Nghiên cứu sự biến đổi của super oxidase dimutase, glutathion peroxidase và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) ở bệnh nhân viêm gan b mạn tính (tt)

Các enzym như superoxid dismutase SOD và glutathionperoxidase GPx là những enzym chống oxy hóa cơ bản nhất của cơthể, trong đó SOD có tác dụng thu dọn các gốc tự do khơi mào phảnứng; GPx

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong các bệnh gan mạn tính, viêm gan vi rút B là một bệnhtruyền nhiễm ở người do vi rút viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV)gây nên, một bệnh để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng Nhiễm HBVmạn tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng trong sinh bệnh học củaviêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan Đột biến vùng lõi, vùngPres và gen X là những yếu tố quan trọng trong sinh bệnh học củaung thư biểu mô tế bào gan Cả hai yếu tố này đều được gắn liền vớiquá trình stress oxy hóa, quá trình này có thể gây tổn thương lipid,protein và DNA ở mức độ tế bào Ngoài ra stress oxy hóa cũng liênquan đến mức độ của bệnh, ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạntính, quá trình peroxy hóa lipid và tổn thương DNA tăng cao

Các enzym như superoxid dismutase (SOD) và glutathionperoxidase (GPx) là những enzym chống oxy hóa cơ bản nhất của cơthể, trong đó SOD có tác dụng thu dọn các gốc tự do khơi mào phảnứng; GPx có tác dụng làm giảm nồng độ các gốc tự do hoạt động.Bên cạnh đó, tình trạng chống oxy hoá toàn phần trong cơ thể (TAS)

có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc dự báo khả năng đáp ứng

cơ thể với hiệu quả loại bỏ gốc tự do sinh ra Nhiều nghiên cứu chothấy hoạt độ SOD, GPx và nồng độ TAS giảm đáng kể ở nhóm bệnhnhân viêm gan B mạn tính so với nhóm chứng khỏe mạnh hoặc nhómngười mang vi rút không triệu chứng; đồng thời theo một số tác giảqua việc xác định hoạt độ của các chất chống oxy hóa có thể đánh giátình trạng stress oxy hóa

Những vấn đề này ở Việt Nam chưa được nghiên cứu có hệthống ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính Vì vậy, chúng tôi thực hiện

đề tài này nhằm mục tiêu:

1 Xác định hoạt độ SOD, GPx và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

2 Đánh giá mối liên quan hoạt độ SOD, GPx và TAS trong huyết tương với lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan

B mạn tính.

2 Tính cấp thiết

Ở trạng thái bình thường, trong cơ thể người luôn hình thànhmột sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các chất chống oxyhóa Khi sự cân bằng này mất đi sẽ xuất hiện tình trạng gia tăng cácdạng oxy hoạt động và được gọi là trạng thái stress oxy hóa Viêm

gan vi rút B là bệnh truyền nhiễm do vi rút viêm gan B (HBV) gâynên với nhiều hậu quả nghiêm trọng HBV có cấu trúc kháng nguyênrất phức tạp với những thể đột biến như đột biến vùng nhân và trướcnhân, đột biến ở gen X Một số nghiên cứu gần đây cho thấy tìnhtrạng đột biến này có liên quan đến trạng thái stress oxy hóa của cơthể.

Trong số các chất chống oxy hóa, các enzym như SuperOxidase Dismutase (SOD) và Glutathion Peroxidase (GPx) là nhữngenzym chống oxy hóa cơ bản nhất của cơ thể Bên cạnh đó, tình trạngchống oxy hóa toàn phần trong cơ thể (TAS) có ý nghĩa rất quantrọng trong việc dự báo khả năng đáp ứng của cơ thể với hiệu quảloại bỏ các gốc tự do Nghiên cứu về vai trò của SOD, GPx và TAStrong viêm gan B mạn tính là việc làm cần thiết, góp phần làm sáng

tỏ thêm cơ chế bệnh sinh của bệnh

3 Những đóng góp mới của luận án

Nghiên cứu đã xác định được hoạt độ enzym SOD, GPx và trạngthái chống oxy hóa toàn phần (TAS) ở bệnh nhân viêm gan B mạntính đều thấp hơn so với nhóm chứng (p < 0,001) Điều này chứng tỏvai trò của SOD, GPx và TAS trong cơ chế bệnh sinh của viêm gan Bmạn tính: khi hoạt độ các chất chống oxy hóa giảm sẽ làm gia tăngtrạng thái stress oxy hóa, góp phần làm tổn thương gan và các chứcphận khác trong cơ thể

Nghiên cứu cũng đã xác định có mối liên quan giữa hoạt độenzym GPx trong huyết tương với ALT, AST, GGT huyết thanh,đồng thời xác định có mối liên quan giữa hoạt độ TAS trong huyếttương với mức độ viêm khoảng cửa

4 Bố cục của luận án:

Luận án được trình bày 107 trang bao gồm: đặt vấn đề 2 trang,tổng quan 35 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20 trang,kết quả nghiên cứu 23 trang, bàn luận 24 trang, kết luận 2 trang, kiếnnghị 1 trang

Luận án có 39 bảng, 3 biểu đồ, gồm 118 tài liệu tham khảotrong đó có 17 tài liệu tiếng Việt và 101 tài liệu tiếng Anh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số hiểu biết về gốc tự do trong y sinh học

1.1.1 Khái niệm về gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử

mà lớp ngoài cùng của chúng có các điện tử đơn độc ở quỹ đạo ngoàicùng (điện tử không cặp đôi), chúng có thể mang điện tích âm hoặckhông mang điện và có khả năng phản ứng cao Quá trình sinh gốc tự

do, là một quá trình chuyển hóa bình thường của cơ thể

Bình thường gốc tự do tồn tại trong cơ thể với nồng độ thấp vàtham gia vào một số chức năng sinh lý nhất định Với việc nhậnmột điện tử đầu tiên oxy đã tạo ra gốc superoxyd (O2-), gốc tự do đãhình thành và có khả năng phản ứng cao như hydro peroxyd (H2O2),oxy đơn bội (1O2), gốc hydroxyl (HO-), lipid peroxyd (LO-)…, người

ta gọi là dạng oxy hoạt động

1.1.2 Đặc điểm của gốc tự do (R ∙ )

Các gốc tự do có tính oxy hóa rất mạnh, có xu hướng lấy điện

tử của phân tử bên cạnh ghép đôi với điện tử của gốc tự do Phân tử

bị mất điện tử lại trở thành gốc tự do mới và tác dụng cứ lan truyền,đây chính là nguyên nhân sinh ra chuỗi phản ứng gốc

Tất cả các gốc tự do của oxy và dạng oxy hoạt động được gọi

là các chất oxy hóa (oxydant) hoặc tác nhân gây stress oxy hóa.

1.1.3 Quá trình hình thành các gốc tự do

Các gốc tự do trong cơ thể được tạo ra thường xuyên: quachuỗi hô hấp tế bào, tác nhân phóng xạ, hội chứng viêm, trong hiệntượng thiếu máu cục bộ - tưới máu lại, các tác nhân xenobiotic vàmột số tác nhân khác

1.1.4 Trạng thái Stress oxy hóa

Trong cơ thể luôn hình thành một sự cân bằng giữa các dạngoxy hoạt động và các chất chống oxy hóa Nếu vì một lý do nào đó(cơ thể nhiễm xạ, hóa chất, độc tố, nhiễm vi rút, viêm nhiễm cấptính ) sẽ làm gia tăng các dạng oxy hoạt động, khi đó không còn sựcân bằng giữa các chất oxy hóa và chất chống oxy hóa, người ta gọi

đó là trạng thái stress oxy hóa Nếu stress oxy hóa ở mức độ nhẹ, cácphân tử sinh học bị tổn thương có thể được sửa chữa hoặc thay thế Ởmức độ nặng nề hơn, stress oxy hóa có thể gây tổn thương không hồiphục hoặc chết tế bào

1.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể

Hệ thống chống oxy hóa (antioxydant - system) của cơ thể rất

đa dạng và phức tạp bao gồm các enzym và các chất không có bảnchất enzym Trong cơ thể luôn tồn tại các dạng oxy hoạt động, đồngthời cũng tồn tại một hệ thống chống oxy hóa để loại bỏ các tác hạicủa chúng

1.2.1 Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym

1.2.1.1 Superoxyd dismutase (SOD)

Superoxyd dismutase là một enzym chống oxy hóa có chứakim loại thuộc lớp oxydoreductase thực hiện chức năng xúc tác phảnứng chuyển hóa superoxyd thành O2 và H2O2:

2 O 2 - + 2H+ 2H2O + O2

Hoạt độ SOD càng cao thì nồng độ O 2 - càng giảm đi SOD là

một chất chống oxy hóa rất cơ bản, làm hạ thấp nồng độ O 2 - là chấtkhởi đầu cho phản ứng tạo sinh tất cả các dạng ROS (Reactiveoxygen species) khác

1.2.1.3 Peroxydase

Peroxydase là một nhóm enzym xúc tác các phản ứng oxy hóakhử, thuộc lớp oxydoreductase

peroxydase

AH2 + H2O2 A + 2H2O

* Vai trò và tính chất của peroxydase: Cũng như catalase và

SOD, peroxydase là những enzym chống oxy hóa quan trọng trong

hệ thống sinh học Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào bằngcách chuyển hóa H2O2 thành H2O

1.2.1.4 Glutathion peroxydase

Các enzym chống oxy hóa và glutathione đóng một vai tròquan trọng trong việc bảo vệ chống lại ROS Glutathion peroxydase

(GPx) là enzym xúc tác phản ứng loại bỏ các peroxyd hữu cơ và vôcơ:

ROOH + 2GSH GS-SG + ROH + H2O2

Hoạt độ của GPx và catalase phụ thuộc vào nồng độ H2O2 Khinồng độ H2O2 cao, GPx bị ức chế và chỉ có catalase hoạt động.Ngược lại, khi nồng độ H2O2 còn lại rất thấp, catalase không còn tácdụng thì GPx lại được hoạt hóa, xúc tác phản ứng phân hủy H2O2, hệthống glutathion peroxydase bao gồm GPx, GR và G6PDH đây là hệthống phòng thủ chống lại những tổn thương gây nên bởi quá trìnhoxy hóa

1.2.2 Hệ thống chống oxy hoá có bản chất không enzym

Đây là hệ thống “bẫy” gốc tự do Hệ thống này hỗ trợ hệ thốngchất chống oxy hóa có bản chất enzym Những chất này cần đượccung cấp thêm, hỗ trợ từ bên ngoài thông qua thực phẩm và các chất

bổ sung đưa vào cơ thể

1.2.3 Trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS)

TAS (total antioxydant status) là tình trạng chống oxy hóa toànphần của huyết tương dựa trên khả năng ức chế của các chất chốngoxy hóa TAS được quy cho các chất chống oxy hóa có trong cơ thểchúng gồm nhiều hệ thống bảo vệ nhằm chống lại những ảnh hưởng

có hại của các gốc tự do và hiện tượng peroxyd có hại đối với cơ thể.1.3 Bệnh gan mạn tính do vi rút B

1.4 Stress oxy hóa trong bệnh lý viêm gan B mạn tính

1.4.1 Stress oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Mặc dù ROS và RNS là những dấu hiệu có giá trị tốt nhấttrong đánh giá trạng thái stress oxy hóa, nhưng ROS và RNS lànhững chất không ổn định và dễ bay hơi Do đó, để đánh giá trạngthái stress oxy hóa do ROS và RNS gây ra, chúng ta có thể xác địnhthông qua các "sản phẩm phụ" được ROS / RNS in dấu trên cácprotein, lipid và DNA hoặc thông qua hoạt độ một số enzym chốngoxy hóa như superoxyd dismutase (SOD), glutathion peroxydase(GPx) và trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS) của cơ thể để cóthể đánh giá tình trạng stress oxy hóa Mức độ tổn thương gan gây rabởi sự stress oxy hóa phụ thuộc vào hai yếu tố: (i) các loại và sốlượng của gốc tự do và thời gian duy trì của nó trong cơ thể , (ii) sựsẵn có của cơ chế phòng vệ phù hợp tế bào Nó là sự cân bằng giữahai quá trình đối lập mà cuối cùng quyết định sự đóng góp của stress

oxy hóa vào sinh bệnh học tổn thương gan trong các bệnh gan mạntính.

1.4.2 Vai trò của các chất chống oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Một số nghiên cứu đã cho thấy sự thiếu hụt chất chống oxyhóa ở bệnh nhân viêm gan B có thể gây trở ngại cho hiệu quả của quátrình điều trị Vì vậy, hệ thống các chất chống oxy hóa này cần đượctăng cường để giảm stress oxy hóa và cải thiện kết quả điều trị

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 2 nhóm (nhóm bệnh vànhóm chứng) Đối tượng được chọn vào 2 nhóm tương đương nhau

về tuổi và giới

- Nhóm bệnh: gồm 55 bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan Bmạn tính điều trị nội trú tại Khoa Nội truyền nhiễm Bệnh viện 103trong thời gian từ tháng 4/ 2013 – tháng 1/ 2015

- Nhóm chứng: 50 quân nhân khỏe mạnh

2.1.1 Nhóm bệnh

2.1.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

55 bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan vi rút B mạn tínhtheo tiêu chuẩn của Hiệp hội nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ (AASLD)2009

- HBsAg (+) > 6 tháng

- Xét nghiệm AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục

- Nồng độ HBV – DNA > 105 copies/ml và HBeAg (+) hoặcHBV – DNA > 104 copies/ml và HBeAg (-)

- Điểm mô bệnh học HAI ≥ 4

Trong đó tiêu chuẩn vàng là điểm mô bệnh học HAI ≥ 4

2.1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Loại khỏi nghiên cứu các bệnh nhân sau:

- Không đáp ứng được tiêu chuẩn lựa chọn

- Bệnh nhân đang được điều trị bằng thuốc kháng virus

- Bệnh nhân nghiện rượu, nghiện thuốc lá, tiếp xúc với hóachất độc hại

- Anti HCV (+), anti HIV (+)

- Bệnh nhân mắc các bệnh cấp tính, mạn tính khác kèm theo

- Bệnh nhân xơ gan, ung thư gan

- Trẻ em, phụ nữ có thai

- Bệnh nhân không hợp tác nghiên cứu

2.1.2 Nhóm chứng

- Số lượng: 50 quân nhân tại ngũ, không nhiễm vi rút viêm gan B

- Tiêu chuẩn lựa chọn:

+ Lâm sàng khỏe mạnh

+ ALT, AST, GGT trong giới hạn bình thường

+ HBsAg âm tính, anti HCV âm tính

+ Loại trừ các bệnh cấp tính, mạn tính, các trường hợp nghiệnrượu, nghiện thuốc lá, tiếp xúc với hóa chất độc hại bằng khám lâmsàng và hỏi bệnh

+ Tình nguyện tham gia nghiên cứu và có chữ ký xác nhận

2.2 Phương pháp nghiên cứu.

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu.

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang, có so sánh đối chứng

2.2.2 Cỡ mẫu

- Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện cho cả 2 nhóm

- Nhóm chứng: 50 người trưởng thành khỏe mạnh

- Nhóm bệnh: Trong khoảng thời gian từ tháng 4/ 2013 – tháng1/2015 có 55 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn lựa chọn vào nghiên cứu

2.2.3 Phương tiện nghiên cứu

- Bộ kit ELISA định lượng hoạt độ SOD, GPx và TAS ở ngườicủa hãng Sunlong Biotech (Trung Quốc) Các Bộ kit Elisa đạt tiêuchuẩn ISO-9001-9002

- Một số máy móc, trang bị, phương tiện khác

2.3 Nội dung và chỉ tiêu nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu lâm sàng

2.3.2 Nghiên cứu cận lâm sàng

2.3.2.1 Xét nghiệm tế bào máu ngoại vi

2.3.2.2 Xét nghiệm hoá sinh máu

+ Lưu trữ trong hộp lạnh chuyên dụng, chuyển đến Bộ môn Sinh

lý bệnh – Học viện Quân y trong vòng 30 phút

+ Ly tâm, tách huyết tương ở tốc độ 3000 vòng/ phút, trong 15phút

+ Lưu giữ huyết tương trong tủ lạnh âm sâu 800C

- Thời điểm lấy máu: Bệnh nhân được lấy máu khi vào viện,

nhưng trước khi được điều trị đặc hiệu bằng thuốc kháng vi rút

- Đo mật độ quang (OD) tại Bộ môn Sinh lý bệnh – Học việnQuân y bằng máy đọc ELISA DAR 800

- Xây dựng đường cong chuẩn và tính toán kết quả bằng phầnmềm micorosoft Excel 2013 Đơn vị tính: U/ml

2.3.4 Sinh thiết gan

Đánh giá mức độ hoạt động của viêm gan mạn tính dựa vàochỉ số hoạt động mô bệnh học (HAI)

2.5 Xử lý số liệu

Theo phương pháp thống kê y học, sử dụng phần mềm SPSS

13

2.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

- Đảm bảo y đức trong nghiên cứu

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu và nhóm chứng.

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Bảng 3.4 Xét nghiệm Enzym gan

Xét nghiệm Enzym gan Số BN (n=55) Tỷ lệ %

HBV-DNA trung bình (Log10 bản sao/ml) 7,23 ± 1,52 (4,08 – 10)

Bảng 3.7 Đặc điểm tổn thương gan trên mô bệnh học

Đặc điểm tổn thương Số BN (n=55) Tỷ lệ %

Tổn thương

hoại tử

Kiểu mối gặm vừa +

3.2 Xác định hoạt độ SOD, GPx và tình trạng chống oxy hóa

toàn phần (TAS) huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Bảng 3.9 Tỷ lệ bệnh nhân định lượng được hoạt độ SOD, GPx

và TAS trong huyết tương

a: test Chi bình phương b: test Fisher’s 2 phía.

Bảng 3.10 Hoạt độ SOD (U/ml) ở bệnh nhân viêm gan

B mạn tính

Chỉ tiêu so sánh Nhóm bệnh(n=42) Nhóm chứng(n=43) p

p* <0,001

p*: kiểm định Mann – Whitney

Bảng 3.11 Hoạt độ GPx (U/ml) ở bệnh nhân viêm gan B

mạn tính

Chỉ tiêu so sánh Nhóm bệnh (n=54) Nhóm chứng(n=50) p

p* < 0,001

p*: kiểm định Mann – Whitney

Bảng 3.12 Hoạt độ TAS (U/ml) ở bệnh nhân viêm gan

B mạn tính.

Chỉ tiêu so sánh Nhóm bệnh(n=46) Nhóm chứng(n=50) p

p* < 0,001

p*: kiểm định Mann – Whitney

3.3 Đánh giá mối liên quan hoạt độ SOD, GPx và TAS trong huyết tương với lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan

Bảng 3.23 Mối liên quan giữa TAS với enzym gan

TAS

Enzym gan

Dưới ngưỡng phát hiện

Bảng 3.24 Mối liên quan giữa hoạt độ SOD với Enzym gan

(U/ml) ( ± SD)

Trung vị

p*

ALT

< 2 lần GTBT (p1) 13 10,72 ± 14,32 3,34 p1p2= 0,48

p1p3= 0,42p2p3= 0,07

2 – 5 lần GTBT(p2) 12 10,09 ± 13,63 4,07

> 5 lần GTBT(p3) 6 3,93 ± 4,64 2,20

p*: kiểm định Mann - Whitney

Bảng 3.25 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx với enzym

gan

(U/ml) (  ± SD)

Trung vị

p*

ALT

< 2 lần GTBT(p1) 17 27,31 ± 48,13 8,8 p1p2= 0,39

p1p3= 0,51p2p3= 0,09

22

17 24 21

Biểu đồ 3.7 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx và enzym AST

17

30

24 21

Biểu đồ 3.8 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx với enzym GGT