,độtrơnbóngmàtasosánh,đốichiếumàchọnr

akhuẩnlạccủavikhuẩnAcetobacter.

2.2.2 Tuyểnchọnc h ủ n g Acetobacterc h o màngcelluloset h e o phươngp h

á p Graxinop[1],[2],[3]

Trướckhituyểnchọncầnnhângiốngcácchủngvikhuẩnbằngcách:dùngquecấyđầutròn(đãkhửtrùngtrênngọnlửađèncồn)gợtlấymộtkhuẩnl ạ c riêngrẽ,đủtiêuchuẩncấyvàomộtốngnghiệmđãđượcđổthạch(MT2,đ ặ t nghiêng,đểnguội)theođườngziczac.Đánhd ấ u c á c ố n g n g h i ệ m b ằ n g mộtkíhiệuriêng,đểtrongtủấmở2

+RửasạchlamkínhbằngNaOHsauđórửsạchHClhoặcH2SO4,rửalạ i bằngcồn,nướccấtvàlaukhô

+Nhỏmộtgiọtnướcv ô trùnglênlamkính,dùngq u e c ấ y khửtrùngtrênngọnl ử a đèncồn,đểnguội,lấymộtí t màng(hoặcdịchnuôicấyhoặcgiốngvikhuẩn)hoàvàocùnggiọtnướcđó,hơquatrênngọnlửađèncồnđểc ố địnhmẫu(chúý:mẫucáchngọnlửađèncồnkhoảng10đến15cmlàhợpl ý )

không

c ó khảnăngbắtmàunàynêndễbịrửatrôibởicồn.ChỉkhinhỏFucshinvikhuẩnGr-mớibắtmàuhồngcủaFucshin

2.2.5 Phươngphápx ác địnhkhảnăngtổ ng hợpax it aceticb ằ n g chuẩnđộvới NaOH0,1NcóPhenolphtaleinlàmchỉthị(phươngphápTherne)[ 4]

Đểxácđịnhlượngaxittạothànhtrongquátrìnhnuôicấychúngtôitiếnh à n h chuẩnđộbằngNaOH0 , 1 N cóPhenolphtalein.H à m l ư ợ n g axita x e t i c t ạ o thànhđượcxácđịnhtheocôngthức:

XV .K .10010 (g/ml)

Trongđó: Xlàsốgamaxetictrong100mldungdịchlênmen

VlàsốmlNaOH0,1Nsửdụng

K=0,006làlượngaxitaxetictươngứngvới1mlNaOH0,1N

2.2.6 Phươngphápxácđịnhsốlượngtếbào[6]

Lấy1mldịchhuyềnphùcóchứavikhuẩn24giờnuôicấy,phaloãngt h e o phươngphápp h a loãnggiớihạnrồidùngmicropipethút0 , 1 mlp h a loãngrồitrangđềutrênmôitrườngthạchđĩa.Nuôiở300Ctrong2ngàyđếmsốkhuẩnlạc(CFU)trongmôitrườngđĩapetri,từđóxácđịnhsốlượngtếbàovikhuẩntrong1mldịchnuôicấybanđầutheocôngthức

Phaloãnghuyềnphùvikhuẩntheonhiềunồngđộkhácnhau,chúngtôil ự a chọnnồngđộ10-4–10-

7để

tiếnhànhcácnghiêncứutiếptheo.Mộtphầnhuyềnphùởnồngđộnàychúngtôiđemphânlậpởcáchộppetriđểđếmsốlượngkhuẩnlạc.Đồngthời,mộtphầnkhácđ e mđoO D bướcsóng6 1 0 n m (OD610),tiếnhànhlặplại3lần.SaukhiđãđếmđượcsốlượngkhuẩnlạcquaphânlậpvàđođượcgiátrịOD610,chúngtôithiếtlậpmốitươngquangiữagiát r ị OD610v ớ isốlượngtếbàovikhuẩntươngứngvớicácnồngđộkhácnhau

+B ư ớ c 2 : D ự a v à o đ ồ t h ị , đ ã x á c địnhgiátrịOD610sẽtínhđượcs ố lượngtếbàotrongdịchnghiêncứucùngnồngđộởthờiđiểmkhácnhau

2.2.9 Phươngphápquyhọachhoátoánhọcthựcnghiệm(phươngphápBox– Wilson)[4],[8],[9]

PhươngphápBox-Wilsonlàphươngphápdẫndắtcácyếutốđếnvùngtố i ưukhicácbiếnsốthayđổicùngmộtlúctheongônngữtoánhọc.Phươngphápn à y c h o phépx á c địnhthànhphầnmôitrườngvàđiềukiệnnuôicấy,

(2)Trongđó: klàsốlầnlặplạicủathínghiệm.