Nghiên cứu phân lập thành phần Flavonoit từ lá cây Me rừng (phyllanthus Emblica)

Phyllemblin được coi là hoạt chất có tác dụng tương tự như adrenalin,gây giảm đau, an thần, đặc biệt là với hệ thần kinh trung ương [5],… Những acid hữu cơ trong quả me rừng như: acid as

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ là ô nhiễm môi trường

và nảy sinh những vấn đề khác, ví dụ như các căn bệnh nguy hiểm (ung thư,kháng sinh, cúm H1N1, H7N9,…) Nguyên nhân của các căn bệnh trên đến

từ nhiều nguồn khác nhau, có thể do ô nhiễm môi trường, do kháng sinh.Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành các chươngtrình nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất từ thiên nhiên, với hy vọng các dượcphẩm mới có nguồn gốc thực - động vật sẽ giúp giảm thiểu các căn bệnh nguyhiểm nêu trên, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe và kéo dài tuổi thọ conngười Những nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao đểứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống conngười đã và đang trở thành những nhiệm vụ quan trọng của các quốc gia trênthế giới

Là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tươngđối lớn, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), nhiệt độ trung bình khoảng từ 15 -

270C, Việt Nam có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sựphong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau Điềunày có ý nghĩa rất quan trọng tới sự phát triển của nền y học cổ truyền củaViệt Nam

Trong số các loài thực vật của Việt Nam, các loài thực vật thuộc họThầu dầu hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Ví dụ như:

cây Me rừng (Phyllanthus emblica), thuộc họ Thầu dầu, là một loài cây đã

được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu trong y học dân gian như chữahuyết áp cao, viêm ruột, viêm da, đau họng, đau răng, rắn cắn, Tuy nhiên,

để có được cơ sở khoa học nhằm phát triển và ứng dụng cụ thể loài cây này,cần có những nghiên cứu cụ thể về hóa học, hoạt tính sinh học và những

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Học

1

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp

Học

2

nghiên cứu sâu hơn về dược lý để giải thích tác dụng trong y học cổ truyền của loài cây này, qua đó tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh.

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên tôi chọn đề tài cho khoá luận tốtnghiệp là:

“Nghiên cứu phân lập thành phần flavonoit từ lá cây Me rừng”.

Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần flavonoit từ lá cây Me rừngbao gồm những nội dung chính là:

1 Thu mẫu lá cây Me rừng (Phyllanthus emblica), xử lý mẫu và tạo dịch

chiết

2 Phân lập các hợp chất flavonoit

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

học là Phyllanthus emblica Đây là cây gỗ nhỏ hoặc bụi, cao 3-8(-10) m, vỏ

mỏng, màu nâu nhạt, nâu hoặc màu xám, nhẵn Thân thường cong queo, phâncành nhiều, cành nhỏ mềm, cành già màu xám nhạt, mang các nhánh nhỏ, cólông Cành mang lá mảnh, màu xanh nhạt Cành mang lá và lá cùng sắp xếpgần như trên một mặt phẳng Phiến lá hình bầu dục khuôn, hai đầu tù, kíchthước (3-)12-20 x (1-)3,5 - 5 mm, nhẵn; gần như không cuống hoặc rất ngắn

Lá kèm rất nhỏ, hình tam giác, màu đỏ nâu Hoa đơn tính cùng gốc

Hình 1.1 Mẫu lá, quả và tiêu bản cây me rừng

Hoa nhỏ mọc thành xim co ở nách lá phía dưới cành, gồm nhiều hoađực và 1-2 hoa cái Hoa đực có cuống ngắn; đài gồm 6 mảnh màu hồng hoặcxanh nhạt, hình bầu dục Hoa cái gần như không cuống; đài có 6 thuỳ tương

tự hoa đực Quả hình cầu, kích thước 13-25 x 20-30 mm, mọng nước, màuvàng xanh; khi khô thành quả nang, tự mở Hạt dạng 3 cạnh, màu hồng nhạthay nâu nhạt [1, 2, 4, 5]

1.1.2 Phân bố sinh thái

Cây mọc phổ biến khắp nơi ở Việt Nam, nhất là ở các tỉnh miền núi vàtrung du phía bắc [1, 2, 4, 5]

Me rừng là loài có vùng phân bố rộng ở nhiều nước châu Á, từ Ấn Độđến Myanmar, Nepal, Thái Lan, Malaysia, Lào, Campuchia, miền nam TrungQuốc Hiện me rừng đã được đưa vào trồng tại Nhật Bản, Hoa Kỳ vàAustralia

1.1.3 Công dụng

Nhiều bộ phận của loài Me rừng (P emblica L.) có hoạt tính kháng

khuẩn, kháng oxy hóa, chống suy giảm miễn dịch, kháng độc và bảo vệ tế bàogan do các kim loại màu gây ra [1, 2, 4, 5],…

Trong y học dân gian, lá được dùng chữa phù thũng, viêm da, mẩnngứa Hạt dùng chữa hen, viêm cuống phổi và thiểu năng mật Rễ dùng đểchữa huyết áp cao, đau thượng vị, viêm ruột và lao hạch bạch huyết [5],

Quả thường dùng ăn tươi, làm ô mai, nước hoa quả, giải khát, hầm thịt,làm thuốc nhuộm răng, nước gội đầu để kích thích mọc tóc Quả cũng đượcdùng làm thuốc chữa bệnh thiếu vitaminC (bệnh Scorbut), viêm đau gan, vàng

da, rối loạn tiết mật, viêm đau dạ dày, kiết lỵ, tiêu chảy, nhuận tràng, kíchthích tiêu hóa, lợi tiểu, đái đường, giải nhiệt, xuất huyết, cầm máu, thiếu máu,giảm huyết áp, đau nhức đầu, đau nhức mắt, giảm sốt, choáng váng, ho, viêmphế quản, viêm sưng phổi,… Hạt dùng chữa hen suyễn, viêm phế quản, thiểunăng mật,… Hoa được dùng làm thuốc nhuận tràng, giải nhiệt và làm thuốc

xổ Lá me dùng làm thuốc giải nhiệt, chữa phù thũng và một số bệnh ngoài

da Vỏ thân dùng làm thuốc chữa tiêu chảy, lỵ amip, cầm máu Rễ cây đượcdùng để chữa trị các bệnh cao huyết áp, đau thượng vị, viêm ruột, lao hạchbạch huyết,… Cộng đồng các dân tộc tại miền núi ở Việt Nam và các nước

Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ,… thường sử dụng các bộ phận của cây Me, đặc biệt là quả để ăn cũng như làm thuốc khá rộng rãi [1, 2, 4, 5].

1.1.4 Thành phần hóa học

Quả me rừng có vị chua, nguồn nguyên liệu rất giàu vitamin C Trongquả chứa các trigalloyglucose, ellagic acid, corilagin, terchebin, phylleblin,phyllemblic acid và emblicol Các nghiên cứu gần đây cho biết cả vitamin C

và acid gallic cùng có đặc tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn Hoạttính ức chế các quá trình oxy hóa có thể còn do tác dụng của các tannin,emblicanin A, emblicanin B, punigluconin và pedunculagin ở trong quả merừng [5]

Phyllemblin được coi là hoạt chất có tác dụng tương tự như adrenalin,gây giảm đau, an thần, đặc biệt là với hệ thần kinh trung ương [5],…

Những acid hữu cơ trong quả me rừng như: acid aspartic, ellagic,gallic, myristic, ascorbic, các alanine, glycine, histidine, methionine, niacin,tyrosine cùng với một số hợp chất tannin được coi là có tác dụng phòng chốngmột số dạng ung thư và kìm hãm sự phát triển của virut HIV [5],…

Lá là nguồn nguyên liệu giàu flavonoid, tannin và sterol Từ lá có thểtách chiết được các hoạt chất ellagic acid, amlaic acid, kaempferol-3-glucoside, kaempferol, lupeol, α-amyrin acetat, các phytosterol C29 như β-sitosterol, poriferasterol, β-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid [5],

Vỏ cây chứa β-sitoserol,(+)-leucodelphinidin (3,75%), lupeol (2,25%)

và tannin Thành phần chủ yếu trong tannin gồm phyllembin, gallotannin như1,2,3-trigalloyglucose, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic acid,chebulinic acid Hạt chứa khoảng 16% dầu béo, chủ yếu là các linoleic acid(44%), oleic acid (28,4%), linolenic acid, stearic acid, palmatic và myristicacid [5]

Dưới đây là ví dụ về cấu trúc một số hợp chất từ cây me rừng:

O O

O OH

1.2 Giới thiệu về lớp chất flavonoit [10-14]

Flavonoit là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng rãi nhấttrong tự nhiên Cho đến nay có hơn 4000 Flavonoit được tìm thấy từ thực vật.Ban đầu chúng được phát hiện với vai trò là các sắc tố của thực vật vàomùa thu khi các loài hoa, lá cây dần chuyển sang màu vàng, da cam, đỏ CácFlavonoit cũng được tìm thấy trong rau, quả, quả hạch, hạt, cỏ, gia vị, thâncây, các loại hoa cũng như trong chè và rượu vang đỏ Flavonoit có mặt tronghầu hết các bộ phận của cây như lá, hoa, quả, phấn, rễ,… và cư trú ở thành tếbào Nó tham gia vào sự tạo thành màu sắc của cây đặc biệt là hoa (tạo chohoa những màu sắc rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụphấn của cây)

Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật Chúng là hợp chất

có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A, B được nối với nhau bởi một dị vòng C với

bộ khung cacbon C6-C3-C6 Việc phân loại các flavonoit dựa trên sự khácnhau của nhóm C3 (các glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà;antoxianin và antoxianiđrin màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu;isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin là các chất tan trong nước và thườngnằm trong không bào)

OR O

Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng

tự do mà thường dưới dạng glycozit

Bên cạnh các hợp chất có dạng khung flavan, flavon, flavonol còn cócác hợp chất thuộc dạng Flavanonol-3 (Hình 1.6) và một số hợp chất thuộckhung Chalcon (Hình 1.7), khung auron (Hình 1.8)

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phâncực trung bình, ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khácnhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dungmôi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoáthứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứngvới chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.

Dung môi lẫn tạp chất thì ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng củaquá trình chiết do vậy cần phải được chưng cất để thu được dạng sạch trướckhi sử dụng Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat Những chất này có thể lẫnvới dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trongcác thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kếtquả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tínhtrong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chloroform,metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trongquá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa,

[di-(2-Những tạp chất của chloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứngvới một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩmkhác Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng

có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợpchất khác Chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làmviệc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phảiđeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơnchloroform

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn cáchiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽthấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thuđược lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của

chloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancolhoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phâncực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bịhoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tínhtốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùngmethanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từTrechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phânhuỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatenseđược chiết trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây màthay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit

dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chấtkhông có khả năng tạo cholesterol như các carotenoit Tiếp đến là axetoncũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trìnhphân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit - bazơ có thểtạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấptrong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợpcho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạothành chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ khôngquá 30 - 400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ caohơn

1.3.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãinhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức vàthời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dungmôi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trướcđây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thểdùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phươngpháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉthực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa nhữngchất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cáchkhác nhau

Ví dụ:

- Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất nàybằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:Đragendroff và tác nhân Mayer

- Các flavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết chảy ra

mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao

Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến vàhữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợpchất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chấthấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và phađộng

Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chấtcủa chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, ) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khácnhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọctheo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quátrình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh

sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếuhơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quátrình sắc ký

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữahai pha tĩnh và pha động Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sựphụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tửđẳng nhiệt Langmuir:

Trong đó: n - Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞ - Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chấthấp phụ nào đó

b - Hằng số

C - Nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạngthái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhómlớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia rathành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1 Sắc ký cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồmcác loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinhhoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hếtsức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấpphụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năngtách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạtcàng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọngtrường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảyđược), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), ápsuất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rấtquan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêucầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữaquãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này

mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấpphụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệnày thấp (từ 1/5 – 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ

số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trongkhoảng 1/20-1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ vàolượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phươngpháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chấtvào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh, thì đưatrực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột vớilượng tối thiểu

Có hai phương pháp đưa chất hấp phụ lên cột:

- Phương pháp 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trựctiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột đểchất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột đểchạy cột đến khi cột trong suốt

- Phương pháp 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dungmôi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cộtđến khi đủ lượng cần thiết

L

ưu

ý:

không được để bọt khí bên trong cột (nếu có bọt khí gây nên

hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), cột không được nứt,gẫy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảyquá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và địnhhướng cho sắc ký cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵnsilicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điềuchế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được trángsilicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạysắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giảihấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thểphát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặctrưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [5-7]

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào cácphương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất màngười ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêucầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, đểxác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vàocác phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với cácphương pháp sắc ký so sánh,…

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động củacác liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại.Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó,dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưngtrong hợp chất, ví dụ: dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhómhydroxyl là 3300- 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700-

1750 cm-1,

1.5.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)

Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa họccủa các hợp chất hữu cơ

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion củaphân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho cácpic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phânmảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất Hiện nay có rất nhiềuloại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân

mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổbiến là 70eV

- Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ

phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơnnhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử vàcác pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bịphá vỡ

- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên

tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thuđược cũng dễ thu được pic ion phân tử

- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho

phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao

Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc

ký kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí-khối phổ), LC-MS(sắc ký lỏng-khối phổ) Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệukhi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trongngành dược)

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữuhiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR mộtchiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc củahợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton vàcacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tácdụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng

độ chuyển dịch hoá học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân tử cònđược xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spincoupling)

1.5.3.1 Phổ 1 H-NMR

Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoá học (δ) của các protonđược xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ laihoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào nhữngđặc trưng của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác địnhđược cấu trúc hoá học của hợp chất

1.5.3.2 Phổ 13 C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộnghưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo củaphổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm

1.5.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Trênphổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất Tín hiệu của CH vàCH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350 Trên phổDEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

1.5.3.4 Phổ 2D-NMR

- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác

trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ,một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HMQCnằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1 H- 1 H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các

proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tửđược nối ghép lại với nhau

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu

diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổnày mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định vềcấu trúc

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn

các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết

mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quảphổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOEdifferences để xác định cấu trúc không gian của phân tử Bằng việc đưa vàomột xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì cácproton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộnghưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn

Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấutrúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể.Nhưng phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phươngpháp này là cần phải có đơn tinh thể Đây là một điều kiện không phổ biến đốivới các hợp chất hữu cơ

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụngkết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, sosánh kết hợp khác Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tínhiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài cácmạch Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loạiđường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương phápthuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS vớicác đường chuẩn dự kiến.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mẫu thực vật

Mẫu cây Me rừng thu thập tại Mê Linh – Vĩnh Phúc Người thu thập vàđịnh loài: TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định Tiêu bản mẫu(VNB_21) được lưu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam Hình ảnh mẫu và tiêu bản (Hình 1.1)

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại

ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO410% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện đến khihiện màu

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại haibước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử làdung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như

cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silicagel có chất, giải hấp phụ bằngdung môi thích hợp

2.2.3 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường vàpha đảo Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.)