Việc sử dụng nguồn nước này trong thịi gian dài cĩ th ể dẫn tĩi một sơ' bệnh cho con ngiíời như các bệnh ung Ihư da, ung th ư phổi, rối loạn sắc tố da.. Do vậy, việc khảo s á t xác định
Trang 1N G H I Ê N C Ứ U Ả N H H Ư Ở N G C Ủ A M Ộ T s ố Y Ê U T ố
Đ Ế N V I Ệ C X Á C Đ Ị N H A S E N T R O N G N Ư Ớ C
B Ằ N G V I K H U Ẩ N C H Ỉ T H Ị
P h ạ m T h ị K im T r a n g , N g u y ề n V ă n M ùi
K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
P h ạ m T h ị D ậ u , P h ạ m H ù n g V iệ t
T ru n g tâm N ghiên Cứu C ơng nghệ Mơi trường và P h á t triể n Bển vững
Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
M ic h a e l B e rg , J a n R V a n D e r M e e r
Viện K hoa học và Cơng nghệ Mơi trường, L iên bang T h u ỵ sĩ
1 Đ ặ t v â n đ ề
o nhiễm asen (thạch tín) trong nưốc ngầm là một hiện tượng cĩ nguồn gốc tự nhiên xuất hiện ỏ nhiều quốc gia trê n th ế giối trong đĩ cĩ Việt nam Ở n h iều vùng nĩng thơn Việt Nam, nước ngầm là nguồn nưđc chủ yếu dùng cho ăn uốhg và sinh hoạt Việc sử dụng nguồn nước này trong thịi gian dài cĩ th ể dẫn tĩi một sơ' bệnh cho con ngiíời như các bệnh ung Ihư da, ung th ư phổi, rối loạn sắc tố da Do vậy, việc khảo s á t xác định mức độ ơ nhiễm asen trong nước giếng khoan là vơ cùng cần th iết [1,4] Để p hản án h dũng hiện trạn g ơ nhiễm asen, ta cần phái phân tích tạ i từng giếng nên lượng m ẫu cần kiểm tra lốn, rấ t tơn kém nếu sử dụng các phương pháp ph ân tích truyền thơng trong phịng th i nghiệm như khơi phổ cảm ứng plasm a (ICP-MS), quang phổ hấp th ụ nguyên tử (AAS) Do dĩ cần cĩ các phương pháp phân tích hiện trường cĩ chi phi tháp Hiện nay, m ột sị* vi khuân chi thị (Biosensor) dùng để xác định hàm lượng ase n trong nước dà được các n h à khoa học trên th ế giới nghiên cứu chế tạo Ưu điểm của nĩ là dễ sử dụng, n ăng s u â t p h ân tích cao, giá thành
rẻ, cỏ đáp ứng dặc hiệu vĩi asen, độ nhạy và độ chính xác cao [3,5] Vi k h u ẩn này khi tiếp xúc với asen sẽ tạo r a enzym luciferaza, oxy hố n-decanal th à n h ax it n-decanoic Phản ứng này p h át ra án h s án g ỏ bước sĩng 490nm và dược đo bằng th iế t bị đo án h sáng (Lum inom eter) Vi k h u ẩn này cĩ đáp ứng r ấ t tố t với asen trong các d u n g dịch chuẩn, nhưng các m ẫu nước ngầm thườ ng cĩ th àn h p hần phức tạ p và đặc biệt luơn chứ a s ắ t với hàm lượng cao cĩ ảnh hưỏng xấu tới khả năn g làm việc của chúng M ục đích của bài báo này là nghiên cửu ánh hường của m ột số yếu tơ' đến việc xác định asen bằng chỉ th ị vi k h u ẩ n (2,3,6]
2 Đ ố i t ư ợ n g v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u
2.1 N h ả n g iơ n g và bảo q u à n vi k h u ẩ n
Chung vi k h u ẩ n E.coli DH5a (pJAM A-arsR) cĩ k h ả n ảng p h á t hiện asen ở nồng độ
rấ t th ấp O.OõụM (4jig/l) được tạo bởi các n h à khoa học thuộc nhĩm sinh học phân từ của
khuẩn trên dược nuơi cấy trong mơi trườ ng Luria-B roth (LB) trên m áy lắc ơn nhiệt ở 37°c
Trang 2Dịch vi k h u ẩ n th u được trộn lần vói glycerol 87%, chia đều vào các ô’ng Eppendorf vô trùng (với th ể tích l,3m l) và bào q uản trong tủ lạnh sâu -80"C [6],
2.2 Phép đo h o a t tín h đ á p ứ n g với asen c ủ a vỉ k h u ẩ n c h ỉ th ị
Ô ng giống được làm ta n đá rồi trộ n với 10ml môi trườ ng lỏng LB Đo ho ạt tính của vi khuẩn: trộ n 500^1 m ẫu nước chứa asen với 500^1 dịch vi k h u ẩ n lắc â 30"C, bổ xung dung dịch n-decanal và đo cường độ án h sáng trê n m áy J u n io r LB 9509 L um inom eter Các thí nghiệm đểu lặp lại 3 lần, lấy tru n g bình Đơn vị tín h là cường độ án h sáng (RLƯ), m ẫu đối chứng là m ẫu không chứa asen hoặc không bổ xung hoá chất
2.3 T hí n g h iệ m tối ưu th ờ i g ia n tiếp x ú c a s e n và h à m lư ợ ng cơ ch ấ t
Khi vi k h u ẩn tiếp xúc với asen sẽ tạo r a enzym luciferaza xúc tác cho phản ỏng chuyển hoá cơ c h ấ t (phản ứng p h á t quang), P h ản ứng này phụ thuộc vào lượng enzym và cơ chất, do đó cần phải tối ưu thời gian tạo enzym (thời gian vi k h u ẩn tiếp xúc vối asen từ 30 -
120 phút) và lượng cơ ch ấ t (n-decanal từ 0,125 - 2mM) nhằm tạo r a m ột đáp ứng lớn nh ất cho hệ thông
2.4 T hi n g h iệm đ á n h g iá ả n h hư ởng củ a s ắ t và ch ọ n lự a hoá c h ấ t bảo q u ả n m ẫ u nước n gầm
Nước ngầm chứa nhiều asen thường có hàm lượng s ắ t cao từ 100-600 nM, hàm lượng
s ắ t cao n h ư vậy sẽ gây những ản h hưởng không tố t cho phép đo Để đ ánh giá ảnh hưởng của
s ắ t tới ho ạt tín h của vi k h u ẩn chúng tôi đã tạo r a các m ẫu chứa asen có F e l+ th ay dôi từ 0- lOOOnM (FeCla.8H30 , analytical -Sigma) trong môi trườ ng tru n g tín h và pH 2 Các axit HC1, HNO;i, H.,SOj, H3PO., (Merck) được đùng để tạo pH 2 D ung dịch pyrophotphat 200mM
sẽ được bổ xung đế' tạo môi trườ ng có pH 6,8 là điều kiện p hù hợp cho enzym luciferaza có hoạt tín h cao n h ất Các ch ấ t tạo phức với s ắ t được dùng là muôi T ri N a tri N itrilo triax etat
m onohydrat (C6H 6N N a30 6.H20-NTA-Fluka), D iN a tri etylendiam in te tra a x e ta t d ihydrat (C10Hu N2Na2O8.2H2O-EDTA-Fluka), N atri pyro p h o tp h at (N a4P9O7.10H2O-Sigma) vối nồng
độ từ 0,1-1 raM,
3 Kết quả và bàn luận
3.1 Tối ưu h à m lư ợ ng cơ c h ấ t và thời g ia n tiếp xú c với asen
K ết quả th í nghiệm tối ưu thòi gian tiếp xúc với asen cho th ấy cường độ án h sáng tăn g lên khi ủ vi kh u ẩn trong mõi trường có chứa 0,65jxM ase n từ 30 p h ú t đến 120 p h ú t và
đ ạ t cực đại ở khoảng 90 p h ú t sau đó có chiều hướng giảm (hình 1) N hư vậy, khi thòi gian
Trang 3các bước n hặn dạn g asen [2] Các tác giả của bài báo sô [6] đã dùng thời gian tiếp xúc là 60
p hút và gợi ý có th ể kéo dài khoảng thòi gian này Nhưng k ế t quả th i nghiệm cho th ấy nếu kéo dài thời gian này hơn 90 p h ú t thì cường độ án h sáng giảm, có th ể giải thích là sự tồn tại quá lâu trong môi trường chứ a ch ấ t độc asen của vi khuẩn làm x u ấ t h iện các ảnh hưởng bất lợi đến sinh lý tế bào N hư vậy, với k ế t quả tìm được chúng tôi th ấy thờ i gian tiếp xúc với asen trong 90 p h ú t là tôi ưu
Hình 1 Ảnh hưỏng của thời gian tiếp Hình 2 Tối ưu nồng độ cơ chất
n-xúc giũa asen và vi khuẩn chì thị E.cõli decanal cho phản ửng xúc tác bâi
Lượng cơ ch ấ t n-decanal cũng cần được tối ưu vì nếu th iếu th i độ n hậy của phép đo
sẽ không đ ạ t gía t r ị tối ưu còn nếu cao quá thì sẽ thừa vì lượng enzym luciferaza sinh ra là
có hạn Các tác già [6] đã sử dụng lượng n-decanal là 2mM n h ư ng khi th ử nghiệm các lượng
n d e c a n a l từ 0,125-‘2mM chúng tôi th ấy giá trị bão hoà b ắ t đầu đ ạ t ỏ kho án g 1 mM (hình 2) Các điều kiện th í nghiệm dã tối ưu sẽ được sử dụng cho các th í nghiệm tiếp theo
3.2 Đ á n h g iá ả n h h ư ở ng củ a s ắ t và chọn lựa hoá c h ấ t bảo q u ả n m ẫ u nước n gầm
Khi p hân tích asen trong nước ngầm có nhiều s ắ t có th ể có hai ả n h hường làm giảm khá năng ph át hiện asen của vi kh u ẩn chỉ thị T hứ n h ất, khi s ắ t k ế t t ủ a tạo th àn h hydroxỵt
s ắt (III) các p hản tử ase n sẽ bị h ấp phụ lên đó nên hàm lượng asen hoà ta n trong dung dịch
và tiếp cận vâi vi k h u ẩ n sẽ giảm đi Ngoài ra, hàm lượng s ắ t quá cao cũng gây b ấ t lợi cho hoạt động sinh lý bình thường của vi khuẩn
Kết quả h ình 3 cho th ấy tác hại của s ắ t với hoạt tín h p h á t hiện ase n của vi khuan Cường độ án h sáng giảm r ấ t n h an h khi lượng sắt tăng từ 0-500 ỊiM T ín hiệu giảm khoảng 50% khi s ắ t là 25 (iM và giám hoàn toàn khi hàm lượng s ấ t là 500 nM H iện tượng này xảy
ra là do asen đã bị h ấp th ụ vào các h ạ t s ắ t k ế t tủ a nên không còn đủ để gãy cảm ứng với vi
Trang 4tinh đáp ừng với asen cùa phức tói đáp ửng với asen cùa vi khuẩn chi
vi khuẩn chỉ thị thị (mẫu đôì chửng là mẫu không bổ xung
axit hoặc chất tạo phức)
Với m ẫu nước có pH 2 đã ngăn cản sự k ế t tủa của s ắ t tạo điều kiện cho asen tồn tại tự
do trong dung dịch và tiếp xúc vối vi khuẩn, thì đường biểu diễn cho th ấy cường dộ ánh sáng không giảm dột ngột m à k h á ổn định cho tối khi hàm lượng s ắ t đ ạ t 250nM, có thê cho
rằ n g hoạt tính của vi k h u ẩn chỉ thị asen đã bị ảnh hưởng xấu khi nồng độ s ắ t lốn hơn 250|jM N hư vậy, so với trường hợp không axit hoá m ẫu ta có th ể sử dụng vi kh u ẩn chỉ thị này để xác định h àm lượng asen trong m ột khoảng nồng độ s ắ t kh á rộng (0-250^iM) mà không gáy giảm n h iều hoạt tính của vi khuẩn
Tuy nhiên, khi xét riên g vùng có hàm lượng s ắ t nhỏ (0-25|iM) ta th ấy k h ả năng dáp ứng của vi k h u ẩn chỉ thị giảm đi nhiều ở m ẫu đã axit hoá so với m ẫu tru n g tính Như vậy, môi trưòng axit và quá trìn h bổ xung pyrophotphat tru n g hoà lại có th ể gây h ạ n chế cho
ho ạt động của vi k h u ẩ n chỉ thị, vấn đề này cần được tối ưu hơn nữa nhằm kh ai thác khả năng p h á t hiện asen vốn có cùa vi kh u ẩ n chỉ thị
Kết quả từ h ình 4 cho th ấy trong số các axit đã sử dụng để bảo q uản m ẫu th ì HNO.1 là
có đáp ứng cao hơn rồi mối đến a x it HC1 Axit H3P 0 4 đã được coi là m ột ch ấ t bảo quản tốt cho m ầu chứa asen khi p hân tích kiểu hoá học nhưng vâi trường hợp này nó có th ể gây nèn những ức chẽ cho vi k h u ẩn do cấu trúc tương tự của p h o tp h at và a s e n a t [2,6] Còn H2S 0 4 thể hiện ản h hưởng kém hơn cả trong sô’ các axit đã sử dụng, điều này có th ể được giải thích bởi tin h oxy hoá quá m ạnh của nó
Trong thí nghiệm khảo s á t vai trò cùa các chất tạo phức với s ắ t với các nồng độ từ 0,1-1
mM chúng tôi th ấy ở nồng độ 0,4 mM vi khuẩn chỉ thị có đáp ứ ng cao hơn với cả ba loại
Trang 5p y ro photphat n h ư ng vẫn không bằn g a x it nitric N hư vậy từ k ế t q u ả th u được chúng tôi sẽ
sứ dụng ax it n itric đê làm hoá c h ấ t bảo q u ản cho m ẫu nước khi thử nghiệm với vi k h u ẩn chi thị asen
N hư vậy, s ắ t tro n g nước ngầm có ả n h hường không tố t tới quá trìn h xác d ính asen
b ăng vi k h u ẩ n chỉ th ị E.coli D H 5a (pJAM A-arsR), nhược điểm này có th e khắc phục nhò
việc axit hoá m ẫu b ằn g a x it n itric tới pH 2 và sau đó tru n g hoà lại bằng pyrophotphat Phép
do hàm lượng asen có th ể được thự c hiện sau khi nuôi vi k h u ẩ n chi thị trong môi trườ ng có chứa asen 90 p h ú t và bô’ xung lượng cơ c h ấ t n-decanal với nồng dộ 1 mM Sàn phẩm này cần dược th ử nghiệm tro n g th ự c tiễn với các m ẫu nước ngầm thực có th àn h ph ần hoá học khác
nh au nhằm đ ánh giá tín h k h ả th i của phương pháp xác định hàm lượng asen trong nưóc ngầm bằn g vi k h u ẩ n chỉ thị
T À I L IỆ U THA M KHÀO
1 Berg, M., T ra n , H-, c , N guyen, T., C-, P ham , H V., Schertenleib, R., Giger, w , Arsenic contam ination o f gro u n d w a te r a n d d ringking w ater in Vietnam: A h u m a n health threat E n v ironm ent S cience Technology 13, 2001, pp 2621-2626.
2 D aunert, s , B a rre tt, G., Feliciano, J , s , S hetty, R., s , S hresth a, s , Sm ith-spencer,
w , G enetically E ngineered Whole-Cell S en sing System s: C oupling Biological Recognition w ith R eporter Genes, Chem , Rev, 100, 2000, pp 2705-2738.
3 Kinniburgh, D., G., Kosm us, w , Arsenic contam ination in groundwater:some analytical considerations T a la n ta 58, 2002, pp 165-180.
4 P hạm Thị Kim T ra n g , Nguyễn văn Đản, P hạm H ùng V iệt, nnk, Bước đầu nghiên cứu
s ự ô nhiễm asen trong nước ngầm ngoại th à n h H à nội, T uyến tập báo cáo khoa học Tiếu ban K H liên n g ành K H C N m ôi trường, Trường Đại học K hoa học Tự nhiên,
ĐHQG H à Nội, 2002, tr 65-71,
5 R ahm an, M., M,, M urkherjee, D., S engupta, e t al, Effectiveness a n d reliability o f
A rsenic fie ld testin g kits: are the m illio n dollar screening projects effective or n o t?,
E nvironm ent S cience Technology, 36, 2002, pp 5385-5394
Ổ Stocker, J B alluch, D., G sell, M., H arm s, H., Feliciano, J , D a unert, s Malik, K., A.,
van d er M eer, J , R, Developm ent o f a set o f sim ple Bacterial B iosensor for quantitative
a n d ra p id m e asurem ents o f arsenite a n d arsenate in potable w ater, E nvironm ent
Science Technology 37, 2003, pp 4743-4750
Trang 6VNU JOURNAL OF SCIENCE Na! S c i & Tech., T.xx N02AP 2004
S T U D Y I N G O F T H E E F F E C T S O F F A C T O R S O N T H E
D E T E R M I N A T I O N O F A R S E N I C I N W A T E R B Y B I O S E N S O R
T r a n g P h a m T h i K im , M u i N g u y e n V a n
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U
D a u P h a m T h i, V ie t P h a m H u n g The Centre fo r Environm ental Technology a n d S u sta in a b le D evelopment,
Hanoi College o f Science, V N U ■ Hanoi
M ic h a e l B erg , J a n R V a n D e r M e er
S w iss Federal In stitute for E nvironm ental Science a n d Technology, S w itze rla n d
Arsenic (As) contam inated groundw ater problem h a s been found in m any co u n trie s in the w orld-included V ietnam It h as requested developm ent of new , efficient an d economic quick test facilities beside expensive and so p histicated in s tru m e n t a s atom ic absorption spectrom etry (AAS) Arsenic bacterial biosensors E.coli D H 5a (pJA M A arsR ) (nonpathogenic laboratory strain ) can d ete rm in e arsenic a t level o f 0.05 (4ppb) Hydroxide iron (III) in th e groundw ater will p re cip ita te and absorb ars e n ic in th e presence
of oxygen E xperim ents checking the abilities ag a in st th is phenom ena by adding several acids a s HC1, H N 0 3, H.,S04 H 3P 0 4 a n d chelators a s (CliH6N N a30(i.H20-NTA), (C|0H|,N-,Na.,08.2H^0- EDTA), (N a4P ,0 7.10H20 ) shows th a t HNOa h a s b e s t effect Optim izing experim ents for th e testing procedure show th a t m axim um arsenic sensor ability will be reached afte r 90 m inutes of incubation tim e w ith arsen ic a n d Im M s u b s tra te n-decanal is the best T he arsenic biosensor E.coli DH5 (pJAM A -arsR) sh ould be tested for its reliability by using real groundw ater sam ples w ith different m atrix