Nghiên cứu khả năng phân hủy hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học phân lập tại một số địa điểm ô nhiễm dầu ở Việt Nam

GVIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ViÖn c«ng nghÖ sinh häc CUNG thÞ ngäc MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT VÒNG THƠM CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌC PH

GVIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

ViÖn c«ng nghÖ sinh häc

CUNG thÞ ngäc MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY

HỢP CHẤT VÒNG THƠM CỦA CÁC CHỦNG

VI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌC

PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM

Ô NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM

LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc

VI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌC

PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM

Ô NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CUNG THỊ NGỌC MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦYHỢP CHẤT VÕNG THƠM CỦA CÁC CHỦNGVI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌCPHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA

ĐIỂMÔ NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh

Viện Nghiên cứu hệ gen

2 TS Lê Thị Nhi Công

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017

i

Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngoc Minh, Phó Viện trưởng Viện nghiên cứu hệ gen và TS Lê Thị Nhi Công, Trưởng phòng CNSH môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm qúy báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS Masaaki Morikawa, Khoa Khoa học trái đất, Đại học Hokkaido Nhật Bản đã tạo điều kiện cho nhóm nghiên cứu sử dụng các trang thiết bị phân tích tại Khoa

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt những năm qua

Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi hoàn thành những thủ tục cần thiết trong suốt quá trình nghiên cứu sinh và bảo vệ luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia và Ban chủ nhiệm Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước “Nghiên cứu phát triển

và ứng dụng Công nghệ Sinh học” đã cấp kinh phí cho 2 đề tài mã số 106.03-2011.53 và KC.04.21/11-15 cho nhóm nghiên cứu Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đơn vị: phòng Thí nghiệm trọng điểm gen- Viện Công nghệ sinh học; phòng Vi sinh vật học- Học viện Quân y 103; phòng Thí nghiệm siêu cấu trúc- Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương; phòng Sinh thái vi sinh vật- Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học; phòng Hóa học phân tích- Viện Hóa học đã phối hợp thực hiện một số kết quả phân tích trong luận án

Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học nơi tôi đang công tác, cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình cũng như những đóng góp quý báu của các chị, em đồng nghiệp, nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu

đó

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

Cung Thị Ngọc Mai

ii

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Cung Thị Ngọc Mai

iii

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm, nguồn gốc phát sinh của phenol và PAH 3

1.1.1 Đặc điểm và nguồn gốc phát sinh của phenol 3

1.1.2 Đặc điểm và nguồn gốc phát sinh của PAH 4

1.2 Tính độc và ảnh hưởng của phenol, PAH tới môi trường, sức khỏe con người và động vật 6

1.2.1 Tính độc và ảnh hưởng của phenol tới môi trường, sức khỏe con người và động vật 6

1.2.2 Tính độc và ảnh hưởng của phenol tới môi trường, sức khỏe con người và động vật 7

1.3 Phân hủy phenol và PAH bởi vi sinh vật 8

1.3.1 Phân hủy phenol bởi vi sinh vật hiếu khí 9

1.3.2 Phân hủy PAH bởi vi sinh vật hiếu khí 12

1.4 Các công nghệ xử lý 16

1.4.1 Công nghệ sử dụng bùn hoạt tính 17

1.4.2 Công nghệ sử dụng màng lọc 18

1.5 Màng sinh học (Biofilm) 21

1.5.1 Khái niệm về biofilm 21

1.5.2 Vi sinh vật tạo biofilm 21

1.5.3 Sự hình thành biofilm 23

1.5.4 Thành phần, cấu trúc của biofilm 24

1.5.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển biofilm 26

1.5.6 Ứng dụng của biofilm trong phân hủy sinh học 28

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Vật liệu nghiên cứu 31

2.1.1 Nguyên liệu 31

2.1.2 Hóa chất, môi trường nuôi cấy 32

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Nhóm phương pháp vi sinh vật 35

2.2.2 Nhóm phương pháp sinh học phân tử 43

2.2.3 Nhóm phương pháp phân tích hóa học 47

2.2.4 Xử lý thống kê 47

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Làm giàu và phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng

iv

các hydrocarbon vòng thơm 48

3.2 Khả năng tạo biofilm và sử dụng hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật phân lập được

54 3.2.1 Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật 54

3.2.2 Khả năng sử dụng hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật 56

3.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và phân loại, định têna các chủng vi sinh vật chọn lọc 58

3.3.1 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật 58

3.3.2 Phân loại và định tên các chủng vi sinh vật 60

3.4 Kiểm tra tính đối kháng và đánh giá độ an toàn của các chủng vi sinh vật sàng lọc 63

3.4.1 Kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi sinh vật 64

3.4.2 Đánh giá độ an toàn của các chủng vi sinh vật 64

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sự hình thành biofilm của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 65

3.5.1 Ảnh hưởng của pH 65

3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 67

3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl 68

3.5.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon 69

3.5.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 70

3.6 Khả năng phân hủy một số hydrocarbon vòng thơm của từng chủng vi sinh vật lựa chọn 72

3.6.1 Khả năng phân hủy hydrocarbon vòng thơm của vi sinh vật 72

3.6.2 Khả năng chuyển hóa iso-pentylbenzene do biofilm của chủng Candida viswanathii TH1 tạo thành 73

3.7 Khả năng phân hủy hợp chất vòng thơm trong nước nhiễm dầu của biofilm do các chủng vi sinh vật tạo thành 78

3.7.1 Khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm có trong nước nhiễm dầu 78

3.7.2 Mật độ tế bào, cấu trúc biofilm và cấu trúc quần thể vi khuẩn trước và sau xử lý 83

Chương 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 88

4.1 Phân lập, phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm và sử dụng các hợp chất vòng thơm từ các mẫu nhiễm dầu 88

4.2 Các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng tạo biofilm của các chủng visinh vật 92

4.3 Hiệu quả xử lý các hợp chất vòng thơm có trong nước nhiễm dầu do biofilm đa chủng tạo thành 96

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99

v

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN

ĐẾN LUẬN ÁN 101

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 107

PHẦN PHỤ LỤC 1

Phụ lục 1: Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật 1

Phụ lục 2: Phân loại vi sinh vật bằng kít chuẩn sinh hóa 2

Phụ lục 3: Khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên các nguồn hydrocarbon khác nhau 5

Phụ lục 4: Kết quả phân tích GCMS do biofilm đa chủng tạo thành 7

Điện di gel với dải nồng độ biến tính

DNA Dioxyribonucleic acid

EPS Extracellular polymeric

substances

Mạng lưới các chất ngoại bào

ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm chuyển tiếp phía trong

LD50 Lethal Dose 50 Liều lượng chất độc gây chết cho

một nửa (50%) động vật thí nghiệm MPA Meat peptone agar Cao thịt peptone thạch

Kính hiển vi điện tử quét

RNA Ribonucleic acid

USEPA United States

Environmental Protection Agency

Cơ quan Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tính chất vật lý của một số loại PAH 5

Bảng 1.2 Danh mục các gen tham gia 13

Bảng 2.1 Các địa điểm ô nhiễm dầu và đặc điểm mẫu thu thập 31

Bảng 2.2 Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu 33

Bảng 2.3 Các thiết bị được sử dụng trong luận án 34

Bảng 2.4 Các điều kiện môi trường được khảo sát 40

Bảng 2.5 Các cặp mồi sử dụng trong kỹ thuật PCR 44

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR 44

Bảng 2.7 Các cặp mồi sử dụng trong kỹ thuật PCR-DGGE 45

Bảng 2.8 Thành phần và chu trình của phản ứng PCR 45

Bảng 2.9 Các nồng độ biến tính gốc và nồng độ biến tính sử dụng 46

Bảng 3.1 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu có trong nước thải lấy tại kho xăng dầu Đỗ Xá, Hà Nội 48

Bảng 3.2 Số lượng VSV dị dưỡng và VSV sử dụng hydrocarbon vòng thơm 50

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được 51

Bảng 3.4 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm men phân lập được 53

Bảng 3.5 Khả năng sử dụng các hợp chất hydrocarbon thơm của các chủng vi khuẩn 56

Bảng 3.6 Khả năng sử dụng các hợp chất hydrocarbon thơm của các chủng nấm men 57

Bảng 3.7 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn 58

Bảng 3.8 Đặcđiểm sinh học của các chủng nấm men 59

Bảng 3.9 Tên khoa học, độ tương đồng và mã số trên NCBI của các chủng VK 61

Bảng 3.10 Tên khoa học, độ tương đồng và mã số trên NCBI của các chủng NM 63

Bảng 3.11 Kết quả xác định LD50 của các chủng vi sinh vật 65

Bảng 3.12 Hiệu suât phân hủy hydrocarbon thơm của vi sinh vật 72

Bảng 3.13 Thời gian lưu và phổ hấp thụ UV/vis các sản phẩm do biofilm chủng C viswanathii TH1 chuyển hóa iso-pentylbenzene 74

Bảng 3.14 Mức độ tương đồng về trình tự đoạn gen 16S rRNA của các băng được cắt với các chủng vi khuẩn trên NCBI 86

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số loại PAH 4

Hình 1.2 Mở vòng ở vị trí ortho- và ở vị trí meta- của catechol 10

Hình 1.3 Phân hủy sinh học hiếu khí phenol theo con đường mở vòng vị trí meta- và ortho- bởi loài Pseudomonas sp CF600 11

Hình 1.4 Các vùng trao đổi chất trong phân hủy PAH 12

Hình 1.5 Các con đường phân hủy PAH 14

Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống xử lý bằng phương pháp bùn hoạt tính 18

Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống xử lý bằng phương pháp MBR 19

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống xử lý sử dụng biofilm 20

Hình 1.9 Chu trình hình thành biofilm 24

Hình 1.10 Cấu trúc mô phỏng của 1 biofilm và cấu trúc hiển vi của biofilm do chủng Bacillus subtilis tạo thành dưới kính hiển vi điện tử quét 25

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm thực hiện trong luận án 35

Hình 2.2 Sơ đồ các bước thử nghiệm khả năng phân hủy các hydrocarbon thơm trong nước nhiễm dầu của biofilm do các chủng vi sinh vật lựa chọn tạo thành ở quy mô 5 lít 41

Hình 2.3 Các mô hình xử lý 42

Hình 3.1 Mẫu làm giàu vi sinh vật lần 3 trên các nguồn cơ chất tại các vị trí thu thập mẫu khác nhau 51

Hình 3.2 Khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn phân lập 55

Hình 3.3 Khả năng tạo biofilm của các chủng nấm men phân lập 56

Hình 3.4 Mức độ sinh trưởng của chủng VTPG5 trên các nguồn cơ chất 57

Hình 3.5 Mức độ sinh trưởng của chủng nấm men trên các nguồn cơ chất 57

Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn 61

Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn 62

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi sinh vật 64

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn 66

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành biofilm của các chủng nấm men 66 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng hình thành biofilmcủa

các chủng vi khuẩn 67 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng hình thành biofilm của

các chủng nấm men 67 Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng hình thành biofilm

của các chủng vi khuẩn 68 Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng hình thành biofilm

của các chủng nấm men 68 Hình 3.15 Ảnh hưởng của nguồn C tới khả năng hình thành biofilmcủa

các chủng vi khuẩn 69 Hình 3.16 Ảnh hưởng của nguồn C tới khả năng hình thành biofilmcủa

các chủng nấm men 70 Hình 3.17 Ảnh hưởng của nguồn N tới khả năng hình thành biofilmcủa

các chủng vi khuẩn 71 Hình 3.18 Ảnh hưởng của nguồn N tới khả năng hình thành biofilmcủa

các chủng nấm men 71 Hình 3.19 Quang phổ khối lượng các sản phẩm trao đổi chất V, VI và

VII được phát hiện bằng phân tích GCMS tại các thời gian lưu 9,1; 20,1 và 20,8 phút sau khi so sánh các chất chuẩn 76 Hình 3.20 Con đường chuyển hóa iso-pentylbenzene do biofilm chủng

C viswanathii TH1 77

Hình 3.21 Kết quả phân tích khả năng phân hủy phenol sau 7 ngày nuôi

tĩnh của biofilm đa chủng vi khuẩn bằng phương pháp HPLC 79 Hình 3.22 Hiệu suất phân hủy các thành phần hydrocarbon thơm sau 14

ngàynuỗi tĩnh của biofilm đa chủng vi khuẩn 80 Hình 3.23 Kết quả phân tích khả năng phân hủy phenol sau 7 ngày nuôi

tĩnh của biofilm đa chủng nấm men bằng phương pháp HPLC 81 Hình 3.24 Hiệu suất phân hủy các thành phần hydrocarbon thơm sau 14

ngàynuỗi tĩnh của biofilm đa chủng nấm men 82 Hình 3.25 Cấu trúc biofilm đa chủng vi khuẩn tại thời điểm 0 ngày và 14

ngày 83 Hình 3.26 Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA của mẫu nước

84 Hình 3.27 Điện di biến tính với dải nồng độ 30% - 60% 85

có thể gây tử vong.Do vậy, việc loại bỏ các thành phần hữu cơ trên có trong dầu mỏ tại các khu vực ô nhiễm là một việc làm cần thiết hiện nay

Để xử lý các hợp chất này, các phương pháp vật lý, hóa lý đã được sử dụng

và cho kết quả khả quan Các phương pháp này có ưu điểm là xử lý nhanh, tuy nhiên quá trình xử lý không được triệt để và thường tạo ra các sản phẩm phụ thứ cấp ảnh hưởng tới môi trường xung quanh Phương pháp phân hủy sinh học sử dụng các tác nhân sinh học như vi sinh vật và các chất có hoạt tính sinh học do vi sinh vật sản sinh ra đã được sử dụng ngày càng rộng rãi do hiệu quả, rẻ, thân thiện với môi trường Đặc biệt khi vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm sinh trưởng trong cấu trúc màng sinh học (biofilm) thì hiệu quả xử lý các hợp chất này trong nước bị ô nhiễm dầu cao hơn khi ở dạng tế bào tự do Biofilm là một tập hợp các vi sinh vật bám trên một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt đó.Khu hệ vi sinh vật trong biofilm có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường (sự thay đổi về pH, nhiệt độ,

sự thẩm thấu hay sự mất nước của tế bào, v.v…) tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn

và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác từ đó làm tăng hiệu suất phân hủy các hợp chất ô nhiễm khi xử lý ngoài hiện trường

Ở Việt Nam cho đến nay chưa có nhiều nghiên cứu về ứng dụng các vi sinh vật tạo biofilmtrong xử lý các hợp chất hydrocarbon thơm trong nước ô nhiễm.Để

giải quyết những vấn đề thực tiễn nêu trên, luận án: “Nghiên cứu khả năng phân

hủy hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học phân lập tại một số địa điểm ô nhiễm dầu ở Việt Nam” đã được thực hiện với mục tiêu và

nội dung như sau:

Mục tiêu:

Tìm kiếm các chủng vi sinh vật vừa có khả năng tạo biofilm, vừa có khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm nhằm ứng dụng trong xử lý môi trường ô nhiễm những hợp chất này

Nội dung nghiên cứu:

1 Làm giàu và phân lập vi sinh vật có khả năng sử dụng các hydrocarbon thơmnhư nguồn carbon và năng lượng duy nhất

2 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sử dụng các hydrocarbon thơm có khả năng tạo biofilm

3 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại, định tên các chủng đại diện

4 Kiểm tra tính đối kháng và đánh giá độ an toàn của các chủng vi sinh vật chọn lọc

5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện tới khả năng tạo biofilm

6 Đánh giá khả năng phân hủy một số hydrocarbon thơm của các chủng lựa chọn

7 Đánh giá hiệu suất phân hủycác hydrocarbon thơm trong nước nhiễm dầu dobiofilm đa chủng vi khuẩn và biofilm đa chủng nấm men tạo thành

Những đóng góp mới của luận án:

(1) Đây là công trình nghiên cứu có hệ thống về phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn, nấm men vừa có khả năng tạo biofilm tốt vừa có khả năngphân hủy tốt các hợp chất hữu cơ vòng thơm phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Việt Nam

(2) Lần đầu tiên ở Việt Nam đã thiết lập được con đườngchuyển pentylbenzene bởi chủng nấm men Candida viswanathii TH1

hóaiso-Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Đặc điểmvà nguồn gốc phát sinh của phenol

Phenol là một đơn vị cấu trúc vòng thơm đơn giản nhất, mùi hăng và có vị rất đặc trưng mùi khói Phenol ít tan trong nước ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên trên

68oC, nó tan hoàn toàn vào nước Phenol ít bay hơi ở nhiệt độ phòng (tốc độ bay hơi

chậm hơn nước) và dễ bị bốc cháy (Gami et al., 2014)

Hiện nay, phenol được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất nhựa phenolic, caprolactan và bisphenol A, thuốc tẩy uế, thuốc diệt côn trùng và các sản phẩm dược phẩm Phenol và các dẫn xuất của nó tồn tại chủ yếu ở trong nguồn nước thải của nhiều ngành công nghiệp và trong không khí bị ô nhiễm thông qua các hoạt động sinh hoạt thường ngày của con người: chế biến thức ăn, hút thuốc lá

v.v… (Al-Khalid et al., 2012) Bên cạnh đó, phenol còn được phát sinh từ các quá

trình sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ như: 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) hay 4-chloro-2-methylphenolxyacetic acid (MCPA) và pentachlorophenol (PCP), dinoseb (một loại thuốc diệt cỏ cũng được dùng như: thuốc diệt nấm và côn trùng bị EPA cấm sử dụng vào năm 1986 vì gây ra

nguy cơ dị tật trong sinh sản và vô sinh hoặc thuốc diệt cỏ)(Gami et al., 2014;

Rozánki, 1998) Phenol còn được phát sinh trong các phản ứng giữa chlorobenzene

và sodium hydrocide, quá trình oxi hóa toluene và tổng hợp từ benzene và propylene.Ngoài ra, phenol cũng được hình thành bởi các phản ứng hóa học xảy ra trong khí quyển trong quá trình nước bay hơi hình thành mây và trong quá trình sinh tổng hợp bởi thực vật hay các phản ứng phân hủy các chất hữu cơ (US EPA, 1980)

Ngoài các nguồn phát sinh trên thì1 nguồn phát sinh phenol đáng phải kể đến

đó là tại các bể thu gom nước thải của các kho bể và các cửa hàng xăng dầu do hiện

tượng rò rỉ, rơi rớt xăng dầu trong quá trình xúc rửa các bể chứa dầu, vận chuyển

xăng dầu từ kho tới các cây xăng dầu để tiêu thụ (Yu et al., 2013)

1.1.2 Đặc điểm và nguồn gốc phát sinh của PAH

PAH (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) được sử dụng để chỉ một số các chất hữu cơ gồm hai hay nhiều vòng hydrocarbon thơm liên kết với nhau Có hơn

100 loại PAH khác nhau trong đó có 16 loại PAH được nghiên cứu tỉ mỉ do chúng nguy hại hơn so với các loại PAH khác và được xác định là có nồng độ cao nhất tại các vị trí nguy hiểm trong Danh sách các quốc gia được ưu tiên (NPL - National Priorities List) của cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số loại PAH

phân tử mà các PAH có những tính chất vật lý, hoá học khác nhau Nhìn chung chúng có nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi cao, áp suất bay hơi thấp và rất ít tan trong nước nhưng tan tốt trong chất béo Một số đặc tính cơ bản của PAH được mô

trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzene tăng (Cerniglia,1992)

Một vài PAH được sử dụng trong dược phẩm và được làm thuốc nhuộm, nhựa và thuốc trừ côn trùng Chúng cũng được tìm thấy trong các nguồn cơ chất

vòng

Nhiệt độ nóng chảy ( o C)

Nhiệt độsôi ( o C)

Độ tan trong nước (mg/l)

LogKp d

Áp suất hơi ở

20 o C (torr)

như: dầu thô, than đá, nhựa đường, dầu hỏa hay từ các hoạt động phun trào núi lửa Chúng cũng được tìm thấy ở mọi nơi trong môi trường trong không khí, nước và đất trong sinh hoạt hàng ngày của con người: việc hút thuốc, đun nấu bằng củi và dầu hỏa, đốt nóng các loại dầu khác nhau và nướng thịt Đặc biệt, PAH xuất hiện nhiều trong quá trình cracking bẻ gãy các liên kết mạch dài của các chất hữu cơ có trong dầu mỏ, các công đoạn đúc sắt thép và sản xuất nhôm, than chì (US Department of health and human services, 1995).Cũng như phenol, nước thải nhiễm dầu tại các bể

thu gom nước thải của các kho xăng dầu cũng là 1 nguồn phát sinh PAH lớn(Yu et

al., 2013)

SỨC KHỎE CON NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

1.2.1 Tính độc và ảnh hưởng của phenol tới môi trường, sức khỏe con người

và động vật

Phenol là một trong những hợp chất vòng thơm đầu tiên được đưa ra trong danh sách các chất ô nhiễm được chú trọng của USEPA Đã có nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về tính độc cũng như ảnh hưởng của phenol lên sức khỏe con người và môi trường Liều gây độc cho người khi uống phải là từ 200 mg đến

300 mg và liều gây chết là 3 g đến 30 g (Todoroviê, 2003) Phenol sau khi thấm vào

tế bào, trải qua quá trình chuyển hóa chủ yếu với sự tham gia của các oxidase trong

hệ thống Cytochrome P450 Quá trình chuyển hóa làm tăng độc tính do sự trao đổi điện tích dẫn tới việc chúng có thể liên kết và phá hủy các phân tử DNA hoặc các enzyme khác của cơ thể làm thay đổi cấu trúc của mô, gây đột biến và ung thư (Michałowicz and Duda, 2007) Ngoài ra, phenol còn là một chất gây kích ứng mắt,

màng nhầy và da, gây co giật, suy gan, thận và một số cơ quan khác (Wasi et al.,

2013)

Khi động vật hít lâu hơi phenol ở nồng độ trong khoảng 30 đến 60 ppm có thể gây tổn thương phổi, giảm cân và tê liệt Tiếp xúc cấp tính với phenol có thể gây suy tim, suy thận Phenol gây cháy da, làm trắng và ăn mòn da.Bệnh tăng nhãn áp

đã được thử nghiệm trên thỏ bằng cách tiêm 5% phenol cho thấy khi mắt thỏ tiếp

xúc với phenol dạng tinh thể hoặc dung dịch sẽ gây trắng giác mạc, sau 8 giờ giác mạc bị tê liệt Những con chuột khi uống phải nước pha 2.500 ppm phenol trong

103 tuần sẽ có hiện tượng gia tăng bệnh bạch cầu và các u lympho, mặc dù vậy cho đến nay, phenol không được coi là chất gây ung thư Bên cạnh đó, khi tiếp xúc với phenol trong thời gian dài có thể dẫn đến chán ăn, da phát ban, câm điếc, rối loạn tiêu hóa, nôn mửa, giảm cân, đau cơ, đau gan và rối loạn thần kinh Phenol và dẫn

xuất của nó rất độc hại và được phân loại là vật liệu nguy hiểm (Gami et al., 2014; Kumari et al., 2013)

1.2.2 Tính độc và ảnh hưởng của PAH tới môi trường, sức khỏe con người và

động vật

Hầu hết các loại thực vật đều rất nhạy cảm với PAH ở những mức độ khác nhau Trong quá trình trao đổi chất, thực vật có thể hấp thụ và hấp phụ PAH từ môi trường đất, nước và không khí vào cơ thể qua thân, rễ, lá của chúng Khi được hấp thụ vào những tế bào thực vật, PAH làm giảm khả năng sinh trưởng, sinh sản và phát triển của các loài thực vật cũng như kìm hãm một số quá trình sinh học trong

hệ sinh thái PAH được tích tụ trong hệ thực vật sẽ từ đó đi vào chuỗi thức ăn của động vật và gây ra những tác hại lâu dài và nghiêm trọng hơn Từ hệ thực vật, PAH được hấp thụ vào cơ thể của một số loài động thực vật thông qua các chuỗi thức ăn

Do độ hoà tan trong nước của các PAH phân tử lượng nhỏ cao hơn của các PAH phân tử lượng lớn, chúng có khả năng gây độc trực tiếp đối với các cơ thể động vật cao hơn là các PAH khối lượng phân tử lớn Tuy nhiên, các PAH phân tử lượng lớn lại khó phân huỷ sinh học hơn, chúng thường bị tích tụ rất lâu trong môi trường cũng như trong cơ thể động vật (US Department of health and human services, 1995)

Khi PAH được phóng thích từ các khu vực phát sinh chúng sẽ thâm nhập vào trong các nguồn nước, đất và không khí ô nhiễm xâm nhập vào cơ thể người thông qua các con đường: hít thở, ăn, uống, hút thuốc hoặc tiếp xúc qua da khi con người tiếp xúc với chúng trong một khoảng thời gian nhất định PAH thường tồn tại ở dạng hỗn hợp, ít thấy ở dạng đơn lẻ do vậy khi bị nhiễm PAH, con người sẽ bị

nhiễm hỗn hợp các PAH, chính điều này càng làm cho độc tính của chúng được tăng cường (US Department of health and human services, 1995)

Do độ hoà tan trong nước thấp và độ hoà tan trong dầu cao nên khi xâm nhập vào cơ thể người qua những con đường khác nhau, PAH có xu hướng bị tích tụ nhiều hơn ở thận, gan và các mô mỡ của con người Một lượng nhỏ PAH có thể bị tích tụ ở lá lách, tuyến thượng thận và buồng trứng.Khi bị tích tụ, chúng có thể kết hợp hay phản ứng với một số chất khác trong cơ thể để hình thành nhiều loại hợp chất khác nhau Một số sản phẩm gây ra những tác hại nghiêm trọng hơn PAH và một số khác thì ít nghiêm trọng hơn đối với sức khoẻ của con người Tuy nhiên, cũng theo những nghiên cứu này, một số loại PAH thông thường không tồn trữ lâu dài trong cơ thể con người Thời gian lưu giữ của chúng trong cơ thể người chỉ khoảng vài ngày, sau đó là được thải ra ngoài qua phân và nước tiểu

Khi bị nhiễm các hợp chất PAH thì các yếu tố như: liều lượng, thời gian tiếp xúc, con đường bị nhiễm (ăn, uống, tiếp xúc qua da, v.v…), hay tuổi, giới tínhtình trạng sức khỏe được quan tâm USEPA cũng đưa ra mức nồng độ an toàn của PAH trong quá trình tiếp xúc để không gây ảnh hưởng có hại cho sức khoẻ con người Cụ thể: không nên tiếp xúc với một số chất PAH tại những nồng độ lớn hơn những mức sau: 0,3 mg anthracene/kg cơ thể người; 0,06 mg acenaphthene/kg cơ thể người, 0,04 mg fluoranthene/kg cơ thể người; 0,03 mg pyrene/kg cơ thể người v.v…(US Department of health and human services, 1995)

Để phòng tránh sự xâm nhập của PAH, chúng ta cần hạn chế và kiểm soát sự phát sinh của những hợp chất này trong sản xuất và sinh hoạt Ví dụ như giảm thiểu việc sử dụng những nguồn nguyên, nhiên liệu có thể sản sinh ra PAH trong giao thông và công nghiệp, kiểm soát nghiêm ngặt các quá trình đốt để tránh các quá trình cháy không hoàn toàn của một số lò đốt rác thải, hạn chế hút thuốc và ăn các sản phẩm nướng cháy

Hiện nay, phân hủy sinh học là một trong các phương pháp làm sạch ô nhiễm dầu mỏ hiệu quả và an toàn cho môi trường nhất được sử dụng kế tiếp ngay sau các

biện pháp ứng cứu nhanh Nguyên lý của phương pháp này là kích thích sự phát triển của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng phân hủy dầu hoặc các chất ô nhiễm có trong dầu bằng cách thay đổi các yếu tố môi trường như: độ thông khí, các chất dinh dưỡng như nitrogen, phosphore, vi lượng, các chất hoạt động bề mặt sinh học do chính các chủng vi sinh vật đó tạo thành, v.v tức là tạo điều kiện tối ưu để vi sinh vật sử dụng dầu hoặc các hydrocarbon có trong dầu phát triển và hoạt động để tạo ra các sản phẩm là các acid hữu cơ, nước, CO2 và sinh khối vi sinh vật (Kensa, 2011)

Bên cạnh đó, việc sử dụng chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH)do các chủng vi sinh vật tạo ra để tăng cường quá trình phân hủy hydrocarbon có trong

dầu mỏ (Bustamante et al, 2012) Chất hoạt động bề mặt có các ưu điểm như: độc

tính thấp, phân hủy nhanh hơn, chịu pH, chịu mặn và có khả năng tổng hợp từ các nguyên liệu rẻ tiền Tất cả CHHBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo) Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa 2 pha (có thể là chất lỏng-chất lỏng, chất lỏng-chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và không khí) và giảm sức

căng giữa 2 pha (chất lỏng-chất lỏng và chất lỏng-chất rắn) (Magdalena et al.,

2011).Một ví dụ điển hình về vai trò của CHHBMSH do chủng vi khuẩn

Pseudomonas pseudomalei H24 tạo ra giúp làm tăng cường khả năng phân hủy dầu

DO của vi sinh vật từ mẫu cát biển có khả năng phân hủy 67% và 37% với nồng độ

dầu ban đầu lên tới 39,2 g/l (Lại Thúy Hiền và cs, 2010)

1.3.1 Phân hủy phenol bởi vi sinh vật hiếu khí

Trên thế giới đã có nhiều công bố về các nhóm vi sinh vậthiếu khí có khả năng sử dụng phenol như nguồn carbon và năng lượng duy nhất Chúng thuộc các chi: Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonasfluorescens, Bacilluscereus ( Agarry và Solomon, 2013; Arifet al., 2012; Gami et al., 2014; Krastanov et al., 2013; Liu et al., 2016; Nwanyannwu và

Abu, 2013; Safont et al., 2012; Taghreed và Muftah, 2012),

Candidatropicalis,Fusariumflocciferiumvà Trichosporoncutaneu(Mendoca et al.,

2004; Zhou et al., 2011)

Những nghiên cứu về phân hủy sinh học hay chuyển hóa hiếu khí phenol đã được nhiều tác giả quan tâm từ những năm 1969 Các tác giả đã chỉ ra rằng phenol

có thể được phân hủy theo con đường mở vòng ở vị trí meta- nhờ các loài vi khuẩn

Pseudomonas sp CF600; Pseudomonasputida, Pseudomonascepacia, Pseudomonaspicketti và Alcaligenedeutrophus (Feist và Hegeman, 1969;

Mahiudddin, 2012; Paisio et al., 2013) hoặc ở vị trí ortho- trong các nhóm vi sinh vật như:Pseudomonas sp CF600; Trichosporoncutaneum, Rhodotorularubura và

Acinetobactercalcoacetium (Katayama-Hirayama et al., 1991; Mahiudddin, 2012;

mở vòng ở vị trí meta- tạo 2-hydroxymuconic semialdehyde bởi catechol

2,3-dioxygenase Các sản phẩm cuối cùng của cả 2 con đường này tham gia vào chu trình TCA (tricarboxylic acid cycle) (Hình 1.2, Hình 1.3)

Hình 1.2 Mở vòng ở vị trí ortho-(A) và ở vị trí meta-(B) của catechol

(Nguồn: Cerniglia, 1992; Mahiudddin et al., 2012)

Hình 1.3 Phân hủy sinh học hiếu khí phenol theo con đường mở vòng vị trí meta-

(A) và ortho- (B) bởi loài Pseudomonas sp CF600

(Nguồn: Mahiudddin et al., 2012)

1.3.2 Phân hủyPAH bởi vi sinh vật hiếu khí

Do độ hòa tan trong nước thấp nên các PAH rất bền vững và có thể được tích

tụ trong môi trường qua chuỗi thức ăn do vậy nó ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe con người Một vài PAH có các vùng A, B, Bay, K và L Những vùng này khi trải qua quá trình trao đổi chất tạo ra các epoxide có hoạt tính cao Trong môi trường, sự bền vững của PAH trong môi trường phụ thuộc vào đặc tính vật lý, hóa học, nồng

độ cũng như khả năng phân hủy sinh học của chúng Các PAH khối lượng phân tử lớn thường độc hơn và bền vững trong môi trường hơn các PAH khối lượng phân tử

thấp(Chauhan et al., 2008)

Hình 1.4 Các vùng trao đổi chất trong phân hủy PAH

(Nguồn: Chauhan et al., 2008)

Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật có thể tạo ra dạng không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2dưới sự có mặt của nhiều enzyme do chính các vi

sinh vật tổng hợp (Mahjoubi et al., 2013).Vi sinh vật phân hủy PAH thuộc nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas vesicularis, Pseudomonas cepacia, Alcaligenes denitrificans, Mycobacterium sp., Aeromonas

sp., Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus, Vibrio sp., Cyclotrophicus sp.,

Stenotrophomonas maltophilia, Beijerinckia sp., Micrococcus sp., Nocardia sp.,

vàFlavobacterium sp (Guiraud et al.,2001; Liu et al., 2016) Các gen mã hóa cho

các enzyme xúc tác cho quá trình phân hủy PAH được liệt kê ở Bảng 1.2 (Chauhan

Bảng 1.2.Danh mục các gen tham gia vào quá trình phân hủy PAH

Pseudomonas putida

nahAa nahH ndoA

Naphthalene Naphthalene Naphthalene

Reductase Catechol oxygenase Dioxygenase

Pseudomonas stutzeri

hydroxylase

Naphthalene-salicylate-1-Alcaligenes faecalis

Dihydroxyphenanthrene dioxygenase

Dioxygenase mở vòng

Naphthalene, phenanthrene, anthracene

(Nguồn: Chauhan et al., 2008)

Phân hủy PAH có thể được diễn ra theo nhiều con đường khác nhau phụ thuộc vào các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình chuyển hóa (Hình 1.5)

Hình 1.5 Các con đường phân hủy PAH

(Nguồn: Cerniglia, 1992)

Các con đường phân hủy hiếu khí PAH cụ thể như sau:

- Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi khuẩn và nấm: Các

cytochrome P450 monooxygenease được sinh ra bởi một số loài vi khuẩn và vi nấm Các enzyme này chuyển hóa PAH đến Epoxide, sau đó dạng hợp chất trung gian này được tái sắp xếp (không có sự tham gia của enzyme) thành dạng phenol hoặc

được hydrate hóa bởi epoxyde hydrolase đến dạng trans-dihydrodiol Trong trường

hợp các vi sinh vật chỉ có thể thực hiện theo cách chuyển hóa này thì chúng sẽ không sử dụng PAH như là nguồn carbon mà chỉ có thể loại bớt tính độc của PAH

thành các PAH đỡ độc hơn (Sutherland et al., 1995)

- Chuyển hóa PAH tới quinon bởi nấm mục trắng: Sự phân hủy lignin và cellulose bởi một số nấm mục trắng chuyển hóa PAH đến quinon và các chất khác

Mở vòng

mà không thông qua cis hoặc trans-dihydrodiol bởi các enzyme như lignin/Mn

peroxydase hay laccase

- Chuyển hóa PAH đến cis-dihydrodiol, phenol và sản phẩm cắt vòng bởi vi

và vi khuẩn khuẩn lam: Quá trình phân hủy PAH hiếu khí trong hầu hết vi khuẩn và

vi khuẩn lam chủ yếu thông qua sự oxy hóa các vòng thơm đến dạng dihydrodiol có sự xúc tác của dioxygenease Sau đó các dạng cis-dihydrodiol được

cis-chuyển hóa tiếp đến catechol bởi dehydrogenase Hợp chất catechol có thể được mở

vòng ở vị trí ortho- tạo cis,cis-muconic acid nhờ hệ enzyme intradiol hay vị trí

meta- tạo 2-hydroxymuconic semialdehyde nhờ hệ enzyme extradiol Các sản phẩm

trung này trải qua giai đoạn khoáng hóa tạo CO2

Trong một số vi sinh vật, khả năng phân hủy sinh học PAH tỷ lệ thuận với số lượng vòng benzene và trọng lượng phân tử của PAH đó (Heitkamp và Cerniglia, 1987) Cụ thể, 50% phân tử 3 vòng benzene là phenanthrene trong đất và trầm tích được phân hủy từ 16-126 ngày, trong khi 50% phân tử 4 vòng benzene là benzo[α]pyrene (BαP) mất khoảng 229-1400 ngày (Shuttleworth và Cerniglia, 1995)

Đối với các PAH có trọng lượng phân tử cao có từ 4 vòng benzene trở lên

như pyrene đã được nghiên cứu cụ thể trong chủng Mycobaterium vanbaalenii PYR-1 do quá trình loại 1 và 2 nguyên tử oxygene (Brezna et al., 2005) Dựa trên

cả đặc tính về gen và protein, Kim và cộng sự, 2007 đã xác định có 27 enzyme cần cho 25 bước tham gia vào quá trình phân hủy hoàn toàn pyrene theo con đường o- phthalate and the β-ketoadipate Những gen này thuộc tiểu phần β hoặc α của dioxygenase NdiAB2 được tìm thấy trong nhiều chủng vi khuẩn khác nhau (Kim et

al., 2007)

Quá trình phân hủy sinh học các hợp chất ô nhiễm áp dụng hạn chế với những vùng mà tập đoàn vi sinh vật bản địa phân huỷ không hiệu quả chất ô nhiễm hoặc các điều kiện môi trường tại đó không thuận lợi cho vi sinh vật, thời gian xử lý dài hơn, việc kiểm soát quá trình xử lý ô nhiễm khó tiến hành hơn và thường không khả thi với các vùng ô nhiễm quá nặng Để khắc phục những khó khăn trên, ứng

dụng biofilm cho xử lý nước ô nhiễm dầu đang là một hướng đi mới và có nhiều triển vọng bởi hệ vi sinh vật trong biofilm có khả năng phân huỷ nhiều loại hydrocarbon khác nhau giúp các chủng vi sinh vật có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác từ đó tăng cường quá trình phân hủy các chất ô

nhiễm (Chenget al., 2010)

Tính chất độc hại và cấu trúc khó bị phân hủy trong tự nhiên của PAH và phenol đã trở thành một vấn đề cấp bách đang được chú ý Các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu nhiều biện pháp hóa học, lý học, sinh học v.v… nhằm phân hủy PAH và phenol Việc làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất độc nhằm tạo ra các sản phẩm thân thiện với môi trường (ít độchoặc không độc) cho môi trường và con người mà giá thành thấp đang là một thách thức đối với các nhà khoa học và công

nghệ (Bao et al, 2012)

Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp sinh học có thể được tiến hành theo 2 hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học Trong khi tăng cường sinh học là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung

vi sinh vật vào các nơi bị ô nhiễm do hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân như: sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật Còn kích thích sinh học là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như: giá trị pH, nhiệt

độ, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, v.v…(Komarkova et al., 2003; Perelo, 2010; Suhaila et al., 2013; Zhou và Chen, 2013)

Khi kết hợp cả 2 biện pháp vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời bổ sung các nguồn dinh dưỡng để tạo

điều kiện tối ưu cho tập đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động tốt nhất thì hoạt động của tập đoàn vi sinh vật bản địa (cả các chủng vi sinh vật sau khi được phân lập và nghiên cứu các đặc tính quý) cùng với hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng

cường hiệu quả của quá trình xử lý (Komarkova et al., 2003)

Tại Việt Nam, để xử lý các hợp chất hữu cơ khó phân hủy trong đó có phenol hay PAH, thậm chí cả dioxin trong đất ô nhiễmbằng cách bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 và các hợp chất, vi lượng, thành phần xúc tác, các chất hoạt động bề mặt sinh học, phối hợp với sự thay đổi hàm lượng oxy và thay đổi độ

ẩm, hiệu quả của quá trình xử lý “chôn lấp tích cực” (kết hợp cô lập, hấp phụ,

chôn lấp và phân hủy sinh học), Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, 2005 sau hơn hai

năm xử lý rất rõ rệt Trong tất cả các lô xử lý, sau 8 đến 24 tháng, từ 50 đến 70% tổng độ độc đã bị giảm

Theo báo cáo của Tổng công ty Petrolimex thì nước thải nhiễm dầu tại phần lớn các kho xăng dầu và các cửa hàng xăng dầu hiện nay đều mới chỉ xử lý theo cơ học (bao gồm các bước lọc, lắng, gạt tuyển nổi và để tự nhiên cho quá trình phân hủy tự diễn ra) Hiện nay, mới chỉ có báo cáo của kho xăng dầu B12 – Quảng Ninh

về việc bổ sung các thành phần NPK nhằm kích thích các vi sinh vật bản địa sinh trưởng và phát triển, nhằm tăng cường khả năng tự phân hủy sinh học Hiện nay, có

2 mô hình xử lý sinh học hiếu khí nguồn nước ô nhiễm phenol và PAH điển hình đó

là sử dụng bùn hoạt tính (activated sludge reactor) và sử dụng màng lọc sinh học

(membrane bioreator-MBR) (Zheng et al., 2013)

1.4.1 Công nghệ sử dụng bùn hoạt tính

Bùn hoạt tính là phương pháp mà các vi sinh vật mà chủ yếu là vi khuẩn trong nước thải bám vào các chất lơ lửng trong đó để cư trú, sinh sản, phát triển và các vi sinh vật này sử dụng nguồn chất hữu cơ trong nước làm thức ăn đồng thời phân hủy chất hữu cơ làm tăng sinh khối và dần dần tạo thành các hạt bông gọi là bùn hoạt tính Cơ chế quá trình phân huỷ các chất hữu cơ của phương pháp bùn hoạt tính bao gồm các quá trình: Oxy hoá (phân huỷ) chất hữu cơ, tổng hợp tế bào (đồng hoá) và tự oxy hoá (hô hấp nội bào) Bùn hoạt tính sau khi xử lý sẽ lắng xuống đáy,

do vậy phải tháo lượng bùn cặn này ra Nếu không kịp thời tách bùn các sinh khối

vi sinh vật trong bùn sẽ tự phân hủy dẫn tới ô nhiễm nguồn nước thứ cấp, gây hiện tượng bùn khó lắng Nhưng nếu tháo bùn ra quá nhiều, nồng độ bùn hoạt tính trong nước không đủ dể phân hủy các chất hữu cơ dẫn tới giảm hiệu suất xử lý Một mô

hình xử lý sử dụng bùn hoạt tính được thể hiện ở Hình 1.6 (Zheng et al., 2013)

Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống xử lý bằng phương pháp bùn hoạt tính

lý Cơ chế hoạt động của vi sinh vật trong công nghệ MBR cũng tương tự như bể bùn hoạt tính hiếu khí nhưng thay vì tách bùn sinh học bằng công nghệ lắng thì công nghệ MBR lại tách bằng màng

Trong MBR, vi sinh vật, chất ô nhiễm, bùn hoàn toàn bị giữ lại tại bề mặt màng Đồng thời chỉ có nước sạch mới qua được màng Phần nước trong được bơm hút ra ngoài, phần bùn nằm lại trong bể và định kỳ tháo về bể chứa bùn.Vì kích thước lỗ màng MBR rất nhỏ (0,01 ~ 0,2 µm) nên bùn sinh học sẽ được giữ lại trong bể, mật độ vi sinh cao và hiệu suất xử lý tăng Nước sạch sẽ bơm hút sang bể chứa

và thoát ra ngoài mà không cần qua bể lắng , lọc và khử trùng.Máy thổi khí ngoài cung cấp khí cho vi sinh hoạt động còn làm nhiệm vụ thổi các màng này để hạn chế

bị nghẹt màng (Hình 1.7) (Zheng et al., 2013)

Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống xử lý bằng phương pháp MBR

(Nguồn: Zheng et al., 2013)

Hai công nghệ kể này có nhiều ưu điểm như hiệu quả xử lý BOD cao tuy nhiên cũng có nhiều hạn chế như: khi vận hành có thể phát tán bọt, chi phí điện cao, phải đầu tư thêm bơm tuần hoàn bùn, bơm thổi khí Ngoài ra, hệ thống vận hành phức tạp do sau khi oxy hóa được 80,5 đến 90% BOD trong nước thải, nếu không khuấy đảo hoặc thổi khí, bùn hoạt tính sẽ lắng xuống đáy, do vậy phải tháo lượng bùn cặn này ra Nếu không kịp thời tách bùn các sinh khối vi sinh vật trong bùn sẽ

tự phân hủy dẫn tới ô nhiễm nguồn nước thứ cấp, gây hiện tượng bùn khó lắng Nhưng nếu tháo bùn ra quá nhiều, nồng độ bùn hoạt tính trong nước không đủ dể phân hủy các chất hữu cơ dẫn tới giảm hiệu suất xử lý Bên cạnh đó, do lượng bùn

hoạt tính tháo ra sẽ được hồi lưu trở lại, nên luôn phải kiểm tra tuổi của bùn cũng như nồng độ bùn trong bể xử lý để đảm bảo cho quá trình xử lý đạt hiệu quả cao Hơn nữa, những công nghệ này có những khó khăn nhất định khi áp dụng ở những khu vực có nguồn nước thải phức tạp như tại các bể chứa nước thải của các kho xăng dầu Tại đây, quá trình xúc rửa bể chứa hàng năm cũng xả thải ra một lượng các hydrocarbon trong đó có các hợp chất vòng thơm khiến pH cũng như nhiệt độ trong nước thải thay đổi và điều này sẽ khiến hệ vi sinh vật bản địa khó thích nghi với điều kiện khó khăn từ đó sẽ làm giảm mật độ tế bào sinh vật do đó sẽ giảm hiệu suất xử lý

Chính vì vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài này với mục tiêu là nghiên cứu cơ bản bước đầu về việc ứng dụng biofilmdo tập hợp các vi sinh vật tạo thành

để xử lý các hợp chất hữu cơ khó phân hủy Trong biofilm các vi sinh vật sẽ liên kết chặt chẽ với nhau và hỗ trợ nhau vì mỗi chủng vi sinh vật sẽ có 1 ưu thế nhất định trong việc phân hủy 1 hợp chất hữu cơ Phương pháp sử dụng biofilm là sử dụng tập đoàn các vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu tốt được tạo biofilm và được bổ sung vào bể xử lý sinh học Khi được bao bọc bởi lớp màng EPS, biofilm có khả năng chống chịu các điều kiện môi trường thay đổi(thay đổi về pH, nhiệt độ, sự thẩm thấu hay sự mất nước của tế bào, v.v) tốt hơnvà hạn chế được sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác từ đó làm tăng hiệu suất phân hủy các hợp chất ô nhiễm khi xử lý ngoài hiện trường (Hình 1.8)

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống xử lý sử dụng biofilm

(1)-Bơm nước thải; (2)-Biofilm từ các chủng VSV; (3)-Sục khí; (4)-Van nước sau xử lý

1.5 MÀNG SINH HỌC (BIOFILM)

1.5.1 Khái niệm về biofilm

Biofilm là một tập hợp các vi sinh vật bám trên một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt đó Phần lớn các vi sinh vật sinh trưởng trên môi trường bán lỏng đều có khả năng tạo ra biofilm Khu hệ vi sinh vật trong biofilm có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh

vật khác (O’Toole et al., 2000)

1.5.2 Vi sinh vật tạo biofilm

Biofilm là cấu trúc thường gặp trong tự nhiên, trên 99% vi khuẩn sống trong biofilm và có thể hình thành trên bề mặt sống hoặc bề mặt như các váng trên mặt nước, cặn máy lọc, mô mềm v.v… Để tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt (thiếu dinh dưỡng;thay đổi của pH, nhiệt độ, v.v…) vi sinh vật phải học cách bám lên bề mặt, liên kết với các loài khác để cộng sinh và tự bảo vệ mình (Rastogi và Sani, 2011; Yamaga

et al., 2010)

Biofilm có thể được hình thành từ một chủng (biofilm đơn chủng) hoặc nhiều chủng vi sinh vật khác nhau (biofilm đa chủng), v.v….Trong tự nhiên, biofilm thường tồn tại ở dạng đa chủng Một nghiên cứu của đã chỉ ra rằng, biofilm

được tạo thành từ 4 loài vi khuẩn Microbacterium phyllosphaerae, Shewanella

japonica, Dokdonia donghaensis và Acinetobacter lwoffiicó mật độ cao hơn 167%

so với biofilm đơn chủng của các chủng đó tương ứng (Burmolle et al., 2006) Vi

khuẩn bám vào bề mặt theo nhiều cách khác nhau Một số vi khuẩn tự bản thân đã có tính kết dính nhờ lipopolysaccharides ngoại bào cộng với những đặc tính cấu trúc tế bào hỗ trợ cho việc di chuyển đến bề mặt là các phần phụ gốc proteins như lông nhung hoặc lông roi Các vi khuẩn khác chỉ tổng hợp chất kết dính cần thiết khi xuất hiện bề mặt cho chúng bám vào, điển hình như trong vòng 15 phút khi vi khuẩn gây viêm

đường hô hấp Pseudomonas aeruginosa gặp một mặt kính, nó sẽ kích hoạt ngay một

gen cần để tổng hợp polysaccharides, khi vi khuẩn đã gắn vào bề mặt, chúng phân chia và liên tục sản xuất nhiều polysaccharides để tạo nên màng sinh học hoàn

chỉnh (Barken et al., 2008)

Vi khuẩn trong biofilm có nhiều thuận lợi hơn là những vi khuẩn lơ lửng tự

do trong nước Trước hết, chúng chia sẻ thông tin di truyền và hỗ trợ trao đổi chất

cho nhau như trong biofilm ở cao răng, vi khuẩn Veillonella sử dụng lactate do vi khuẩn Streptococcus sinh ra Thứ hai, vi khuẩn trong biofilm được bảo vệ khỏi kẻ

thù và các hoá chất độc hại như các động vật nguyên sinh, các loại tảo độc hại

(Dinoflagellates - tảo roi) và khuẩn độc (Myxobacteria - niêm khuẩn); thuốc kháng sinh, hoá chất, kháng thể, tế bào miễn dịch, v.v … làm hại Ở P aeruginosa, khi xử

lý chất kháng sinh tobramycin với nồng độ 0,05 mg/ml đã làm giảm 82% khả năng sinh trưởng của vi khuẩn này nếu tồn tại ở dạng lơ lửng mà không ảnh hưởng gì nếu

tồn tại dưới dạng biofilm (Burmolle et al., 2006; Đăng Hưng, 2013)

Một số vi khuẩn có khả năng tạo biofilm phân theo nhóm vi khuẩn Gram Cụ

thể như nhóm vi khuẩn Gram (-) như:Pseudomnas aeruginosa, Pseudomnas

fluorescens, Escherichia coli và Vibrio choleraehay nhóm vi khuẩn Gram (+)

như:Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Bacillus, Rhodococcus và một số cầu khuẩn khác (Khusnuryani et al., 2014; Lu et al., 2012; Vanysacker et al.,

2013)

Sự hình thành biofilm được bắt đầu khi vi khuẩn có các tín hiệu môi trường trên bề mặt Những tín hiệu môi trường rất đa dạng tùy thuộc vào từng loài vi sinh

vật khác nhau Ví dụ như:P aeruginosa và P fluorescens sẽ hình thành biofilm

dưới mọi điều kiện mà chúng có thể sinh trưởng được(O’Toole và Kolter, 1998a)

Mặt khác, một số chủng như:E coli K-12và V cholerae không hình thành biofilm trong môi trường thiếu acid amine(Watnick và Kolter, 1999) Trong khi đó, E coli

O517:H7 chỉ có thể hình thành được biofilm trong môi trường cạn kiệt nguồn dinh dưỡng(Dewanti và Wong, 1995) Ngoài ra, hàm lượng dinh dưỡng, điều kiện môi trường như: nhiệt độ, nồng độ muối, pH, sắt và O2 cũng ảnh hưởng tới quá trình tạo biofilm (O’Toole et al.,2000; Watnick và Kolter, 1999)

Giống như nhóm vi khuẩn Gram (-), nhóm vi khuẩn Gram (+) cũng sản xuấtEPS hay còn gọi là “chất nhầy” khi chúng phát triển trên một bề mặt “Chất nhầy” ảnh hưởng tới sự phát triển của biofilm và giữ vai trò quan trọng trong việc

hình thành cấu trúc của biofilm.S epidermidis tăng khả năng tạo “chất nhầy”trong

môi trường thiếu sắt khi nguồn dinh dưỡng bị hạn chế (Deighton và Borland, 1993) Bên cạnh đó, việc sản xuất vỏ Polysaccharide/Adhesin có vai trò quan trọng tới việc tạo ra “chất nhầy” và cũng là bước quan trọng trong việc gắn kết các tế bào vi sinh

vật ở giai đoạn sau (Muller et al., 1993) Việc tương tác đầu tiên của tế bào và bề

mặt trải qua nhiều biến đổi do sự thay đổi của biểu hiện các gen Trong

Staphylococcus mutans, việc biểu hiện gen gtfBC (mã hóa cho việc chuyển hóa

glucosyl khi có mặt các polymer glucan) trong biofilm cao hơn từ 10-70 lần so với

các tế bào tự do, trong khi đó, gen ftf tham gia tổng hợp polymer có mứcbiểu hiện giảm khoảng 100 lần (Burne et al., 1997)

Bên cạnh vi khuẩn, nấm men là sinh vật điển hình thuộc nhóm vi sinh vật nhân thật có khả năng tạo biofilm Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nấm men có thể sử dụng nguồn ô nhiễm làm nguồn dinh dưỡng để sinh tổng hợp nên các chất hữu cơ và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất hữu ích Chính vì vậy,các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm và tìm được một số chủng nấm men có khả năng ứng

dụng trong lĩnh vực xử lý sinh học (Pathak et al., 2012)

Chủng nấm men Yarrowia lipolytica đã được chứng minh là có khả năng

phát triển trên các nguồn dinh dưỡng carbon như: nước thải nhà máy dầu cọ, phân hủy TNT và các hydrocarbon khác như: alkane, acid béo, chất béo và dầu mỏ

Chủng nấm men Rhodosporidium toruloides cũng đã được chứng minh là có khả

năng phân hủy sinh học dầu diesel (Mrinalini và Jayanthi, 2011).Cũng trong năm

2011, các tác giả Chandran và Das lần đầu tiên công bố các kết quả về việc sử dụng

nấm men Candida tropicalis tạo màng trên sỏi để xử lý dầu DO.Kết quả cho thấy,

sau 10 ngày, các viên sỏi được bao phủ bằng biofilm do chủng này tạo ra có khả năng phân hủy tới 97% dầu DO thí nghiệm Một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng các

chủng nấm men Cryptococcus terreus và Rhodotorula creatinivora sống trong điều

kiện lạnh 10oC có khả năng phân hủy phenol khi tạo biofilm trên các hạt zeolit tốt

hơn ở dạng tế bào tự do (Krallish et al., 2006)

1.5.3 Sự hình thành biofilm

Một quá trình hình thành điển hình của biofilm có thể được tóm tắt vào 3 giai

đoạn chính: Giai đoạn đầu là giai đoạn gắn, bị ảnh hưởng nhiều bởi các đặc tính bề mặt và tỷ lệ các vi sinh vật được vận chuyển đến bề mặt Hai giai đoạn sau là sự tăng sinh và tăng trưởng, bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vận chuyển và sự khuếch tán chất dinh dưỡng, lực cắt bề mặt của dòng chảy và tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật Biofilm sẽ phân giải khi việc sản xuất các polymer ngoại bào bị hạn chế do hậu quả của đột biến (Hình 1.9)

Hình 1.9 Chu trình hình thành biofilm

(Nguồn: Cheng et al., 2010)

Vi sinh vật bám vào bề mặt giá thể theo nhiều cách khác nhau Một số vi sinh vật tự bản thân nó đã có tính kết dính nhờ lipopolysaccharides ngoại bào cộng với những đặc tính cấu trúc tế bào hỗ trợ cho việc di chuyển đến bề mặt là các phần phụ gốc protein như lông nhung hoặc lông roi ở vi khuẩn Các vi sinh vật khác chỉ tổng hợp chất kết dính cần thiết khi xuất hiện bề mặt cho chúng bám vào, điển hình như

trong vòng 15 phút khi vi khuẩn gây viêm đường hô hấp Pseudomonas aeruginosa

gặp một mặt kính, nó sẽ kích hoạt ngay một gen cần để tổng hợp polysaccharides, khi vi khuẩn đã gắn vào bề mặt, chúng phân chia và liên tục sản xuất nhiều

polysaccharides để tạo nên màng sinh học hoàn chỉnh (Barken et al., 2008)

1.5.4 Thành phần, cấu trúc của biofilm

Một biofilm trong tự nhiên gồm 2 thành phần chính: Thành phần tế bào và EPS bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc đặc trưng cho biofilm (Hình 1.10) Trong đó, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tổng khối lượng biofilm, 3-6%

là EPS và ion, còn lại là nước Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phần ngoại bào khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đặc tính của từng loài vi khuẩn

cũng như cách thức hình thành biofilm của chúng(Andersson et al., 2009)

Hình 1.10 Cấu trúc mô phỏng của 1 biofilm (A) và cấu trúc hiển vi của biofilm do

chủng Bacillus subtilis tạo thành dưới kính hiển vi điện tử quét(B)

(Nguồn: Morikawa, 2006)

Tế bào vi khuẩn

EPS Kênh vận chuyển

(B) (A)

Cấu trúc biofilm bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào Mạng lưới các chất ngoại bào có vai trò quy định sự sắp xếp tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền nước bên trong biofilm Nhờ đó một dòng nước chảy có thể đi qua biofilm tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các

tế bào trong biofilm cũng như mang đi những chất thải không cần thiết (Dolan, 2002) Biofilm có cấu trúc không đồng nhất, bao gồm nhiều lớp vi khuẩn hiếu khí bên trên và nhiều lớp vi khuẩn kỵ khí bên dưới Do các luồng nước chảy qua khuấy động nên các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí song song tồn tại trong các hốc nhỏ phân

bố khắp trong biofilm Chiều dày của biofilm thay đổi từ một vài μm thậm chí đến vài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật, tuổi biofilm, lượng dinh dưỡng và áp lực dòng

chảy (Cheng et al., 2010)

Ngoài ra, cấu trúc của 1 biofilm chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: đặc tính, cấu trúc của bề mặt; sự khuếch tán, thành phần dinh dưỡng; lực hút giữa bề mặt với

vi sinh vật; khả năng sinh EPS; độ kết dính giữa các tế bào; sự tăng trưởng của các

vi sinh vật; lực cắt; nhiệt độ và pH, v.v (Cheng et al., 2010)

1.5.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển biofilm

Đa số các chủng vi sinh vật sẽ hình thành biofilm dưới mọi điều kiện mà chúng có thể sinh trưởng được(O’Toole và Kolter, 1998a) Chính vì vậy, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật cũng ảnh hưởng tới khả năng tạo biofilm của chúng

Chuyển hóa chất dinh dưỡng liên quan trực tiếp và phụ thuộc vào sự có mặt của các enzyme Vì vậy, có thể khẳng định rằng sự hình thành của một biofilm phụ thuộc vào sự có mặt và tốc độ phản ứng của các enzyme mà kiểm soát sự phát triển của các hệ thống sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn Nhiệt độ có tương quan với tốc

độ phản ứng của các enzyme vì vậy nó ảnh hưởng lên sự phát triển của các tế bào,

từ đó tác động đến quá trình hình thành biofilm Ngoài ra, nhiệt độ môi trường còn ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý của các hợp chất bên trong và xung quanh tế bào

(Garrett et al., 2008) Số lượng lông roi của tế bào vi khuẩn Listeria monocytogenes

phụ thuộc vào nhiệt độ Ở 35oC có 1 lông roi, trong khi ở 21oC chúng có 2 hoặc 3 lông roi, ở 10oC các tế bào này có thể biểu hiện tới một vài lông roi Như vậy, tương tác ban đầu giữa vi khuẩn và bề mặt để hình biofilm tăng theo chiều giảm nhiệt độ

do ở nhiệt độ thấp các polysaccharides có cấu trúc đồng nhất hơn (Herald và Zottola, 1988)

Bên cạnh yếu tố nhiệt độ thì pH ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Tế bào vi khuẩn có các kênh proton liên kết với màng vì thế

mà các proton vận chuyển từ màng sinh chất tạo nên một lực đẩy proton Dòng vận chuyển proton theo gradient điện thế, đáp ứng với lực vận chuyển proton để điều hòa pH trong bào tương Những đáp ứng vi khuẩn đến thay đổi pH bên trong và bên ngoài tế bào thông qua sự điều chỉnh các hoạt động, tổng hợp các protein và liên quan đến nhiều quá trình tế bào khác nhau mà trực tiếp là việc sản xuất các polymer ngoại bào (Garrett et al., 2008)

Ngoài 2 yếu tố nhiệt độ và pH thì nồng độ muối NaCl tác động trực tiếp lên

sự hình thành biofilm thông qua đáp ứng với một số gen quy định cho sự hình thành, phát triển biofilm và tác động gián tiếp qua ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng

độ muối thấp hơn 2%, nhưng cũng có một số loại vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa nồng độ muối trên 30%, đó là các vi khuẩn ưa muối (halophilic)

như: Halobacterium, Natronococcus, v.v… (Nester et al., 1978)

Nguồn dinh dưỡng như: Carbon (C), nitrogen (N), là các chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi sinh vật Tuy nhiên, nồng độ dinh dưỡng trong môi trường quá cao cũng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật do vậy ảnh

hưởng đến quá trình hình thành biofilm (O’Toole et al., 2000) Vi sinh vật có khả

năng đồng hóa nhiều loại C và N khác nhau, trong đó nguồn C có thể là các loại carbonhydrate đơn giản như: đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như: tinh bột, cellulose, xylan Còn nguồn N tồn tại ở dạng vô cơ như: urea, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử như: cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tương, bột cá hay peptone Tùy loài vi sinh vật mà nguồn N được sử dụng là

khác nhau Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại N để sinh trưởng lại phụ thuộc vào từng loài

1.5.6 Ứng dụng của biofilm trong phân hủy sinh học

Ứng dụng biofilm trong phân hủy sinh học cho hiệu quả xử lý và có tính an toàn hơn đã thay thế cho xử lý sinh học với các vi sinh vật dạng tự do Các tế bào trong biofilm dễ thay đổi để thích ứng và tồn tại đặc biệt suốt thời kỳ bị áp lực,

giống như chúng được bảo vệ trong khung polymer ngoại bào (Kokare et al., 2009)

Với mật độ sinh khối cao, mối quan hệ gần gũi, các tương tác vật lý và sinh lý hỗ trợ giữa các vi sinh vật trong biofilm mà việc sử dụng các chất độc hại tốt hơn thông qua khả năng cố định các hợp chất nhờ hấp phụ sinh học, sự tích lũy sinh học (tăng

sự tích tụ của vi khuẩn dưới nguồn ô nhiễm), và sự khoáng hóa, do đó, biofilm được

ứng dụng xử lý sinh học theo nhiều hướng (Bayat et al., 2017; Singh et al., 2006)

Tại Mỹ, Châu Âu (Hà Lan, Đức, v.v…) và Nhật Bản hệ thống biofilm đã được ứng dụng thành công và hiệu quả trong xử lý mùi Đây là một phương pháp hấp dẫn để xử lý các chất khí có mùi hôi và các hợp chất hữu cơ bay hơi có nồng độ thấp Trong hệ thống này, các vi sinh vật sẽ tạo thành một màng sinh học Đây là một màng mỏng và ẩm bao quanh các nguyên liệu lọc Trong quá trình lọc, khí thải được bơm chậm, xuyên qua hệ thống lọc, các chất ô nhiễm trong khí thải sẽ bị các vật liệu lọc hấp thụ Các chất gây ô nhiễm sẽ bị hấp phụ bởi màng sinh học Tại đây, các vi sinh vật sẽ phân hủy chúng để tạo nên năng lượng và các sản phẩm cuối cùng

là khí cacbonic và nước Hệ thống biofilm trước đây thường được thiết kế để xử lý mùi của các hệ thống xử lý nước thải, các nhà máy tái chế, quá trình ủ phân compost Sau đó, nó được ứng dụng phổ biến trong việc xử lý các hợp chất hữu cơ

bay hơi và các hợp chất hữu cơ khác (Morikawa, 2006; Neria-Gonzalez et al., 2006)

Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu sử dụng biofilm do các chủng vi sinh

vật tạo thành trong xử lý các hydrocarbon thơm như: benzene, naphthalene, phenol,

toluen, xylen, v.v (Meliani và Bensoltane, 2014; Shukla et al., 2014; Yamaga et al.,

2010) Ứng dụng biofilm trong phân hủy các hợp chất hữu cơ đã được nghiên cứu

từ những năm 1989 Nghiên cứu của nhóm tác giả Hettige và Sheridan (1989) cũng

chứng minh các loài Hormoconis resinae, Penicillium corylophilum và

Paecilomyces variotii sinh trưởng tốt trên dầu DO và có khả năng tạo biofilmrất tốt

Bên cạnh đó, các loài Hormoconis resinae và Aspergillus fumigatus phân lập từ các

mẫu ô nhiễm dầu diesel cũng được ghi nhận khả năng sinh trưởng tốt của chúng

trên nguồn cơ chất này (Lin et al., 2014)

Chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus P23 được phân lập từ khu hệ rễ bèo Lemna aoukikusa có khả năng tạo biofilmvà phân hủy phenol tốt hơn dạng tế bào tự do (Yamaga et al., 2010) Shimada và cộng sự, 2012 đã sử dụng chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri T102 phân lập từ các mẫu đất nhiễm dầu để tạo

biofilmvà chứng minh khả năng phân hủy tốt naphthalen của chủng này ở dạng tạo

biofilmhơn ở dạng tế bào tự do Hai chủng vi khuẩn thuộc chi Vibrio và

Acinetobacter đã được phân lập từ các mẫu đất nhiễm dầu thô ở Vịnh Bohai, Trung

Quốc có khả năng sinh trưởng tối ưu trên NaCl lên tới 70 g/l với dải pH từ 5,6 – 8,6

và ở dạng tạo biofilmthì khả năng phân hủy các hydrocarbon no cao hơn 30% so với

tế bào ở dạng tự do(Lin et al., 2014) Bên cạnh đó, bioiflm do chủng Acinetobacter

sp BS8Y tạo thành khi được gắn trên polyvinyl alcohol có khả năng phân hủy phenol tốt hơn so với dạng tự do và có thể tái sử dụng 10 lần khi được bảo quản ở

4oC trong 35 ngày (Jiang et al., 2013)

Đặc biệt, biofilmđa chủng được tạo thành từ 5 chi vi khuẩn là: Polaromonas,

Sphingomonas, Alcaligenes, Caulobacter và Variovorax phân lập từ các mẫu lấy ở

Bắc cựccó khả năng phân hủy 20 µg/ml pyren và 39 µg/ml phenanthrene sau 60

ngày nuôi cấy (Erikssonet al., 2003) Bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh thông thường, 2 chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng phân hủy pyrene rất tốt đã được phân lập từ biofilm này (El-Masry et al, 2004)

Tại Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng biofilmcòn ở mức độ phòng thí nghiệm