TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHQGHN, KHTN & CN.. Công trinh được hỗ trợ về kinh phí của Chương trinh NCCB, đề tài 621306... Phổ đỉện di proteỉn hạt thanh long TlL tro n g các dung dịch ch iế t khác
Trang 1TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHQGHN, KHTN & CN T.XXIII, s ố 1, 2007
NGHIÊN CỨU CÁC CHẤT ứ c CHẾ TRIPXIN (TI)
VÀ KIMOTRIPXIN (KI) CỦA HẠT THANH LONG
Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trân Châu
T ru n g tăm Công nghệ S in h học, Đại học quốc gia H à N ội
1 Mở đầu
C ây th a n h long được trồ n g p hổ b iến ồ nước ta c ũ n g n h ư các nước Đ ông N am Á khác Q ủa th a n h long có tá c d ụ n g giải n h iệ t, lợi tiểu , n h u ậ n t r à n g [2] P h ầ n ăn được của q u ả chứ a 82 - 83% nưốc, g iầu v ita m in c và m ột sô' v ita m in n h ó m B [5] Công b ố của P e re z 2005 [6] cho b iế t n h iề u bộ p h ậ n củ a cây th a n h long tro n g đó có q u ả còn có tác
d ụ n g làm liền v ế t th ư ơ n g ỏ người bị tiể u đường T h eo n h iề u tá c giả, các c h ấ t ức c h ế
p ro te in a z có th ể có n h iề u tr iể n vọng sử d ụ n g làm th u ố c c h ữ a n h iề u b ệ n h tro n g đó có các
b ện h liê n q u a n đ ến v ế t th ư ơ n g p h ầ n m ềm T uy n h iê n ch ư a có công b ố n à o vể các c h ấ t
ức c h ế p ro te in a z củ a loại q u ả q u í giá này P h ầ n ă n được c ủ a q u ả bao gồm n h iề u h ạ t r ấ t
nhỏ xen lẫn với th ịt quả, r ấ t khó tách riêng, có lẽ vì vậy chưa có các n g h iên cứu phân
tích riê n g về h ạ t th a n h long Để tìm h iể u kỹ hơn về các h o ạ t c h ấ t củ a q u ả th a n h long,
ch ú n g tôi tiế n h à n h tá c h riê n g h ạ t khỏi th ị t quả và n g h iê n cứu đ iề u t r a sơ bộ các c h ấ t
ức c h ế p ro te in a z củ a h ạ t
2 Nguyên liệu và Phương pháp
- Q u ả th a n h long c h ín tá c h h ạ t, h o n g kh ô ờ n h iệ t độ b ìn h th ư ờ n g , bảo q u ản tro n g
tù lạn h , d ù n g cho các lầ n p h â n tích k h á c n h a u
- Xác đ ịn h h à m lượng c h ấ t khô tu y ệ t đối b ằ n g c â n S caltex
- Xác đ ịn h p ro te in th e o p hư ơng p h á p B rađ ío rd [1]
- Xác đ ịn h h o ạ t độ p ro te in a z: b ằ n g phương p h áp k h u ế c h tố n t r ê n đ ĩa th ạ c h (điểu
tr a sơ bộ) và p hư ơng p h á p A nson cải tiế n [7] với cơ c h ấ t cazein
- Xác định h o ạ t độ ức chế trip x in (TIA), kim otripxin (KIA) cũng thực hiên theo
h a i phương p h á p tr ê n n h ư n g enzim được ủ với d u n g dịch n g h iê n cứ u tro n g 10 p h ú t ờ
n h iệt độ phòng trước khi xác định h o ạt độ n h ư đã mô tả trước đây [3]
Công trinh được hỗ trợ về kinh phí của Chương trinh NCCB, đề tài 621306.
Chơ viết tắt: DC: dịch chiết; DCTL: dịch chiết hạt thanh long; Đ1: đỉnh 1; Đ2: đĩnh 2; HĐR: hoạt độ riỏng; KI: chát ú t chí kimotripxin; KIA: hoạt đô ức chố kimotripxin; LC: dịch lên cột; PA: hoạt độ proteỉnaz; PAGE: điện di trên gd
poliacrylamit; TL: thanh long; TI: chất ức chố tripxin; TIA: hoạt độ ứd chế tripxỉn; Rm: độ dỉ động*
26
Trang 2N g h itn cứu các chất ức c h ế tripxin (T I) ■ 27
- Đ iện di p ro te in th e o p hư ơng p h á p L aem m li [4], gel 12,5%
- Đ iện di đ ể p h á t h iệ n trự c tiếp p ro te in a z, các c h ấ t ức c h ế p ro te in a z: gel 12,5%
đồng tr ù n g hợp với c a se in , n ồ n g độ c a se in tro n g gel 0,1% , đ iệ n di k h ô n g có SDS, k hông
có c h ấ t khử , m ẫ u k h ô n g xử lý n h iệ t
3 K ết q u ả v à th ả o lu ậ n
K ết q u ả p h â n tíc h sơ bộ quả th a n h long cho th ấ y
Trọng lượng
qua (kg)
Phần ăn được (gam)
Dịch thu được (ml)
Trọng lượng hạt (gam)
Protein (mg)
(,) dịch ép n h ậ n được từ p h ầ n th ịt q u ả (670g) đ ã bỏ h ạ t (viết t ắ t là 8-fj)
K ế t q u ả t r ê n cho th ấ y h ạ t chỉ chiếm k h o ả n g 1,6% trọ n g lượng p h ầ n ă n được của
q u ả n h ư n g p ro te in củ a h ạ t đ ạ t k h o ả n g g ầ n 92% p ro te in củ a s-fj N goài ra , k h i p h â n tích d ịch ép t h ị t q u ả c ũ n g k h ô n g p h á t h iệ n được p ro te in a z , h o ạ t độ ức c h ế trip x in (TIA)
cũ n g n h ư h o ạ t độ ức c h ế k im o trip x in (KIA) Vì vậy, c h ú n g tôi chỉ tiế n h à n h n g h iê n cứu với h ạ t th a n h long
3.1 Hàm lượng protein, hoạt độ ức c h ế trypxin (TIA) và kimotripxin (KIA)
củ a h ạ t th a n h lo n g c h iế t b ằng các d u n g d ịch đ ệm k h á c n hau
Đ ể lựa chọn d u n g dịch c h iế t các c h ấ t ức c h ế try p x in (TI), k im o trip x in (KI), c h ú n g tôi đã s ử d ụ n g 4 lo ại d u n g dịch k h ác n h a u để c h iế t r ú t K ết q u ả tr ê n b ả n g 1 cho th ấ y
k h i sử d ụ n g nước M ili Q h a y d u n g dịch a x it ax etic 0 ,005 M, TIA tổ n g 8ố cũ n g n h ư KLA
tổ n g 80 tro n g các d ịc h c h iế t n à y đ ều cao hơ n k h i sử d ụ n g các d u n g dịch k h ác D u n g dịch đệm S o re n se n c h iế t r ú t được n h iể u p ro te in n h ấ t, n h ư n g TLA, KIA đ ểu th ấ p hơn 80 với dịch c h iế t b ằ n g nước h a y b ằ n g a x it axetic Do đó, h o ạ t độ riê n g củ a dịch c h iế t b ằ n g đệm
S o re n se n th ấ p h ơ n k h i sử d ụ n g các d u n g dịch kh ác Vì vậy, để tin h sạch T I hoặc K3 cùa h ạ t th a n h lo n g có th ể d ừ n g nưỏc M ili Q hoặc d u n g d ịch a a x etic 0,005M
Bảng 1 So sánh cầc loại dung d|ch khác nhau dùng đ i c h ií t TI vè KI từ hạt thanh long
STT Dung dịch dùng để
chiết rút
Protein (mg/100 gam hạt)
Hoat độ tổng
số (IU/100g hạt)
HĐR miu/mg protein
Hoạt đô tổng
số (IU/100g hạt)
HĐR miu/mg protein
2 Đêm Sorensen 1/15M
3 Đệm natri axetat
T jp c h í Klu>a h ọ c D H Q G H N K H T N & C N T J 0 ữ ll, S Ã I 2 0 0 7
Trang 328 H oàng T hu Hà, Phạm Thị T rân Châiu
T heo k ế t q u ả n g h iê n cứu c ủ a c h ú n g tôi, h à m lư ợng c h ấ t k h ô c ủ a h ạ t th a n h lo n g l;à 91% do đó, n ế u tín h h à m lư ợng p ro te in tr ê n c h ấ t kh ô sẽ b ằ n g 3,1%
3.2 So sán h p h ổ đ iệ n d i p ro tein củ a 4 lo ạ i d ịch c h iế t
Hình 1 Phổ đỉện di proteỉn hạt thanh long (TlL)
tro n g các dung dịch ch iế t khác nhau
1 Nước Mili Q
2 Dung dịch đệm Sorensen 1/15M pH 6,5
3 Dung dịch đệm Natri axeỉat 0 f02M pH 4,5
4 Dung dịch axit axetic 0.005M (ghi chú này dùng cho cả hình 2 và 3)
Hlnh 2 Phổ điện di PA của hạt TL trong
4 dung dịch chiết khác nhau
Hình 3 Phổ điện di TIA của hạt TL trong
4 dung dịch chiết kháo nhau
Đ ể so s á n h tiế p k h ả n ă n g c h iế t r ú t p ro te in củ a các d u n g d ịch trê n , đ ã tiế n h à n h
đ iện di p ro te in có tro n g 4 loại d u n g dịch trê n K ết q u ả tr ê n h ìn h 1 cho th ấ y ph ổ đ iện di
p ro te in c ủ a các d u n g dịch tư ờ n g tự n h a u
3.3 So sán h p h ổ đ iệ n di PA* TI, KI củ a 4 lo ạ i d ịc h c h iế t
Sử d ụ n g p h ư ơ n g p h á p đ iện di tr ê n gel p o ly a c rila m it 12,5% đồng tr ù n g hợp với cơ
c h ấ t cazein 0,1% là p h ư ơ n g p h á p n h ạ y , cho p h ép p h á t h iệ n trự c tiế p p ro te in a z , các c h ấ t
ức c h ế p ro te in a z từ dịch c h iế t n g u y ê n liệu m à k h ô n g c ầ n p h ả i tin h sạch S a u k h i điện
di, giữ gel tro n g đ iều k iệ n th íc h hợp, ở vị t r í có p ro te in a z , c a s e in tro n g gel sẽ bị p h â n giải, gel k h ô n g b ắ t m ầ u k h i n h u ộ m với C oom asie B lu e, tạ o th à n h n h ữ n g b ă n g sá n g trê n
n ề n gel m ầ u đ ậm K ế t q u ả tr ê n h ìn h 2 cho th ấ y tấ t cả 4 lo ại dịch c h iế t đ ề u có m ộ t b ăn g sán g , ch ứ n g tỏ h ạ t th a n h lo n g có p ro te in a z
Trang 4Nghiên cứu các chất ức ch ế tripxin ( T I ) 29
Đ iện di các T I có tro n g dịch ch iết (hình 3) đ ã p h á t h iệ n được 2 b ă n g TI (băng m àu
đ ậm hơn nền gel): b ă n g c h ín h có độ di động (Rm) » 0,97, b ă n g nh ỏ có R m w 0,53 Điểu
n à y c h ứ n g tỏ p h ầ n lớn các T I của h ạ t th a n h long có th ể có tín h a x it và có khôi lượng
p h â n tử th ấ p K ết q u ả đ iện di song song vối các p ro te in c h u ẩ n (không trìn h b ày ở đây) cho th ấ y b ă n g T I/K I c h ín h có khối lượng p h â n tử th ấ p h ơ n 14,4 kD
Đ iện di KI c ũ n g n h ậ n được ph ổ đ iện di tư ơ n g tự với p h ổ đ iện di TI
T ừ các k ế t q u ả trê n , tro n g các th í n g h iệm tiế p th e o c h ú n g tôi đ ã sử d ụ n g nước
M ili Q để c h iế t r ú t T I v à KI c ủ a h ạ t th a n h long, vừ a đơn g iả n và rẻ tiền
3.4 S ắ c ký q u a c ộ t S e p h a d e x G-25
Đ ể sơ bộ tá c h từ n g p h ầ n các p ro te in của dịch c h iế t, đ ã tiế n h à n h sắc ký q u a cột
S ep h ad ex G-25 C â n b ằ n g cột và c h iế t r ú t p ro te in b ằ n g d u n g dịch a x it ax etic 0.005M ,
pH 4,5 Xác đ ịn h p ro te in tro n g các p h â n đ o ạn th u được b ằ n g p h ư ơ n g p h á p B rad ío rd ,
n h ậ n được 2 đ ỉn h p ro te in (h ìn h 4), ký h iệ u là Đ l và Đ2 th e o th ứ tự được r ú t x uống cột
OD595nm
• protein xuống CỘI
Thể tích rút (ml) không kể 20ml ban đáu
Hlnh 4 Sắc kỷ mẫu TL qua cộ t Sephadex G-25 Kích thước của cột: 1,2x55cm ; vận tốc 17ml/h ; thể tích mỗỉ phân đoạn 1ml
— ♦— proteỉn: (xác định thớo Bradíord)
Đ I là đ ĩn h c h ín h (b ản g 2), có th ể tích r ú t là 38m l (tư ơng đương Ve củ a riòonucleaz); V e c ủ a Đ2 là 54m l (trước m uối l l m l ) N h ư v ậ y Đ2 có th ể là các
p ro te in /p o ly p e p tit có k h ô i lượng p h â n tử th ấ p hơ n Đ l K ết q u ả tr ê n b ả n g 2 cho th ấ y TTA củ a Đ I g ấp h ơ n 3 lầ n TIA của Đ2 T uy n h iê n , tổ n g T IA củ a cả 2 đ ỉn h Đ I và Đ2
Tẹo c h i K h o a h ọ c D H Q G H N , K H T N & C N TX X H Ị S ổ ỉ , 2 0 0 7
Trang 530 H oàng Thu Hà, Phạm Thị Trán Chiâu
cũ n g chỉ b ằ n g 73,1% TIA c ủ a dịch lên cột, do đó h o ạ t độ riê n g c ủ a cả 2 đ ỉn h Đ I và D 2 đều bị giảm so với dịch lên cột P h ả i c h ă n g T I của h ạ t th a n h lo n g k h ô n g b ề n ? H o ạ t đ ộ
ức c h ế k im o trip x in lại k h ô n g bị giảm v à tậ p tr u n g ở Đ l: K IA c ủ a Đ I ch iêm đên 98'% KIA củ a dịch lên cột, g ấp k h o ả n g 10,8 lầ n KIA của Đ 2; h o ạ t độ riê n g củ a đ ỉn h n à y t ă n g lên g ần 1,6 lầ n so với dịch lê n cột N h ư vậy, để tin h sạ c h KI t ừ h ạ t th a n h long chỉ c ầ n
th u Đ l
Đ iện di p ro te in c ủ a đ ỉn h 1 v à đ ỉn h 2 cho th ấ y b ă n g p ro te in có R m = 0 ,9 7 chiếm tỉ
lệ lớn (h ìn h 5) Đ iện di T I (h ìn h 6) c h ứ n g tỏ b ă n g p ro te in với R m = 0,97 có h o ạ t tín h lức chê trip x in Đ iện di K I (h ìn h 7) đ ã p h á t h iệ n được Đ I và Đ2 đ ều có b ă n g KI với
Rm = 0,97, ngoài b ă n g n ày , Đ2 còn có th ê m 1 b ă n g K I n h ỏ với R m =0,53, giông với D»c
lên cột (cột 1, h ìn h 7)
Bảng 2 Tóm tắt kết quả sắc ký dịch chỉất hạt thanh long qua c ộ t Sephadex G-25
Mau
miu/mg protein
Số lần tinh sạch
miu/mg protein
Số lần tinih sạch
Dich chiết hat
Sau qua cột
Sephadex
G25
Đỉnh 1
Đỉnh 2
51,00 30,30
62.5 37.5
11 494
3 577
55,8 17,3
225.37 116,89
0,893 0,463
3 425 316
98,2 9.0
67,15 10,33
1,57 0,24
Hỉnh 5 Phổ điện di protein của DCTL
qua cột G25
1.DC lên c ộ t; 2 01 ; 3 Đ2 ;
4 DC lên cột pha loãng
Hỉnh 6 Phổ điện di TIA của DCTL qua cột G25
1.DC lên c ộ t; 2 Đ1 ; 3 Đ2 ;
4 DC lên cột pha loăng
T ạ p c h í K h o a h ọ c Đ tìQ G H N , K t ì T N & C N , TJO ữH S ố ỉ , 20 0 7
Trang 6Nghiẽn cứu các chát ức ch ế tripxin ( T I ) 31
Rm
'■■uysị
■ K IA
ị y H H B H B H l (0,53)
(0,97)
Hinh 7 Phổ diện di KIA của DCTL qua cộ t G25
1.LC ; 2 Đ1 ; 3 Đ2
K ết q u ả k iểm t r a h o ạ t tín h k h á n g k h u ẩ n (h ìn h 8) cho th ấ y : ngoài h o ạ t tín h ức c h ế
trip x in , k im o trip x in , Đ l còn có tá c d ụ n g ức c h ế s in h trư ở n g c ủ a P seu d o m o n a s
aeru ginosa p h â n lậ p từ m ủ v ế t th ư ơ n g bỏng của b ệ n h n h â n
4 K ết lu â n
- H àm lư ợng p ro te in h ò a ta n củ a h ạ t th a n h long v ào k h o ả n g 3% châ't khô của h ạ t
- H ạ t th a n h long có p ro te in a z và các c h ấ t ức c h ế trip x in (T I), k im o trip x in (KI) Đ ể
c h iế t r ú t T I, KI từ h ạ t t h a n h long và tiếp tụ c tin h 8ạch, n ê n d ù n g d u n g dịch a x it axetic 0,005M hoặc nước M iliQ
- P h ổ đ iện di T I, K I c ủ a dịch c h iế t từ h ạ t th a n h lo n g k h á giống n h a u về số b ăn g ,
độ di động cũ n g n h ư tỉ lệ g iữ a các băng: có 2 b ă n g T I/K I, b ă n g c h ín h có độ di động
n h a n h hơn với R m = 0,97; b ă n g p h ụ có độ di động vào k h o ả n g 0,53
- S ắc ký q u a cột S e p h a d e x G-25 n h ậ n được 2 đ ỉn h p ro te in (xác đ ịn h th eo
B rad ío rd ), đ ỉn h 1 (Đ l) là đ ỉn h ch ín h , có TIA gấp hơ n 3 lầ n v à KIA gấp k h o ả n g 10,6 lầ n
ở đỉn h 2 (Đ2)
- Đ l còn có h o ạ t tín h ức c h ế sin h trư ở n g củ a P se u d o m o n a s a eru g in o sa p h â n lập từ
m ù v ế t th ư ơ n g b ỏ n g củ a b ệ n h n h â n
sẫ&kL'' ỊgyịTv 1■ , 1' ^ •ỈKỈàĐaSĨÉÌÌ
M n L ' V #->
I t e S " ' " I i n n
j v
W : • ■ 11 ■V 1,
H ai-;
Hinh 8 Đ1 DCTL qua cộ t G25 ức chế sinh trưỏng của Pseudomonas aeruginosa
Trang 732 Hoàng Thu Hà, Phạm Thị T rân C hau
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 B r a d íò r d M M , A r a p id a n d s e n s i t i v e M e th o d fo r t h e q u a n t i t a t i o n o f m ic r o g r a m q u a n t i t i e s
of protein ultilizing the principle of protein - dye binding, Anal Biochem 1976, 72: 248-253.
2 Đỗ H Bích, Đặng Q Chung, Bùi X Chương, Nuyễn T Dong, Đỗ T Đàm, Phạm V Hiển,
V ũ N L ộ, P h ạ m D M a i, P h ạ m K M ã n , Đ o à n T N h u , N g u y ễ n T ậ p , T r ầ n T o à n , C â y t h u ố c
và động vật làm thuốc ở Việt N a m , NXB Khoa học & Kỷ th uật, Hà Nội 2004, Tập II, 1256
t r a n g , p p 8 2 6 -8 2 7
3 H o à n g T h u H à , P h ạ m T h ị T r â n C h â u , M ộ t s ố t h à n h p h ầ n h ó a s i n h v à h o ạ t t í n h s i n h h ọ c
của dịch ép từ th ịt quả mướp đắng (Momordica charantia L.), Tạp chí Sin h học V.28, NOI
(2 0 0 6 ), p p 7 5 -8 0
4 Laemmli U.K., Cleavage of structure proteins during assem bly of the head of bacteriophage
T4 Nature 227(1970), p 341-349.
5 Morton, Julia F., Miami, FL Morton, J 1987 In: Fruits o f wam climates Straw berry Pear
p 347 - 348.
6 P e r e z G R M , V a r g a s S R ,O r tiz H Y D , W o u n d h e a li n g p r o p e r t ie s o f H y lo c e r e u s u n d a t u s
o n d ia b e t e s , P h y to t h e r a p y R e s e a r c h V 1 9 , N 0 8 (2 0 0 5 ), p 6 6 5 -6 6 8
7 Pietrowa J s , Wincjunajte M M.f Opredelenie proteolyticheskoi aktivnosti ferm entnykh
p r e p a r a to ư m ic r o b io lo g ic h e s k o v o p r o is k h o z h d e n ỉe , P r i k l a d B io c h e m M ik ro b io l., 2 (1 9 6 6 ),
p 2 3 2 - 2 3 6 ( tiế n g N g a ).
VNU JOURNAL OF SCIEN CE, Nat., Sci., & Tech., T.XXI1I, NọỊ, 2007
STUDY ON TRYPSIN INHIBITOR (TI) AND CHYMOTRYPSIN
Hoang Thu Ha, Pham Thi Tran Chau
C enter fo r B iotechnology, V ietn a m N a tio n a l U niưersity, H a n o i
Blue d rag o n (or s tra w b e rry p ear) p la n ts h av e b e e n w idely p la n te d in V iet Nam
a n d o th e r c o u n trie s of S o u th E a s t A sian region T h e ir f ru it ju ice h a s b een enjoyed as a cool d rin k M oreover, th e w o und h e a lin g p ro p e rtie s o f f ru it p u lp h a v e also b een found recently H ence, i t is w o rth y to in v e stig a te b io ch em ical co m p o n en ts of th is fru its In
th is w ork, we focused on try p s in a n d ch y m o try p sin in h ib ito rs o f seed s s e p a ra te d frcm edible p o rtio n of íru its
T ạ p c h i K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K tì T N & C N , T.XXIII, S ô '1 , 2 (0 7
Trang 8Nghiên cứu các chấl ức ch ế tripxin ( T I ) 33
T h e o b ta in e d re s u lts in d ic a te d t h a t soluble p ro te in s c o n te n t of th e seeds w as
a ro u n d 3% of d ry s u b sta n c e s of seeds By u sin g se v e ra l m eth o d s d o cu m en ted t h a t H
u n d a tu s seed s c o n ta in in g p ro te in a se , try p s in in h ib ito rs a n d ch y m o try p sin in h ib ito rs,
w hich could be e x tra c te d by e ith e r M ili Q w a te r, or a cetic acid 0.005M , S o ren sen b u íĩe r
pH 6.5, n a tr i a c e ta te b u íĩe r pH 4.5 T h e to ta l a n d speciíic in h ib ito ry a c tiv ity in th e fĩrs t
tw o e x tra c t so lu tio n s w ere h ig h e r th a n th o se of th e la te r ones H ow ever, th e
e le ctro p h o re tic p a tte r n s of p ro te in , PA, T I a n d KI from th e s e 4 seed e x tra c ts w ere
r a th e r sim ila r: One PA b a n d a n d tw o in h ib ito r b a n d s on poly acry lam id e gel copolym erized w ith c a se in w ere d etected T h e m obility (Rm) of th e m ajor TI/K I b a n d
w as a ro u n d 0.97 a n d t h a t of th e m in o r TI/K I w as a ro u n d 0.53
By íra c tio n a tin g seed a q u eo u s e x tra c t on S e p h a d e x G-25 colum n, two p ro te in
p eak s w ere o b ta in e d , d e sig n a te d a s D l a n d D2 B o th of th e m ex h ib ited in h ib ito ry
ac tiv ity a g a in s t try p s in (TIA) a n d ch y m o try p sin (KIA) M oreover, in h ib ito ry activ ity
c o n c e n tra te d on p e a k 1: TIA an d KIA of D l w ere h ig h e r th a n th o se of D2 th re e- a n d teníold, resp ectiv ely I t 18 in te re s te d t h a t D l also in h ib ite d g ro w th of P seudom onas
aeruginosa iso la te d from p us of p a tie n t’s in fected b u rn w ound.
T ip c h i K h o a h ọ c D H Q G H N K IỈT N & C N T XXIII Sứ' 1 2 0 0 7