Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)

Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban, Họ hoa tán Apiaceae) (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO

TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM

DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY

RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN

Công trình được hoàn thành tại:

Viện Hoá học Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS TSKH Trần Văn Sung

Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 TS Trần Văn Lộc

Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Số

18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội

Vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu Luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

Trong số các hợp chất thiên nhiên, hợp chất triterpene có khung ursane như nhóm ursolic acid và các dẫn xuất của ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên ngày càng được quan tâm nghiên cứu về mặt hoá học và dược lý học Trong đó hoạt tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, cũng như với tế bào bạch cầu lympho P-388 và L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB và khả năng ức chế phát triển khối u trên da chuột đã được khẳng định

Trong quá trình tìm hiểu về các cây thuốc cổ truyền Việt nam, chúng tôi thấy

cây rau má có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán

(Apiaceae) có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane như là asiatic acid, asiaticosid, madecassic acid, madecassoside… với hàm lượng khá cao có hoạt tính độc với tế bào ung thư Để tận dụng nguồn nguyên liệu này và góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các chất mới có hoạt tính cao, chúng tôi đặt mục đích sử dụng các triterpene tách được từ cây rau má để chuyển hóa chúng tạo thành các dãy dẫn xuất mới và thăm dò hoạt tính kháng ung thư của các chất thu được

Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, chuyển

hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má

[Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)”

2 Nhiệm vụ của luận án

1 Nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây rau má

Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam

2 Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập được

từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng

3 Thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tương quan cấu trúc – hoạt tính của chúng

3 Những đóng góp mới của luận án

 Đã tiến hành định lượng hai hợp chất triterpene chính là asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), tỉnh Nam Định và

thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp sắc ký cột và phương pháp HPLC Kết quả cho thấy hàm lượng của hai triterpene trên trong mẫu rau má Sơn Tây là cao nhất: asiatic acid là 0,72%, madecassic acid là 0,89% so với nguyên liệu khô Mẫu rau má này được lựa chọn làm nguyên liệu để chiết suất asiatic và madecassic acid phục vụ cho các chuyển hóa hóa học

 Đã đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của asiatic acid chiết tách từ cây rau má trên

mô hình gây độc gan chuột bằng paracetamol Kết quả cho thấy asiatic acid có hoạt tính bảo vệ gan có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng

 Đã tổng hợp 29 dẫn xuất của asiatic acid bằng biến đổi hóa học tạo amide ở vị trí C-28, và chuyển hóa các nhóm hydroxy ở vị trí C-2, C-3, C-23 Trong số các chất tổng hợp được có 25 hợp chất mới, chưa được công bố trong tài liệu

 Từ madecassic acid đã tổng hợp được 17 dẫn xuất mới thông qua việc tạo ra các amide ở vị trí C-28 và acetyl hóa các nhóm hydroxy ở C-2, C-3 và C-23 của madecassic acid

 Các hợp chất được tổng hợp (28 dẫn xuất của asiatic acid và 14 dẫn xuất của madecassic), được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ưng thư:

KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) và Lu-1 (ung thư phổi) Hầu hết dẫn xuất tổng hợp đều có hoạt tính cao hơn chất đầu Có nhiều chất có hoạt tính cao hơn chất đầu từ 60 đến gần 100 lần trên cả ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm Kết quả này hứa hẹn khả năng tìm ra chất mới có hoạt tính kháng ung thư cao, góp phần phát triển ngành hóa dược

 Đã rút ra được kết luận về mối tương quan Hoạt tính-Cấu trúc của các dẫn xuất của asiatic acid và madecassic acid Amide hoá nhóm 28-COOH làm tăng hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng ung thư thử nghiệm, và acetyl hóa nhóm 2-OH, 3-

OH và 23-OH cũng làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Bố cục của luận án

Luận án gồm 136 trang gồm: Mở đầu (1 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang), Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (3 trang), Chương 3: Thực nghiệm (38 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (46 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Danh mục các công trình đã công bố (1 trang)

Phần tài liệu tham khảo có 124 tài liệu về lĩnh vực liên quan đến luận án, được cập nhật đến năm 2017

Phần phụ lục gồm 149 trang gồm các loại phổ của các chất phân lập từ cây rau

má, các dẫn xuất tổng hợp được, nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một

số dẫn xuất tổng hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử), kết quả thử hoạt tính độc tế bào của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất của chúng

1.2 Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene

glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.)Urban

1.3 Hoạt tính sinh học của cây rau má

1.4 Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất 1.5 Một số chuyển hóa của asiatic acid

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Các phương pháp chiết xuất và phân lập chất

Phối hợp các phương pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) trên các loại pha tĩnh khác nhau như silica gel pha thường, sephadex LH-20…

2.2 Các phương pháp phổ

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được thiết lập dựa trên các dữ kiện phổ (IR, ESI-MS, 1D-, 2D-NMR), cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo

2.3 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ

Các phương pháp tổng hợp hữu cơ đã được sử dụng bao gồm:

Phản ứng acetyl hóa nhóm hydroxyl với anhydride và pyridine ở nhiệt độ phòng

Nhóm caboxylic được chuyển hóa thành acid chlorid với oxalyl chloride trong dung môi DCM

Phản ứng amide hóa acid chlorid bằng cách thêm các amin tương ứng và triethylamin (TEA) khuấy ở nhiệt độ phòng trong 20 giờ

Acetyl hóa các amino hoặc OH mạch nhánh của amide thu được bằng acetyl chloride (AcCl) và xúc tác DMAP

Thủy phân để loại bỏ các nhóm chức acetyl bằng KOH 4% trong MeOH Tạo acetonide ở vị trí 3-OH và 23-OH của asiatic acid bằng phản ứng với 2,2-dimethoxypropane, TsOH.H2O trong DMF để bảo vệ nhóm 3-OH và 23-OH, sau

đó thực hiện các phản ứng este hóa ở nhóm 2-OH, loại bỏ nhóm bảo vệ ở vị trí

3-OH và 23-3-OH bằng phản ứng thủy phân trong acid HCl ở 90 oC

2.4 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium) Giá trị thể hiện hoạt tính là IC50

(3-(4,5-(nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào) Phép thử được thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học

2.5 Phương pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm

Hoạt tính bảo vệ gan được thử nghiệm (in vivo) tại Phòng thí nghiệm thử hoạt

tính Sinh học (Viện Hóa học) kết hợp với Phòng thử nghiệm Sinh học (Viện Công nghệ Sinh học) theo mô hình chuột BALB/c gây độc gan bằng paracetamol thông qua việc nghiên cứu sự thay đổi của các chỉ số AST và ALT của các enzyme chức năng gan, khối lượng gan, và hàm lượng MDA (malon dialdehyde) trong gan

2.6 Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp được trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử)

Trong luận án này chúng tôi đã hợp tác với nhóm nghiên cứu của PGS.TS Lê Thị Lý để thực hiện các nghiên cứu docking phân tử 20 dẫn xuất của asiatic acid

và 14 dẫn xuất của madecassic acid tổng hợp được trên hai loại enzyme trên

Chương 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Nguyên liệu

Mẫu cây rau má Centella asiatica dùng trong nghiên cứu này được thu hái

tại Sơn Tây (Hà Nội) và tỉnh Nam Định vào tháng tư năm 2010, các mẫu rau má Thành phố Hồ Chí Minh được thu thập tháng 5 năm 2013 Tên cây do ThS sinh học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội xác định tên khoa học Các tiêu bản CRM1, CRM2 và CRM3 được lưu giữ tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học

3.2 Phân lập chất

3.2.1 Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu hái tại thành phố

Hồ Chí Minh

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C asiatica (L.) Urban] thu hái

tại Thành phố Hồ Chí Minh

Các số liệu phổ của các chất phân lập được trình bày ở phần 3.2.1.2

3.2.2 Nghiên cứu định lượng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ

Hàm lượng asiatic acid và madecassic acid được định lượng bằng phương pháp HPLC và phương pháp sắc ký cột để so sánh đối với ba mẫu cây rau má thu tại Sơn Tây (Hà Nội), Nam Định và Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2.1 Xác định hàm lượng asiatic acid bằng phương pháp HPLC

3.2.2.2 Xác định hàm lượng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi asiatic acid và madecassic acid

3.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

3.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn

1200g RMHCM

n- Hexane,

3×5L, 2h/ lần

Cao chiết n-Hexane, 29g

Bã

CH2Cl2 , siêu âm 3×4L, 2h/ lần

Bã

n- BuOH, siêu âm

3×3L, 2h/ lần

Cao chiết n-BuOH, 50g

Silica gel

CH2Cl2/MeOH 95:5-70:30

168 mg

Hỗn hợp stigmasterol

glucoside và

β-sitosterol glucoside (144)

Madecassoside (14)

Bã Cao chiết

CH2Cl2 , 33g

3.2.3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết

3.2.4 Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica

(L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất

3.3 Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid

3.3.1 Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid

3.3.2 Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid

3.4 Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp được

3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro

3.4.2 Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo)

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập chất

4.1.1 Thành phần hóa học của cây rau má thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh

Từ cao chiết n-BuOH của rau má RMHCM, theo phương pháp phân lập được

Sơ đồ 3.1, có 6 hợp chất đã được phân lập gồm: Stigmasterol, β-Sitosterol, asiatic acid, madecassic acid, Hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside

% trong mẫu khô

% diện tích pic

% trong mẫu khô

% diện tích pic

% trong mẫu khô Asiatic acid 33,81 0,718 30,49 0,615 28,92 0,241 Madecassic

4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng asiatic acid và madecassic acid 4.3 Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid

4.3.1 Chuyển hóa của asiatic acid

4.3.1.1 Chuyển hóa hóa học của nhóm COOH vị trí C-28

Như trong sơ đồ 4.1, asiatic acid được chuyển hóa thành các dẫn xuất amide bằng phản ứng với các hợp chất amin bậc 1 và bậc 2 khác nhau

Sơ đồ 4.1: Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid

Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH 3 CO) 2 O, pyridine, rt., 12 h, 80%, b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) RNH2, DCM, rt, 24 h, (75-92%), d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%, e) KOH, MeOH, rt, 16 h, 72-80%, f) acetyl chloride, DMAP, rt, 85%

Trong dãy phản ứng chuyển hóa asiatic acid (1) thành các amide, các nhóm

OH vòng A trước hết được bảo vệ với nhóm acetyl Asiatic acid được xử lý với

acetic anhydride trong pyridine tạo thành asiatic acid triacetate (145) với hiệu suất 80% Cấu trúc của hợp chất 145 được khẳng định qua phân tích phổ IR, ESI-MS

và 1D-NMR Phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 145 cho thấy ngoài các tín hiệu tương ứng của hợp chất 1 đã xuất hiện 3 tín hiệu của 3 nhóm acetyl CH3 tại H

(ppm): 1,92 (3H, s, -CH3-CO), 1,96 (3H, s, -CH3-CO), 2,02 (3H, s, -CH3-CO) và

C (ppm): 170,83 (CH3CO-), 170,48 (CH3CO-), 170,37 (CH3CO-) Các tín hiệu

H-2β, H-3α và H-23 được dịch chuyển về phía trường thấp hơn ở δH (ppm) 3,51 (1H,

d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,78 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3α) và 5,09 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2β) so với các tín hiệu tương ứng [δH

(ppm) 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,38

(1H, d, J = 9,5 Hz, H-3α), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2β)] của hợp chất 1

Như vậy cả 3 nhóm OH đều đã được acetyl hóa Điều này được chứng minh thêm

bởi phổ FT-IR của hợp chất 145 với đỉnh hấp phụ đặc trưng cho acetate tại

1746,26 và 1237,00, 1698,88 (-COOH) và phổ khối ESI-MS ion dương tại m/z

615 [M+H]+ Dữ liệu phổ của hợp chất 145 giống với tài liệu tham khảo [96] Hợp

chất 145 được chuyển hóa thành asiatic acid chloride triacetate (146) bằng phản

ứng với oxalyl chloride Sản phẩm trung gian này, không cần tách và tinh chế, được phản ứng với các amin tương ứng trong sự có mặt của triethylaminee làm xúc tác bắt acid HCl Các phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng với hiệu suất

cao từ 75-92% so với nguyên liệu đầu 145 (Sơ đồ 4 1)

Hợp chất 147 cho thấy trong phổ 1

H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,69 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-7’) và các tín hiệu của 7 nhóm methylene mạch nhánh

Các kết quả trên phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho pic ion giả

phân tử tại m/z 727 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp hợp chất 147 Như vậy phản ứng amide hóa của hợp chất 145 với 1,7-heptadiamin đã thành

công

Hợp chất 148 cho thấy trong phổ 1

H-NMR có các cụm pic mới xuất hiện của các nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’),

3,12-3,14 (2H, m, 2H-9’) Cấu trúc của hợp chất 148 cũng được khẳng định qua

phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử tại m/z 755 [M+H]+ tương ứng với CTPT C47H74N2O7 của hợp chất 148 như trong phản ứng

Hợp chất 149: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’), 3,14-3,11 (2H, m, 2H-

10’) Trên phổ 13

C-NMR còn xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 30,33-30,68 và 40,73-41,09 của nhóm methylene mạch nhánh Kết quả này cũng được khẳng định

thêm qua phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+, cho

thấy hợp chất 149 phù hợp với CTPT C46H76N2O7 như trong phương trình phản ứng

Hợp chất 150: trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton của nhóm methylene mạch nhánh tại H (ppm): 3,11-3,16 (1H, m, H-1’a), 3,53-3,63 (3H, m, H-1’b, 2H-3’) Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại

m/z 672 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8

Hợp chất 151 cho thấy đỉnh hấp thụ tại ν* (cm-1): 1742 và 1235 của các nhóm acetate và nhiều đỉnh hấp thụ xung quanh vùng 3418 của nhóm -NHNH2 Phổ

khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 629

[M+H]+ phù hợp với CTPT C36H56N2O7 chứng minh rằng phản ứng của hợp chất

145 với hydrzine đã tạo thành sản phẩm mong muốn 151

Trên phổ 1

H-NMR của amide 152 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm): 6,48

(1H, t, J = 4,0 Hz, -NH-amide), đặc trưng cho liên kết amide Ngoài các tín hiệu

phổ của 145, còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,83 (1H, dd, J = 4,0, 18,5 Hz,

H-1’a), 4,05 (1H, dd, J = 5,0, 18,5 Hz, H-1’b), 4,21 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1’’), 1,29 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-2’’) nhóm tín hiệu và hằng số tương tác này đặc trưng

cho độ dịch chuyển hóa học của glycine Trong phổ 13

C-NMR có các tín hiệu của nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh xuất hiện tại C : 61,48 ppm Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử

tại m/z 700 [M+H]+

phù hợp với CTPT C40H61NO9 Trên phổ 1H-NMR của amide 153 ngoài các tín hiệu của 145, quan sát thấy sự

xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole tương ứng ở δ (ppm): 7,03

phù hợp với CTPT C39H61NO8 của hợp chất này Phổ

1H-NMR của hợp chất 155 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 3,92 (1H,

hept, J = 7,0 Hz, H-1’) cùng với tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 2 xuất hiện chồng

lấp với các nhóm methyl của khung asiatic acid từ 1,12-1,05 ppm Phổ 13C-NMR

có chứa các tín hiệu của nhóm isopropyl trong mạch nhánh ở vùng trường cao

chồng lấp với các tín hiệu khác của khung Như vậy cấu trúc của hợp chất 155 đã

được khẳng định như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4 1)

Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 156 xuất hiện thêm tín hiệu tại H (ppm): 3,72 (4H, br s, 2H-2’) và C (ppm): 60,87 (C-2’)

Các hợp chất 147-156 đã được chứng minh qua các số liệu phổ 1

H-NMR, 13NMR, ESI-MS Kết quả hoàn toàn phù hợp với công thức như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4 1)

C-Các phản ứng acetyl hóa mạch nhánh

Các nhóm chức -NH2 và -OH mạch nhánh của các hợp chất 147-150, 156 được

acetyl hóa bằng phản ứng với acetyl chloride (CH3COCl) với sự xúc tác của DMAP trong dung môi dichloromethane (DMC) ở nhiệt độ phòng trong thời gian

2 giờ Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.1 cho các sản

phẩm tương ứng 157-161 với hiệu suất từ 75-80%

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 157 cho các tín hiệu tại H (ppm): 6,05 (1H, t,

J = 5,0 Hz, -NH-amide), 4,10 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3’), 3,09 (1H, m, H-1’a), 3,39

(1H, m, H-1’b) cùng với một tín hiệu methyl singlet mới tại H (ppm): 2,1 bên cạnh nhóm methylene còn lại của mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của nhóm -CH2- khác trong khung cho thấy mạch nhánh đã được gắn vào vị trí C-28

Tín hiệu H-3' trong hợp chất 157 xuất hiện ở dạng một triplet ở δH 4,10 ppm (J =

6,0 Hz) so với tín hiệu hợp chất gốc 150 là multiplet ở δH 3,53 -3,63 ppm, chồng

lấp với H-23a, H-2'a Các tín hiệu -NH của 157 cũng dịch chuyển về phía trường

cao tại δH 6,05 (t, J = 5,0 Hz) so với δH 6,18 (t, J = 5,5 Hz) trong hợp chất 150

Điều này được chứng minh thêm qua phổ 13

C-NMR với sự xuất hiện tín hiệu tại

C (ppm): 62,05 (C-3’) (CH2OAc) so với tín hiệu tại C 59,26 ppm (C-3’) của hợp

chất 150 Các kết quả trên cho thấy phản ứng acetyl hóa đã được thực hiện như

trong Sơ đồ 4 1

Hợp chất 158 cho thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng sau đây so với hợp chất 147 H (ppm): 5,61 (1H, br s, 1’-NH-amide), 5,85 (1H, t, J = 5,0 Hz, 7’- NH-), 3,00 (1H, m, H-1’a), 3,30 (1H, m, H-1’b), 3,23 (2H, q, J = 6,5 Hz, H-7’)

bên cạnh các tín hiệu của những nhóm methylene còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các nhóm methylene trong khung xuất hiện ở dạng multiplet trong vùng từ 1,98-1,38 (ppm), phù hợp với phổ 1H-NMR Đặc biệt ở đây tín hiệu H-7’ có dạng quartet do tương tác với 2H-6’ và –NH-Ac tương đương về từ Phổ 13

C-NMR cũng cho thêm một tín hiệu của nhóm acetate tại C (ppm): 170,82 và các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh trong vùng từ 44,0-21,0 ppm trùng lặp với các nhóm methylene trong khung Điều này được khẳng định qua phổ qua phổ ESI-MS với

pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H72N2O8 của hợp

chất 158

Hợp chất 159: Tương tự như vậy phổ 1H-NMR của hợp chất 159 có xuất hiện

thêm các tín hiệu tại H (ppm): 5,88 (t, J = 5,0 Hz, 1’-NH-amide), 5,96 (1H, br s,

9’-NH-amide) bên cạnh các tín hiệu tại H (ppm): 3,01 (1H, m, H-1’a), 3,29 (1H,

m, H-1’b), 3,22 (2H, m, H-9’), 1,99 (3H, s) cùng với các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene khác của khung Phổ 13C-NMR có thêm một tín hiệu của nhóm acetyl tại 170,68 ppm cùng với các nhóm methylene trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene trong khung Điều này được khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS ion âm với

pic ion giả phân tử tại m/z 795 [M-H]- tương ứng với CTPT C47H76N2O8 của hợp

chất 159 như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4 1)

Hợp chất 160: Tương tự như hợp chất 158, 159 cấu trúc của hợp chất 160 được

chứng minh qua việc xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh trong phổ 1H-NMR,

13

C-NMR và khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS với pic ion giả phân tử tại

m/z 811 [M+H]+ với CTPT C48H78N2O8

Hợp chất 161: Phổ 1

H-NMR của hợp chất 161 xuất hiện thêm 2 tín hiệu methyl

singlet của nhóm acetyl tại H (ppm): 2,07 và 2,08 Bên cạnh đó, các nhóm methylene mang oxy (-CH2OAc) tại H (ppm): 4,25 (4H, br s, 2H-2’) và các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh trùng lặp với nhóm methylene của hợp chất ban đầu

Trong hợp chất 161, tín hiệu của H-2' ở δH 4,25 (4H, br s) thay vì δH 3,72 (4H, br s)

trong hợp chất 156 Phổ khối của hợp chất 161 cho pic ion giả phân tử tại m/z 786

[M+H]+ phù hợp với CTPT C44H67NO11 của hợp chất 161

Tương tự như trên cấu trúc của các hợp chất 157-161 cũng được khẳng định bằng

phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS đúng như các công thức ở sơ đồ (Sơ đồ 4.1)

 Phản ứng thủy phân nhóm acetyl ở vòng A

Để so sánh hoạt tính giữa các sản phẩm amide có nhóm OH vòng A bị khóa

bởi nhóm aceyl và các nhóm OH tự do, một số sản phẩm 147-156 được lựa chọn

để loại bỏ nhóm Acetyl bằng phản ứng thủy phân trong dung dịch KOH ở nhiệt độ phòng, khuấy trong 16 giờ Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như thường quy (phần thực nghiệm 3.3.1) thu được các sản phẩm tương ứng với hiệu suất cao từ 72-

80% Cấu trúc của các sản phẩm dãy 162-166 được khẳng định thông qua phân

tích phổ ESI-MS và 1

H-NMR, 13C-NMR

Hợp chất 162: Trong phổ 1

H-NMR của hợp chất 162 đã không còn các tín hiệu

của các nhóm acetyl Ngoài ra, thấy có sự chuyển dịch hóa học của các nhóm methyl gắn dị tố oxy về phía trường cao tạiH (ppm): 3,29 (1H, d, J = 10,0 Hz, H- 23a), 3,38 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,72 (1H,

dt, J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-12) và H (ppm): 2,86 (2H, t,

J = 10,0 Hz, H-1’), 3,14 (2H, m, H-7’) Kết quả này cũng được khẳng định thêm

qua phổ 13C-NMR với sự vắng mặt của tín hiệu của các nhóm acetyl carbonyl ở vùng 170 ppm và các nhóm methyl của acetyl ở vùng trường cao Phổ khối ESI-

MS ion dương của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 601 [M+H]+

phù hợp với CTPT C39H64N2O5 của hợp chất 162 như trong Sơ đồ 4 1

Hợp chất 163: Tương tự như hợp chất 162, trong phổ 1

H-NMR của hợp chất

163 đã không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm acetyl tại vị trí C-2, C-3,

C-23 Đồng thời các tín hiệu của nhóm oxy-methine cũng bị đẩy về phía trường cao hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J

= 9,5 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,66 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-9’) của mạch

nhánh Phù hợp với số liệu này phổ 13C-NMR cũng thấy vắng mặt các tín hiệu của nhóm acetyl carbonyl ở vùng C (ppm): 170 và acetyl methyl ở vùng trường cao Các kết quả này được minh chứng thêm bởi phổ ESI-MS ion dương của hợp chất

163 với pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H68N2O4

của 163 như trong Sơ đồ 4 1

Hợp chất 164: Cũng tương tự như hợp chất 162, 163 trong phổ 1

H-NMR của

hợp chất 164 cũng không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm methyl

acetyl Đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxy methyl cũng dịch chuyển về phía trường cao hơn, xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,80 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-10’) của

mạch nhánh Phổ 13

C-NMR cũng vắng mặt các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl ở vùng khoảng 170 ppm và vùng trường cao Phổ khối ESI-MS ion dương