DSpace at VNU: Đặc điểm hình thái và phân tử của một số chủng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Như Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Như Trang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ

SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Như Trang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ

SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh

Hà Nội - 2014

i

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu, PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh, những người thầy đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo và cán bộ nghiên cứu Phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể thực hiện được đề tài nghiên cứu luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lê Thị Mai Linh, Phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, làm việc tại phòng Tuyến Trùng học - Viện Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp về mặt kỹ thuật phân

tử và các ý kiến tư vấn hết sức hiệu quả trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm cùng tập thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, nói chung và Bộ môn động vật không xương sống nói riêng đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ

để tôi hoàn thành được chương trình khóa học

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè những người luôn bên cạnh giúp đỡ, là chỗ dựa tinh thần để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Tác giả

Nguyễn Như Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 42

DEFINED.

1.1.Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) Error!

Bookmark not defined.

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu: Error! Bookmark not defined 1.1.2 Đặc điểm hình thái Error! Bookmark not defined 1.1.3 Đặc điểm sinh học Error! Bookmark not defined.

1.2 Khả năng ứng dụng của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng trong phòng

trừ sinh học sâu hại Error! Bookmark not defined 1.2.1 Trên thế giới Error! Bookmark not defined 1.2.2 Tại Việt Nam Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4.1 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tuyến trùngError! Bookmark

not defined.

2.4.2 Phương pháp phân loại tuyến trùng dựa trên trình tự 18S – rDNA Error!

Bookmark not defined.

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của EPNError! Bookmark

not defined.

2.4.4 Phương pháp xác định độc lực của EPN Error! Bookmark not defined 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ERROR!

iii

BOOKMARK NOT DEFINED.

3.1 Đặc điểm hình thái Error! Bookmark not defined.

3.2 Đặc điểm sinh học phân tử (đoạn 18S-rDNA và đoạn D2-D3, thuộc

28S-rDNA) Error! Bookmark not defined 3.2.1 Kết quả PCR Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kết quả giải trình tự gen Error! Bookmark not defined 3.2.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tuyến trùng Error!

Bookmark not defined.

3.3 Một số đặc điểm sinh học của tuyến trùng Error! Bookmark not defined.

3.3.1 Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng trong G melonnella

Error! Bookmark not defined.

3.3.2 Khả năng sinh sản của tuyến trùng trong ấu trùng G mellonella Error!

Bookmark not defined.

3.3.3 Hiệu lực gây chết của tuyến trùng S-DL13 đối với ấu trùng BSL Error!

Bookmark not defined.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

(Entomopathogenic nematodes)

VKCS : Vi khuẩn cộng sinh

IJs : Ấu trùng cảm nhiễm (Infective juveniles)

BSL

PTSH

: :

Bướm sáp lớn (Galleria mellonella)

Phòng trừ sinh học

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mối quan hệ họ hàng của các loài Steinernema phân lập ở Việt Nam

(Phan Ke Long, 2004) Error! Bookmark not defined

Hình 1.2: Hình chụp từ kính hiển vi điện tử của tuyến trùng Steinernema và

Heterorhabditis (Theo Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Error! Bookmark not defined

Hình 1.3: Vòng đời của các loài Heterorhabditis and Steinernema trên bọ hung (

Gaugler,Brown,Shapiroilan&Atwa,2002) Error! Bookmark not defined

Hình 3.1: Ảnh chụp hiển vi của con đực Steinernema siamkayai thế hệ 1 Error!

Bookmark not defined

Hình 3.2: Ảnh chụp hiển vi của con cái Steinernema siamkayai T Error!

Bookmark not defined

Hình 3.3: Ảnh chụp hiển vi của ấu trùng cảm nhiễm Steinernema siamkayai Error!

Bookmark not defined

Hình 3.4a: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 18S 38 Hình 3.4b: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen D2D3 38

Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại gen 18S của mẫu nghiên cứu với các loài khác

trên genbank theo phương pháp ME Error! Bookmark not defined

Hình 3.6: Cây phát sinh chủng loại gen D2-D3 của mẫu nghiên cứu với các loài

khác trên genbank theo phương pháp ME Error! Bookmark not defined Hình 3.7: Ấu trùng cảm nhiễm phát tán ra khỏi vật chủ.Error! Bookmark not defined

Hình 3.8: Đồ thị tương quan giữa sản lượng IJs và số lượng IJs gây nhiễm ban đầu

của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL Error! Bookmark not defined

Hình 3.9: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ ấu trùng BSL chết và số lượng gây nhiễm

ban đầu của chủng S-DL13 Error! Bookmark not defined

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Danh sách các chế phẩm sinh học BIOSTARError! Bookmark not defined

Bảng 1.2 Áp dụng phòng trừ sâu hại ở một số địa phươngError! Bookmark not

defined

Bảng 2.1 Các mồi đặc hiệu cho PCR Error! Bookmark not defined Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp cho PCR Error! Bookmark not defined Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Error! Bookmark not defined Bảng 2.4: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNAError! Bookmark

not defined

Bảng 2.5: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNAError! Bookmark

not defined

Bảng 3.1: Các chỉ số đo của loài S siamkayai ở Việt NamError! Bookmark not

defined

Bảng 3.2: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự

đoạn gen 18S trên Genbank Error! Bookmark not defined

Bảng 3.3: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự

gen D2-D3 trên Genbank Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Khả năng sinh sản của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.5: Hiệu lực gây chết ấu trùng BSL của chủng S-DL13Error! Bookmark not defined

42

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có sự đa dạng phong phú

về các loài thực vật, động vật và có nền nông nghiệp phát triển Tuy nhiên, điều kiện khí hậu trên cũng là điều kiện tốt để sâu bệnh hại phát sinh, phát triển quanh năm Có thể nói, đây là một trong những trở ngại lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp của nước ta Hàng năm, các côn trùng gây hại làm giảm đến 40-50% sản

lượng của sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999)

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân đã sử dụng rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học khác nhau, mặc dù đem lại hiệu quả nhanh, dễ sử dụng, giá thành thấp, nhưng lại gây ra những hậu quả tiêu cực đối với môi trường sống, gây hại đến sức khỏe người và động vật nuôi, đồng thời tạo nên tính kháng thuốc của nhiều loài dịch hại Đặc biệt, thuốc hóa học còn tiêu diệt nhiều loài sinh vật có ích làm giảm tính đa dạng trong tự nhiên gây mất cân bằng sinh thái

Hướng đến phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, vật nuôi và các sinh vật có ích, đảm bảo được tính đa dạng sinh học và tính cân bằng sinh thái trong tự nhiên, việc nghiên cứu lựa chọn biện pháp phòng trừ tổng hợp trong đó có biện pháp sinh học đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm đặc biệt, được nghiên cứu, phát triển rộng rãi nhằm hạn chế sử dụng và tiến tới thay thế một phần thuốc hóa học trừ sâu được dùng trong nông nghiệp hiện nay Hiện nay, phương pháp phòng trừ sinh học, đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tế, một số kết quả đạt được như sử dụng thiên địch tự nhiên như ong mắt đỏ ký sinh, bọ rùa, bọ xít bắt mồi, nhện bắt mồi ăn thịt,… để không chế dịch hại Ngoài ra vi khuẩn, nấm và virut đa nhân cũng đã được nghiên cứu, ứng dụng cho phòng trừ sâu hại cây trồng Đặc biệt gần đây, các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng cũng được nhanh chóng nghiên cứu, áp dụng trong phòng trừ sâu hại Tuyến trùng ký sinh gây bệnh cho côn trùng (EPN) thực chất là những tổ hợp cộng sinh giữa các loài tuyến trùng ký sinh

thuộc giống Steinernema (Họ Steinermatidae) và Heterorhabditis (Họ Heterorhabditidae) và các loài vi khuẩn gây bệnh giống Xenorhabdus và

Photorhabdus Trong đó, tuyến trùng đóng vai trò vừa là ký sinh lại là những vector

mang truyền vi khuẩn gây bệnh Chính vì vậy mà nhóm tuyến trùng này trở thành tác nhân sinh học có nhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học sâu hại như: phổ diệt sâu hại rộng, khả năng diệt sâu nhanh, có khả năng tự sản sinh tăng số lượng sau khi đã giết chết sâu hại và có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ sinh học thích hợp

in vivo và in vitro

EPN đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi và thương mại hóa như những chế phẩm sinh học ở nhiều nước như Mỹ, Úc, Canada, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan [2] Mặc dù nghiên cứu EPN ở Việt Nam chỉ mới được triển khai vài thập niên gần đây, nhưng các kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên EPN phong phú và đa dạng, đồng thời đã đạt được một số kết quả quan trọng trong việc điều tra phân loại và nghiên cứu, tuyển chọn các chủng tuyến trùng có tiềm năng sinh học đưa vào sản xuất sinh khối và ứng dụng vào thực tiễn trong phòng trừ sinh học sâu hại [3, 5] Tuy nhiên, hầu hết các chủng EPN ở Việt Nam chỉ tồn tại ở các hệ sinh thái rừng tự nhiên, rất ít các chủng EPN được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Vì vậy, việc điều tra phân lập nhóm tuyến trùng này trong các hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên là rất cần thiết

Để có thêm dẫn liệu về tuyến trùng trong các hệ sinh thái nông nghiệp, chúng

tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của

một số tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên ” với các mục đích sau:

Xác định đặc điểm hình thái và phân tử của EPN ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên

Đặc trưng sinh học và tiềm năng sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học

Do hạn chế về thời gian và phạm vi nghiên cứu rất rộng, nên chúng tôi tập trung nghiên cứu và xác định các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng – EPN trong hệ sinh thái cây công nghiệp trong hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên, cụ thể tập trung với 2 loại cây công nghiệp chủ lực là cà phê và hồ tiêu

44

Đề tài luận văn đã cung cấp dẫn liệu về đặc điểm hình thái và phân tử của

chủng tuyển trùng S-DL13 thuộc loài tuyến trùng Steinernema siamkayai được phân

lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên Một số dẫn liệu sinh học về sinh trưởng, phát triển và độc lực học cũng như khả năng sinh sản của tuyến trùng trên

côn trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) bước đầu cũng được cung cấp và thảo

luận

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước

1 Nguyễn Ngọc Châu (1998),” Nghiên cứu sử dụng tuyến trùng trong phòng

trừ sinh học sâu hại cây trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ

36(2), 24-29

2 Nguyễn Ngọc Châu (2007), “Tình hình sâu đục thân hại cây ăn quả tại một

số trang trại ở Mê Linh, Vĩnh Phúc và khả năng phòng trừ bằng tuyến trùng

diệt sâu epn”, Tạp chí BVTV 2 (212), 21-24

3 Nguyễn Ngọc Châu (2008), Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở Việt

Nam, Nhà Xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội

4 Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh (1997), “Phát hiện đầu tiên về nhóm

tuyến trùng ký sinh gây bệnh ở côn trùng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 19

(4), 22-29

5 Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Lại Phú Hoàng, Ngô Xuân Tường (1999),

“Hiệu lực gây chết của các chủng tuyến trùng Steinernema sp TK10 và

Heterorhabditis sp TK3 đối với một số sâu hại ở cây trồng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 21(2B), 104-113

6 Lại Phú Hoàng, Nguyễn Ngọc Châu (2004), “Hiệu lực gây chết của chủng

tuyến trùng H-MP11 đối với sâu xanh Helicoverpa armigera (Hubner)”, Tạp

chí BVTV 6 (198), 27-31

7 Lại Phú Hoàng, Nguyễn Ngọc Châu (2005), “Hiệu lực diệt sâu xanh

Helicoverpa armigera (Hubner) của chủng tuyến trùng TX1”, Tạp chí Sinh học 27(3A), 87-90

8 Lại Phú Hoàng, Phạm Hồng Thái, Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ (2003),

“Hiệu lực phòng trừ sâu xám (Agrotis ypsilon) hại thuốc lá của một số chế phẩm sinh học tuyến trùng (EPN)”, Tạp chí BVTV 4 (190), 26-29

9 Lại Phú Hoàng, Phạm Hồng Thái, Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Nguyễn Anh Diệp (2003), “Hiệu lực gây chết và khả năng sinh sản của tuyến trùng

46

Steinernema carpocapsae TL trên bọ hung hại mía (Alissonotum impresscolle)”, Tạp chí Khoa học 1, 100-104

10 Phan Kế Long (2004), “Cây phát sinh chủng loại của một số chủng

Steinernema ở Việt Nam trên cơ sở giải mã vùng ITS-rDNA”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản KHKT Hà Nội, tr

156-159

Tài liệu nước ngoài

11 Akhust R.J (1986), “Controlling insects in soil with Entomopathogenic

Nematodes”, Fundamental and Applied Aspects of Invertebrate Pathology,

Wageningen, The Netherlands, 265-267

12 Anon (1988a), SAS Technical Report, Additional SAS/STAT Procedures

Release 6.03, SAS Institute, NC, USA, pp 179

13 Anon (1988b), SAS/STAT User Guide Release 6.03, SAS Isntitute, Cary,

NC, USA, pp 1028

14 Bedding R.A (1984b), “Large scale production, storage and transport of

insect parasitic nematodes Neoplectana spp and Heterorhabditis spp”,

Annals of Applied Biology 104, 117-120

15 Bedding R.A (1990), “Logister and strategies for introduction entomopathogenic nematodes technology into Developing Countries”, In:

Gaugler, R & Kaya, H.K.(Eds.), Entomopathogenic Nematodes in

Biological Control, CRC Press, Florida, 233-246

16 Cabanias H.E & Raulston J.R (1994), “Pathogenicity of Steinernema

riobranis against corn earworm, Helicoverpa zea (Boddie)”, Fund Appl Nematol., 17(3), 219-223

17 Cutler C.G and Stock S.P (2003), “Steinernema websteri sp n (Rhabditida:

Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from China”,

Nematol medit, 31, pp 215-224

18 Deley P., Félix M.A., Frisse L.M., Nadler S.A., Sternberg P.W & Thomas W.K (1999), “Molecular and morphological characterisation of two