Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật Lê Thị Thanh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số
Trang 1Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật
Lê Thị Thanh
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số 60 42 01 14 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Tường Vân; PGS TS Võ Thị Thương Lan
Năm bảo vệ: 2013
Abstract Thiết kế thành công các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 Đồng thời các
đoạn gen này đã được dòng hóa thành công vào vector tách dòng pBT/T và lưu trữ trong tế bào vi khuẩn E coli DH 5α Thiết kế thành công các vector chuyển gen pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-ltb-gp3 bằng kỹ thuật Gateway qua hai phản ứng BP và LR Tạo được các chủng Agrobacterium tumefaciens mang các vector chuyển gen trên Đã chuyển thành công các gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sàng lọc được dòng BY-2 mang gen ltb-gp5 biểu hiện ra
sản phẩm protein
Keywords Tế bào thực vật; Vi rút PRRS; Sinh học thực nghiệm; Thiết kế Vector; Gen
Content
MỞ ĐẦU
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có khả năng lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế Ở Việt Nam bệnh còn được gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh Đặc trưng của bệnh là hiện tượng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đường
hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987 Sau đó xuất hiện ở nhiều nước chăn nuôi lợn theo phương thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990);
Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)… Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nước khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn
Trang 2tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn Ước tính hàng năm nước Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trường
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam Tuy nhiên các dịch bệnh nặng chỉ được thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Đến nay bệnh đã trở nên khó có thể kiểm soát được và lây lan ngày càng rộng hơn do tập quán và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt Nam
Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp vẫn được sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y Gần đây chỉ có một số lượng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhược độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu Tuy nhiên vắcxin dạng này có một số nhược điểm như vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thườ ng không cao, còn vắcxin nhược độc tạo ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tương đồng nhưng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống PRRSV dạng này nhưng giá thành khá cao, hiệu quả lại thấp và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút
Vắcxin thực vật hay còn go ̣i là vắcxin ăn được (edible vaccine) là một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn So với các
hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ưu điểm như: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt
độ phòng nên dễ bảo quản và sử dụng; có thể dùng qua đường miệng như ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ; an toàn; đặc biệt vắcxin ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm
Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài
“Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật”, được tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế về KH&CN theo nghị định thư giữa hai nước Việt Nam –
Vương Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) của virus gây
bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương” giai đoạn 2011-2013 Đề tài được tiến hành
tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho một số kháng nguyên của
vi rút PRRS vào tế bào thực vật và ii) Đánh giá hiệu quả sử dụng của các vector thông qua việc phân tích sự biểu hiện của các kháng nguyên trong tế bào thuốc lá BY-2
Reference
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2007), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 12
tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2007
Trang 32 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 12
tháng năm 2008, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2008
3 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2009), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 12
tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2009
4 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2010), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 12
tháng năm 2010, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2010
5 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2011), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 12
tháng năm 2011, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2011
6 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2012), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 12
tháng năm 2012, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2012
7 Bùi Mỹ Duyên (2012), Thiết kế vector biểu hiện một số kháng nguyên của virus lợn tai
xanh (PRRSV) trong tế bào thuốc lá, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Đại học
Mở
8 Đậu Ngọc Hào , Văn Đăng Kỳ , Nguyễn Văn Long , Tiêu Quang An (2008), “Mô ̣t số đă ̣c điểm di ̣ch tễ Hô ̣i chứng sinh sản và hô hấp (PRRS) ở lợn từ cuối tháng 3 đến đầu tháng
7/2008 tại một số tỉnh trong cả nước”, Tạp chí Khoa học và Kỹ thuật Thú y, (5), tr 14-20
9 Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hương,Trần Quang Vui, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Bá Hiến (2009), “Phân tích gen M mã hoá protein màng của virus
gây bệnh lợn tai xanh”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, (7), tr 282 – 290
10 Nguyễn Thị Thanh Huyền, Chuẩn hóa phương pháp chuyển gen vào tế bào thuốc lá BY-2
nhằm biểu hiện protein HA của vius H5N1, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Đại
học Mở
11 Võ Thị Thương Lan (2004), Sinh ho ̣c phân tử, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội
12 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Giáo trình Công nghệ gen
trong nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế
13 Lê Quỳnh Liên , Phan Tro ̣ng Hoàng , Đỗ Xuân Đồng , Chu Hoàng Hà , Lê Trần Bình (2008), “Biểu hiện kháng nguyên glycoprotein của virus dại trên cây thuốc lá chuyển
gen”, Tạp chí CNSH, (6), tr 445-452
14 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào , Nhà xuất
bản Đại học Quốc gia Hà Nội
15 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất bản Giáo dục
Việt nam
16 Trịnh Thị Trang Nhung (2010), Biểu hiện và tinh sạch peptide kháng khuẩn Cecropin,
Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 417 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), “Công nghệ gen thực vật”, Hội nghị Khoa học và công nghệ 2007,5, tr 345-411
18 Nguyễn Tường Vân (2011), “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein vỏ Glycoprotein (GP5) của virus gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương”, Thuyết minh nhiệm
vụ hợp tác quốc tế về KH&CN theo Nghị định thư, tr 1-25
Tài liệu tiếng Anh
19 Ansari, I.H., Kwon, B., Osorio, F.A., Pattnaik, A.K (2006), “Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus
infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies”, J Virol, (80), pp
3994–4004
20 Arakawa T, Chong DK, Merritt JL and Langridge WH (1997), “Expression of
cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants”, Transgenic Research,
(6), pp 403-413
21 Arntzen C, Plotkin S, Dodet B (2008), “Plant-derived vaccines and antibodies: potential
and limitations”, Vaccine, (23), pp 1753–1756
22 Aziz MA, Singh S, Kumar PA and Bhatnagar R (2002), “Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against
anthrax”, Biochemical and Biophysical Research Communications, (299), pp 345-351
23 Chia MY, Hsiao SH, Chan HT, Do YY, Huang PL, Chang HW, Tsai YC, Lin CM, Pang
VF, Jeng CR (2010), “Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine
reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant”, Vet Immunol
Immunopathol, 135, pp 234-242
24 Dalsgaard K, Uttenthal A Jones TD, Xu F Merryweather A, Hamilton WDO, Langcveld JPM, Boshuizen RS, Karnstrup S Lomonossoff GP, Porta C, Vela C, Casa] JI, Meloen RH, Rodgers PB (1997), “Plant-derived vaccine protects target animals against a
viral disease”, Nat Biotechnol, 15, pp 248-252
25 Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K (2001), “Medical molecular farming: production of
antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants”, Trends Plant Sci, 6, pp
219-226
26 Diaz I, Darwich L, Pappaterra G, Pujols J, Mateu E (2006), “Different European-type vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus have different
immunological properties and confer different protection to pigs”, Virology, 351, pp
249–259
Trang 527 Dus Santos MI, Wigdorovitz A, Trono K, Rios RD, Franzone PM, Gil F, Moreno J, Carrillo C, Escnihano IM, Borca MV (2002), “A novel methodology to develop a toot
and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in transgenic plants”, Vaccine,
20, pp 1141-1147
28 Feng Y, Zhao T, Tung Nguyen, Inui K, Ma Y, Nguyen Thi Hoa, Nguyen Van Cam , Liu
D , Bui Quang Anh, To Long Thanh , Wang C, Tian K, and Gao GF (2008), “Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China in 2007”,
Emerging Infectious Diseases, 14, pp 1774-1776
29 Hou YH, Chen J, Tong GZ, Tian ZJ, Zhou YJ, Li GX, Li X, Peng JM, An TQ, Yang HC (2008), “A recombinant plasmid co-expressing swine ubiquitin and the GP5 encoding-gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces protective immunity
in piglets”, Vaccine, 26, pp 1438–1449
30 Invitrogen (2010), Gateway® Technology, Version E, Catalog nos 12535-019 and
12535-027
31 Jani D, Meena LS, Rizwan UHQM, Singh Y, Sharma AK and Tyagi AK (2002),
“Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants”, Transgenic Res, 1,
pp 447-454
32 Jiang W, Jiang P, Li Y, Tang J, Wang X, Ma S (2006a), “Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome
virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice”, Vet Immunol,
113, pp 169–180
33 Jiang W, Jiang P, Wang X, Li Y, Wang X, Du Y (2007), “Influence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 glycoprotein N-linked glycans on
immune responses in mice”, Virus Genes, 35, pp 663–671
34 Jiang Y, Xiao S, Fang L, Yu X, Song Y, Niu C, Chen H (2006b), “DNA vaccines co-expressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
(PRRSV) display enhanced immunogenicity”, Vaccine, 24, pp 2869–2879
35 Kim TG, Gruber A and Langridge WHR (2004), “HIV-1 gp 120 V3 cholera toxin B
subunit fusion gene expression in transgenic potato”, Protein Expression and
Purification, 37, pp 196-202
36 Lamphear BJ, Jilka JM, Kest L, Welter M, Howard JA, Streatfield Si (2004), “A corn-based delivery system or animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus
vaccine boosts lactogenic immunity in swine”, Virology, 22, pp 2420-2424
Trang 637 Lauterslager TGM, Florack DEA, Wal TJV, Molthoff JW, Langeveld JPM, Bosch D, Boersma WJA and Hilgers LAT (2001), “Oral immunisation of naive and primed
animals with transgenic potato tubers expressing LTB”, Vaccine, 19, pp 2749-2755
38 Mason HS, Warzecha H, Mor T and Arntzen CJ (2002), “Edible plant vaccines:
application for prophylactic and therapeutic molecular medicine”, Trends in Molecular
Medicine, 8, pp 324-329
39 Ostrowski M, Galeota JA, Jar AM, Platt KB, Osorio FA, Lopez OJ (2002),
“Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive
and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain”, J Virol, 76, pp 4241–4250
40 Palmer K E, Schnippenkoetter WH, Rybicki EP (1998), “Geminivirus isolation and
DNA extraction” In Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic
Resistance, pp 41-52 Edited by G Foster & S Taylor Totowa, NJ:Humana Press
41 Perlak FJ, Fuchs RL, Dean DA, McPherson SL and Fishhoff DA (1991), “Modification
of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes”, Proc
Natl Acad Sci USA, 88, pp 3324-3328
42 Plagemann PG (2004), “GP5 ectodomain epitope of porcine reproductive and respiratory
syndrome virus, strain Lelystad virus”, Virus Res, 102, pp 225–230
43 Rebay Lab (2013), Transformation of Bacteria via Electroporation Protocol
44 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 1, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
45 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 2, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
46 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 3, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
47 Streatfield SJ and JA Howard (2003), “Plant-based vaccines”, Int J Parasitol, 33, pp
479-493
48 Thermo sciencetific (2006), CloneJET TM PCR Cloning Kit procedure
49 Thermo sciencetific (2008-2009), Molecular Biology Catalog and Product Application
guide
50 Thermo Scientific (2006), GeneJET Gel Extraction Kit Procedure
51 Thermo Scientific (2006), GeneJE TTM PCR Purification Kit Procedure
52 Thermo Scientific (2006), GeneJET™ RNA Purification Kit Procedure
53 Thermo Scientific (2006), RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Procedure
54 Wasin Charerntantanakul (2012), “Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects”, Virology, 1(1): 23-30
Trang 755 Zheng Q, Chen D, Li P, Bi Z, Cao R, Zhou B, Chen P (2007), “Co-expressing GP5 and
M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus ankara (rMVA)-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of
porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)”, Virus Genes, 35, pp
585–595
Trang web
56 http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/molStudents/spring2003/McCord/electrop oration.htm
57 www.bio.utk.edu/cellbiol/prot/by2-medium.pdf
58
http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/DNA/DNA_Extraction_Purification/DNA_Extraction _from_Plants/
59 http://www.prrs.org/Elimination/93/RegionalElimination.aspx#.Ui2T639EnqE
60 http://www.prrssymposium.org/default.aspx
61 http://www.respig.com/diseases/prrs.asp
62 http://www.thepigsite.com/diseaseinfo/97/porcine-reproductive-respiratory-syndrome-prrs