Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction trong chẩn đoán viêm âm đạo- cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình Trần Thị Hòa Trường Đại học K
Trang 1Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction trong chẩn đoán viêm âm đạo- cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại
bệnh viện Đại học Y Thái Bình
Trần Thị Hòa
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: GS TS Lương Xuân Hiến
Năm bảo vệ: 2011
Abstract: Tổng quan về vi khuẩn Chlamydia trachomatis: Vi khuẩn Chlamydia
trachomatis; Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis; Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nước Trình bày các phương pháp nghiên cứu: Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu; Kỹ thuật xét nghiệm; Xử lý số liê ̣u Trình bày kết quả và thảo luận : Tối ưu hóa phản ứng PCR phát hiê ̣n Chlamydia trachomatis; Độ nhạy của kỹ thuật PCR; Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR; Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR
Keyword: Sinh học thực nghiệm; Phụ khoa; Viêm âm đạo; Viêm tử cung;
Chlamydia trachomatis
Content:
Viêm đường sinh dục do Chlamydia trachomatis được coi là bệnh lây truyền qua đường tình dục xếp thứ nhất trên thế giới Nhiễm C.trachomatis thường gây
viêm niệu đạo , viêm cổ tử cung Tuy nhiên nếu không điều tri ̣ có thể dẫn đến các biến chứng như viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngoài tử cung, vô sinh
do tổn thương ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao Tổ chức Y tế thế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm
C.trachomatis được phát hiện mới Bệnh do C.trachomatis hay gặp ở những người
trẻ tuổi, trong độ tuổi sinh đẻ Nguy hiểm nhất của nhiễm C.trachomatis qua đường
sinh dục là có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng, người bệnh hoàn toàn không biết mình mắc bệnh
Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của
các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase
Chain Reaction – PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều
nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét
nghiệm chẩn đoán khác Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm này cho
phép xác định sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch âm đạo, tử cung của bệnh nhân
Đề tài thực hiện với mục tiêu:
Trang 2- Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis trên máy Master Cycler C 1000 BioRad tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình
- Bước đầu xác đi ̣nh tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachoma tis ở bệnh nhân viêm
âm đạo , cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011 bằng kỹ thuật PCR
Đối tượng nghiên cứu:
- Mẫu DNA vi khuẩn C.trachomatis do Viện Công nghệ sinh học- Viện
Khoa học Việt Nam cung cấp
- Các bệnh nhân nữ trong độ tuổi sinh sản (15-49 tuổi) có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám ta ̣i phòng khám Sản phu ̣ khoa - Bệnh viê ̣n Đa ̣i ho ̣c Y Thái Bình trong thời gian từ 01/04/2011 đến 10/2011
Địa điểm nghiên cứu:
Lấy mẫu dịch quết cổ tử cung tại phòng khám Sản phu ̣ khoa - Bê ̣nh viê ̣n Đa ̣i học Y Thái Bình Chuẩn quy trình kỹ thuật , xử lý mẫu, tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dươ ̣c - Đa ̣i ho ̣c Y Thái Bình
Cỡ mẫu: Vớ i p = 17% (theo nghiên cứu của Farhad B Hashemi và cô ̣ng sự)
và lựa chọn giá trị độ sai số m = 0.05 thì cỡ mẫu tối thiểu là 217 bê ̣nh nhân
Tách chiết DNA theo phương pháp Boom, chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực
hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn C.trachomatis trên máy Master Cycler
C1000 BioRad Các bước chuẩn hoá bao gồm: thực hiện phản ứng PCR trong các nồng độ mồi khác nhau, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2, số chu kỳ thích hợp trong mỗi phản ứng
Xác định độ nhạy của phản ứng: mẫu plasmid tái tổ hợp có mang đoạn
DNA của vi khuẩn C.trachomatis được pha loãng thành các dung dịch có các nồng
độ từ 1010, 109, 108, 107, đến 101 bản sao plasmid/µl và sử du ̣ng làm mẫu chuẩn để đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ứng Xác định độ đặc hiệu của phản ứng bằng thử nghiệm
PCR với các loài Chlamydia khác và các mẫu DNA khác Xác đi ̣nh tỷ lê ̣ nhiễm
C.trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo , cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại
học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011: Các mẫu bệnh phẩm thu thập
đúng tiêu chuẩn chọn lựa sẽ được tiến hành bằng phản ứng PCR theo quy trinh chuẩn ở trên
Kết quả: Quy trình đã được chuẩn hóa: Phản ứng PCR đầu tiên có MgCl2
nồng độ 2.1 mM, 0.4 pmol mỗi loại mồi KL-5, KL-6, 0.05 U UNG, nước đến 25 µl Phản ứng Nested PCR chứa MgCl2 nồng độ 1,5 mM, 0,4 pmol mỗi loại mồi KL-1, KL-2, 1 µl phản ứng PCR lần đầu, nước đủ 25 µl Độ nhạy: phát hiện được 10 bản sao plasmid Độ đặc hiệu 100%
Trong số 217 bệnh nhân có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011 có 80 người có
kết quả dương tính với C.trachomatis chiếm tỷ lệ 36.9% Kết quả xét nghiệm trên
chưa phản ánh được toàn bộ quần thể vì còn có những đối tượng nhiễm bệnh nhưng không có biểu hiện viêm nhiễm nên không đi khám, và xét nghiệm này lần đầu tiên được áp dụng tại Thái Bình Trong số bệnh nhân dương tính, nhóm dưới 25 tuổi có
tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis cao nhất, chiếm 40.6% Đồng thời tỷ lệ nhiễm
vi khuẩn C.trachomatis trong nghiên cứu tại Thái Bình ở nông thôn cao hơn ở thành
phố Tỷ lệ bệnh nhân dương tính tại khu vực nông thôn là 37.8%
Trang 3References:
Tiếng Việt
1 Phạm Đông An (1996) Viêm nhiễm cổ tử cung do Chlamydia trachomatis ở
phụ nữ mang thai, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ y khoa, Trung tâm đào tạo và
bồi dưỡng cán bộ y tế
2 Bộ Y Tế (2007), “Vi sinh vật Y học”, Nhà xuất bản Y học
3 Lê Hồng Cẩm (2002) Nghiên cứu tỷ lệ viêm cổ tử cung do Chlamydia
trachomatis và một số yếu tố kết hợp ở phụ nữ trong lứa tuổi sinh đẻ tại huyện Hóc Môn, Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
4 Phạm Văn Đức (2007) “ Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatic ở phụ nữ hút thai ba tháng đầu thai kỳ và các yếu tố liên quan”, Tạp chí y học TP Hồ Chí
Minh, tập 13 (1), trang 17-22
5 Nguyễn Phúc Như Hà, “Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán
bệnh phong và các bệnh lây truyền qua đường tình dục tại bệnh viện phong- da liễu Trung ương Quy Hòa” Bệnh viện phong- da liễu Trung ương Quy Hòa
6 Nguyễn Thanh Hùng, Nguyễn Trọng Hào, Nguyễn Ngọc Bá, “Giá trị chẩn
đoán của test nhanh (quick test-USA) so với PCR (công ty Nam Khoa- Việt
Nam) trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân đến khám
tại bệnh viện Da liễu thành phố Hồ Chí Minh” Bệnh viện Da liễu thành phố
Hồ Chí Minh
7 Trần Hậu Khang, Phạm Đăng Bảng, Lê Huyền My, viện Da liễu Quốc gia
(2009), “Áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia
trachomatis đường sinh dục tiết niệu”, Tạp chí y học thực hành, 1, trang 641-
642
8 Trần Thị Lợi (2000) “Sơ bộ khảo sát tình hành nhiễm Chlamydia trachomatis trong viêm sinh dục “ Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 4 (1): trang 14-18
9 Đặng Chi Mai (2003) “ Chlamydiae” Vi khuẩn học Đại học Y dược TP Hồ
Chí Minh, trang 176-176
10 Nguyễn Văn Thục, “Dịch tễ học bệnh lây truyền qua đường tình dục và nhiễm HIV ở khu vực phía Nam Việt Nam: Một số vấn đề nổi cộm” Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh
Tiếng Anh
11 Achchhe L Patel, Divya Sachdev, Poonam Nagpal, Uma Chaudhry, Subash C Sonkar, Suman L Mendiratta and Daman Saluja (2010), “Prevalence of
Chlamydia infection among women visiting a gynaecology outpatient
department: evaluation of an in-house PCR assay for detection of Chlamydia
trachomatis”, Annals of clinical microbiology and antimicrobials, 9 (24),
12 Anahita Jenab, Naser Golbang, Pouran Golbang, Leili Chamani-Tabriz, M.PH, Rasoul Roghanian (2009), “Diagnostic Value of PCR and ELISA for
Chlamydia trachomatis in a Group of Asymptomatic and Symptomatic
Women in Isfahan, Iran”, Royan Institue International Journal of Fertility and
Sterility Vol 2, (4), pp 193-198
13 Bass CA, Jungkind DL, Silverman NS (1993), “Clinical evaluation of a new
polymerase chain reaction assay for detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens” J Clin Microbiol; 31, pp 2648-2653
14 Boom R et al., (1990), “Rapic and simple method for purification of nucleic acids”, J Clin Microbiol., vol 28 no 3, pp 495-503
Trang 415 European Centre for Disease prevention and Control (2008), Technical report
review of Chlamydia control activities in EU countries, Stockholm
16 Farhad B Hashemi, BabakPourakbari, and JavadZaeimiYazdi (2007),
“Frequency of Chlamydia trachomatis in Women with Cervicitis inTehran, Iran”, Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology Vol 2007, 4 pp
17 Frost EH, Deslandes S, Bourgaux-Ramoisy D (1993), “Sensitive detection and
typing of Chlamydia trachomatis using nested polymerase chain reaction”
Genitour in Med, 69, pp 290-294
18 James B Mahony, Kathleen E Luinstra, John W Sellors, Dan Jang, and Max
A Chernesky (1992), “Confirmatory Polymerase Chain Reaction Testing for
Chlamydia trachomatis in First-Void Urine from Asymptomatic and
Symptomatic Men”, Journal of clinical microbiology, pp 2241-2245
19 Joanne Rampersad, Xiaohui Wang, Helen Gayadeen, Samuel Ramsewak, and David Ammons (2007), “In-house polymerase chain reaction for affordable
and sustainable Chlamydia trachomatis detection in Trinidad and Tobago”,
Ammons Rev Panam Salud Publica, 22(5), pp 317- 322
20 J.S Wilson, E.Honey, A Templeton, J.Paavonen, P.A Mardh, A.Stary and
B.Stray- Pedesen (2002), “A systematic review of the prevalence of
Chlamydia trachomatis among European women”, Human Reproduction update, Vol 8, (4), pp 385-394
21 Loeffelholz MJ, Lewinski CA, Silver SR, (1992), “Detection of Chlamydia
trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction” J Clin Microbiol, 30, pp 2847-2851
22 Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini, Esteban Serra (2002), “One-tube nested
Polymerase Chain Reaction for detection of Chlamydia trachomatis”, Mem
Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol 97(6), pp 897-900
23 Saiki RK et al., (1985), “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia”,
Science, 230, pp 1350-1354
24 Nguyen Thi Thanh Thuy, Vo Tuyet Nhung, Nguyen Van Thuc, Truong Xuan Lien and Ha Ba Khiem (1998), “HIV infection and risk factors among female
sex workers in southern Vietnam”, AIDS, 12, pp 425-432
25 Huynh Thi Trong, Nguyen Quoc Chinh and Nguyen Van Tu (2002), Prevalence of lower reproductive tract infections among married childbearing-age women in Ho Chi minh City
26 Vietnam Commission for Population, Family and Children – Ministry of Health AIDS Division and Pasteur Institute Ho Chi Minh City STI/HIV survey among female sex workers in 5 border provinces, Vietnam, 2002
Medical Publishing House, 2003
Tài liệu tham khảo khác
27 www.cfsh.ca/files/PDF/chlamydia in canada.pdf
28 www.pasteur-hcm.org.vn/anpham/anpham.htm
29 www.pasteur-hcm.org.vn/anpham/dichtehoc_blqdtd.htm
30 www.quyhoandh.org.vn
31 www.hosrem.org.vn/index.php? chlamydia nhan
32 www.cicatelli.org/ /CHLAMYDIATESTINGTECHNOLOGIES012007.pdf
33 www.advms.pl/?q=system/files/30_52Bulhak-Koziol.pdf
34 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Chlamydia_trachomatis
Trang 535 www.vsmmb.com/data/upload_file/File/ /PCR_basic.pdf